JP5908401B2 - 血液凝固タンパク質複合体 - Google Patents

Description

本願は、２０１０年５月２１に出願された米国特許仮出願第６１／３４７，１３６号、および２００９年７月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／２２８，８２８号の利益を主張し、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、水溶性ポリマーを血液凝固タンパク質に共役させるための物質および方法に関する。

第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼを含む、血液凝固タンパク質等の治療的ポリペプチドは、タンパク質分解酵素によって迅速に分解され、抗体によって中和される。これは、それらの半減期および循環時間を減少させ、それによって、それらの治療有効性を制限する。比較的高い用量および頻繁な投与が、これらの凝固タンパク質の所望の治療効果または予防効果に達し、かつ持続するために必要である。その結果、適切な用量調節を得ることは困難であり、頻繁な静脈内投与の必要性により、患者の生活様式が制限される。

ポリペプチド薬物のＰＥＧ化は、循環血中のそれらを保護し、それらの薬力学的および薬物動態プロファイルを改善させる（Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｃｈｅｓｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００３；２：２１４−２１）。ＰＥＧ化プロセスは、エチレングリコール（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の反復単位を、ポリペプチド薬物に付着させる。ＰＥＧ分子は、流体力学的に大容量（球状タンパク質のサイズの５〜１０倍）を有し、非常に水溶性であり、水和されており、非毒性であって、非免疫原性であり、身体から迅速に除去される。分子のＰＥＧ化は、薬物の酵素分解に対する耐性の増大、生体内半減期の増大、投薬頻度の減少、免疫原性の減少、物理的および熱的安定性の増大、溶解度の増大、液体安定性の増大、および凝集の低減をもたらすことができる。最初のＰＥＧ化薬物は、１９９０年代初期にＦＤＡによって承認された。それ以降、ＦＤＡは、経口、注入可能、および局所投与のための種々のＰＥＧ化薬物を承認している。

コロミン酸（ＣＡ）とも称されるポリシアル酸（ＰＳＡ）は、天然由来の多糖である。それは、α（２→８）ケトシド連結を有するＮ−アセチルノイラミン酸のホモポリマーであり、その非還元末端において隣接ジオール基を含有する。それは負荷電され、かつヒトの身体の天然成分である。それは大量の細菌から容易に、かつ規定の物理的特長を有して産生することができる（米国特許第５，８４６，９５１号）。細菌によって産生されたＰＳＡが、ヒトの身体内で産生されたＰＳＡと化学的および免疫学的に同一であるため、細菌性ＰＳＡは、タンパク質に結合したときでさえ、非免疫原性である。いくつかのポリマーとは異なり、ＰＳＡ酸は、生物分解性である。カタラーゼおよびアスパラギナーゼへのコロミン酸の共有結合は、タンパク質分解酵素または血漿の存在下での酵素安定性を増大することが明らかになっている。ポリシアル酸化および非修飾アスパラギナーゼとの生体内比較研究は、ポリシアル酸化が酵素の半減期を増大させたことを明らかにした（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｉｎｔ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １３４１：２６−３４，１９９７）。

水溶性ポリマーと治療的タンパク質との間の共有連結を形成することによる複合体の調製は、種々の化学的方法によって実施することができる。例えば、ペプチドまたはタンパク質へのＰＥＧ誘導体の結合は、Ｒｏｂｅｒｔｓら（Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２００２；５４：４５９−７６）によって検討されている。治療的タンパク質への水溶性ポリマーの結合のための１つの方法は、タンパク質の炭水化物部分を介するポリマーの共役である。タンパク質中の炭水化物の隣接ヒドロキシル（ＯＨ）基は、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）で容易に酸化され、活性アルデヒド基を形成することができる（Ｒｏｔｈｆｕｓ ｅｔ Ｓｍｉｔｈ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９６３；２３８：１４０２−１０、ｖａｎ Ｌｅｎｔｅｎ ｅｔ Ａｓｈｗｅｌｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９７１；２４６：１８８９−９４）。その後、ポリマーは、例えば、活性ヒドラジド基を含有する試薬の使用によって、炭水化物のアルデヒド基に結合することができる（Ｗｉｌｃｈｅｋ Ｍ ａｎｄ Ｂａｙｅｒ ＥＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９８７；１３８：４２９−４２）。より近年の技術は、アルデヒドと反応してオキシム連結を形成するアミノオキシ基を含有する試薬の使用である（国際公開第９６／４０６６２号、国際公開第２００８／０２５８５６号）。

治療タンパク質への水溶性ポリマーの共役を説明する更なる例は、フォンヴィレブランド因子中の炭水化物部分の酸化、およびヒドラジド化学を使用するＰＥＧへのその後の結合を教示する国際公開第０６／０７１８０１号、ｒＦＶＩＩＩの酸化、ならびにヒドラジド化学を使用するＰＥＧおよび他の水溶性ポリマー（例えば、ＰＳＡ、ＨＥＳ、デキストラン）へのその後の結合を教示する米国公開第２００９／００７６２３７号、異なる凝固因子（例えば、ｒＦＩＸ、ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩａ）の酸化、ならびにオキシム連結を形成することによって、アミノオキシ化学を使用する、例えば、ＰＥＧへのその後の結合を教示する国際公開第２００８／０２５８５６号、およびＦＩＸの酸化、ならびにヒドラジド化学を使用するＰＥＧへのその後の結合を教示する米国特許第５，６２１，０３９号に説明されている。

近年、アルデヒドを生成するためのシアル酸の温和な過ヨウ素酸塩酸化後、触媒量のアニリンの存在下で、試薬を含有するアミノオキシ基との反応を含む、改善された方法が説明された（Ｄｉｒｋｓｅｎ Ａ ｅｔ Ｄａｗｓｏｎ ＰＥ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００８；１９，２５４３−８、およびＺｅｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９；６：２０７−９）。アニリン触媒は、オキシムライゲーションを著しく加速させ、非常に低い濃度の試薬の使用を可能にする。

水溶性ポリマーを治療的タンパク質に共役させるための方法が使用可能であるにもかかわらず、種々の試薬に関連する費用を最小限化したまま、タンパク質の薬力学的および／または薬物動態特性を改善する、タンパク質に水溶性ポリマーを共役させるための物質および方法を開発する必要性が、依然として存在する。

本発明は、タンパク質にポリマーを共役させるための物質および方法を提供し、種々の試薬に関連する費用を最小限化したまま、タンパク質の薬力学的および／または薬物動態特性を改善する。

本発明の一実施形態では、血液凝固タンパク質の酸化炭水化物部分に水溶性ポリマーを共役させる方法は、酸化炭水化物部分を、共役を可能にする条件下で、活性化水溶性ポリマーに接触することを含み、血液凝固タンパク質は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼ、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体から成る群より選択され、水溶性ポリマーは、活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）から成る群より選択され、炭水化物部分は、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）から成る群より選択される酸化剤を含む緩衝液でのインキュベーションによって酸化され、オキシム連結が、酸化炭水化物部分と水溶性ポリマー上の活性アミノオキシ基との間に形成される。

本発明の別の実施形態では、上述の方法に従う水溶性ポリマーは、ＰＳＡである。関連する実施形態では、ＰＳＡは、約５〜５００または１０〜３００個のシアル酸単位から成る。さらに別の実施形態では、上述の方法に従う血液凝固タンパク質は、ＦＩＸである。別の実施形態では、上述の方法に従う血液凝固タンパク質は、ＦＶＩＩａである。さらに別の実施形態では、上述の方法に従う血液凝固タンパク質は、ＦＶＩＩＩである。また別の実施形態では、酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）である上述の方法が提供される。別の実施形態では、上述の方法に従う血液凝固タンパク質の酸化炭水化物部分は、血液凝固タンパク質の活性化ペプチド内に位置する。

また本発明の別の実施形態では、ＰＳＡが活性化アミノオキシリンカーを酸化ＰＳＡと反応させることによって調製される、上述の方法が提供され、アミノオキシリンカーは、式：

の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカー、および式：

の３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミンリンカーから成る群より選択され、

ＰＳＡは、酸化剤とのインキュベーションによって酸化され、ＰＳＡの非還元末端において末端アルデヒド基を形成する。さらに別の実施形態では、活性化アミノオキシリンカーが１〜５０個のエチレングリコール単位を含む、上述の方法が提供される。さらに別の実施形態では、アミノオキシリンカーが、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンである、上述の方法が提供される。関連する実施形態では、酸化剤は、ＮａＩＯ_４である。

本発明の別の実施形態では、酸化炭水化物部分を、活性化水溶性ポリマーと接触させることが、アニリンおよびアニリン誘導体から成る群より選択される求核触媒を含有する緩衝液中で生じる、上述の方法が提供される。

また本発明の別の実施形態では、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）およびアスコルビン酸（ビタミンＣ）から成る群より選択される還元化合物を含む、緩衝液中の共役された血液凝固タンパク質のインキュベーションによって、共役された血液凝固タンパク質内でオキシム連結を還元するステップをさらに含む、上述の方法が提供される。関連する実施形態では、還元化合物は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）である。

本発明の別の実施形態では、上述の方法によって産生された、修飾された血液凝固タンパク質が提供される。

本発明のさらに別の実施形態では、ＦＩＸ分子、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体を含み、ＦＩＸ分子に少なくとも１つのアミノオキシＰＳＡが結合する、修飾されたＦＩＸが提供され、該アミノオキシＰＳＡは、１つまたは複数の炭水化物部分を介して、ＦＩＸに付着する。

本発明の別の実施形態では、ＦＶＩＩａ分子、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体を含み、少なくとも１つのアミノオキシＰＳＡがＦＶＩＩａ分子に結合する、修飾されたＦＶＩＩａが提供され、該アミノオキシＰＳＡは、１つまたは複数の炭水化物部分を介して、ＦＶＩＩａに付着する。

本発明のさらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ分子、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体を含み、少なくとも１つのアミノオキシＰＳＡがＦＶＩＩＩ分子に結合する、修飾されたＦＶＩＩＩが提供され、該アミノオキシＰＳＡは、１つまたは複数の炭水化物部分を介して、ＦＶＩＩＩに付着する。

本発明のさらに別の実施形態では、ＦＩＸ分子、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体を含み、少なくとも１つのアミノオキシＰＥＧがＦＩＸ分子に結合する、修飾されたＦＩＸが提供され、該アミノオキシＰＥＧは、１つまたは複数の炭水化物部分を介して、ＦＩＸに付着する。

本発明の別の実施形態では、ＦＶＩＩａ分子、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体を含み、少なくとも１つのアミノオキシＰＥＧがＦＶＩＩａ分子に結合する、修飾されたＦＶＩＩａが提供され、該アミノオキシＰＥＧは、１つまたは複数の炭水化物部分を介して、ＦＶＩＩａに付着する。

本発明のさらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ分子、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体を含み、少なくとも１つのアミノオキシＰＥＧがＦＶＩＩＩ分子に結合する、修飾されたＦＶＩＩＩが提供され、該アミノオキシＰＥＧは、１つまたは複数の炭水化物部分を介して、ＦＶＩＩＩに付着する。

さらに別の実施形態では、活性アミノオキシリンカーを含む水溶性ポリマーが提供され、該水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）から成る群より選択され、該活性アミノオキシリンカーは、式：

の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカー、および式：

の３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミンリンカーから成る群より選択される。

さらに別の実施形態では、活性化アミノオキシリンカーが１〜５０個のエチレングリコール単位を含む、上述の方法が提供される。

凝固第ＩＸ因子の一次構造を示す。 アミノオキシ−ＰＳＡへの酸化ｒＦＩＸの結合を示す。 水溶性ジアミノオキシリンカー（３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンおよび３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミン）の合成を示す。 アミノオキシ−ＰＳＡの調製を示す。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色を用いるＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体の解析評価を示す。 抗ＦＩＸおよび抗ＰＳＡ抗体での検出を用いるＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体の解析評価を示す。 注入後の時間に対する、天然ｒＦＩＸおよびＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体の活性を示す。 注入後の時間に対する、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩおよびＡｄｖａｔｅレベルを示す。

治療的タンパク質の薬理学的および免疫学的特性は、化学修飾、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）等のポリマー化合物との共役によって改善することができる。得られた複合体の特性は、一般に、ポリマーの構造および大きさに強く左右される。したがって、画定された狭い大きさの分布を有するポリマーが、通常、当該技術分野において好ましい。ＰＥＧ等の合成ポリマーは、狭い大きさの分布で容易に製造することができ、ＰＳＡは、狭い大きさの分布を有する最終ＰＳＡ調製をもたらすような方法で精製することができる。加えて、画定されたポリマー鎖および狭い大きさの分布を有するＰＥＧ化試薬は、市場に出回っており、手頃な価格で市販されている。

ポリシアル化等を介する可溶性ポリマーの追加は、ＦＩＸ等の血液凝固タンパク質、ならびに他の凝固タンパク質（例えば、ＶＷＦ、ＦＶＩＩａ（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２００８／０２２１０３２Ａ１号を参照）、およびＦＶＩＩＩ）の特性を改善するための１つの方法である。

血液凝固タンパク質
本明細書に説明するとき、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼを含むが、これらに限定されない、血液凝固タンパク質が、本発明によって意図される。本明細書に使用するとき、「血液凝固タンパク質」という用語は、任意の第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼを指し、それらは特定の天然血液凝固タンパク質に関連する、生物学的活性を呈する。

血液凝固カスケードは、３つの異なるセグメント、すなわち内因性、外因性、および一般的経路に分割される（Ｓｃｈｅｎｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４；１１：２７２−７）。カスケードには、一連のセリンプロテアーゼ酵素（チモーゲン）およびタンパク質補因子が関与する。必要なとき、不活性キモーゼン前駆体が活性形態に変換され、それは、その後、カスケード中の次の酵素を変換する。

内因性経路は、凝固因子ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、およびＸＩＩを必要とする。内因性経路の開始は、プレカリクレイン、高分子量キニノゲン、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、および第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）が負荷電された表面に暴露されるときに生じる。血小板から分泌されるカルシウムイオンおよびリン脂質も必要とされる。

外因性経路は、血管の血管腔が損傷されたときに開始される。膜糖タンパク質組織因子が暴露され、次いで、循環因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）に、かつ既存の少量のその活性型ＦＶＩＩａに結合する。この結合は、ＦＶＩＩａへのＦＶＩＩの完全な変換に続き、カルシウムおよびリン脂質の存在下で、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の第ＩＸ因子ａ（ＦＩＸａ）への変換、および第Ｘ因子（ＦＸ）の第Ｘ因子ａ（ＦＸａ）への変換を促進する。組織因子とのＦＶＩＩａの会合は、基質（ＦＩＸおよびＦＸ）のためのＦＶＩＩの結合部位を接近させることによって、かつ構造変化を誘発させることによって、タンパク質分解活性を強化させ、それは、ＦＶＩＩａの酵素活性を強化させる。

ＦＸの活性は、２つの経路の共有点である。リン脂質およびカルシウムの他に、因子Ｖａ（ＦＶａ）およびＸａは、プロトロンビンをトロンビン（プロトロンビナーゼ錯体）に変換し、それは、次いで、フィブリノゲンを開裂して、フィブリンモノマーを形成する。モノマーは、重合化されフィブリン鎖を形成する。第ＸＩＩＩａ因子（ＦＸＩＩＩａ）は、これらの鎖を相互に共有結合して、剛性メッシュを形成する。

ＦＶＩＩａへのＦＶＩＩの変換はまた、トロンビン、ＦＩＸａ、ＦＸａ、第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）、および第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）を含む、多くのプロテアーゼによって触媒される。カスケードの初期段階の阻害のために、組織因子経路阻害剤は、ＦＶＩＩａ／組織因子／ＦＸａ生成物錯体を標的とする。

Ａ．ポリペプチド
一態様では、本発明の出発物質は、血液凝固タンパク質であり、それは、ヒト血漿に由来することができるか、または米国特許第４，７５７，００６号、米国特許第５，７３３，８７３号、米国特許第５，１９８，３４９号、米国特許第５，２５０，４２１号、米国特許第５，９１９，７６６号、およびＥＰ第３０６ ９６８号に説明する、組換え操作技術によって産生することができる。本明細書に説明するとき、血液凝固タンパク質という用語は、天然血液凝固タンパク質に関連する生物学的活性を呈する、任意の血液凝固タンパク質分子を指す。本発明の一実施形態では、血液凝固タンパク質分子は、完全長の血液凝固タンパク質である。

意図される血液凝固タンパク質分子は、完全長のタンパク質、完全長のタンパク質の前駆体、完全長のタンパク質の生物学的に活性なサブユニットまたはフラグメント、ならびに血液凝固タンパク質のこれらの形態のうちのいずれかの生物学的に活性な誘導体および変異体を含む。したがって、血液凝固タンパク質は、（１）少なくとも約２５、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００以上のアミノ酸の領域にわたって、参照核酸、または本明細書に説明するアミノ酸配列によってコードされたポリペプチドと、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列を有し、および／または（２）本明細書に説明する参照アミノ酸配列を含む免疫原、その免疫原性フラグメント、および／またはその保存的に修飾された変異体に対して生成された抗体、例えば、ポリクロナールまたはモノクローナル抗体に特異的に結合する、血液凝固タンパク質を含む。

本発明に従い、「組換え血液凝固タンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技術を介して得られた任意の血液凝固タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、この用語は、本明細書に説明するタンパク質を包含する。

本明細書に使用するとき、「内在性血液凝固タンパク質」は、治療を受けることを企図されている哺乳類に由来する血液凝固タンパク質を含む。該用語はまた、該哺乳類に存在する導入遺伝子または任意の他の外来ＤＮＡから転写された血液凝固タンパク質を含む。本明細書に使用するとき、「外在性血液凝固タンパク質」は、治療を受けることを企図されている哺乳類に由来しない血液凝固タンパク質を含む。

本明細書に使用するとき、「血漿由来血液凝固タンパク質」または「血漿性」は、凝固経路に関与する特性を有する哺乳類から得られた、血中に見られるタンパク質のすべての形態を含む。

本明細書に使用するとき、「生物学的に活性な誘導体」または「生物学的に活性な変異体」は、該分子の実質的に同一の機能的および／または生物学的特性（結合特性等）、および／または同一の構造基盤（ペプチド主鎖または塩基ポリマー単位）を有する分子の任意の誘導体または変異体を含む。

「類似体」、「変異体」、または「誘導体」は、天然由来の分子と構造が実質的に同様であり、ある特定の例では、異なる程度ではあるが、同一の生物学的活性を有する化合物である。例えば、ポリペプチド変異体は、参照ポリペプチドと実質的に同様の構造を有し、同一の生物学的活性を有するポリペプチドを指す。変異体または類似体は、（ｉ）ポリペプチドの１つまたは複数の末端、および／または自然発生のポリペプチド配列（例えば、フラグメント）の１つまたは複数の内部領域における１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、（ｉｉ）ポリペプチドの１つまたは複数の末端、および／または自然発生のポリペプチド配列の１つまたは複数の内部領域（典型的には、「挿入」）における１つまたは複数のアミノ酸の挿入または追加（典型的には、「追加」または「融合」）、または（ｉｉｉ）自然発生のポリペプチド内の他のアミノ酸への１つまたは複数のアミノ酸の置換に関与する１つまたは複数の変異に基づき、類似体が由来する自然発生ポリペプチドと比較して、それらのアミノ酸配列の組成において異なる。例として、「誘導体」は、例えば、化学的に修飾されている参照ポリペプチドと同一または実質的に同様の構造を有するポリペプチドを指す。

変異体または類似体ポリペプチドは、挿入変異体を含み、１つまたは複数のアミノ酸残基が本発明の血液凝固タンパク質アミノ酸配列に追加される。挿入は、タンパク質の末端のいずれか、または両方に位置してもよい、および／または血液凝固タンパク質アミノ酸配列の内部領域内に位置付けられてもよい。末端のいずれか、または両方において追加の残基を伴う挿入変異体は、例えば、融合タンパク質、およびアミノ酸タグまたは他のアミノ酸ラベルを含むタンパク質を含む。一態様では、血液凝固タンパク質分子は、特に、分子が大腸菌等の細菌性細胞内に組換えで発現するときに、随意に、Ｎ−末端Ｍｅｔを含有する。

欠失変異体では、本明細書に説明する血液凝固タンパク質ポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸残基が除去される。欠失は、血液凝固タンパク質ポリペプチドの１つまたは両方の末端において、および／または血液凝固タンパク質アミノ酸配列内の１つまたは複数の残基の除去によって達成することができる。したがって、欠失変異体は、血液凝固タンパク質ポリペプチド配列のフラグメントを含む。

置換変異体では、血液凝固タンパク質ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基が除去され、代替の残基で交換される。一態様では、置換は、性質上保存的であり、このタイプの保存的置換は、当該技術分野において公知である。代替的には、本発明は、非保存的でもある置換を包含する。例示的な保存的置換を、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５），ｐｐ．７１−７７］に説明されており、下に提示する。
保存的置換
側鎖の特徴 アミノ酸
非分極性（疎水性）：
Ａ．脂肪族 ＡＬＩＶＰ
Ｂ．芳香族 ＦＷ
Ｃ．硫黄含有 Ｍ
Ｄ．境界 Ｇ
非荷電極性：
Ａ．ヒドロキシル ＳＴＹ
Ｂ．アミド ＮＱ
Ｃ．スルフヒドリル Ｃ
Ｄ．境界 Ｇ
正電荷（塩基性） ＫＲＨ
負電荷（酸性） ＤＥ

代替的には、例示的保存置換を下に提示する。
保存的置換ＩＩ
元の残基 例示の置換
Ａｌａ（Ａ） Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
Ａｒｇ（Ｒ） Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ
Ａｓｎ（Ｎ） Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
Ａｓｐ（Ｄ） Ｇｌｕ
Ｃｙｓ（Ｃ） Ｓｅｒ
Ｇｌｎ（Ｑ） Ａｓｎ
Ｇｌｕ（Ｅ） Ａｓｐ
Ｈｉｓ（Ｈ） Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
Ｉｌｅ（Ｉ） Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ
Ｌｅｕ（Ｌ） Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ
Ｌｙｓ（Ｋ） Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ
Ｍｅｔ（Ｍ） Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ
Ｐｈｅ（Ｆ） Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ
Ｐｒｏ（Ｐ） Ｇｌｙ
Ｓｅｒ（Ｓ） Ｔｈｒ
Ｔｈｒ（Ｔ） Ｓｅｒ
Ｔｒｐ（Ｗ） Ｔｙｒ
Ｔｙｒ（Ｙ） Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ
Ｖａｌ（Ｖ） Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ

Ｂ．ポリヌクレオチド
本発明の血液凝固タンパク質をコードする核酸としては、例えば、遺伝子、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、多形変異体、対立遺伝子、合成および自然発生の変異が挙げられるが、これらに限定されない。

また、本発明の血液凝固タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、（１）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に説明する参照アミノ酸配列をコードする核酸、およびその保存的に修飾された変異体に特異的にハイブリダイズする、（２）少なくとも約２５、約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約５００、約１０００以上のヌクレオチド（最大、成熟タンパク質の１２１８ヌクレオチドの完全長配列）の領域にわたって、本明細書に説明する参照核酸配列と、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上のヌクレオチド配列同一性を有する、核酸配列を有するポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」条件は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８中の４２℃でのハイブリダイゼーション、および３０分間、５５℃での１×ＳＳＣの洗浄を含む。これらの例示的条件の変化は、ハイブリダイズされる配列の長さおよびＧＣヌクレオチド含有量に基づき行うことができることを理解されたい。当該技術分野における標準公式は、適切なハイブリダイゼーション条件を決定するために適切である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）９．４７−９．５１を参照。

「天然由来の」ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的には、霊長類（例えば、ヒト）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または任意の哺乳類が挙げられるが、これらに限定されない哺乳類からのものである。本発明の核酸およびタンパク質は、組換え分子（例えば、異種であり、野生型配列またはその変異体をコードする、または非天然由来）であることができる。

本発明のある特定の実施形態では、上述のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、以下の血液凝固タンパク質によって例示される。

第ＶＩＩａ因子
ＦＶＩＩ（安定因子またはプロコンベルチンとも称される）は、止血および凝固における中枢的役割を有する、ビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質である（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．２００２；３：２８７−９９）。

ＦＶＩＩは、肝臓内で合成され、４８ｋＤの単鎖糖タンパク質として分泌される。ＦＶＩＩは、すべてのビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質と、脂質膜とのタンパク質の相互作用に関与する、９〜１２残基を有するアミノ末端γカルボキシシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメイン、カルボキシ末端セリンプロテアーゼドメイン（触媒ドメイン）、および組織因子との相互作用を媒介する、カルシウムイオン結合部位を含有する２つの上皮成長因子様ドメインから成る同一のタンパク質ドメイン構造を共有する。γグルタミルカルボキシラーゼは、分子のアミノ末端タンパク質部分内のＧｌａ残基のカルボキシル化を触媒する。カルボキシラーゼは、その作用に対してビタミンＫの還元型に左右され、それは、エポキシド型に酸化される。ビタミンＫエポキシド還元酵素がビタミンＫのエポキシド型を還元型に変換し戻すために必要である。

主要な割合のＦＶＩＩは、酵素原形態の血漿中で循環し、この形態の活性は、アルギニン１５２とイソロイシン１５３との間のペプチド結合の開裂をもたらす。結果の活性ＦＶＩＩａは、単一ジスルフィド結合（Ｃｙｓ１３５〜Ｃｙｓ２６２）を介して連結した、ＮＨ_２由来の軽鎖（２０ｋＤ）およびＣＯＯＨ末端由来の重鎖（３０ｋＤ）から成る。軽鎖は、膜結合Ｇｌａドメインを含有し、重鎖は、触媒ドメインを含有する。

遺伝因子および環境因子によって決定されるＦＶＩＩの血漿濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬである（Ｐｉｎｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０００；９５：３４２３−８）。異なるＦＶＩＩ遺伝子型は、平均ＦＶＩＩレベルにおいて数倍の差異をもたらすことができる。血漿ＦＶＩＩレベルは、健康な女性の妊娠中に上昇し、また、年齢とともに増大し、女性および高トリグリセリド血症を罹患するヒトにおいてより高い。ＦＶＩＩは、すべての凝固促進要因のうち最短の半減期（３〜６時間）を有する。健康な個人におけるＦＶＩＩａの平均血漿濃度は、３．６ｎｇ／ｍＬであり、ＦＶＩＩａの循環半減期は、他の凝固因子と比較して、比較的長い（２．５時間）。

遺伝性ＦＶＩＩ欠損症は、一般集団において５００，０００人当たり１症例であると推定される有病率を有する、稀な常染色体劣性出血性疾患である（Ａｃｈａｒｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２００４；２２４８−５６）。阻害剤からの後天的ＦＶＩＩ欠損症もまた、非常に稀である。セファロスポリン、ペニシリン、および経口抗凝固剤等の薬物に関連して生じる欠損症の症例も報告されている。さらに、後天的ＦＶＩＩ欠損症は、自然に、または例えば骨髄腫、敗血症、再生不良性貧血等の他の症状とともに、インターロイキン−２および抗胸腺細胞グロブリン療法で生じることが報告されている。

参照ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列としては、例えば、ゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０２９３３、ｃＤＮＡのＭ１３２３２（Ｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １９８６；８３：２４１２−６）、およびポリペプチド配列のＰ０８７０９（参照は、その全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられる。ＦＶＩＩの種々の多形性は、例えば、Ｓａｂａｔｅｒ−Ｌｌｅａｌ ｅｔ ａｌ（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２００６；１１８：７４１−５１を参照）（参照は、その全体が本明細書に組み込まれる）に説明されている。

第ＩＸ因子
ＦＩＸは、カルシウムイオン、リン脂質、およびＦＶＩＩＩａの存在下で、ＦＸをその活性型に変換することによって、血液凝固の内因性経路に関与するビタミンＫ依存性血漿タンパク質である。ＦＩＸの主要な触媒能力は、ＦＸ内の特定のアルギニン−イソロイシン結合に対して特性を有する、セリンプロテアーゼとしての触媒能力である。ＦＩＸの活性化は、ＦＩＸからの活性化ペプチドの切除をもたらし、１つまたは複数のジスルフィド結合によって保持される２つの鎖を含む活性ＦＩＸ分子を産生する、ＦＸＩａによって生じる。ＦＩＸの欠損は、Ｘ連鎖血友病Ｂの原因である。

血友病ＡおよびＢはそれぞれ、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸポリペプチドの欠損を特徴とする遺伝性疾患である。欠損の根本的な原因は、頻繁に、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ遺伝子の突然変異の結果であり、それらの両方は、Ｘ染色体上に位置する。血友病に対する従来の療法は、しばしば、正常の個人からのプール血漿または半精製された凝固タンパク質の静脈内投与を伴う。これらの調製は、感染性プリオン、ＨＩＶ、パルボウイルス、Ａ型肝炎、およびＣ型肝炎等の病原体またはウイルスによって汚染される可能性がある。したがって、ヒト血清の使用を必要としない治療薬に対する緊急の必要性が存在する。

ＦＩＸ活性の減少レベルは、血友病Ｂの重症度に直接比例する。血友病Ｂの現在の治療は、血漿由来または組換えＦＩＸ（ＦＩＸ置換または交換治療もしくは療法と称される）による、不足したタンパク質の交換から成る。

ＦＩＸのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ００７４０、米国特許第６，５３１，２９８号、および図１において見出すことができる。

第ＶＩＩＩ因子
凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、非常に低い濃度で血漿中を循環し、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）に非共有結合する。止血中、ＦＶＩＩＩは、ＶＷＦから分離され、カルシウムおよびリン脂質、または細胞膜の存在下で、活性化の速度を強化させることによって、活性第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）媒介のＦＸ活性化のための補因子として機能する。

ＦＶＩＩＩは、ドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を有する、約２７０〜３３０ｋＤの単鎖前駆体として合成される。血漿（例えば、「血漿由来」または「血漿性」）から精製されるとき、ＦＶＩＩＩは、重鎖（Ａ１−Ａ２−Ｂ）および軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）から成る。軽鎖の分子質量は、８０ｋＤであり、Ｂドメイン内のタンパク質分解により、重鎖は、９０〜２２０ｋＤの範囲内である。

ＦＶＩＩＩはまた、出血性障害における治療用途のための組換えタンパク質として合成される。種々の生体内アッセイは、治療薬物としての組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の潜在的有効性を決定するために考案されている。これらのアッセイは、内在性ＦＶＩＩＩの生体内効果を模倣する。ＦＶＩＩＩのin vitroトロンビン治療は、in vitroアッセイによって測定される、その凝固促進活性の迅速な増加およびその後の減少をもたらす。この活性化および不活性化は、例えば、ＦＶＩＩＩをＶＷＦから解離させ、かつリン脂質表面に結合させて、異なる結合エピトープの有効性を調整するか、またはある特定のモノクローナル抗体への結合能力を調整する、重鎖および軽鎖の両方における特定の制限されたタンパク質分解と一致する。

ＦＶＩＩＩの欠如および機能不全は、最も頻度の高い出血性障害である血友症Ａと関連する。血友症Ａの管理のための治療選択は、血漿由来、またはｒＦＶＩＩＩ濃縮物を用いる交換療法である。１％以下のＦＶＩＩＩレベルを有する重度の血友症Ａを罹患する患者は、一般に、ＦＶＩＩＩを用量との間で１％以上に維持することを目的とする予防療法を受けている。循環血中の種々のＦＶＩＩＩ生成物の平均半減期を考慮すると、この結果は、通常、ＦＶＩＩＩを週に２〜３回投与することによって達成することができる。

参照ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列としては、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ００４５１（ＦＡ８＿ＨＵＭＡＮ）、Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｇｅｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２（５９９２）：３２６−３０（１９８４）、Ｖｅｈａｒ ＧＨ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２（５９９２）：３３７−４２（１９８４）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＡＲ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ，２００３：２９；１１−２９（２００２）が挙げられる。

フォンヴィレブランド因子
フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、約５００〜２０，０００ｋＤの範囲のサイズの一連の多量体として血漿中を循環する糖タンパク質である。ＶＷＦの多量体形態は、ジスルフィド結合によって相互に連結された２５０ｋＤのポリペプチドサブユニットから成る。ＶＷＦは、損傷した血管壁の内皮下層への初期血小板粘着を媒介する。より大きな多量体のみが止血活性を呈する。内皮細胞は大きいポリマー形態のＶＷＦを分泌し、低分子重量を有するＶＷＦの形態（低分子重量のＶＷＦ）はタンパク質分解開裂から生じることが想定されている。高分子質量を有する多量体は、内皮細胞のバイベルパラーデ小体内に保管され、刺激時に遊離される。

ＶＷＦは、大部分の反復ドメインから成るプレプロＶＷＦとして内皮細胞および巨核球によって合成される。シグナルペプチドの開裂時に、プロＶＷＦは、そのＣ末端領域においてジスルフィド連結を介して二量体化する。二量体は、多量体化のためのプロトマーとして機能し、それは、遊離と末端の間のジスルフィド連結によって支配される。多量体へのアセンブリの後、プロペプチド配列のタンパク質分解除去が続く（Ｌｅｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７４（１９９１），２５７−２６１）。

ＶＷＦのクローン化ｃＤＮＡから予測される一次翻訳生成物は、２８１３残基の前駆体ポリペプチド（プレプロＶＷＦ）である。プレプロＶＷＦは、２２個のアミノ酸シグナルペプチドおよび７４１個のアミノ酸プロペプチドから成り、成熟ＶＷＦは２０５０個のアミノ酸を含む（Ｒｕｇｇｅｒｉ Ｚ．Ａ．，ａｎｄ Ｗａｒｅ，Ｊ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，３０８−３１６（１９９３）。

ＶＷＦの欠損は、ほぼ顕著な出血性表現型を特徴とする、フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）の原因である。３型ＶＷＤは、ＶＷＦが完全に欠損している最も重度な形態であり、１型ＶＷＤは、ＶＷＦの量的減少に関連し、その表現型は、非常に軽度である可能性がある。２型ＶＷＤは、ＶＷＦの質的欠損に関連し、３型ＶＷＤと同様の重度である可能性がある。２型ＶＷＤは、多くの亜種形態を有し、そのうちのいくつかは、高分子重量の多量体の損失または減少に関連する。２ａ型フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ−２Ａ）は、中間体および大きい多量体の両方の損失を特徴とする。ＶＷＤ−２Ｂは、最も高い分子重量の多量体の損失を特徴とする。ＶＷＦに関連する他の疾患および障害は、当該技術分野において既知である。

プレプロＶＷＦのポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００５５２およびＮＰ＿０００５４３で入手可能である。

本発明に従う他の血液凝固タンパク質は、例えば、Ｍａｎｎ ＫＧ，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ，１９９９；８２：１６５−７４の当該技術分野において説明されている。

Ｃ．血液凝固タンパク質の産生
血液凝固タンパク質の産生は、（ｉ）遺伝子操作による組換えＤＮＡの産生、（ｉｉ）例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションによる（これらに限定されない）原核細胞または真核細胞への組換えＤＮＡの導入、（ｉｉｉ）形質転換細胞のインキュベーション、（ｉｖ）例えば、構造的に、または誘導時の血液凝固タンパク質の発現、および（ｖ）精製された血液凝固タンパク質を得るために、例えば、培養培地から、または形質転換細胞を収集することによる血液凝固タンパク質の単離のための、当該技術分野において既知の任意の方法を含む。

他の態様では、血液凝固タンパク質は、薬理学的に許容される血液凝固タンパク質分子を産生することによって特徴付けられる好適な原核または真核宿主系内の発現によって産生される。真核細胞の例は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２等の哺乳類細胞である。

多種多様なベクターが血液凝固タンパク質の調製に使用され、真核および原核発現ベクターから選択される。原核発現のためのベクターの例としては、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、およびｐＢＡＤ等のプラスミドが挙げられるが、これらに限定されず、原核発現ベクターに使用されるプロモーターは、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、またはａｒａＢＡＤのうちの１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。真核発現のためのベクターの例としては、（ｉ）酵母における発現では、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、またはＡＵＧ１等に制限されないプロモーターを使用する、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、またはｐＭＥＴ等が挙げられるが、これらに限定されないベクター、（ｉｉ）昆虫細胞における発現では、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、またはｐｏｌｈ等のプロモーターを使用する、ｐＭＴ、ＰＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、またはｐＢＡＣ等に限定されないベクター、および（ｉｉｉ）哺乳類細胞における発現では、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、またはｐＢＰＶ等に限定されないベクター、および一態様では、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびβ−アクチン等に制限されないプロモーターを使用する、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルス等に限定されないウイルス系に由来するベクターが挙げられる。

Ｄ．投与
一実施形態では、本発明の共役された血液凝固タンパク質は、静脈内、筋肉内、または腹腔内注入等の注入によって投与されてもよい。

本発明の血液凝固タンパク質を含む共役組成物を、ヒトまたは試験動物に投与するために、一態様では、組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む。「薬学的に」または「薬理学的に許容される」という用語は、安定し、凝集および開裂生成物等のタンパク質分解を阻害し、加えて、下記に説明するとおり、当該技術分野において公知の経路を使用して投与されるとき、アレルギー反応または他の有害反応を産生しない分子的実体および組成物を指す。「薬学的に許容される担体」は、上記に開示する薬剤を含む、任意の、かつすべての臨床的に有用な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに同等物を含む。

本明細書に使用するとき、「有効量」は、本明細書に説明する出血性障害を有する哺乳類を治療するために好適な用量を含む。

組成物は、経口的、局所的、経皮的、非経口的、吸引スプレーによって、経膣的、経直腸的、または頭蓋内注入によって、投与されてもよい。本明細書に使用するとき、非経口という用語は、皮下注入、静脈内注入、筋肉内注入、嚢内注入、または点滴技術を含む。特定の部位における静脈内、皮下、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、球後、肺内注入、または外科的移植による投与もまた、意図される。一般に、組成物には、実質的に発熱物質、ならびに受容者に有害である可能性がある他の不純物がない。

組成物の単一または複数の投与は、治療する医師によって選択される用量レベルまたはパターンで実行することができる。疾患の予防または治療では、適切な投与量は、上述のとおり、治療される疾患の種類、疾患の重症度および経過、薬物が予防または治療目的のために投与されているか、以前の療法、患者の病歴および薬物への反応、ならびに担当医の判断に左右される。

本発明はまた、本明細書に定義する有効量の共役された血液凝固タンパク質を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物はさらに、薬学的に許容される担体、希釈剤、塩、緩衝液、または賦形剤を含んでもよい。薬学的組成物は、上記に定義する出血性障害を治療するために使用することができる。本発明の薬学的組成物は、溶液または凍結乾燥された生成物であってもよい。薬学的組成物の溶液は、任意の好適な凍結乾燥プロセスに供してもよい。

さらなる態様として、本発明は、対象に投与するためのその使用を促進する方法で梱包された本発明の組成物を含むキットを含む。一実施形態では、かかるキットは、本明細書に説明する化合物または組成物（例えば、共役された血液凝固タンパク質を含む組成物）を含み、それは密封ボトルまたは器等の容器に梱包され、その容器にはラベルが貼られているか、または方法を実践する上での化合物または組成物の使用を説明するパッケージに含まれる。一実施形態では、キットは、共役された血液凝固タンパク質を含む組成物を有する第１の容器、および第１の容器内の組成物のための生理的に許容される再構成溶液を有する第２の容器を含有する。一態様では、化合物または組成物は、単位用量形態で梱包される。キットはさらに、具体的な投与経路に従い組成物を投与するための好適な装置を含んでもよい。好ましくは、キットは、治療的タンパク質またはペプチド組成物の使用を説明するラベルを含有する。

水溶性ポリマー
一態様では、提供される血液凝固タンパク質誘導体（すなわち、共役された血液凝固タンパク質）分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）が挙げられるが、これらに限定されない、水溶性ポリマーに結合する。本発明の一実施形態では、水溶性ポリマーは、３５０〜１２０，０００、５００〜１００，０００、１０００〜８０，０００、１５００〜６０，０００、２，０００〜４５，０００Ｄａ、３，０００〜３５，０００Ｄａ，および５，０００〜２５，０００Ｄａの範囲の分子重量を有する、シアル酸分子から成る。水溶性ポリマーの結合は、タンパク質への直接結合によって、またはリンカー分子を介して実行することができる。化学的リンカーの一例は、炭水化物−選択的ヒドラジドおよびスルフヒドリル反応マレイミド基を含有する、ＭＢＰＨ（４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酪酸ヒドラジド）である（Ｃｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９２；２６７：１５９１６−２２）。他の例示的および好ましいリンカーは、下記に説明される。

一実施形態では、誘導体は、天然の治療的血液凝固タンパク質生成物の完全な機能活性を保持し、天然の治療的血液凝固タンパク質生成物と比較して、延長した生体内半減期を提供する。別の実施形態では、誘導体は、天然の血液凝固タンパク質に対して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６，５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０パーセント（％）の生物学的活性を保持する。関連する態様では、誘導体および天然の血液凝固タンパク質の生物学的活性は、血液凝固因子抗原値に対する色原体活性の割合（血液凝固因子：Ｃｈｒ：血液凝固因子：Ａｇ）によって決定される。本発明のさらに別の実施形態では、構築物の半減期は、天然の血液凝固タンパク質の生体内半減期に対して、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍減少または増大する。

Ａ．シアル酸およびＰＳＡ
本明細書に使用するとき、「シアル酸部分」は、水性溶液または懸濁液中で可溶性であり、薬学的に有効量のＰＳＡ−血液凝固タンパク質複合体の投与時に、哺乳類への副作用等の悪影響がわずか、または全くない、シアル酸モノマーまたはポリマー（「多糖類」）を含む。一態様では、ポリマーは、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、または５００個のシアル酸単位を有することを特徴とする。ある特定の態様では、異なるシアル酸単位が鎖に組み込まれる。

本発明の一実施形態では、多糖化合物のシアル酸部分は、非常に親水性であり、別の実施形態では、全化合物は、非常に親水性である。親水性は、主に、シアル酸単位のペンダントカルボキシル基、ならびにヒドロキシル基によって与えられる。サッカリド単位は、アミン基、ヒドロキシル基、または硫酸基等の他の官能基、またはその組み合わせを含有してもよい。これらの基は、自然発生のサッカリド化合物上に存在してもよいか、または誘導体多糖化合物中に導入されてもよい。

自然発生するポリマーＰＳＡは、広域な大きさの分布（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃ−５７６２）、および高い多分散性（ＰＤ）を示す、多分散調製物として使用可能である。多糖類は通常、共精製する内毒素の特有のリスクを持つ細菌内で産生されるため、長いシアル酸ポリマー鎖の精製は、内毒素含有量の増大の可能性を上げる場合がある。１〜４個のシアル酸単位を有する短いＰＳＡ分子はまた、合成的に調製することができ（Ｋａｎｇ ＳＨ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２２７−８、Ｒｅｓｓ ＤＫ ａｎｄ Ｌｉｎｈａｒｄｔ ＲＪ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．２００４；１：３１−４６）、したがって、高い内毒素レベルのリスクを最小限化させる。しかしながら、ここで、内毒素もない、狭い大きさの分布および低い多分散性を有するＰＳＡ調製物を製造することができる。一態様では、本発明のための特定の使用の多糖化合物は、細菌によって産生された多糖化合物である。これらの自然発生の多糖類のうちのいくつかは、糖脂質として知られている。一実施形態では、多糖化合物には、実質的に、末端ガラクトース単位がない。

Ｂ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＥＧ化
ある特定の態様では、血液凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸ、または他の血液凝固因子分子は、種々の化学的方法のいずれかによって、水溶性ポリマーに共役される（Ｒｏｂｅｒｔｓ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ ２００２；５４：４５９−７６）。例えば、一実施形態では、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、またはＦＩＸは、ＰＥＧの共役によって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを使用して、タンパク質の遊離アミノ基に修飾される。別の実施形態では、水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧは、マレインイミド化学、または前酸化後に、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、もしくはＦＩＸの炭水化物部分へのＰＥＧヒドラジドもしくはＰＥＧアミンの結合を使用して、遊離ＳＨ基に結合される。

一態様では、共役は、水溶性ポリマーの直接結合（またはリンカー系を介する結合）によって、安定結合の形成下で、血液凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、またはＦＩＸに対して実行される。分解性に加えて、放出性または加水分解性リンカー系が本発明のある特定の態様に使用される（Ｔｓｕｂｅｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４；２７９：３８１１８−２４／Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９９９；４２：３６５７−６７／Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ ２００６；１７：３４１−５１／国際公開第２００６／１３８５７２Ａ２号／米国特許第７２５９２２４Ｂ２号／米国特許第７０６０２５９Ｂ２号）。

本発明の一実施形態では、血液凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、またはＦＩＸは、コハク酸スクシンイミジル、グルタル酸スクシンイミジル、またはプロピオン酸スクシンイミジル等のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含有するポリエチレングリコール誘導体の使用によって、リジン残基を介して修飾される。これらの誘導体は、安定アミド結合を形成することによって、温和な条件下で、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、またはＦＩＸのリジン残基と反応する。本発明の一実施形態では、ＰＥＧ誘導体の鎖長は、５，０００Ｄａである。直鎖および分岐構造を含む、５００〜２，０００Ｄａ、２，０００〜５，０００Ｄａ、５，０００以上〜最大１０，０００Ｄａ、または１０，０００以上〜最大２０，０００Ｄａ、または２０，０００以上〜最大１５０，０００Ｄａの鎖長を有する他のＰＥＧ誘導体が、種々の実施形態に使用される。

アミノ基のＰＥＧ化のための代替の方法としては、ウレタン結合を形成することによるＰＥＧカルボン酸での化学的共役、または二級アミド結合を形成する還元アミノ化によるアルデヒドもしくはケトンとの反応が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の一実施形態では、血液凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸ、または他の血液凝固因子、分子は、市販されるＰＥＧ誘導体を使用して化学修飾される。代替的態様におけるこれらのＰＥＧ誘導体は、直鎖または分岐構造を有する。ＮＨＳ基を含有するＰＥＧ誘導体の例は、下記に列挙される。

以下のＰＥＧ誘導体は、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．、ｗｗｗ．ｎｅｋｔａｒ．ｃｏｍ／ＰＥＧ試薬カタログ；Ｎｅｋｔａｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ、価格表２００５〜２００６を参照）から市販されるＰＥＧ誘導体の非制限的な例である：
ｍＰＥＧ−プロピオン酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）

ｍＰＥＧ−スクシンイミジルα−メチルブタノアート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）

ｍＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳ（ＣＭ＝カルボキシメチル；ＨＢＡ＝ヒドロキシ酪酸）

分岐ＰＥＧ誘導体（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の構造：
分岐ＰＥＧ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）

分岐構造を有するこの試薬は、Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２００１；５：４１９−２９）によって、より詳細に説明されている。

ＰＥＧ誘導体の他の非制限的例は、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ；ｗｗｗ．ｎｏｆ．ｃｏ．ｊｐ／ｅｎｇｌｉｓｈ：カタログ２００５を参照）から市販されている。
直鎖ＰＥＧ誘導体（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．）の一般構造：

Ｘ＝カルボキシメチル

Ｘ＝カルボキシペンチル

Ｘ＝コハク酸

Ｘ＝グルタル酸

分岐ＰＥＧ誘導体（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．）の構造：２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（１，５−ジオキソ−５−スクシンイミジルオキシ、ペンチルオキシ）プロパン

２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（スクシンイミジルカルボキシペンチルオキシ）プロパン

これらのプロパン誘導体は、１，２置換パターンを有するグリセロール主鎖を示す。本発明では、１，３置換を有するグリセロール構造、または米国特許第２００３／０１４３５９６Ａ１号に説明される他の分岐構造に基づく分岐ＰＥＧ誘導体もまた、意図される。

Ｔｓｕｂｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４；２７９：３８１１８−２４）、およびＳｈｅｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（国際公開第０４０８９２８０Ａ３号）によって説明される、分解性を有するＰＥＧ誘導体（例えば、加水分解性リンカー）もまた、意図される。

驚くべきことに、本発明のＰＥＧ化されたＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸ、または他の血液凝固因子は、延長した生体内半減期と組み合わせて、機能活性を呈する。加えて、ＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸ、または他の血液凝固因子は、トロンビン不活性化に対してより耐性であるように思える。

Ｃ．付着方法
血液凝固タンパク質は、当業者に既知の種々の技術のいずれかによって、多糖化合物に共有連結され得る。本発明の種々の態様では、シアル酸部分は、例えば、米国特許第４，３５６，１７０号に説明される方法（参照により、本明細書に組み込まれる）によって、血液凝固タンパク質、例えば、ＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、またはＶＷＦに結合される。

ＰＳＡをポリペプチドに結合するための他の技術はまた、既知であり、本発明によって意図される。例えば、米国公開第２００７／０２８２０９６号は、例えば、ＰＳＡのアミンまたはヒドラジド誘導体をタンパク質に共役させることを説明する。加えて、米国公開第２００７／０１９１５９７号は、還元末端において基質（例えば、タンパク質）との反応のためのアルデヒド基を含有するＰＳＡ誘導体を説明する。これらの参照文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

種々の方法が米国特許第５，８４６，９５１号の７列、１５行〜８列、５行に開示される（参照によりその全体が組み込まれる）。例示的な技術は、血液凝固タンパク質または多糖のうちのいずれかの上のカルボキシル基と、血液凝固タンパク質または多糖のアミン基との間のペプチド結合、または血液凝固タンパク質または多糖のカルボキシル基と、血液凝固タンパク質または多糖のヒドロキシル基との間のエステル連結を介する連結を含む。血液凝固タンパク質が多糖化合物に共有結合される、別の連結は、過ヨウ素酸塩酸化によって多糖の非還元末端において形成されたアルデヒド基と反応させられる血液凝固タンパク質上の遊離アミノ基の間のシッフ塩基を介する（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ＨＪ ａｎｄ Ｌｕｇｏｗｓｋｉ Ｃ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８１；１２７：１０１１−８；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ＡＩ ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ Ｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９７；１３４１；２６−３４）。一態様では、生成されたシッフ塩基は、ＮａＣＮＢＨ３での特異的還元によって安定化され、二級アミンを形成する。代替の方法は、前酸化後のＮＨ_４Ｃｌでの還元アミノ化によるＰＳＡ内の末端遊離アミノ基の生成である。二官能性試薬を２つのアミノ基または２つのヒドロキシル基を連結するために使用することができる。例えば、アミノ基を含有するＰＳＡは、ＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸／Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）等の試薬で、タンパク質のアミノ基に結合される。加えて、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−ε−マレインイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル／Ｐｉｅｒｃｅ）等のヘテロ二官能性架橋連結試薬を使用して、例えば、アミン基およびチオール基を連結する。

別の方法では、ＰＳＡヒドラジドが、前酸化、およびアルデヒド官能基の生成の後に調製され、タンパク質の炭水化物部分に連結される。

上述のとおり、治療的タンパク質の遊離アミン基は、シアル酸残基の１−カルボキシル基と反応してペプチド結合を形成するか、またはエステル連結が１−カルボキシル酸基と血液凝固タンパク質上のヒドロキシルまたは他の好適な活性基との間に形成される。代替的には、カルボキシル基は、脱アセチル化５−アミノ基とのペプチド連結を形成するか、または血液凝固タンパク質の分子のアルデヒド基は、シアル酸残基のＮ−脱アセチル化５−アミノ基を有するシッフ塩基を形成する。

代替的には、多糖化合物は、非共有方法で血液凝固タンパク質と会合する。例えば、一態様では、多糖化合物および薬学的に活性化合物は、疎水性相互作用を介して連結される。他の非共有会合は、相互に求引する逆帯電されたイオンでの静電相互作用を含む。

種々の実施形態では、血液凝固タンパク質は、化学量論量（例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：７、１：８、１：９、または１：１０等）の多糖化合物に連結、または会合される。種々の実施形態では、１〜６、７〜１２、または１３〜２０の多糖類が血液凝固タンパク質に連結される。さらに別の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の多糖類が血液凝固タンパク質に連結される。

種々の実施形態では、血液凝固タンパク質は、修飾されて、グリコシル化部位（すなわち、天然のグリコシル化部位以外の部位）に導入される。かかる修飾は、当該技術分野において既知の標準分子生物学的技術によって達成されてもよい。その上、１つまたは複数の炭水化物部分を介する水溶性ポリマーへの共役前に、血液凝固タンパク質は、生体内または生体外でグリコシル化されてもよい。これらのグリコシル化部位は、水溶性ポリマーとのタンパク質の共役のための標的として機能することができる（米国特許出願第２００９００２８８２２号、米国特許出願第２００９／００９３３９９号、米国特許出願第２００９／００８１１８８号、米国特許出願第２００７／０２５４８３６号、米国特許出願第２００６／０１１１２７９号、およびＤｅＦｒｅｅｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，１６，９，８３３−４３）。

Ｄ．アミノオキシ連結
本発明の一実施形態では、オキシム基を形成するための、アルデヒド（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後の炭水化物部分上）とのヒドロキシルアミンまたはヒドロキシアミン誘導体の反応が、血液凝固タンパク質の複合体の調製に適用される。例えば、糖タンパク質（例えば、本発明に従う血液凝固タンパク質）は、まず、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）等の酸化剤で酸化される（Ｒｏｔｈｆｕｓ ＪＡ ｅｔ Ｓｍｉｔｈ ＥＬ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９６３，２３８，１４０２−１０、およびＶａｎ Ｌｅｎｔｅｎ Ｌ ａｎｄ Ａｓｈｗｅｌｌ Ｇ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９７１，２４６，１８８９−９４）。糖タンパク質の過ヨウ素酸塩酸化は、１９２８年のｔｈｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｃｉｎａｌ ｄｉｏｌｓ ｗｉｔｈ ｐｅｒｉｏｄａｔｅ ｔｏ ｆｏｒｍ ａｎ ａｃｔｉｖｅ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐ（Ｍａｌａｐｒａｄｅ Ｌ．，Ａａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｂｕｌｌ Ｓｏｃ Ｃｈｉｍ Ｆｒａｎｃｅ，１９２８，４３，６８３−９６）に説明された古典的マラプラード反応に基づく。かかる酸化剤のさらなる例は、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）_４）、酢酸マンガン（ＭｎＯ（Ａｃ）_３）、酢酸コバルト（Ｃｏ（ＯＡｃ）_２）、酢酸タリウム（ＴｌＯＡｃ）、硫酸セリウム（Ｃｅ（ＳＯ_４）_２）（米国特許第４，３６７，３０９号）、または過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ_４）（Ｍａｒｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １９９７，１１９，１２６６１−２）である。「酸化剤」とは、炭水化物中の隣接ジオールを酸化し、それによって、生理学的反応条件下で、活性アルデヒド基を生成することが可能な温和な酸化化合物を意味する。

第２のステップは、オキシム連結を形成するための、酸化炭水化物部分へのアミノオキシ基を含有するポリマーの結合である。本発明の一実施形態では、このステップは、触媒量の求核触媒アニリンまたはアニリン誘導体の存在下で実施することができる（Ｄｉｒｋｓｅｎ Ａ ｅｔ Ｄａｗｓｏｎ ＰＥ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００８；Ｚｅｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９；６：２０７−９）。アニリン触媒は、オキシムライゲーションを著しく加速させ、非常に低い濃度の試薬の使用を可能にする。本発明の別の実施形態では、オキシム連結は、ＮａＣＮＢＨ_３での還元により安定化され、アルコキシアミン連結を形成する（図２）。

本発明の一実施形態では、水溶性ポリマーを血液凝固タンパク質に共役させるための反応ステップは、別個に、かつ順次実施され（すなわち、出発材料（例えば、血液凝固タンパク質、水溶性ポリマー等））、試薬（例えば、酸化剤、アニリン等）、および反応性生物（例えば、血液凝固タンパク質上の酸化炭水化物、活性化アミノオキシ水溶性ポリマー等）は、個々の反応ステップの間で分離される）。

アミノオキシ技術についてのさらなる情報は、以下の参照文献で確認することができ、それらのそれぞれは、その全体が組み込まれる：欧州特許第１６８１３０３Ａ１号（ＨＡＳ化エリスロポエチン）、国際公開第２００５／０１４０２４号（オキシム連結基によって連結されるポリマーおよびタンパク質の複合体）、国際公開第９６／４０６６２号（アミノオキシ含有リンカー化合物、およびそれらの複合体における用途）、国際公開第２００８／０２５８５６号（修飾タンパク質）、Ｐｅｒｉ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９８，５４，１２２６９−７８、Ｋｕｂｌｅｒ−Ｋｉｅｌｂ Ｊ ｅｔ．Ｐｏｚｓｇａｙ Ｖ．，Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ２００５，７０，６８８７−９０；Ｌｅｅｓ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２００６，２４（６），７１６−２９、およびＨｅｒｅｄｉａ ＫＬ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｅｃｕｌｅｓ ２００７，４０（１４），４７７２−９。

本発明の種々の実施形態では、本明細書に説明するアミノオキシ技術に従い、血液凝固タンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、またはＦＩＸ）の酸化炭水化物部分に連結される水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。

以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態を制限するものではなく、例示目的のみである。

（実施例１）
ホモ二官能性リンカーＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_２ＯＮＨ_２の調製
ホモ二官能性リンカーＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_２ＯＮＨ_２

２つの活性アミノオキシ基を含有する（３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン）を、一級アミンの修飾ガブリエル合成を採用する２ステップ有機反応で、Ｂｏｔｕｒｙｎ ｅｔ ａｌ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９７；５３：５４８５−９２）に従い合成した（図３）。第１のステップでは、２，２−クロロジエチルエーテルの１つの分子を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のエンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドの２つの分子と反応させた。所望のホモ二官能性生成物を、エタノール中のヒドラジン分解によって、得られる中間体から調製した。

（実施例２）
ホモ二官能性リンカーＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_４ＯＮＨ_２の調製
ホモ二官能性リンカーＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_４ＯＮＨ_２

２つの活性アミノオキシ基を含有する（３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミン）を、一級アミンの修飾ガブリエル合成を採用する２ステップ有機反応で、Ｂｏｔｕｒｙｎ ｅｔ ａｌ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９７；５３：５４８５−９２）に従い合成した（図３）。第１のステップでは、ビス−（２−（２−クロロエトキシ）−エチル）−エーテルの１つの分子を、ＤＭＦ中のエンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドの２つの分子と反応させた。所望のホモ二官能性生成物を、エタノール中のヒドラジン分解によって、得られる中間体から調製した。

（実施例３）
アミノオキシ−ＰＳＡの調製
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａ）から得た５００ｍｇの酸化ＰＳＡ（分子量＝１８．８ｋＤ）を、８ｍＬの５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５中に溶解した。次に、１００ｍｇの３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを添加した。室温で、２時間、振とうした後、４４ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。４℃で、さらに４時間、振とうした後、反応混合物を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｌｄ，ＩＬ）透析カセット（３．５ｋＤの膜、再生成セルロース）に装填し、４日間、ＰＢＳ ｐＨ７．２に対して透析した。生成物を、−８０℃で凍結した。本手順に従うアミノオキシ−ＰＳＡの調製を、図４に示す。

アミノオキシＰＳＡ調製のための代替的手順
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａ）から得た１０００ｍｇの酸化ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）を、１６ｍＬの５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解した。次いで、１７０ｍｇの３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを、反応混合物に与えた。室温で、２時間、振とうした後、７８．５ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、反応を、一晩、１８時間実行した。次いで、反応混合物を、再生成されたセルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から作製された５ｋＤのカットオフを有する膜を使用して、限外ろ過／ダイアろ過手順（ＵＦ／ＤＦ）に供した。

（実施例４）
ｒＦＩＸへのアミノオキシ−ＰＳＡの結合、および複合体の精製
６．３ｍＬの５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解した、１２．６ｍｇのｒＦＩＸに、２８９μＬの水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１０ｍＭ）を添加した。混合物を、４℃で、１時間、暗室で、振とうし、６．５μＬの１Ｍのグリセロールの添加によって、室温で、１５分間、反応停止処理をした。低分子重量の不純物を、ビバスピン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）濃縮器（３０ｋＤの膜、再生成セルロース）を採用する限外ろ過／ダイアろ過手順（ＵＦ／ＤＦ）によって除去した。次に、４３ｍｇのアミノオキシ−ＰＳＡを、ＵＦ／ＤＦ残余分に添加し、混合物を、４℃で、１８時間、振とうした。過剰なＰＳＡ試薬を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって除去した。冷却した反応混合物の伝導率を、１８０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３Ｍの塩化ナトリウム、６．７ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化した５ｍＬのＨｉＴｒａｐブチルＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）ＨＩＣカラム（１．６×２．５ｃｍ）上に装填した。複合体を、５ｍＬ／分の流量で、２．４カラム体積（ＣＶ）で、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６．７ｍＭの塩化カルシウム、０．００５％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４で溶出した。調製物を、総タンパク質（ＢＣＡ）およびＦＩＸ色原体活性を測定することによって分析的に特徴付けた。ＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体に対して、８０．２ＩＵ／ｍｇのタンパク質の特異的活性を決定した（天然ｒＦＩＸと比較して５６．４％）。結果を、表１に要約する。

クマシー染色でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体の分析的特長付けを図５に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の、抗ＦＩＸおよび抗ＰＳＡ抗体を用いるウエスタンブロットを図６に示す。

（実施例５）
求核触媒としてのアニリンの存在下でのｒＦＩＸへのアミノオキシ−ＰＳＡの結合
１．４ｍＬの５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解した、３．０ｍｇのｒＦＩＸに、１４．１μＬの水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１０ｍＭ）を添加した。混合物を、４℃で、１時間、暗室で、振とうし、１．５μＬの１Ｍのグリセロールの添加によって、室温で、１５分間、反応停止処理をした。低分子重量の不純物を、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）を用いる、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって除去した。１．３３ｍＬの５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解した、１．２ｍｇの酸化ｒＦＩＸを、７０μＬのアニリン（２００ｍＭの水性貯蔵溶液）と混合し、室温で、４５分間、振とうした。次に、４．０ｍｇのアミノオキシ−ＰＳＡを添加し、混合物を、室温で、２時間、４℃で、さらに１６時間振とうした。サンプルを、１時間後、２時間後、および１８時間後の反応の最後に引き出した。次に、過剰のＰＳＡ試薬および遊離ｒＦＩＸを、ＨＩＣによって除去した。冷却した反応混合物の伝導率を、１８０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３Ｍの塩化ナトリウム、６．７ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化した５ｍＬのＨｉＴｒａｐブチルＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）ＨＩＣカラム（１．６×２．５ｃｍ）上に装填した。複合体を、５ｍＬ／分の流量で、２０ＣＶで、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６．７ｍＭの塩化カルシウム、０．００５％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４に対して直線勾配で溶出した。

（実施例６）
ｒＦＩＸへのアミノオキシ−ＰＳＡの結合、およびＮａＣＮＢＨ_３での還元
５．２５ｍＬの５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解した、１０．５ｍｇのｒＦＩＸに、５３μＬの水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１０ｍＭ）を添加した。混合物を、４℃で、１時間、暗室で、振とうし、５．３μＬの１Ｍのグリセロールの添加によって、室温で、１５分間、反応停止処理をした。低分子重量の不純物を、ビバスピン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）濃縮器（３０ｋＤの膜、再生成セルロース）を用いるＵＦ／ＤＦによって除去した。次に、３５．９ｍｇのアミノオキシ−ＰＳＡを、ＵＦ／ＤＦ残余分に添加し、混合物を、室温で、２時間、振とうした。次いで、５３μＬの水性シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（５Ｍ）を添加し、反応を、さらに１６時間進行させた。次いで、過剰なＰＳＡ試薬を、ＨＩＳによって除去した。冷却した反応混合物の伝導率を、１８０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３Ｍの塩化ナトリウム、６．７ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化した５ｍＬのＨｉＴｒａｐブチルＦＦ ＨＩＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）カラム（１．６×２．５ｃｍ）上に装填した。複合体を、５ｍＬ／分の流量で、２．４ＣＶ内で、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６．７ｍＭの塩化カルシウム、０．００５％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４で溶出した。

（実施例７）
ｒＦＩＸへのアミノオキシ−ＰＳＡ（リンカー：ＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_４ＯＮＨ_２）の結合、および複合体の精製
２．８ｍＬの５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解した、５．６ｍｇのｒＦＩＸに、１０２μＬの過ヨウ素酸ナトリウムの水溶液（１０ｍＭ）を添加した。混合物を、４℃で、１時間、暗室で、振とうし、２．９μＬの１Ｍのグリセロールの添加によって、室温で、１５分間、反応停止処理をした。低分子重量の不純物を、ビバスピン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）濃縮器（３０ｋＤの膜、再生成セルロース）を用いるＵＦ／ＤＦによって除去した。次いで、１９ｍｇのアミノオキシ−ＰＳＡを、ＵＦ／ＤＦ残余分に添加し、混合物を、４℃で、１８時間、振とうした。過剰なＰＳＡ試薬を、ＨＩＣによって除去した。冷却した反応混合物の伝導率を、１８０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３Ｍの塩化ナトリウム、６．７ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化した５ｍＬのＨｉＴｒａｐブチルＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）ＨＩＣカラム（１．６×２．５ｃｍ）上に装填した。複合体を、５ｍＬ／分の流量で、２．４ＣＶ内で、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６．７ｍＭの塩化カルシウム、０．００５％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４で溶出した。

（実施例８）
ｒＦＶＩＩＩへのアミノオキシ−ＰＳＡの結合
１１ｍＬのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ６（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ）中に溶解した、１１ｍｇのｒＦＶＩＩＩに、５７μＬの１０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムを添加した。混合物を、４℃で、３０分間、暗室で、振とうし、１０７μＬの１Ｍのグリセロール水溶液の添加によって、４℃で３０分間反応停止処理をした。次いで、１９．８ｍｇのアミノオキシ−ＰＳＡ（１８．８ｋＤ）を添加し、混合物を、４℃で、一晩、振とうした。イオン強度を、８Ｍの酢酸アンモニウム（８Ｍの酢酸アンモニウム、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、３５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液の添加によって増大して、最終濃度の２．５Ｍの酢酸アンモニウムを得た。次に、反応混合物を、ＨｉＴｒａｐブチルＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）カラム上に装填し、平衡緩衝液（２．５Ｍの酢酸アンモニウム、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、３５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９）で平衡化した。生成物を、溶出緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４）で溶出し、溶出物を、３０，０００ＭＷＣＯを有するビバスピン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）デバイスを使用する遠心ろ過によって濃縮した。

（実施例９）
血友病マウスにおけるＰＫの試験
ＦＩＸ欠損マウスに、１０ｍＬ／ｋｇの体重の体積用量の製剤緩衝液（１０ｍＭのヒスチジン、２６０ｍＭのグリシン、２９ｍＭのスクロース、０．００５％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．８）中のｒＦＩＸまたはＰＳＡ−ｒＦＩＸ（実施例４に従い調製）のいずれかを注入した。６匹のマウスのグループを、物質注射の５分後、３時間後、９時間後、１６時間後、２４時間後、および４８時間後に安楽死させ、血液を心臓穿孔によって収集した。クエン酸血漿を調製し、ＦＩＸ活性の分析まで冷凍保存した。

ＦＩＸ活性を、色原体ＦＩＸアッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＩＸアッセイ、Ｈｙｐｈｅｎ Ｂｉｏｍｅｄ，Ｎｅｕｖｉｌｌｅ−ｓｕｒ−Ｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で決定し、抽出曲線を構築した（図７）。実際のＦＩＸ活性用量は、ＰＳＡ−ｒＦＩＣでは、１２３ＩＵ ＦＩＸ／ｋｇであり、ｒＦＩＸでは１４３ＩＵ ＦＩＸ／ｋｇであった。薬物動態パラメータを、プログラムＲ（ｔｈｅ Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，２００８）で計算した。生体内回収率は、ｒＦＩＸでは、１３％であり、ＰＳＡ−ｒＦＩＸでは、２９％であった。ＰＳＡ−ｒＦＩＸに対して用量適合されたＡＵＣは、ｒＦＩＸに対して６．４倍増大し、末端半減期は、１．２倍増大し、ＭＲＴは、ｒＦＩＸと比較して、ＰＳＡ−ｒＦＩＸでは１．７倍長かった（表２）。

（実施例１０）
血液凝固タンパク質のポリシアル化
本明細書に説明するポリシアル化は、他の凝固タンパク質まで拡大され得る。例えば、本発明の種々の態様では、実施例５、６、および９に説明する、アミノオキシ−ＰＳＡでの上記のポリシアル化を、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、およびＶＷＦ等の凝固タンパク質で繰り返す。

（実施例１１）
ホモ二官能性リンカーＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_６ＯＮＨ_２の調製
ホモ二官能性リンカーＮＨ_２［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_６ＯＮＨ_２

２つの活性アミノオキシ基を含有する（３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ−ヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミン）を、一級アミンの修飾ガブリエル合成を採用する２ステップ有機反応で、Ｂｏｔｕｒｙｎら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９７；５３：５４８５−９２）に従い合成した。第１のステップでは、二塩化ヘキサエチレングリコールの１つの分子を、ＤＭＦ中のエンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドの２つの分子と反応させた。所望のホモ二官能性生成物を、エタノール中のヒドラジン分解によって、得られる中間体から調製した。

（実施例１２）
マレイミド／アミノオキシリンカー系を用いるｒＦＩＸのポリシアル化
Ａ．修飾試薬の調製
アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、マレイミド／アミノオキシリンカー系の使用によって調製する（Ｔｏｙｏｋｕｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ２００３；１４，１２５３−９）。遊離末端ＳＨ−基を含有するＰＳＡ−ＳＨ（２０ｋＤ）を、２ステップ手順（ａ）国際公開第０５０１６９７３Ａ１号に従う、ＮＨ_４Ｃｌでの酸化ＰＳＡの還元アミン化によるＰＳＡ−ＮＨ_２の調製、およびｂ）米国特許第７６４５８６０号に説明するとおり、２−イミノチオラン（トラウト試薬／Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）との末端一級アミノ基の反応によるスルフヒドリル基の導入）を使用して調整する。ＰＳＡ−ＳＨを、１０倍のモル過剰のリンカー、および５０ｍｇ／ｍＬのＰＳＡ−ＳＨ濃度を使用して、ＰＢＳ−緩衝液中のｐＨ７．５のリンカーのマレイミド基に結合する。反応混合物を、室温で、穏やかな振とうで、２時間、インキュベートする。次いで、過剰リンカー試薬を除去し、アミノオキシ−ＰＳＡを、ダイアろ過によって、酸化緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）に緩衝液交換する。緩衝液を、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ ５ｋＤで再生成されたセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて、２５回交換する。

Ｂ．ＮａＩＯ_４での前酸化後のｒＦＩＸの修飾
ｒＦＩＸを、緩衝液中の１００μＭの過ヨウ素酸ナトリウムを用いて、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で酸化する。混合物を、４℃で、１時間、暗室で、振とうし、５ｍＭの最終濃度まで、グリセロールの添加によって、室温で、１５分間、反応停止処理をした。低分子重量の不純物を、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって除去した。次いで、酸化ｒＦＩＸを、アニリンでスパイクして、１０ｍＭの最終濃度を得、アミノオキシ−ＰＳＡ試薬と混合して、５倍のモル過剰のＰＳＡを達成する。反応混合物を、室温で、暗室で、穏やかな振とうで、２時間インキュベートした。

Ｃ．複合体の精製
過剰のＰＳＡ試薬および遊離ｒＦＩＸをＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、１８０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３Ｍの塩化ナトリウム、６．７ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で、事前に平衡化した４８ｍＬのブチル−セファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填されたカラム上に装填した。その後、複合物を、４０ＣＶで、６０％の溶出緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ，６．７ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．４）の線形勾配で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ｒＦＩＸを含有する画分を収集し、再生成されたセルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から作製された３０ｋＤの膜の使用によって、ＵＦ／ＤＦに供する。調製を、総タンパク質（ＢＣＡ）およびＦＩＸ色原体活性を測定することによって、分析的に特徴付ける。両方の変異体で調製されたＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体に対して、天然のｒＦＩＸと比較して、５０％超の特性活性を決定する。

（実施例１３）
アミノオキシ−ＰＳＡ試薬の調製
アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を実施例３に従い調製した。最終生成物を、５ｋＤの膜（再生成されたセルロース、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、緩衝液、ｐＨ７．２（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ）に対してダイアろ過し、−８０℃で凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、試薬を、適切な水容積中で溶解し、炭水化物修飾を介してＰＳＡ−タンパク質複合体の調製のために使用した。

（実施例１４）
ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスモデルにおけるポリシアル化されたｒＦＶＩＩＩの薬物動態
ＰＳＡ−ＦＶＩＩＩ複合体を実施例８に従い調製した。複合体は、６２３７ＩＵ／ｍｇの特異的活性（色原体アッセイによって決定されたＦＶＩＩＩ活性、ブラッドフォードアッセイによって決定された総タンパク質）を示し、レソルシノールアッセイ（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ Ｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９５７；２４：６０４−１１）によって測定して、６．７のポリシアル化の度合い（モルＦＶＩＩＩ当たりモルＰＳＡ）を有した。

Ｂｉら（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９９５；１０：１１９−２１）によって詳細に説明されるＦＶＩＩＩ欠損マウスを、重度のヒト血友病Ａのモデルとして使用した。６匹のマウスのグループが、２００ＩＵ ＦＶＩＩＩ／体重ｋｇの用量で、実施例８に従い調製されたＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩまたは天然のｒＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のいずれかで、尾静脈を介するボーラス注入（２００ＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｋｇ）を受けた。麻酔後の心臓穿孔によるクエン酸血漿を、注入５分後、３時間後、６時間後、９時間後、１６時間後、２４時間後、３２時間後、および４２時間後に、それぞれのグループから調製した。ＦＶＩＩＩ活性レベルを、色原体アッセイの使用によって、血漿サンプル中で測定した。この実験の結果を表３に要約し、図８に示す。すべての計算を、Ｒバージョン２．１０．１（Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ．）で実行した。その結果、平均滞留時間（ＭＲＴ）は、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ複合体では、５．４時間（アドベイト対照）から１１．１時間に増大した。

（実施例１５）
アミノオキシ−ＰＳＡ試薬の詳細な合成
３−オキサ−ペンタン−１，５ジオキシアミンを、実施例１に列挙する２ステップの有機合成で、Ｂｏｔｕｒｙｎら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９７；５３：５４８５−９２）に従い合成した。

ステップ１：
７００ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のエンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドの（５９．０ｇ；１．００等量）の溶液に、無水Ｋ_２ＣＯ_３（４５．５１ｇ、１．００等量）および２，２−ジクロロジエチルエーテル（１５．８４ｍＬ、０．４１等量）を添加した。反応混合物を、５０℃で２２時間攪拌した。混合物を、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残基を、２Ｌのジクロロメタン中で懸濁し、ＮａＣｌ飽和水溶液（各１Ｌ）で２回、抽出した。ジクロロメタン層を、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、次いで、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、高真空内で乾燥して、白黄色の固体（中間体１）として６４．５ｇの３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシ−エンド−２’，３’−ジカルボキシジイミドノールボルネンを得た。

ステップ２：
８００ｍＬの無水エタノール中の中間体１（６４．２５ｇ、１．００等量）の溶液に、３１．０ｍＬのヒドラジン水和物（４．２６等量）を添加した。次いで、反応混合物を、２時間、還流させた。混合物を、減圧下で、溶媒を蒸発させることによって、出発容量の半分まで濃縮した。生じた沈殿物をろ過した。残りのエタノール層を、減圧下で、乾燥するまで蒸発させた。粗生成物３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを含有する残基を、真空内で乾燥させ、４６．３ｇを得た。粗生成物をさらに、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０、ジクロロメタン／メタノール混合物での定組成溶離、９＋１）によって精製して、１１．７ｇの純最終生成物３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを得た。

（実施例１６）
ＰＳＡヒドラジドを使用するｒＦＩＸのポリシアル化
ｒＦＩＸを、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）との酸化ＰＳＡの反応によって調製されたＰＳＡヒドラジド試薬の使用によってポリシアル化する。

ステップ１：ＰＳＡヒドラジドの調製
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａ）から得た５００ｍｇの酸化ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）を、８ｍＬの５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５中に溶解した。次いで、１００ｍｇのアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を添加した。溶液を、２時間、弱く振とうした。次いで、４４ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応物を、４℃で、さらに４時間、インキュベートした後、反応混合物を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）透析カセット（３．５ｋＤの膜、再生成セルロース）に装填し、４日間、ＰＢＳ ｐＨ７．２に対して透析した。生成物を−８０℃で凍結した。

ステップ２：ｒＦＩＸでのＰＳＡヒドラジドの反応、および複合体の精製
ｒＦＩＸを、ステップ１に説明するＰＳＡヒドラジド試薬の使用によってポリシアル化する。ｒＦＩＸ（濃度１ｍｇ／ｍＬ）を、穏やかな振とうで、暗室で、ＮａＩＯ_４（濃度：８０μＭ）で、４℃で、１時間、酸化する。反応を、グリセロールの添加によって停止し、酸化ＦＩＸを、再生成されたセルロース（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）から作製された３０ｋＤの膜の使用によって、ＵＦ／ＤＦに供する。次いで、酸化ｒＦＩＸを、２００倍のモル過剰の試薬、および１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を使用して、ｐＨ６．５でポリシアル化する。ｒＦＩＸおよびポリシアル化試薬を、室温で、暗室で、穏やかな振とうで、２時間、インキュベートする。最後に、ＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体を、ＨＩＣによって精製する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウムを含有する緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９）を添加することによって、１３０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化したＨｉＴｒａｐブチルＦＦカラム（５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に装填する。その後、複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４で溶出する。最後に、留分を含有するＰＳＡ−ｒＦＩＸを収集し、再生成されたセルロース（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）から作製された３０ｋＤの膜の使用によって、ＵＦ／ＤＦに供する。ＰＥＧ−ｒＦＩＸ複合体では、天然のｒＦＩＸと比較して、５０％超の特異性活性を決定する（色原体アッセイ）。

（実施例１７）
求核触媒としてのアニリンの存在下で、ＰＳＡヒドラジドを使用するｒＦＩＸのポリシアル化
１２３ｍｇのｒＦＩＸを、６０ｍＬのリン酸緩衝液（５０ｍＭのＮａＰＯ_４、ｐＨ６．５）緩衝液中に溶解する。次いで、１．２ｍＬの水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１０ｍＭ）を添加し、混合物を、穏やかな攪拌で、４℃で、暗室で、１時間、インキュベートする。その後、反応物を、６００μＬの１Ｍのグリセロール水溶液の添加によって、室温で、１５分間、反応停止処理する。その後、混合物を、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ Ｕｌｔｒａｃｅｌ ３０ｋＤの膜を使用するＵＦ／ＤＦに供する。

酸化されたｒＦＩＸを含有する、ＵＦ／ＤＦ残余分（６３．４ｍＬ）をさらに、５９．６ｍＬのリン酸緩衝液（５０ｍＭのＮａＰＯ_４、ｐＨ６．０）で希釈し、６．５ｍＬの水性アニリン溶液（２００ｍＭ）と混合し、室温で、３０分間、インキュベートする。次いで、１２．３ｍＬのＰＳＡ−ヒドラジド試薬（実施例１６に従い調製）を添加して、５倍の試薬モル過剰を得る。この混合物を、穏やかな攪拌で、暗室で、室温で、２時間、インキュベートする。

過剰のＰＳＡ−ヒドラジド試薬および遊離ｒＦＩＸを、ＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、１８０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、４８ｍＬのブチル−セファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填されたカラム上に装填し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３Ｍの塩化ナトリウム、６．７ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化する。その後、複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４で溶出する。最後に、留分を含有するＰＳＡ−ｒＦＩＸを収集し、再生成されたセルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から作製された、３０ｋＤの膜を使用することによって、ＵＦ／ＤＦに供する。調製を、総タンパク質（ＢＣＡ）およびＦＩＸ色原体活性を測定することによって分析的に特徴付ける。ＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体では、天然のｒＦＩＸと比較して、５０％超の特異的活性が決定される。

（実施例１８）
ｒＦＩＸのポリシアル化および２ステップ手順を使用する精製
１４０ｍｇのｒＦＩＸを、６２ｍＬのリン酸緩衝液（５０ｍＭのＮａＰＯ_４、ｐＨ６．０）緩衝液中に溶解した。次いで、１．９２ｍＬの水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１０ｍＭ）を添加し、混合物を、穏やかな攪拌で、４℃で、暗室で、１時間、インキュベートし、６４μＬの１Ｍの水性グリセロール溶液の添加によって、室温で、１５分間、反応停止処理をした。その後、混合物を、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ Ｕｌｔｒａｃｅｌ ３０ｋＤの膜を採用するＵＦ／ＤＦに供した。

酸化されたｒＦＩＸを含有する、ＵＦ／ＤＦ残余分（６９．４ｍＬ）をさらに、７３．８ｍＬのリン酸緩衝液（５０ｍＭのＮａＰＯ_４、ｐＨ６．０）で希釈し、８．２ｍＬの水性アニリン溶液（２００ｍＭ）と混合し、室温で、３０分間、インキュベートした。次いで、１２．３ｍＬのアミノオキシ試薬（実施例３に従い調製）を添加して、２．５倍の試薬モル過剰を得た。この混合物を、穏やかな攪拌で、暗室で、室温で、２．５時間、インキュベートした。

遊離ｒＦＩＸを、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＩＥＣ）によって除去する。反応混合物を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．５）で希釈し、Ｑ−セファロースＦＦ２６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に装填し、緩衝液Ａで事前に平衡化する。次いで、カラムを、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．５）で溶出する。遊離ｒＦＩＸは１２〜２５ｍＳ／ｃｍの間の伝導率で、および複合体は２７〜４５ｍＳ／ｃｍの間の伝導率で溶出する。次いで、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ６．９）の添加によって、１９０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、ブチルセファロースＦＦ２６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に装填し、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ６．９）で事前に平衡化する。遊離ＰＳＡ試薬を、５ＣＶの緩衝液Ｄ内で洗浄する。その後、複合体を、１００％の緩衝液Ｅ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．４）で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース（８８ｃｍ^２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から作製された１０ｋＤの膜を使用するＵＦ／ＤＦによって濃縮する。最終ダイアろ過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＣａＣｌ_２を含有する、ヒスチジン緩衝液、ｐＨ７．２に対して実行する。調製物を、総タンパク質（ＢＣＡ）およびＦＩＸ色原体活性を測定することによって分析的に特徴付ける。ＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体では、天然のｒＦＩＸと比較して、５０％超の特異的活性が決定される。

（実施例１９）
ｒＦＶＩＩａへのアミノオキシ−ＰＳＡの結合、および複合体の精製
５ｍＬの反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中の１０ｍｇのｒＦＶＩＩａの溶液を、ＮａＩＯ_４の水溶液（最終濃度：１００μＭ）と混合し、暗室で、穏やかな攪拌で、４℃で、１時間、インキュベートし、１５分間、システインの水性溶液（最終濃度：１ｍＭ）の添加によって反応停止処理する。その後、反応混合物を、ＵＦ／ＤＦに供する。残余分（１０ｍＬ）に、３０倍モル過剰のアミノオキシ試薬（実施例１に従い調製）を添加する。結合反応を、暗室で、室温で、２時間、実行する。過剰のアミノオキシ試薬を、ＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって、１３０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、ＨｉＴｒａｐ ブチルＦＦカラム（５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に装填し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡する。その後、複合体を、２０ＣＶ中の１００％溶出緩衝液の線形勾配によって、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩａを含有するを画分を収集し、再生成されたセルロース（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）から作製された３０ｋＤの膜の使用によるＵＦ／ＤＦに供する。調製を、総タンパク質（ＢＣＡ）およびＦＶＩＩａ色原体活性（Ｓｔａｃｌｏｔアッセイ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を測定することによって分析的に特徴付け、ｒＦＶＩＩａ出発物質と比較して、２０％超の特異的活性を示す。

（実施例２０）
求核触媒としてのアニリンの存在下でのｒＦＶＩＩａへのアミノオキシ−ＰＳＡの結合
１．４ｍＬの５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解した、３．０ｍｇのｒＦＶＩＩａに、１４．１μＬの水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１０ｍＭ）を添加する。混合物を、４℃で、１時間、暗室で、振とうし、１．５μＬの１Ｍのグリセロールの添加によって、室温で１５分間反応停止処理する。低分子重量の不純物を、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）を用いる、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって除去する。３ｍＬの５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解した、３ｍｇの酸化されたｒＦＶＩＩａを、アニリン（求核触媒、最終濃度：１０ｍＭ）と混合し、室温で、３０分間、振とうする。次に、アミノオキシ−ＰＳＡを添加して、５倍のモル過剰を得、混合物を、室温で、２時間、振とうする。その後、過剰ＰＳＡ試薬および遊離ｒＦＩＸを、ＨＩＣによって除去する。冷却した反応混合物の伝導率を、１８０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、５ｍＬのＨｉＴｒａｐブチルＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）ＨＩＣカラム（１．６×２．５ｃｍ）上に装填し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３Ｍの塩化ナトリウム、６．７ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化する。複合体を、５ｍＬ／分の流量で、２０ＣＶで、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、６．７ｍＭの塩化カルシウム、０．００５％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４に対する線形勾配で溶出する。

（実施例２１）
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬の調製
分岐ＰＥＧ−アルデヒド（分子量４０ｋＤ）を、実施例１に説明するとおり調製する、ジアミノオキシリンカーへ結合のために使用する。このＰＥＧ−アルデヒド試薬は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から入手可能である。５００ｍｇのＰＥＧ−アルデヒドを、８ｍＬの５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５中に溶解する。次いで、１００ｍｇの３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを添加する。室温で、２時間、振とうした後、４４ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加する。４℃で、さらに４時間、振とうした後、反応混合物を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）透析カセット（３．５ｋＤの膜、再生成されたセルロース）上に装填し、４日間、ＰＢＳ、ｐＨ７．２に対して透析する。生成物を、−８０℃で凍結する。

（実施例２２）
アミノオキシＰＥＧ試薬でのｒＦＩＸのＰＥＧ化
ｒＦＩＸを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ｒＦＩＸを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中で、４℃で、暗室で、穏やかな振とうで、１時間、ＮａＩＯ_４（最終：濃度：１００μＭ）での２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で酸化させ、１５分間、グリセロールの水性溶液（最終濃度：１ｍＭ）の添加によって反応停止処理する。その後、反応混合物を、ＵＦ／ＤＦに供する。残余分に、３倍のモル過剰のアミノオキシ試薬およびアニリン（求核触媒、最終濃度：１０ｍＭ）を追加する。結合反応を、穏やかな振とうで、暗室で、室温で、２時間、実行する。最後に、ＰＥＧ−ｒＦＩＸ複合体を、Ｑ−セファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、カラム上に装填し、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０で事前に平衡する。複合体を、２０ＣＶで、５０ｍＭのトリス、および１Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ８．０で溶出し、次いで、３０ｋＤの膜を使用するＵＦ／ＤＦに供する。調製を、総タンパク質（ＢＣＡ）およびＦＩＸ色原体活性を測定することによって分析的に特徴付ける。ＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体では、天然のｒＦＩＸと比較して、７５％超の特異的活性が決定される。

（実施例２３）
アミノオキシＰＥＧ試薬でのｒＦＶＩＩＩのＰＥＧ化
ｒＦＶＩＩＩを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。この種類の試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ｒＦＶＩＩＩを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中で、４℃で、暗室で、穏やかな振とうで、１時間、ＮａＩＯ_４（最終：濃度：１００μＭ）での１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で酸化させ、１５分間、システインの水性溶液（最終濃度：１ｍＭ）の添加によって反応停止処理する。その後、反応混合物を、ＵＦ／ＤＦに供する。残余分に、２０倍のモル過剰のアミノオキシ試薬およびアニリン（求核触媒、最終濃度：１０ｍＭ）を追加する。結合反応を、穏やかな振とうで、暗室で、室温で２時間実行する。最後に、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ複合体を、Ｑ−セファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、カラム上に装填し、５ｍＭのＣａＣｌ_２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で事前に平衡する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ_２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、３０ｋＤの膜を使用するＵＦ／ＤＦに供する。ＦＶＩＩＩ色原体アッセイによる複合体の分析的特長付け、および総タンパク質（ＢＣＡアッセイ）決定は、ｒＦＶＩＩＩ出発物質と比較して、６０％超の特異的活性が決定される。

（実施例２４）
アミノオキシＰＥＧ試薬でのｒＦＶＩＩａのＰＥＧ化
ｒＦＶＩＩａを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ｒＦＶＩＩａを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中で、４℃で、暗室で、 穏やかな振とうで、１時間、ＮａＩＯ_４（最終：濃度：１００μＭ）での２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で酸化させ、１５分間、グリセロールの水性溶液（最終濃度：１ｍＭ）の添加によって反応停止処理する。その後、反応混合物を、ＵＦ／ＤＦに供する。残余分に、５倍のモル過剰のアミノオキシ試薬およびアニリン（求核触媒、最終濃度：１０ｍＭ）を追加する。結合反応を、穏やかな振とうで、暗室で、室温で、２時間、実行する。最後に、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ複合体を、Ｑ−セファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、カラム上に装填し、１ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．４を含有する２０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で事前に平衡する。複合体を、１ｍＭのＣａＣｌ_２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、３０ｋＤの膜を使用するＵＦ／ＤＦに供する。ＦＶＩＩａ活性（Ｓｔａｃｌｏｔアッセイ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、および総タンパク質（ＢＣＡアッセイ）を測定することによる複合体の分析的特長付けは、ｒＦＶＩＩａ出発物質と比較して、２５％超の特異的活性を示す。

（実施例２５）
ＰＥＧヒドラジド試薬でのｒＦＩＸのＰＥＧ化
ｒＦＩＸを、ヒドラジド基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＨＺシリーズである。ｒＦＩＸを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中で、４℃で、暗室で、穏やかな振とうで、１時間、ＮａＩＯ_４（最終：濃度：１００μＭ）での２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で酸化させ、１５分間、グリセロールの水性溶液（最終濃度：１ｍＭ）の添加によって反応停止処理する。その後、反応混合物を、ＵＦ／ＤＦに供する。残余分に、５０倍のモル過剰のヒドラジド試薬およびアニリン（求核触媒、最終濃度：１０ｍＭ）を追加する。結合反応を、穏やかな振とうで、暗室で、室温で、２時間、実行する。最後に、ＰＥＧ−ｒＦＩＸ複合体を、Ｑ−セファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。反応混合物を、カラム（１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲル）上に装填し、５０ｍＭのトリス−緩衝液、ｐＨ８．０で事前に平衡する。複合体を、２０ＣＶのトリス−緩衝液、ｐＨ８．０（５０ｍＭのトリス、１ＭのＮａＣｌ）で溶出し、次いで、３０ｋＤの膜を使用するＵＦ／ＤＦに供する。調製を、総タンパク質（ＢＣＡ）およびＦＩＸ色原体活性を測定することによって分析的に特徴付ける。ＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体では、天然のｒＦＩＸと比較して、５０％超の特異的活性が決定される（色原体アッセイ）。

（実施例２６）
２ｍＭのアニリンの存在下でのｒＦＶＩＩＩのポリシアル化
ｒＦＶＩＩＩを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６）に移し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで希釈し、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中で、４℃で、暗室で、穏やかな振とうで、１時間、ＮａＩＯ_４（最終：濃度：１００μＭ）で酸化させ、１５分間、システインの水性溶液（最終濃度：１ｍＭ）の添加によって反応停止処理する。その後、反応混合物を、ＵＦ／ＤＦに供する。残余分に、２０倍のモル過剰のアミノオキシ試薬およびアニリン（求核触媒、最終濃度：２ｍＭ）を添加する。結合反応を、穏やかな振とうで、暗室で、室温で、２時間、実行する。過剰なアミノオキシ試薬をＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウムを含有する緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９）を添加することによって、１３０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化した５３ｍＬのブチル−セファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填されたカラム上に装填する。その後、複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４で溶出する。最後に、留分を含有するＰＳＡ−ｒＦＩＸを収集し、再生成されたセルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）から作製された、３０ｋＤの膜を使用することによるＵＦ／ＤＦに供する。調製を、総タンパク質（ＢＣＡ）およびＦＶＩＩＩ色原体活性を測定することによって分析的に特徴付ける。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ複合体では、天然ｒＦＶＩＩＩと比較して、８０％の特異的活性が決定される。

（実施例２７）
１０ｍＭのアニリンの存在下でのｒＦＶＩＩＩのポリシアル化
ｒＦＶＩＩＩを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６）に移し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで希釈し、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中で、４℃で、暗室で、穏やかな振とうで、１時間、ＮａＩＯ_４（最終：濃度：１００μＭ）で酸化させ、１５分間、システインの水性溶液（最終濃度：１ｍＭ）の添加によって反応停止処理する。その後、反応混合物を、ＵＦ／ＤＦに供する。残余分に、２０倍のモル過剰のアミノオキシ試薬およびアニリン（求核触媒、最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。結合反応を、穏やかな振とうで、暗室で、室温で、２時間、実行する。過剰なアミノオキシ試薬をＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウムを含有する緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９）を添加することによって、１３０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化した５３ｍＬのブチル−セファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填されたカラム上に装填する。その後、複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ｒＦＩＸを含有する画分を収集し、再生成されたセルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）から作製された、３０ｋＤの膜を使用することによるＵＦ／ＤＦに供する。調製物を、総タンパク質（ＢＣＡ）およびＦＶＩＩＩ色原体活性を測定することによって分析的に特徴付ける。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ複合体では、天然のｒＦＶＩＩＩと比較して、８０％の特異的活性が決定される。

（実施例２８）
分岐ＰＥＧを使用する血液凝固タンパク質のＰＥＧ化
血液凝固タンパク質（実施例２２〜２５に説明するＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、およびＦＶＩＩａ等）のＰＥＧ化は、実施例２１に説明する分岐または直鎖ＰＥＧ試薬まで延長されてもよく、それは、アルデヒド、および活性アミノオキシ基を含有する好適なリンカーから作製される。

Claims (14)

1. 水溶性ポリマーを、血液凝固タンパク質の酸化炭水化物部分に共役させる方法であって、共役を可能にする条件下で、前記酸化炭水化物部分を、活性化水溶性ポリマーと接触させて、共役させた血液凝固タンパク質を得ることを含み、
   前記血液凝固タンパク質は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体から成る群より選択され、
   前記水溶性ポリマーは、活性アミノオキシ基を含有し、ポリシアル酸（ＰＳＡ）であり、
   前記炭水化物部分は、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）_４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）から成る群より選択される酸化剤を含む緩衝液でのインキュベーションによって酸化され、オキシム連結が、前記酸化炭水化物部分と前記水溶性ポリマー上の前記活性アミノオキシ基との間に形成され、
   前記共役させた血液凝固タンパク質が、前記血液凝固タンパク質に対して少なくとも５０％の生物学的活性を保持する、方法。
2. 前記ＰＳＡは、１０〜３００個のシアル酸単位から成る、請求項１に記載の方法。
3. 前記血液凝固タンパク質は、ＦＩＸである、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記血液凝固タンパク質は、ＦＶＩＩＩである、請求項１または２に記載の方法。
5. 前記酸化剤は、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記血液凝固タンパク質の前記酸化炭水化物部分は、前記血液凝固タンパク質の活性化ペプチド内に位置する、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記ＰＳＡは、活性化アミノオキシリンカーを、酸化ＰＳＡと反応させることによって、調製され、
   前記アミノオキシリンカーは、
   ａ）式：
   

   

   の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカー、および
   ｂ）式：
   

   

   の３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミンリンカーから成る群より選択され、
   前記ＰＳＡは、酸化剤でのインキュベーションによって酸化され、前記ＰＳＡの非還元末端において、末端アルデヒド基を形成する、請求項１に記載の方法。
8. 前記アミノオキシリンカーは、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンである、請求項７に記載の方法。
9. 前記酸化剤は、ＮａＩＯ_４である、請求項７に記載の方法。
10. 前記酸化炭水化物部分を、前記活性化水溶性ポリマーと接触させることは、アニリンおよびアニリン誘導体から成る群より選択される求核触媒を含む緩衝液中で生じる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
11. シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ_３）およびアスコルビン酸（ビタミンＣ）から成る群より選択される還元化合物を含む、緩衝液中で、前記共役させた血液凝固タンパク質をインキュベートすることによって、前記共役させた血液凝固タンパク質中のオキシム連結を還元させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記還元化合物は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ_３）である、請求項１１に記載の方法。
13. （ａ）ＦＩＸ分子、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体と、
    （ｂ）前記（ａ）のＦＩＸ分子に結合した少なくとも１つのアミノオキシＰＳＡであって、１つまたは複数の炭水化物部分を介して前記ＦＩＸに付着する、アミノオキシＰＳＡと、を含む、修飾されたＦＩＸであって、
    前記修飾されたＦＩＸが、前記（ａ）のＦＩＸ分子に対して少なくとも５０％の生物学的活性を保持する、修飾されたＦＩＸ。
14. （ａ）ＦＶＩＩＩ分子、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体と、
    （ｂ）前記（ａ）のＦＶＩＩＩ分子に結合した少なくとも１つのアミノオキシＰＳＡであって、１つまたは複数の炭水化物部分を介して前記ＦＶＩＩＩに付着する、アミノオキシＰＳＡと、を含む、修飾されたＦＶＩＩＩであって、
    前記修飾されたＦＶＩＩＩが、前記（ａ）のＦＶＩＩＩ分子に対して少なくとも５０％の生物学的活性を保持する、修飾されたＦＶＩＩＩ。

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