ES2294535T3 - Derivados del acido polisialico. - Google Patents

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Abstract

Compuesto que comprende un polisacárido que presenta por lo menos dos unidades de ácido siálico unidas 2, 8 y/o 2, 9 entre sí y que presenta una parte pendiente unida a por lo menos una unidad terminal derivada de una unidad de ácido siálico que comprende un grupo funcional seleccionado de entre los grupos N-maleimido, grupos vinilsulfona, grupos N-yodoacetamida y grupos ortopiridil disulfuro.

Description

Derivados del ácido polisiálico.
La presente invención se refiere a derivados del ácido polisiálico de utilización en la conjugación de fármacos, proteínas y péptidos, o en sistemas de administración de fármacos tales como liposomas, con grupos sulfidrilo, así como a un procedimiento de productos conjugados para sintetizar los derivados y los conjugados y nuevos intermediarios sintéticos.
La presencia prolongada de fármacos en el sistema vascular o en su utilización extravascular es frecuentemente un prerrequisito para una utilización óptima. Una multiplicidad de antibióticos y citostáticos, por ejemplo, así como también múltiples péptidos y proteínas terapéuticas y liposomas son eliminados de la circulación prematuramente y antes de que alcancen una concentración efectiva en los tejidos diana. Las vidas medias de múltiples proteínas de vida corta (por ejemplo, enzimas, citocinas, etc.) se amplifican mediante su conjugación a poli(etilenglicol) de bajo peso molecular. Parece ser que las moléculas de PEG prolongan el tiempo de circulación de las proteínas y partículas mediante la formación de una nube alrededor de su superficie, impidiendo así la interacción con los factores responsables de su eliminación. Sin embargo, el PEG no es biodegradable y la acumulación intracelular de proteínas PEGiladas puede ser considerable especialmente con su utilización crónica [Bendele, A., Seely, J. Richey, C., Sennello, G., Shopp, G., Renal tubular vacuolation in animals treated with polyethylene-glicol conjugated proteins, Toxicological Sciences, 42:152-157 (1998); Convers, C.D., Lejeune, L., Shum, K., Gilbert, C., Shorr, R.G.L., Physiological Effects of polyethylene glycol conjugation on stroma-free bovine hemoglobin in conscious dogs after partial exchange transfusión, Artificial Organ, 21:369-378 (1997)].
Se ha descrito por parte de los presentes inventores la conjugación de un polisacárido que comprende unidades de ácido siálico unidas 2\rightarrow8 y 2\rightarrow9 (por ejemplo, 2\rightarrow8 y 2\rightarrow9 alternativos) conjugadas a proteínas con el fin de incrementar su vida media, reducir su inmunogenicidad/antigenicidad o incrementar la estabilidad de múltiples proteínas. En WO 92/22331, se hacen reaccionar ácidos polisiálicos con una fármaco modelo y se demuestra que extiende su vida media en la circulación de los ratones. En Cell. Mol. Life Sci. 57:1964-1969 (2000) y en Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 16:203-215 (1999), Gregoriadis et al., describen la conjugación de ácidos polisiálicos con asparraginasa y catalasa y demuestran que se redujo la velocidad de eliminación de la circulación a la vez que se retuvo la actividad enzimática. También hemos polisializado insulina (Biochem. Biophys. Acta 1622:42-49 (2003) y demostrado que permanece activa. Los presentes inventores asimismo han polisializado interferón (AAPS Annual Meeting 2002, Toronto, Canada, M1056). Los presentes inventores han polisializado asimismo el fragmento Fab de anticuerpos [Epenetos, A., et al., Proceedings of ASCO (Clinical Pharmacy)21 (2002)2186].
En todas estas publicaciones, se activa el ácido polisiálico mediante la generación de un grupo aldehído en el extremo no-reductor mediante la oxidación con periodato sódico del diol vecinal 7-8. A continuación se hizo reaccionar el grupo aldehído con los grupos de amina primaria en las proteínas, que generalmente se asume que son los grupos epsilon-amino de las lisinas de las proteínas o los grupos amino N-terminales. La reacción genera una base Schiff que se reduce mediante cianoborohidruro a una amina secundaria.
En WO-A-01/87922 también se sugiere que la derivatización con otras moléculas se podría realizar en presencia de un desnaturalizante con el fin de lograr un nivel de derivatización superior. Otros ejemplos de agentes derivatizantes son los compuestos de polietilenglicol. Se mencionan los compuestos de PEG activado tales como el tresil-PEG y el éster de succinimidil succinato de PEG. Los ejemplos utilizaron PEG activado mediante succinimidil succinato, que se cree que reacciona con los grupos amina.
Los derivados de PEG con grupos funcionales destinados al acoplamiento a grupos tiol se encuentran comercialmente disponibles. Los grupos funcionales pueden ser maleimida, vinilo, sulfona, yodoacetamida u ortopiridil disulfuro. Debido a que dichos reactivos reaccionan específicamente con las cisteínas, y debido a que las proteínas poseen menos cisteínas en su superficie que grupos lisina, la derivatización es más controlable. Además, en ausencia de un grupo de cisteína libre en una proteína nativa, se pueden añadir una o más cisteínas libres mediante ingeniería genética. La ventaja de esta estrategia es que hace posible la derivatización en lugares específicos de zonas de la proteína que minimizarán la pérdida de actividad biológica.
Se ha descubierto que las proteínas PEGiladas generan anticuerpos antiPEG que también pueden afectar el tiempo de residencia del conjugado en la circulación sanguínea [Chern, T., Wu, M., Wu, P., Chern, J., Roffer, SR., Accelerated clearance of polyethylene glycol modified proteins by anti-polyethylene glycol IgM., Bioconjugate Chemistry, 10:520-528 (1999)]. A pesar de la historia establecida del PEG como polímero conjugado a fármacos administrados parenteralmente, se necesitará un mayor conocimiento de su inmunotoxicología, farmacología y metabolismo [Hunter, A.C., Moghimi, S. M., Therapeutic synthetic polymers: a game of Russian Roulette. Drug Discovery Today, 7:998-1001 (2002); Brocchini, S., Polymers in medicine: a game of chess, Drug Discovery Today, 8:111-112 (2003)].
Las modificaciones del ácido polisiálico dirigidas a los grupos tiol (sulfidrilo) resultarían útiles. También sería deseable el incremento en la eficacia de la derivatización mediante ácido siálico; el procedimiento descrito en la técnica anterior mencionado anteriormente necesitó un gran exceso de ácido polisiálico activo. También sería necesario evitar la utilización de cianoborohidruro.
Según la presente invención se proporciona un nuevo compuesto que comprende un polisacárido que comprende por lo menos dos unidades de ácido siálico unidas 2,8 ó 2,9 entre sí y provistas de una parte unida a una o a cada una de las unidades terminales derivadas de una unidad de ácido siálico que comprende un grupo funcional seleccionado de entre los grupos N-maleimido, grupos vinilsulfona, grupos N-yodoacetamida y grupos ortopiridil disulfuro.
La unidad terminal a la que la parte se encuentra unida puede encontrarse en el extremo no reductor del ácido polisiálico o en el extremo reductor del ácido polisiálico. Generalmente la unidad terminal de ácido siálico ha sido sometida a una reacción química preliminar destinada a generar grupos funcionales de utilidad a los que se puedan unir reactivos que comprendan grupos maleimido. Se ha considerado conveniente utilizar la química dada a conocer en nuestras publicaciones anteriores en las que se genera un grupo aldehído, como etapa preliminar a la generación de un grupo funcional mediante el que se puede unir la parte maleimido.
En las publicaciones previas de los presentes inventores mencionadas anteriormente, es la unidad terminal no reductora la que se convierte en una porción aldehído mediante oxidación de la parte diol vecinal 7,8 con periodato sódico con el fin de formar el compuesto aldehído en el carbono 7. Esta es una reacción apropiada para la presente invención.
Como alternativa, es posible proporcionar la parte aldehído en la unidad terminal reductora. En este caso, es preferible (pero no esencial) realizar una etapa preliminar en la que se desactiva el extremo no reductor, mediante etapas de oxidación y reducción preliminares. Una primera etapa de reducción convierte la unidad cetal en el extremo reductor en una forma abierta de anillo reducido, provisto de dioles vecinales. Los dioles próximos a continuación se oxidan mediante la utilización de periodato sódico con el fin de formar un aldehído en el primer átomo de carbono que formaba anteriormente el carbono 7 de la unidad terminal reductora. Mientras que el glicosilo terminal no reductor (generalmente ácido siálico) no se desactiva mediante una etapa preliminar de oxidación, la unidad terminal se activará simultáneamente.
En la presente invención, la parte que comprende el grupo funcional, se puede unir directamente a la unidad de ácido polisiálico, más convenientemente, se puede unir mediante un grupo orgánico difuncional, tal como un grupo diol de alcano, un grupo arileno o un grupo alcano oligo(alquilenoxi), o por el contrario un grupo oligo peptidilo. La unión al ácido polisiálico (desde el conector o la parte que comprende el grupo funcional puede ser una amina secundaria, una hidrazona, una alquilhidracina un éster o un grupo peptidilo. La parte puede ser generada mediante la reacción de un sustrato de ácido polisiálico con un reactivo heterobifuncional. El procedimiento constituye otro aspecto de la presente invención.
Los reactivos de utilidad para introducir los grupos funcionales seleccionados se encuentran comercialmente disponibles. Un compuesto que introducirá un grupo maleimido en una parte amina sin introducir ninguna unidad de unión adicional es la N-metoxi-carbonil-maleimida. Generalmente los reactivos comprenden un segundo grupo funcional para reaccionar con un grupo en el ácido polisiálico que puede ser el grupo aldehído descrito anteriormente, o un grupo amina. Los segundos grupos funcionales adecuados comprenden ésteres de N-hidroxi succinimida y sus análogos sulfosuccinimida e hidrazidas. Preferentemente el compuesto es una hidrazida de ácido N-maleimido-alcanoico, es decir, un compuesto de fórmula general
X-R-Y
en el que:
X es un grupo N-maleimido, N-yodoacetamido, S-vinilsulfonilo o S-ortopiridildisulfuro,
R es un grupo alcano-diilo, arileno o aralquileno alcarileno, alquilen-oxaalquileno o alquileno-oligooxa-alquileno o alquil-oligopeptidil-alquilo; e
Y es un grupo hidrazido, amino o N-hidroxisuccinimido.
Preferentemente R es alcanodiilo C_{1-6}, C_{2-3}-alquil-oxa-C_{2-3}-alquileno,
C_{2-3} alquil-oligo(oxa-C_{2-3} alquileno), o fenil alquileno C_{2-6}.
Preferentemente X es N-maleimido o ortopiridildisulfuro.
Preferentemente Y es una hidrazida o una hidroxil succinimida.
Los compuestos que se pueden hacer reaccionar con un grupo aldehído y que comprenden un parte conectora e introducen un grupo maleimida comprenden ácido N-[\beta-maleimidopropiónico] hidracina y ácido hidrazido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico. El grupo hidrazida reacciona con el aldehído para formar un grupo hidrazona estable. Un compuesto heterobifuncional adecuado que comprende un grupo etilen oligo(etilenoxi) se un compuesto que comprende un grupo polietilenglicol (poli(etilenoxi)) con, en un extremo; un grupo N-hidroxisuccinimida (NHS) y el grupo funcional en el otro extremo. El grupo NHS reacciona con grupos amina formando enlaces amida estables. Los polietilenglicoles heterobifuncionales con NHS en un extremo y vinilsulfona o maleimida en el otro extremo se encuentran disponibles. Otros ejemplos de reactivos heterobifuncionales comprenden 3-(2-piridilditio)propionil hidrazida, N-succinimidil-3-[2-piridilditio]propionato, succinimidil-H-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, N-succinimidil-[4-yodoacetil] amino benzoato, éster de N-[gamma-malei-
midobutiriloxi]succinimida, éster de N-[epsilon-maleimidocaproiloxi]succinimida y N-succinimidil yodoacetato.
Se encuentran disponibles otros reactivos de Pierce Biotechnology y Shearwater Corporation (a base de polietilenglicol).
Los ácidos siálicos (también conocidos como ácidos nonulosónicos) son miembros de una familia de amino-azúcares que comprenden 9 o más átomos de carbono. El ácido siálico más importante es el ácido N-acetilneuramínico (también conocido como ácido 5-(acetilamino)-3,5-dideoxi-D-glicero-D-galacto-nonulosónico, ácido lactamínico y ácido O-siálico) de fórmula:
1
Los ácidos polisiálicos pueden estar unidos 2\rightarrow8 y/o 2\rightarrow9, generalmente en la configuración \alpha. En algunos ácidos polisiálicos las uniones son 2\rightarrow8 y 2\rightarrow9 alternativamente. La presente invención también es de utilidad para los polisacáridos heteropoliméricos que comprenden unidades glicosilo diferentes de las unidades de ácido siálico.
Los ácidos polisiálicos son generalmente no tóxicos y sustancialmente no-inmunogénicos. Además, las unidades de biodegradación, ácido siálico, no es conocido que sean tóxicas y, desde luego, los ácidos siálicos se encuentran ampliamente distribuidos en las proteínas animales y en las células, comprendidas las células sanguíneas y proteínas circulantes.
Los compuestos de polisacáridos que comprenden muchas unidades de ácido siálico son los polisacáridos producidos por Escherichia coli o Moraxella nonliquifaciens, Pasteurella aeroginosis y Neisseria meningitidis o derivados de las mismas. Por ejemplo, los derivados de ácido colominico (mediante hidrólisis para acortar la longitud de cadena) de E. coli KI comprenden unidades de ácido siálico conectadas \alpha-2->8.
El polisacárido de la cepa de E. coli K92 comprende unidades de ácido siálico unidas alternativamente 2\rightarrow8 y 2\rightarrow9. El polisacárido C del grupo C de N. meningitidis comprende unidades de ácido siálico unidas 2\rightarrow9.
Un grupo de compuestos de polisacárido de gran utilización que se ha descubierto posee gran utilidad en la presente invención es el grupo de polisacáridos B Estos compuestos son el producto de N. meningitidis y M. nonliquifaciens, P. aeroginosis A2 y E. coli K1. Dichos compuestos comprenden un componente de polisacárido que comprende residuos de ácidos siálico y componentes de fosfolípido. Los residuos de ácido siálico se encuentran unidos (2\rightarrow8)-\alpha, el polímero natural comprende del orden de 200 residuos. Algunas de las moléculas de glicolípido, en particular las de los compuestos de elevado peso molecular parecen poseer un fosfolípido enlazado covalentemente en el extremo reductor del componente de polisacárido.
Resulta preferido que las bacterias de las que se deriva el polisacárido sean del tipo no patógeno con el fin de facilitar la producción. Es particularmente adecuado, por consiguiente, que el polisacárido provenga de un cepa no patológica de E. coli tal como E. coli K92 o, preferentemente, K1 que no es inmunogénica. Las cepas de E. coli K92 y K1 son bien conocidas y se puede utilizar un tipo cualquiera de cada una de dichas cepas como fuente de polisacárido adecuado. Preferentemente el polisacárido debería tener por lo menos 2, preferentemente por lo menos 5, más preferentemente por lo menos 10, por ejemplo, más de 50 unidades de ácido siálico.
Según la presente invención, también se proporciona un conjugado de una proteína y el nuevo polisacárido activado. El nuevo compuesto comprende una proteína con por lo menos una unidad de cisteína y, unido mediante un enlace de tioéter a la cadena lateral de la unidad de cisteína, un ácido polisiálico mediante una parte enlazada a una, o a las dos unidades terminales del ácido polisiálico.
Cuando el derivado de ácido polisiálico fue un grupo N-maleimido la parte debe incluir un grupo N-succinimidilo, con el tioéster unido en el átomo de carbono \alpha. Preferentemente la parte comprende también una amina secundaria, una hidrazona o un enlace amida.
En la presente invención también se proporciona un nuevo procedimiento en el que un polisacárido con por lo menos dos unidades de ácido siálico unidas 2,8 ó 2,9 entre sí y comprende por lo menos una unidad terminal que está derivada de una unidad de ácido siálico, preferentemente u ácido polisiálico, se hace reaccionar con un reactivo heterobifuncional que comprende un primer grupo funcional para reaccionar con grupos sulfidrilo y un segundo grupo funcional diferente del primero en el que dicho segundo grupo funcional reacciona con una unidad terminal de ácido polisiálico para formar un enlace covalente con éste y generar ácido polisiálico funcional capaz de reaccionar con un ácido polisiálico con un grupo tiol funcional.
En una forma de realización de la presente invención el segundo grupo funcional es un grupo nucleófilo, preferentemente una hidracina. Esto es de particular utilidad cuando el ácido polisiálico comprende un grupo aldehído en la unidad terminal cuyo grupo carbonilo es atacado por el grupo el grupo nucleófilo.
En otra forma de realización de la presente invención del procedimiento el segundo grupo funcional es un grupo electrófilo tal como una N-alcoxil carbonil-imida tal como el éster de N-hidroxisuccinimida, el éster de sulfosuccinimida, o la carbodiimida. El grupo terminal en cada caso es preferentemente un nucleófilo tal como la amina.
En el proceso se prefiere que el reactivo comprenda un grupo orgánico bifuncional que enlaza el primer y el segundo grupo funcional. Preferentemente el grupo orgánico bifuncional se selecciona de entre el grupo que comprende un grupo alcanodiil C_{2-18}, un grupo arileno, un oligopéptido y un grupo oligo(alcoxi)alquilo.
Los ejemplos de reactivos adecuados se proporcionaron anteriormente.
Para la mayor utilidad, el procedimiento comprende una etapa siguiente en la que se hace reaccionar el ácido polisiálico funcional con un polipéptido o con una proteína que comprende por lo menos una unidad Cys libre y no protegida mediante la que el grupo funcional forma un enlace tioéter con el grupo tiol de la unidad Cys formando una proteína o péptido polisialilados. El procedimiento es particularmente adecuado cuando la proteína comprende una sola unidad Cys, mediante la que se logra la derivatización controlada en el lugar.
La presente invención se ilustra mediante los ejemplos adjuntos.
Ejemplos
2
1.1 Síntesis
Se realizaron 3 preparaciones diferentes tal como sigue:
Se disolvió aldehído de ácido colomínico (CAO) producido según WO-A-9222331 (100 mg, 4,4 x 10^{-6} mol) en 500 \mul de 0,1 M acetato sódico, a esto se le añadieron 5 equivalentes molares de ácido hidrazida de ácido N-[\beta-maleimido propiónico] (6,5 mg, 2,2 x 10^{-5} mol). Esta mezcla se mezcló en un vortex y se envolvió en papel de aluminio y se incubó a 37ºC durante 2h en mezclador rotativo. A continuación el polímero se precipitó mediante la adición de 2 volúmenes de (1,0 ml) etanol. El precipitado se recogió mediante centrifugación (13.000 rpm, 2 min) en una centrífuga de mesa. El sobrenadante se descartó y el precipitado se disolvió en 500 \mul de 0,1 M acetato. Este procedimiento se repitió 2 veces más y el precipitado final se disolvió en agua desionizada y se liofilizó durante la noche.
1.2 Ensayo de contenido en maleimida
En este ensayo se hace reaccionar cisteína con la maleimida en el polímero evitando la reacción con el reactivo de Ellman [ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico)] que comprende un disulfuro que genera un color amarillo intenso cuando se sustituye por un tiol no adyacente al anillo aromático. Así, el contenido en maleimida se puede calcular mediante la medición de la inhibición de la reacción ente la cisteína y el reactivo de Ellman.
En primer lugar se prepara un stock de cisteína a 12 x 10^{-3} M (0,145 mg/ml) en PBS. En una placa de pocillos microtitre limpia se producen diluciones dobles de 100 \mul desde 12 x 10^{-3} M hasta 0,375 x 10^{-3} M desde la tira B hasta la tira H. En la tira A se utilizan 100 \mul de PBS como estándar cero. Se preparan las muestras de CA y CA-maleimida (CAM) a 5 o 10 mg/ml y se añaden 100 \mul de cada muestra a columnas duplicadas de las diluciones de cisteína. En un conjunto se añaden 100 \mul de PBS sin CA como control. La placa se cubre y se deja incubar a 37ºC durante 1 hora. A continuación se añaden 20 \mul de reactivo de Ellman (4 mg/ml en PBS) a cada pocillo y se deja incubar la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación se mide la absorción de los pocillos a 405 nm. Se genera una gráfica de la curva estándar y las muestras y se calcula la cantidad de maleimida presente a partir de la inhibición de la señal.
1.4 Tiolación de FAb y conjugación a CAM
En la primera etapa se introduce un grupo tiol en una proteína modelo mediante la tiolación de una amina de la lisina.
FAb ovino (anti Desipramine/Norityrptaline, 4 mg, 7,2 x 10^{-8} mol) se disolvió en 0,25 ml PBS + 10 mM EDTA a esto se le añadieron 0,498 mg de 2-iminotiolane (2-IT, reactivo de Traut 50 equivalentes molares 3,6 x 10^{-8} mol) en 0,25 ml del mismo tampón. El tubo se envuelve en papel de aluminio y se deja incubar con agitación por volteo durante 1 h a 37ºC.
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3 
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El FAb tiolado se purificó del reactivo 2-IT de Traut libre mediante filtración por gel (PD-10) y se ensayaron fracciones de 0,5 ml para determinar la presencia de proteína (ensayo BCA) o tiol (ensayo de Ellman). El primer pico eluído que contenía los dos se juntó y se cuantificó la proteína y los tioles.
1.5 Conjugación de FAb-tiol a CAM
Al FAb tiolado (3,6 mg, 6,6 x 10^{-8} mol) en 2 ml de PBS/EDTA se le añadió 22,5 mg de CAM (9 x 10^{-7} mol, 15 equivalentes molares). El tubo se selló y se dejó incubar a 37ºC durante 1 hora a la vez que se agitó suavemente. El conjugado resultante se purificó de acuerdo con procedimientos aceptados con el fin de eliminar el CAM libre. Se ensayó el contenido tanto de CA como de proteína en el conjugado con el fin de determinar la proporción de conjugación.
Las reacciones control se realizaron en CA como control negativo.
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Se prepararon múltiples lotes de CAM-FAb con diferentes grados de tiolación pero manteniendo una proporción 15:1 de CAM:FAb. Los resultados se muestran en la Tabla 1 a continuación:
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TABLA 1
4
La Figura 1 muestra un gel SDS-PAGE de muestras por triplicado y los controles relevantes.
1.6 Conclusiones
Los resultados demuestran que en todos los pocillos control (muestras de FAb tiolado) la migración de las muestras es semejante a la de FAb reciente (por debajo del marcador de 50 kDa) indicando la ausencia de reticulación de la molécula de FAb durante el procedimiento de conjugación. En los carriles replicados existe un considerable ensanchamiento de las bandas con un máximo de intensidad entre los marcadores de 98 y los 250 KDa lo que indica típicamente un incremento en la masa indicativo de un producto sialilado.
1.7 Conjugación de CAM a beta galactosidasa
A 5,0 mg (4,3 x 10^{-8} mol) de \beta-galactosidasa de E. coli (\beta-gal) en 1 ml PBS se le añadieron 15 mg de CAM (6,59 x 10^{-7} mol, 15 equiv. molares). Se selló el tubo, se envolvió en papel de aluminio y se dejó incubar a temperatura ambiente durante 1 h mientras se agitó suavemente. El conjugado resultante se analizó mediante SDS PAGE y a continuación se purificó según procedimientos aceptados con el fin de eliminar el CAM libre. Las muestras se ensayaron para determinar el contenido en polímero y proteína tal como se indica en otro lugar.
Las reacciones de control se realizaron con CA como control negativo.
1.8 Ensayo de actividad enzimática
Se prepararon estándares que comprenden entre 60 \mug/ml y 3,75 \mug/ml en PBS de \beta-galactosidasa reciente. Las muestras de CAM-\beta-gal se diluyeron a 60 \mug/ml en el mismo tampón. La actividad enzimática de los conjugados se midió tal como sigue:
En una placa microtiter, a 100 \mul de muestra o estándar se le añadieron 100 \mul de sustrato All-in-One \beta-gal (Pierce). La placa se incubó a 37ºC durante 30 minutos y se leyó la absorbancia a 405 nm. Se preparó una curva de calibración con los estándares y se calculó la actividad de las muestras a partir de la ecuación de la curva de regresión lineal.
1.9 Resultados
A partir de los ensayos de proteína y polímero se determinó que la proporción de conjugación fue de 1,23 CAM:1 \beta-gal. También se produjo un incremento correspondiente en la masa molecular aparente a partir de la SDS-PAGE de las muestras (Figura 2). La actividad enzimática en las muestras purificadas se calculó que era del 100,4% en comparación con el enzima libre.
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Ejemplo 2
Vía de Síntesis 2
Etapa 1 Aminación de CA-aldehído (CHO)
5 
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Etapa 2 Introducción del anillo de maleimida
6
Síntesis 2.1 Etapa 1 Aminación de CA oxidado
Se disolvió ácido colomínico oxidado (CA) en entre 10 y 100 mg/ml en 2 ml de agua desionizada con un exceso molar de 300 veces en NH_{4}Cl, en tubos de 50 ml y a continuación se añadió NaCNBH_{3} (5 M stock en 1 N NaOH (acuoso)) a una concentración final de 5 mg/ml. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 días. Se preparó también una reacción control con ácido colomínico (A) en lugar de CAO. El derivado producto de amina de ácido colomínico se precipitó mediante la adición de 5 ml de etanol enfriado en hielo. El precipitado se recuperó mediante centrifugación a 4.000 rpm, durante 30 minutos, a temperatura ambiente en una centrífuga de mesa. El precipitado se recogió y se suspendió en 2 ml de agua desionizada, a continuación se precipitó otra vez con 5 ml de etanol enfriado en hielo en un tubo de centrífuga de 10 ml. El precipitado se recogió mediante centrifugación a 30.000 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. El precipitado se resupendió otra vez en 2 ml de agua desionizada y se liofilizó.
2.2 Ensayo del contenido en amina
Se utilizó el ensayo TNBS (ácido picrilsulfónico o ácido 2,4,6-tri-nitro-bencensulfónico) con el fin de determinar la cantidad de grupos amino presentes en el producto.
En un pocillo de una placa microtiter se añadió TNBS (0,5 \mul de 15 mM TNBS) a 90 \mul de 0,1 M tampón borato pH 9,5. A esto se le añadieron 10 \mul de una disolución de 50 mg/ml de CA-amida. A continuación la placa se deja reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente, antes de leer la absorbancia a 405 nm. Se utilizó glicina como estándar, a concentraciones comprendidas entre 0,1 y 1 mM. El TNBS trinitrofenila los grupos amino primarios. Se detecta el aducto TNP de la amina.
El ensayo del producto purificado mediante una doble precipitación con etanol enfriado en hielo utilizando el ensayo de TNBS demostró una conversión de aproximadamente 90%.
2.3 Maleimidación de CA-amina
Se disolvió CA-amina (17 mg) en 1 ml de agua desionizada, se le añadieron 6 mg de metoxi-carbonil-maleimida (MCM). La mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la muestra 1 se le añadieron 100 \mul de agua y 200 \mul de acetonitrilo y a continuación se incubó a temperatura ambiente durante 4 horas, después de lo cual se añadieron al tubo 300 \mul de CHCl_{3}, se agitó y se recogió la fase acuosa. A continuación se purificó la fracción sobre una columna PD-10 con el fin de eliminar las moléculas pequeñas. El eluído se liofilizó y se ensayó con el fin de determinar el contenido en maleimida. La concentración molar en maleimida fue de 44 mol%.
Ejemplo 3
Preparación de derivado de yodoacetato de ácido colomínico (CAI) 
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7 
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3.1 Síntesis
A 40 mg de amina de ácido colomínico (85 mol% de amina) tal como se describió en el Ejemplo 1, disueltos en 1 ml de PBS pH 7,4, se le añadieron 5 mg de N-succinimidil yodoacetato (SIA). La mezcla se dejó reposar durante 1 h a 37ºC, después de lo cual el exceso de SIA se eliminó mediante filtración en una columna de 5 ml de gel de desalado Hightrap^{TM} (AP Bioscience) eluido con PBS. Se recogieron fracciones de la columna de 0,5 ml y las muestras de cada fracción se ensayaron con el fin de determinar el contenido en ácido colomínico (ensayo de resorcinol) y la reactividad con cisteína que indica yoduro (ensayo de Ellman). Las fracciones positivas a yoduro y CA se juntaron.
3.2 Conjugación de CAI a \beta-galactosidasa
A \beta-galactosidasa de E. coli (5,0 mg, 4,3 x 10^{-8} mol) en 1 ml de PBS se le añadieron 15 mg de CAI (6,59 x 10^{-7}, 15 equiv. molares). El tubo se selló, se envolvió en papel de aluminio y se dejó incubar a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave. El conjugado resultante se analizó mediante SDS-PAGE y a continuación se purificó según procedimientos aceptados con el fin de eliminar el CAI libre. Las muestras se ensayaron para determinar el contenido en polímero y proteína tal como se indicó en otro lugar.
Se realizaron reacciones control con CA como control negativo. Todas las muestras se analizaron con el fin de determinar actividad de \beta-gal como en el Ejemplo 1.8 anterior.
3.3 Conclusiones
Las fracciones 3 a 6 fueron positivas tanto para el polímero como para yodoacetato y se juntaron. Mediante SDS-PAGE (gel de 4-12%, Bis/Tris; Figura 2) se demostró un incremento en la masa molecular aparente en las muestras incubadas con derivado de yodoacetamida pero no con el polímero control. De los ensayos de proteína y polímero se determinó que la proporción de conjugación fue de 1,63 CAI:1 \beta-gal. Se calculó que la actividad de \beta-gal fue del 100.9% para la muestra conjugada, en comparación con la forma libre del enzima.
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Ejemplo 4
4.1 Síntesis: Activación de extremos no reductores con hidrazida de ácido 4(4-N-maleimidofenil) butírico (CA-MBPH) y 3-(2-piridiltio) propionil hidrazida (CA-PDPH)
Las preparaciones se realizaron tal como sigue:
El aldehído de ácido colomínico (CAO; 22,7 kDa, Camida, Irlanda) producido según WO-A-9222331 (73 mg para el MBPH, tubo A; 99,3 mg para PDPH; tubo B) se disolvió individualmente en 800 ml de 0,1 M acetato sódico (pH 5,5). Al tubo A se le añadieron 15 mg de MPPH (proporción de 15:1, conector:CA) de PDPH disuelto en 200 \mul de DMSO. Al tubo B se le añadieron 15 mg de PDPH (proporción 15:1 de conector:CA) disueltos en 200 \mul de DMSO. El pH se ajustó a 5,5 en cada caso en cada recipiente de reacción. Las mezclas a continuación se mezclaron mediante vortex y se envolvieron en papel de aluminio y se incubaron a 37ºC durante 2 horas en un mezclador orbital. Cada disolución de polímeros se purificó mediante filtración por gel (columnas de PD 10) se eluyó con PBS pH 7,4 y se recogió la fracción de 1 ml que contenía CA (por ensayo de resorcinol). Estas muestras se liofilizaron durante la noche y se ensayaron con el fin de determinar el contenido en maleimida tal como se describió en el Ejemplo 1.2.
4.2 Síntesis: Activación del extremo reductor con hidrazida de ácido 4(4-N-maleimidofenil) butírico (MPBH-CA), (2-piridiltio)propil hidrazida (PDPH-CA) y hidrazida de ácido N-\beta-maleimido propiónico) hidrazida (BMPH-CA)
Las preparaciones se realizaron tal como sigue todas ellas a una proporción molar de 25:1 conector:CA:
Ácido colomínico (CA, 22,7 kDa; 73 mg para MBPH, Tubo A; 99,3 mg para PDPH; tubo B y 76,6 mg para BMPH; tubo C) se disolvió individualmente por separado en 800 \mul de 0,1 M acetato sódico (pH 5,5). Al tubo A, se le añadieron 25 mg de MBPH (disuelto en 200 \mul de DMSO), al tubo B, se le añadieron 25 mg de PDPH (disuelto en 200 \mul de DNSO) y al tubo C se le añadieron 25 mg de BMPH (disuelto en 200 \mul de tampón de acetato sódico). El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 5,5. Cada una de las mezclas se mezcló mediante vortex, se envolvió en papel de aluminio y se dejó incubar a 37ºC durante 72 horas en un agitador orbital. Cada disolución de polímero se purificó mediante filtración en gel (columna PD 10) se eluyó con PBS pH 7,4 y se recogió la fracción de 1 ml que contiene el CA (mediante ensayo de resorcinol). Las muestras se liofilizaron durante la noche y se ensayaron para determinar el contenido en maleimida tal como se describió en el Ejemplo 1,2.
4.3 Resultados
La concentración molar de maleimida fue de 49,0 y 35,0 mol% para MBPH y PDPH respectivamente en el extremo no reductor (altamente reactivo). La concentración molar de maleimida fue de 41,5, 32,5 y 48,3 mol% para MBPH, PDPH y BMPH respectivamente en el extremo reductor (débilmente reactivo). Los valores en el extremo reductor son el promedio de dos valores en cada caso.
4.4 Conjugación de \beta-galactosidasa (\beta-gal) a ácidos colomínicos activado mediante maleimida (extremo reductor y extremo no reductor)
A \beta-gal en diferentes tubos se le añadió por separado un exceso de 15 veces de cada uno de los CA activados mediante maleimida (MBPH, PDPH y BMPH en el extremo no reductor o en el extremo reductor, de los ejemplos anteriores) Cada tubo se selló y se dejó incubar a 37ºC durante 1 h a la vez que se agitó suavemente. Los conjugados resultantes se purificaron según procedimientos aceptados con el fin de eliminar polímero activado libre. Todas las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE y para determinar la actividad de \beta-gal tal como en el Ejemplo 1.8.
4.5 Resultados
Los resultados (Figura 3) muestran que en todos los pocillos control (con \beta-gal) la migración de la muestra es semejante a la de la \beta-gal fresca. En los carriles de conjugado se produjo un considerable ensanchamiento de las bandas con intensidad máxima entre los marcadores de 98 y 250 Kda que típicamente indica un incremento en la masa a su vez indicativo de una \beta-gal-polisialilada. Se calculó que la actividad \beta-gal estuvo comprendida entre el 91,0 y el 106% para las muestras conjugadas.

Claims (29)

1. Compuesto que comprende un polisacárido que presenta por lo menos dos unidades de ácido siálico unidas 2,8 y/o 2,9 entre sí y que presenta una parte pendiente unida a por lo menos una unidad terminal derivada de una unidad de ácido siálico que comprende un grupo funcional seleccionado de entre los grupos N-maleimido, grupos vinilsulfona, grupos N-yodoacetamida y grupos ortopiridil disulfuro.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que la parte pendiente se encuentra unida en la unidad terminal reductora del polisacárido.
3. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en el que la parte se encuentra unida en la unidad terminal no reductora del polisacárido.
4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la parte comprende un grupo alcanodiilo y/o un grupo arileno y una unión opcionalmente en combinación con un grupo oxalquileno o un grupo oligooxa-alquileno que es una unión de amina secundaria, una hidrazona, una unión alquil hidrazida o una unión peptídica.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el grupo funcional es el N-maleimido.
6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polisacárido es un ácido polisiálico.
7. Compuesto según la reivindicación 6, en el que el polisacárido está sustancialmente constituido por únicamente unidades de ácido siálico.
8. Compuesto según la reivindicación 1, que presenta la fórmula
8
en la que se aplica uno de los siguientes grupos de definiciones:
i) R^{1} es H o -CHOHCH_{2}OH, R^{2} es OH y R^{3} es o -CH_{2}CHR^{4}R^{5} o -CH(CH_{2}O)CHR^{4}R^{5} en la que R^{4} y R^{5} conjuntamente representan =N-NR^{6} o R^{4} es H y R^{5} es -NR^{6}R^{7} en la que R^{6} es un grupo orgánico que comprende dicho grupo funcional seleccionado de entre N-maleimido, vinilsulfona, N-yodo-acetamido y ortodipiridilo o es H, y R^{7} es H o R^{6} y R^{7} de manera conjunta son un grupo 1,3-buta-2-enedioilo;
ii) R^{1} y R^{2} de manera conjunta representan =N-NR^{6} o R^{1} es H y R^{2} es -NR^{6}R^{7} en la que R^{6} es un grupo orgánico que comprende dicho grupo funcional, y R^{7} es H o R^{6} y R^{7} de manera conjunta son un grupo 1,3-but-2-enedioilo;
Gly-O es un grupo glicosilo (sacárido);
n es 0 o más; y
Ac es acetilo.
9. Compuesto según la reivindicación 8, en el que cada Gly es una unidad de ácido siálico.
10. Compuesto que comprende una proteína con por lo menos una unidad de cisteína libre y, unido a través de un enlace tioéster a la cadena lateral de la unidad de cisteína, con un ácido polisiálico, a través de una parte unida a una o cada una de las unidades terminales del ácido polisiálico, en el que el ácido polisiálico presenta por lo menos 2 unidades de ácido siálico unidas 2,8 y/o 2,9 entre sí.
11. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el polisacárido, o según la reivindicación 10 en el que el ácido polisiálico comprende por lo menos 10 unidades de ácido siálico.
12. Compuesto según las reivindicaciones 10 u 11, en el que el ácido polisiálico o el polisacárido, según sea el caso, presenta por lo menos 50 unidades de ácido siálico.
13. Procedimiento en el que un polisacárido que presenta por lo menos dos unidades de ácido siálico unidas 2,8 y/o 2,9 entre sí y que comprende por lo menos una unidad terminal que se deriva de una unidad de ácido siálico se hace reaccionar con un reactivo heterobifuncional que presenta un primer grupo funcional seleccionado de entre grupos N-maleimido, grupos vinilsulfona, grupos N-yodoacetamida y grupos ortopiridil disulfuro y un segundo grupo funcional diferente del primer grupo por lo que dicho segundo grupo funcional reacciona con dicha unidad terminal derivada de ácido siálico para formar un enlace covalente con la misma y formar un polisacárido funcional adecuado para la conjugación selectiva con un grupo tiol.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho segundo grupo funcional es un grupo nucleófilo.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el grupo nucleófilo es la hidrazina.
16. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la unidad terminal del polisacárido presenta un grupo carbonilo que reacciona con dicho grupo nucleófilo.
17. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho segundo grupo funcional es un grupo electrófilo.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que el grupo electrófilo es una parte N-alcoxicarbonil-imida o carbodiimida.
19. Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, en el que la unidad terminal del polisacárido presenta un grupo amina que reacciona con dicho grupo electrófilo.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que se forma una unión peptídica o de uretano.
21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, en el que el reactivo comprende un grupo orgánico bifuncional que une los primer y segundo grupos funcionales.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que el grupo bifuncional orgánico se selecciona de entre un grupo C_{2-18}-alcanodiilo, un grupo arileno, un oligopéptido y un grupo oligo(alcoxi)alquilo.
23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 22, en el que el primer grupo funcional es un grupo N-maleimido.
24. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el reactivo presenta la fórmula general
X-R-Y
en la que
X es un grupo N-maleimido, N-yodoacetamido, S-vinilsulfonilo o S-ortopiridildisulfuro,
R es un grupo alacano-diilo, arileno o aralquileno alcarileno, alquilen-oxaalquileno o alquilen-oligooxa-alquileno o alquil-oligopeptidil-alquilo; e
Y es un grupo hidrazida, amina o N-hidroxisuccinimido.
25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 24, en el que el polisacárido presenta por lo menos 10 unidades de ácido siálico.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que el polisacárido presenta por lo menos 50 unidades de ácido siálico.
27. Procedimiento según la reivindicación 25 ó 26, en el que las unidades de ácido siálico se encuentran unidas 2\rightarrow8 y/o 2\rightarrow9 entre sí.
28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 27, en el que el ácido polisiálico funcional es un ácido polisiálico maleimido-funcional y se hace reaccionar con un polipéptido o una proteína que presenta por lo menos una unidad de Cys libre desprotegida por lo que el grupo maleimido forma un enlace tioéter con el grupo tiol de una unidad de Cys formando una proteína o un polipéptido polisialilados.
29. Procedimiento en el que un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 se hace reaccionar con un polipéptido o con una proteína que presenta por lo menos una unidad Cys libre y desprotegida por lo que dicho grupo funcional forma un enlace tioéter con el grupo tiol de una unidad Cys para formar un conjugado del polisacárido con el polipéptido o la proteína.
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