ES2294535T3 - Derivados del acido polisialico. - Google Patents
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Abstract
Compuesto que comprende un polisacárido que presenta por lo menos dos unidades de ácido siálico unidas 2, 8 y/o 2, 9 entre sí y que presenta una parte pendiente unida a por lo menos una unidad terminal derivada de una unidad de ácido siálico que comprende un grupo funcional seleccionado de entre los grupos N-maleimido, grupos vinilsulfona, grupos N-yodoacetamida y grupos ortopiridil disulfuro.
Description
Derivados del ácido polisiálico.
La presente invención se refiere a derivados del
ácido polisiálico de utilización en la conjugación de fármacos,
proteínas y péptidos, o en sistemas de administración de fármacos
tales como liposomas, con grupos sulfidrilo, así como a un
procedimiento de productos conjugados para sintetizar los derivados
y los conjugados y nuevos intermediarios sintéticos.
La presencia prolongada de fármacos en el
sistema vascular o en su utilización extravascular es frecuentemente
un prerrequisito para una utilización óptima. Una multiplicidad de
antibióticos y citostáticos, por ejemplo, así como también
múltiples péptidos y proteínas terapéuticas y liposomas son
eliminados de la circulación prematuramente y antes de que alcancen
una concentración efectiva en los tejidos diana. Las vidas medias de
múltiples proteínas de vida corta (por ejemplo, enzimas, citocinas,
etc.) se amplifican mediante su conjugación a
poli(etilenglicol) de bajo peso molecular. Parece ser que las
moléculas de PEG prolongan el tiempo de circulación de las
proteínas y partículas mediante la formación de una nube alrededor
de su superficie, impidiendo así la interacción con los factores
responsables de su eliminación. Sin embargo, el PEG no es
biodegradable y la acumulación intracelular de proteínas PEGiladas
puede ser considerable especialmente con su utilización crónica
[Bendele, A., Seely, J. Richey, C., Sennello, G., Shopp, G., Renal
tubular vacuolation in animals treated with
polyethylene-glicol conjugated proteins,
Toxicological Sciences, 42:152-157 (1998);
Convers, C.D., Lejeune, L., Shum, K., Gilbert, C., Shorr, R.G.L.,
Physiological Effects of polyethylene glycol conjugation on
stroma-free bovine hemoglobin in conscious dogs
after partial exchange transfusión, Artificial Organ,
21:369-378 (1997)].
Se ha descrito por parte de los presentes
inventores la conjugación de un polisacárido que comprende unidades
de ácido siálico unidas 2\rightarrow8 y 2\rightarrow9 (por
ejemplo, 2\rightarrow8 y 2\rightarrow9 alternativos) conjugadas
a proteínas con el fin de incrementar su vida media, reducir su
inmunogenicidad/antigenicidad o incrementar la estabilidad de
múltiples proteínas. En WO 92/22331, se hacen reaccionar ácidos
polisiálicos con una fármaco modelo y se demuestra que extiende su
vida media en la circulación de los ratones. En Cell. Mol. Life
Sci. 57:1964-1969 (2000) y en Biotechnol.
Genet. Eng. Rev., 16:203-215 (1999), Gregoriadis
et al., describen la conjugación de ácidos polisiálicos con
asparraginasa y catalasa y demuestran que se redujo la velocidad de
eliminación de la circulación a la vez que se retuvo la actividad
enzimática. También hemos polisializado insulina (Biochem.
Biophys. Acta 1622:42-49 (2003) y demostrado que
permanece activa. Los presentes inventores asimismo han
polisializado interferón (AAPS Annual Meeting 2002, Toronto, Canada,
M1056). Los presentes inventores han polisializado asimismo el
fragmento Fab de anticuerpos [Epenetos, A., et al.,
Proceedings of ASCO (Clinical Pharmacy)21
(2002)2186].
En todas estas publicaciones, se activa el ácido
polisiálico mediante la generación de un grupo aldehído en el
extremo no-reductor mediante la oxidación con
periodato sódico del diol vecinal 7-8. A
continuación se hizo reaccionar el grupo aldehído con los grupos de
amina primaria en las proteínas, que generalmente se asume que son
los grupos epsilon-amino de las lisinas de las
proteínas o los grupos amino N-terminales. La
reacción genera una base Schiff que se reduce mediante
cianoborohidruro a una amina secundaria.
En WO-A-01/87922
también se sugiere que la derivatización con otras moléculas se
podría realizar en presencia de un desnaturalizante con el fin de
lograr un nivel de derivatización superior. Otros ejemplos de
agentes derivatizantes son los compuestos de polietilenglicol. Se
mencionan los compuestos de PEG activado tales como el
tresil-PEG y el éster de succinimidil succinato de
PEG. Los ejemplos utilizaron PEG activado mediante succinimidil
succinato, que se cree que reacciona con los grupos amina.
Los derivados de PEG con grupos funcionales
destinados al acoplamiento a grupos tiol se encuentran
comercialmente disponibles. Los grupos funcionales pueden ser
maleimida, vinilo, sulfona, yodoacetamida u ortopiridil disulfuro.
Debido a que dichos reactivos reaccionan específicamente con las
cisteínas, y debido a que las proteínas poseen menos cisteínas en
su superficie que grupos lisina, la derivatización es más
controlable. Además, en ausencia de un grupo de cisteína libre en
una proteína nativa, se pueden añadir una o más cisteínas libres
mediante ingeniería genética. La ventaja de esta estrategia es que
hace posible la derivatización en lugares específicos de zonas de
la proteína que minimizarán la pérdida de actividad biológica.
Se ha descubierto que las proteínas PEGiladas
generan anticuerpos antiPEG que también pueden afectar el tiempo de
residencia del conjugado en la circulación sanguínea [Chern, T., Wu,
M., Wu, P., Chern, J., Roffer, SR., Accelerated clearance of
polyethylene glycol modified proteins by
anti-polyethylene glycol IgM., Bioconjugate
Chemistry, 10:520-528 (1999)]. A pesar de la
historia establecida del PEG como polímero conjugado a fármacos
administrados parenteralmente, se necesitará un mayor conocimiento
de su inmunotoxicología, farmacología y metabolismo [Hunter, A.C.,
Moghimi, S. M., Therapeutic synthetic polymers: a game of Russian
Roulette. Drug Discovery Today, 7:998-1001
(2002); Brocchini, S., Polymers in medicine: a game of chess,
Drug Discovery Today, 8:111-112 (2003)].
Las modificaciones del ácido polisiálico
dirigidas a los grupos tiol (sulfidrilo) resultarían útiles. También
sería deseable el incremento en la eficacia de la derivatización
mediante ácido siálico; el procedimiento descrito en la técnica
anterior mencionado anteriormente necesitó un gran exceso de ácido
polisiálico activo. También sería necesario evitar la utilización
de cianoborohidruro.
Según la presente invención se proporciona un
nuevo compuesto que comprende un polisacárido que comprende por lo
menos dos unidades de ácido siálico unidas 2,8 ó 2,9 entre sí y
provistas de una parte unida a una o a cada una de las unidades
terminales derivadas de una unidad de ácido siálico que comprende un
grupo funcional seleccionado de entre los grupos
N-maleimido, grupos vinilsulfona, grupos
N-yodoacetamida y grupos ortopiridil disulfuro.
La unidad terminal a la que la parte se
encuentra unida puede encontrarse en el extremo no reductor del
ácido polisiálico o en el extremo reductor del ácido polisiálico.
Generalmente la unidad terminal de ácido siálico ha sido sometida a
una reacción química preliminar destinada a generar grupos
funcionales de utilidad a los que se puedan unir reactivos que
comprendan grupos maleimido. Se ha considerado conveniente utilizar
la química dada a conocer en nuestras publicaciones anteriores en
las que se genera un grupo aldehído, como etapa preliminar a la
generación de un grupo funcional mediante el que se puede unir la
parte maleimido.
En las publicaciones previas de los presentes
inventores mencionadas anteriormente, es la unidad terminal no
reductora la que se convierte en una porción aldehído mediante
oxidación de la parte diol vecinal 7,8 con periodato sódico con el
fin de formar el compuesto aldehído en el carbono 7. Esta es una
reacción apropiada para la presente invención.
Como alternativa, es posible proporcionar la
parte aldehído en la unidad terminal reductora. En este caso, es
preferible (pero no esencial) realizar una etapa preliminar en la
que se desactiva el extremo no reductor, mediante etapas de
oxidación y reducción preliminares. Una primera etapa de reducción
convierte la unidad cetal en el extremo reductor en una forma
abierta de anillo reducido, provisto de dioles vecinales. Los dioles
próximos a continuación se oxidan mediante la utilización de
periodato sódico con el fin de formar un aldehído en el primer
átomo de carbono que formaba anteriormente el carbono 7 de la unidad
terminal reductora. Mientras que el glicosilo terminal no reductor
(generalmente ácido siálico) no se desactiva mediante una etapa
preliminar de oxidación, la unidad terminal se activará
simultáneamente.
En la presente invención, la parte que comprende
el grupo funcional, se puede unir directamente a la unidad de ácido
polisiálico, más convenientemente, se puede unir mediante un grupo
orgánico difuncional, tal como un grupo diol de alcano, un grupo
arileno o un grupo alcano oligo(alquilenoxi), o por el
contrario un grupo oligo peptidilo. La unión al ácido polisiálico
(desde el conector o la parte que comprende el grupo funcional
puede ser una amina secundaria, una hidrazona, una alquilhidracina
un éster o un grupo peptidilo. La parte puede ser generada mediante
la reacción de un sustrato de ácido polisiálico con un reactivo
heterobifuncional. El procedimiento constituye otro aspecto de la
presente invención.
Los reactivos de utilidad para introducir los
grupos funcionales seleccionados se encuentran comercialmente
disponibles. Un compuesto que introducirá un grupo maleimido en una
parte amina sin introducir ninguna unidad de unión adicional es la
N-metoxi-carbonil-maleimida.
Generalmente los reactivos comprenden un segundo grupo funcional
para reaccionar con un grupo en el ácido polisiálico que puede ser
el grupo aldehído descrito anteriormente, o un grupo amina. Los
segundos grupos funcionales adecuados comprenden ésteres de
N-hidroxi succinimida y sus análogos
sulfosuccinimida e hidrazidas. Preferentemente el compuesto es una
hidrazida de ácido
N-maleimido-alcanoico, es decir, un
compuesto de fórmula general
X-R-Y
en el
que:
X es un grupo N-maleimido,
N-yodoacetamido, S-vinilsulfonilo o
S-ortopiridildisulfuro,
R es un grupo alcano-diilo,
arileno o aralquileno alcarileno,
alquilen-oxaalquileno o
alquileno-oligooxa-alquileno o
alquil-oligopeptidil-alquilo; e
Y es un grupo hidrazido, amino o
N-hidroxisuccinimido.
Preferentemente R es alcanodiilo
C_{1-6},
C_{2-3}-alquil-oxa-C_{2-3}-alquileno,
C_{2-3}
alquil-oligo(oxa-C_{2-3}
alquileno), o fenil alquileno C_{2-6}.
Preferentemente X es N-maleimido
o ortopiridildisulfuro.
Preferentemente Y es una hidrazida o una
hidroxil succinimida.
Los compuestos que se pueden hacer reaccionar
con un grupo aldehído y que comprenden un parte conectora e
introducen un grupo maleimida comprenden ácido
N-[\beta-maleimidopropiónico] hidracina y ácido
hidrazido
4-(4-N-maleimidofenil)butírico.
El grupo hidrazida reacciona con el aldehído para formar un grupo
hidrazona estable. Un compuesto heterobifuncional adecuado que
comprende un grupo etilen oligo(etilenoxi) se un compuesto
que comprende un grupo polietilenglicol (poli(etilenoxi))
con, en un extremo; un grupo N-hidroxisuccinimida
(NHS) y el grupo funcional en el otro extremo. El grupo NHS
reacciona con grupos amina formando enlaces amida estables. Los
polietilenglicoles heterobifuncionales con NHS en un extremo y
vinilsulfona o maleimida en el otro extremo se encuentran
disponibles. Otros ejemplos de reactivos heterobifuncionales
comprenden 3-(2-piridilditio)propionil
hidrazida,
N-succinimidil-3-[2-piridilditio]propionato,
succinimidil-H-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato),
éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida,
N-succinimidil-[4-yodoacetil] amino
benzoato, éster de N-[gamma-malei-
midobutiriloxi]succinimida, éster de N-[epsilon-maleimidocaproiloxi]succinimida y N-succinimidil yodoacetato.
midobutiriloxi]succinimida, éster de N-[epsilon-maleimidocaproiloxi]succinimida y N-succinimidil yodoacetato.
Se encuentran disponibles otros reactivos de
Pierce Biotechnology y Shearwater Corporation (a base de
polietilenglicol).
Los ácidos siálicos (también conocidos como
ácidos nonulosónicos) son miembros de una familia de
amino-azúcares que comprenden 9 o más átomos de
carbono. El ácido siálico más importante es el ácido
N-acetilneuramínico (también conocido como ácido
5-(acetilamino)-3,5-dideoxi-D-glicero-D-galacto-nonulosónico,
ácido lactamínico y ácido O-siálico) de
fórmula:
Los ácidos polisiálicos pueden estar unidos
2\rightarrow8 y/o 2\rightarrow9, generalmente en la
configuración \alpha. En algunos ácidos polisiálicos las uniones
son 2\rightarrow8 y 2\rightarrow9 alternativamente. La presente
invención también es de utilidad para los polisacáridos
heteropoliméricos que comprenden unidades glicosilo diferentes de
las unidades de ácido siálico.
Los ácidos polisiálicos son generalmente no
tóxicos y sustancialmente no-inmunogénicos. Además,
las unidades de biodegradación, ácido siálico, no es conocido que
sean tóxicas y, desde luego, los ácidos siálicos se encuentran
ampliamente distribuidos en las proteínas animales y en las células,
comprendidas las células sanguíneas y proteínas circulantes.
Los compuestos de polisacáridos que comprenden
muchas unidades de ácido siálico son los polisacáridos producidos
por Escherichia coli o Moraxella nonliquifaciens,
Pasteurella aeroginosis y Neisseria meningitidis o
derivados de las mismas. Por ejemplo, los derivados de ácido
colominico (mediante hidrólisis para acortar la longitud de cadena)
de E. coli KI comprenden unidades de ácido siálico conectadas
\alpha-2->8.
El polisacárido de la cepa de E. coli K92
comprende unidades de ácido siálico unidas alternativamente
2\rightarrow8 y 2\rightarrow9. El polisacárido C del grupo C de
N. meningitidis comprende unidades de ácido siálico unidas
2\rightarrow9.
Un grupo de compuestos de polisacárido de gran
utilización que se ha descubierto posee gran utilidad en la
presente invención es el grupo de polisacáridos B Estos compuestos
son el producto de N. meningitidis y M.
nonliquifaciens, P. aeroginosis A2 y E. coli K1.
Dichos compuestos comprenden un componente de polisacárido que
comprende residuos de ácidos siálico y componentes de fosfolípido.
Los residuos de ácido siálico se encuentran unidos
(2\rightarrow8)-\alpha, el polímero natural
comprende del orden de 200 residuos. Algunas de las moléculas de
glicolípido, en particular las de los compuestos de elevado peso
molecular parecen poseer un fosfolípido enlazado covalentemente en
el extremo reductor del componente de polisacárido.
Resulta preferido que las bacterias de las que
se deriva el polisacárido sean del tipo no patógeno con el fin de
facilitar la producción. Es particularmente adecuado, por
consiguiente, que el polisacárido provenga de un cepa no patológica
de E. coli tal como E. coli K92 o, preferentemente, K1
que no es inmunogénica. Las cepas de E. coli K92 y K1 son
bien conocidas y se puede utilizar un tipo cualquiera de cada una de
dichas cepas como fuente de polisacárido adecuado. Preferentemente
el polisacárido debería tener por lo menos 2, preferentemente por
lo menos 5, más preferentemente por lo menos 10, por ejemplo, más de
50 unidades de ácido siálico.
Según la presente invención, también se
proporciona un conjugado de una proteína y el nuevo polisacárido
activado. El nuevo compuesto comprende una proteína con por lo
menos una unidad de cisteína y, unido mediante un enlace de tioéter
a la cadena lateral de la unidad de cisteína, un ácido polisiálico
mediante una parte enlazada a una, o a las dos unidades terminales
del ácido polisiálico.
Cuando el derivado de ácido polisiálico fue un
grupo N-maleimido la parte debe incluir un grupo
N-succinimidilo, con el tioéster unido en el átomo
de carbono \alpha. Preferentemente la parte comprende también una
amina secundaria, una hidrazona o un enlace amida.
En la presente invención también se proporciona
un nuevo procedimiento en el que un polisacárido con por lo menos
dos unidades de ácido siálico unidas 2,8 ó 2,9 entre sí y comprende
por lo menos una unidad terminal que está derivada de una unidad de
ácido siálico, preferentemente u ácido polisiálico, se hace
reaccionar con un reactivo heterobifuncional que comprende un
primer grupo funcional para reaccionar con grupos sulfidrilo y un
segundo grupo funcional diferente del primero en el que dicho
segundo grupo funcional reacciona con una unidad terminal de ácido
polisiálico para formar un enlace covalente con éste y generar ácido
polisiálico funcional capaz de reaccionar con un ácido polisiálico
con un grupo tiol funcional.
En una forma de realización de la presente
invención el segundo grupo funcional es un grupo nucleófilo,
preferentemente una hidracina. Esto es de particular utilidad
cuando el ácido polisiálico comprende un grupo aldehído en la
unidad terminal cuyo grupo carbonilo es atacado por el grupo el
grupo nucleófilo.
En otra forma de realización de la presente
invención del procedimiento el segundo grupo funcional es un grupo
electrófilo tal como una N-alcoxil
carbonil-imida tal como el éster de
N-hidroxisuccinimida, el éster de sulfosuccinimida,
o la carbodiimida. El grupo terminal en cada caso es preferentemente
un nucleófilo tal como la amina.
En el proceso se prefiere que el reactivo
comprenda un grupo orgánico bifuncional que enlaza el primer y el
segundo grupo funcional. Preferentemente el grupo orgánico
bifuncional se selecciona de entre el grupo que comprende un grupo
alcanodiil C_{2-18}, un grupo arileno, un
oligopéptido y un grupo oligo(alcoxi)alquilo.
Los ejemplos de reactivos adecuados se
proporcionaron anteriormente.
Para la mayor utilidad, el procedimiento
comprende una etapa siguiente en la que se hace reaccionar el ácido
polisiálico funcional con un polipéptido o con una proteína que
comprende por lo menos una unidad Cys libre y no protegida mediante
la que el grupo funcional forma un enlace tioéter con el grupo tiol
de la unidad Cys formando una proteína o péptido polisialilados. El
procedimiento es particularmente adecuado cuando la proteína
comprende una sola unidad Cys, mediante la que se logra la
derivatización controlada en el lugar.
La presente invención se ilustra mediante los
ejemplos adjuntos.
Se realizaron 3 preparaciones diferentes tal
como sigue:
Se disolvió aldehído de ácido colomínico (CAO)
producido según WO-A-9222331 (100
mg, 4,4 x 10^{-6} mol) en 500 \mul de 0,1 M acetato sódico, a
esto se le añadieron 5 equivalentes molares de ácido hidrazida de
ácido N-[\beta-maleimido propiónico] (6,5 mg, 2,2
x 10^{-5} mol). Esta mezcla se mezcló en un vortex y se envolvió
en papel de aluminio y se incubó a 37ºC durante 2h en mezclador
rotativo. A continuación el polímero se precipitó mediante la
adición de 2 volúmenes de (1,0 ml) etanol. El precipitado se recogió
mediante centrifugación (13.000 rpm, 2 min) en una centrífuga de
mesa. El sobrenadante se descartó y el precipitado se disolvió en
500 \mul de 0,1 M acetato. Este procedimiento se repitió 2 veces
más y el precipitado final se disolvió en agua desionizada y se
liofilizó durante la noche.
En este ensayo se hace reaccionar cisteína con
la maleimida en el polímero evitando la reacción con el reactivo de
Ellman [ácido
5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico)]
que comprende un disulfuro que genera un color amarillo intenso
cuando se sustituye por un tiol no adyacente al anillo aromático.
Así, el contenido en maleimida se puede calcular mediante la
medición de la inhibición de la reacción ente la cisteína y el
reactivo de Ellman.
En primer lugar se prepara un stock de cisteína
a 12 x 10^{-3} M (0,145 mg/ml) en PBS. En una placa de pocillos
microtitre limpia se producen diluciones dobles de 100 \mul desde
12 x 10^{-3} M hasta 0,375 x 10^{-3} M desde la tira B hasta la
tira H. En la tira A se utilizan 100 \mul de PBS como estándar
cero. Se preparan las muestras de CA y CA-maleimida
(CAM) a 5 o 10 mg/ml y se añaden 100 \mul de cada muestra a
columnas duplicadas de las diluciones de cisteína. En un conjunto
se añaden 100 \mul de PBS sin CA como control. La placa se cubre
y se deja incubar a 37ºC durante 1 hora. A continuación se añaden 20
\mul de reactivo de Ellman (4 mg/ml en PBS) a cada pocillo y se
deja incubar la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante
15 minutos. A continuación se mide la absorción de los pocillos a
405 nm. Se genera una gráfica de la curva estándar y las muestras y
se calcula la cantidad de maleimida presente a partir de la
inhibición de la señal.
En la primera etapa se introduce un grupo tiol
en una proteína modelo mediante la tiolación de una amina de la
lisina.
FAb ovino (anti Desipramine/Norityrptaline, 4
mg, 7,2 x 10^{-8} mol) se disolvió en 0,25 ml PBS + 10 mM EDTA a
esto se le añadieron 0,498 mg de 2-iminotiolane
(2-IT, reactivo de Traut 50 equivalentes molares 3,6
x 10^{-8} mol) en 0,25 ml del mismo tampón. El tubo se envuelve
en papel de aluminio y se deja incubar con agitación por volteo
durante 1 h a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El FAb tiolado se purificó del reactivo
2-IT de Traut libre mediante filtración por gel
(PD-10) y se ensayaron fracciones de 0,5 ml para
determinar la presencia de proteína (ensayo BCA) o tiol (ensayo de
Ellman). El primer pico eluído que contenía los dos se juntó y se
cuantificó la proteína y los tioles.
Al FAb tiolado (3,6 mg, 6,6 x 10^{-8} mol) en
2 ml de PBS/EDTA se le añadió 22,5 mg de CAM (9 x 10^{-7} mol, 15
equivalentes molares). El tubo se selló y se dejó incubar a 37ºC
durante 1 hora a la vez que se agitó suavemente. El conjugado
resultante se purificó de acuerdo con procedimientos aceptados con
el fin de eliminar el CAM libre. Se ensayó el contenido tanto de CA
como de proteína en el conjugado con el fin de determinar la
proporción de conjugación.
Las reacciones control se realizaron en CA como
control negativo.
\newpage
Se prepararon múltiples lotes de
CAM-FAb con diferentes grados de tiolación pero
manteniendo una proporción 15:1 de CAM:FAb. Los resultados se
muestran en la Tabla 1 a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 muestra un gel
SDS-PAGE de muestras por triplicado y los controles
relevantes.
Los resultados demuestran que en todos los
pocillos control (muestras de FAb tiolado) la migración de las
muestras es semejante a la de FAb reciente (por debajo del marcador
de 50 kDa) indicando la ausencia de reticulación de la molécula de
FAb durante el procedimiento de conjugación. En los carriles
replicados existe un considerable ensanchamiento de las bandas con
un máximo de intensidad entre los marcadores de 98 y los 250 KDa lo
que indica típicamente un incremento en la masa indicativo de un
producto sialilado.
A 5,0 mg (4,3 x 10^{-8} mol) de
\beta-galactosidasa de E. coli
(\beta-gal) en 1 ml PBS se le añadieron 15 mg de
CAM (6,59 x 10^{-7} mol, 15 equiv. molares). Se selló el tubo, se
envolvió en papel de aluminio y se dejó incubar a temperatura
ambiente durante 1 h mientras se agitó suavemente. El conjugado
resultante se analizó mediante SDS PAGE y a continuación se
purificó según procedimientos aceptados con el fin de eliminar el
CAM libre. Las muestras se ensayaron para determinar el contenido en
polímero y proteína tal como se indica en otro lugar.
Las reacciones de control se realizaron con CA
como control negativo.
Se prepararon estándares que comprenden entre 60
\mug/ml y 3,75 \mug/ml en PBS de
\beta-galactosidasa reciente. Las muestras de
CAM-\beta-gal se diluyeron a 60
\mug/ml en el mismo tampón. La actividad enzimática de los
conjugados se midió tal como sigue:
En una placa microtiter, a 100 \mul de muestra
o estándar se le añadieron 100 \mul de sustrato
All-in-One
\beta-gal (Pierce). La placa se incubó a 37ºC
durante 30 minutos y se leyó la absorbancia a 405 nm. Se preparó
una curva de calibración con los estándares y se calculó la
actividad de las muestras a partir de la ecuación de la curva de
regresión lineal.
A partir de los ensayos de proteína y polímero
se determinó que la proporción de conjugación fue de 1,23 CAM:1
\beta-gal. También se produjo un incremento
correspondiente en la masa molecular aparente a partir de la
SDS-PAGE de las muestras (Figura 2). La actividad
enzimática en las muestras purificadas se calculó que era del
100,4% en comparación con el enzima libre.
\newpage
Ejemplo
2
Etapa 1 Aminación de
CA-aldehído
(CHO)
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa 2 Introducción del anillo
de
maleimida
Se disolvió ácido colomínico oxidado (CA) en
entre 10 y 100 mg/ml en 2 ml de agua desionizada con un exceso
molar de 300 veces en NH_{4}Cl, en tubos de 50 ml y a continuación
se añadió NaCNBH_{3} (5 M stock en 1 N NaOH (acuoso)) a una
concentración final de 5 mg/ml. La mezcla se incubó a temperatura
ambiente durante 5 días. Se preparó también una reacción control
con ácido colomínico (A) en lugar de CAO. El derivado producto de
amina de ácido colomínico se precipitó mediante la adición de 5 ml
de etanol enfriado en hielo. El precipitado se recuperó mediante
centrifugación a 4.000 rpm, durante 30 minutos, a temperatura
ambiente en una centrífuga de mesa. El precipitado se recogió y se
suspendió en 2 ml de agua desionizada, a continuación se precipitó
otra vez con 5 ml de etanol enfriado en hielo en un tubo de
centrífuga de 10 ml. El precipitado se recogió mediante
centrifugación a 30.000 rpm durante 30 minutos a temperatura
ambiente. El precipitado se resupendió otra vez en 2 ml de agua
desionizada y se liofilizó.
Se utilizó el ensayo TNBS (ácido picrilsulfónico
o ácido
2,4,6-tri-nitro-bencensulfónico)
con el fin de determinar la cantidad de grupos amino presentes en
el producto.
En un pocillo de una placa microtiter se añadió
TNBS (0,5 \mul de 15 mM TNBS) a 90 \mul de 0,1 M tampón borato
pH 9,5. A esto se le añadieron 10 \mul de una disolución de 50
mg/ml de CA-amida. A continuación la placa se deja
reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente, antes de leer la
absorbancia a 405 nm. Se utilizó glicina como estándar, a
concentraciones comprendidas entre 0,1 y 1 mM. El TNBS
trinitrofenila los grupos amino primarios. Se detecta el aducto TNP
de la amina.
El ensayo del producto purificado mediante una
doble precipitación con etanol enfriado en hielo utilizando el
ensayo de TNBS demostró una conversión de aproximadamente 90%.
Se disolvió CA-amina (17 mg) en
1 ml de agua desionizada, se le añadieron 6 mg de
metoxi-carbonil-maleimida (MCM). La
mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
A la muestra 1 se le añadieron 100 \mul de agua y 200 \mul de
acetonitrilo y a continuación se incubó a temperatura ambiente
durante 4 horas, después de lo cual se añadieron al tubo 300 \mul
de CHCl_{3}, se agitó y se recogió la fase acuosa. A continuación
se purificó la fracción sobre una columna PD-10 con
el fin de eliminar las moléculas pequeñas. El eluído se liofilizó y
se ensayó con el fin de determinar el contenido en maleimida. La
concentración molar en maleimida fue de 44 mol%.
Ejemplo
3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A 40 mg de amina de ácido colomínico (85 mol% de
amina) tal como se describió en el Ejemplo 1, disueltos en 1 ml de
PBS pH 7,4, se le añadieron 5 mg de N-succinimidil
yodoacetato (SIA). La mezcla se dejó reposar durante 1 h a 37ºC,
después de lo cual el exceso de SIA se eliminó mediante filtración
en una columna de 5 ml de gel de desalado Hightrap^{TM} (AP
Bioscience) eluido con PBS. Se recogieron fracciones de la columna
de 0,5 ml y las muestras de cada fracción se ensayaron con el fin
de determinar el contenido en ácido colomínico (ensayo de
resorcinol) y la reactividad con cisteína que indica yoduro (ensayo
de Ellman). Las fracciones positivas a yoduro y CA se juntaron.
A \beta-galactosidasa de E.
coli (5,0 mg, 4,3 x 10^{-8} mol) en 1 ml de PBS se le
añadieron 15 mg de CAI (6,59 x 10^{-7}, 15 equiv. molares). El
tubo se selló, se envolvió en papel de aluminio y se dejó incubar a
temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave. El
conjugado resultante se analizó mediante SDS-PAGE y
a continuación se purificó según procedimientos aceptados con el fin
de eliminar el CAI libre. Las muestras se ensayaron para determinar
el contenido en polímero y proteína tal como se indicó en otro
lugar.
Se realizaron reacciones control con CA como
control negativo. Todas las muestras se analizaron con el fin de
determinar actividad de \beta-gal como en el
Ejemplo 1.8 anterior.
Las fracciones 3 a 6 fueron positivas tanto para
el polímero como para yodoacetato y se juntaron. Mediante
SDS-PAGE (gel de 4-12%, Bis/Tris;
Figura 2) se demostró un incremento en la masa molecular aparente en
las muestras incubadas con derivado de yodoacetamida pero no con el
polímero control. De los ensayos de proteína y polímero se
determinó que la proporción de conjugación fue de 1,63 CAI:1
\beta-gal. Se calculó que la actividad de
\beta-gal fue del 100.9% para la muestra
conjugada, en comparación con la forma libre del enzima.
\newpage
Ejemplo
4
Las preparaciones se realizaron tal como
sigue:
El aldehído de ácido colomínico (CAO; 22,7 kDa,
Camida, Irlanda) producido según
WO-A-9222331 (73 mg para el MBPH,
tubo A; 99,3 mg para PDPH; tubo B) se disolvió individualmente en
800 ml de 0,1 M acetato sódico (pH 5,5). Al tubo A se le añadieron
15 mg de MPPH (proporción de 15:1, conector:CA) de PDPH disuelto en
200 \mul de DMSO. Al tubo B se le añadieron 15 mg de PDPH
(proporción 15:1 de conector:CA) disueltos en 200 \mul de DMSO.
El pH se ajustó a 5,5 en cada caso en cada recipiente de reacción.
Las mezclas a continuación se mezclaron mediante vortex y se
envolvieron en papel de aluminio y se incubaron a 37ºC durante 2
horas en un mezclador orbital. Cada disolución de polímeros se
purificó mediante filtración por gel (columnas de PD 10) se eluyó
con PBS pH 7,4 y se recogió la fracción de 1 ml que contenía CA (por
ensayo de resorcinol). Estas muestras se liofilizaron durante la
noche y se ensayaron con el fin de determinar el contenido en
maleimida tal como se describió en el Ejemplo 1.2.
Las preparaciones se realizaron tal como sigue
todas ellas a una proporción molar de 25:1 conector:CA:
Ácido colomínico (CA, 22,7 kDa; 73 mg para MBPH,
Tubo A; 99,3 mg para PDPH; tubo B y 76,6 mg para BMPH; tubo C) se
disolvió individualmente por separado en 800 \mul de 0,1 M acetato
sódico (pH 5,5). Al tubo A, se le añadieron 25 mg de MBPH (disuelto
en 200 \mul de DMSO), al tubo B, se le añadieron 25 mg de PDPH
(disuelto en 200 \mul de DNSO) y al tubo C se le añadieron 25 mg
de BMPH (disuelto en 200 \mul de tampón de acetato sódico). El pH
de la mezcla de reacción se ajustó a 5,5. Cada una de las mezclas se
mezcló mediante vortex, se envolvió en papel de aluminio y se dejó
incubar a 37ºC durante 72 horas en un agitador orbital. Cada
disolución de polímero se purificó mediante filtración en gel
(columna PD 10) se eluyó con PBS pH 7,4 y se recogió la fracción de
1 ml que contiene el CA (mediante ensayo de resorcinol). Las
muestras se liofilizaron durante la noche y se ensayaron para
determinar el contenido en maleimida tal como se describió en el
Ejemplo 1,2.
La concentración molar de maleimida fue de 49,0
y 35,0 mol% para MBPH y PDPH respectivamente en el extremo no
reductor (altamente reactivo). La concentración molar de maleimida
fue de 41,5, 32,5 y 48,3 mol% para MBPH, PDPH y BMPH
respectivamente en el extremo reductor (débilmente reactivo). Los
valores en el extremo reductor son el promedio de dos valores en
cada caso.
A \beta-gal en diferentes
tubos se le añadió por separado un exceso de 15 veces de cada uno de
los CA activados mediante maleimida (MBPH, PDPH y BMPH en el
extremo no reductor o en el extremo reductor, de los ejemplos
anteriores) Cada tubo se selló y se dejó incubar a 37ºC durante 1 h
a la vez que se agitó suavemente. Los conjugados resultantes se
purificaron según procedimientos aceptados con el fin de eliminar
polímero activado libre. Todas las muestras se analizaron mediante
SDS-PAGE y para determinar la actividad de
\beta-gal tal como en el Ejemplo 1.8.
Los resultados (Figura 3) muestran que en todos
los pocillos control (con \beta-gal) la migración
de la muestra es semejante a la de la \beta-gal
fresca. En los carriles de conjugado se produjo un considerable
ensanchamiento de las bandas con intensidad máxima entre los
marcadores de 98 y 250 Kda que típicamente indica un incremento en
la masa a su vez indicativo de una
\beta-gal-polisialilada. Se
calculó que la actividad \beta-gal estuvo
comprendida entre el 91,0 y el 106% para las muestras
conjugadas.
Claims (29)
1. Compuesto que comprende un polisacárido que
presenta por lo menos dos unidades de ácido siálico unidas 2,8 y/o
2,9 entre sí y que presenta una parte pendiente unida a por lo menos
una unidad terminal derivada de una unidad de ácido siálico que
comprende un grupo funcional seleccionado de entre los grupos
N-maleimido, grupos vinilsulfona, grupos
N-yodoacetamida y grupos ortopiridil disulfuro.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que la parte pendiente se encuentra unida en la unidad terminal
reductora del polisacárido.
3. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en
el que la parte se encuentra unida en la unidad terminal no
reductora del polisacárido.
4. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que la parte comprende un grupo
alcanodiilo y/o un grupo arileno y una unión opcionalmente en
combinación con un grupo oxalquileno o un grupo
oligooxa-alquileno que es una unión de amina
secundaria, una hidrazona, una unión alquil hidrazida o una unión
peptídica.
5. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que el grupo funcional es el
N-maleimido.
6. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polisacárido es un ácido
polisiálico.
7. Compuesto según la reivindicación 6, en el
que el polisacárido está sustancialmente constituido por únicamente
unidades de ácido siálico.
8. Compuesto según la reivindicación 1, que
presenta la fórmula
en la que se aplica uno de los
siguientes grupos de
definiciones:
i) R^{1} es H o -CHOHCH_{2}OH, R^{2} es OH
y R^{3} es o -CH_{2}CHR^{4}R^{5} o
-CH(CH_{2}O)CHR^{4}R^{5} en la que R^{4} y
R^{5} conjuntamente representan =N-NR^{6} o
R^{4} es H y R^{5} es -NR^{6}R^{7} en la que R^{6} es un
grupo orgánico que comprende dicho grupo funcional seleccionado de
entre N-maleimido, vinilsulfona,
N-yodo-acetamido y ortodipiridilo o
es H, y R^{7} es H o R^{6} y R^{7} de manera conjunta son un
grupo
1,3-buta-2-enedioilo;
ii) R^{1} y R^{2} de manera conjunta
representan =N-NR^{6} o R^{1} es H y R^{2} es
-NR^{6}R^{7} en la que R^{6} es un grupo orgánico que
comprende dicho grupo funcional, y R^{7} es H o R^{6} y R^{7}
de manera conjunta son un grupo
1,3-but-2-enedioilo;
Gly-O es un grupo glicosilo
(sacárido);
n es 0 o más; y
Ac es acetilo.
9. Compuesto según la reivindicación 8, en el
que cada Gly es una unidad de ácido siálico.
10. Compuesto que comprende una proteína con por
lo menos una unidad de cisteína libre y, unido a través de un
enlace tioéster a la cadena lateral de la unidad de cisteína, con un
ácido polisiálico, a través de una parte unida a una o cada una de
las unidades terminales del ácido polisiálico, en el que el ácido
polisiálico presenta por lo menos 2 unidades de ácido siálico
unidas 2,8 y/o 2,9 entre sí.
11. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el polisacárido, o según la
reivindicación 10 en el que el ácido polisiálico comprende por lo
menos 10 unidades de ácido siálico.
12. Compuesto según las reivindicaciones 10 u
11, en el que el ácido polisiálico o el polisacárido, según sea el
caso, presenta por lo menos 50 unidades de ácido siálico.
13. Procedimiento en el que un polisacárido que
presenta por lo menos dos unidades de ácido siálico unidas 2,8 y/o
2,9 entre sí y que comprende por lo menos una unidad terminal que se
deriva de una unidad de ácido siálico se hace reaccionar con un
reactivo heterobifuncional que presenta un primer grupo funcional
seleccionado de entre grupos N-maleimido, grupos
vinilsulfona, grupos N-yodoacetamida y grupos
ortopiridil disulfuro y un segundo grupo funcional diferente del
primer grupo por lo que dicho segundo grupo funcional reacciona con
dicha unidad terminal derivada de ácido siálico para formar un
enlace covalente con la misma y formar un polisacárido funcional
adecuado para la conjugación selectiva con un grupo tiol.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que dicho segundo grupo funcional es un grupo nucleófilo.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que el grupo nucleófilo es la hidrazina.
16. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que la unidad terminal del polisacárido presenta un grupo
carbonilo que reacciona con dicho grupo nucleófilo.
17. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que dicho segundo grupo funcional es un grupo electrófilo.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que el grupo electrófilo es una parte
N-alcoxicarbonil-imida o
carbodiimida.
19. Procedimiento según la reivindicación 17 ó
18, en el que la unidad terminal del polisacárido presenta un grupo
amina que reacciona con dicho grupo electrófilo.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que se forma una unión peptídica o de uretano.
21. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 20, en el que el reactivo comprende un grupo
orgánico bifuncional que une los primer y segundo grupos
funcionales.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que el grupo bifuncional orgánico se selecciona de entre un
grupo C_{2-18}-alcanodiilo, un
grupo arileno, un oligopéptido y un grupo
oligo(alcoxi)alquilo.
23. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 22, en el que el primer grupo funcional es un
grupo N-maleimido.
24. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el reactivo presenta la fórmula general
X-R-Y
en la
que
X es un grupo N-maleimido,
N-yodoacetamido, S-vinilsulfonilo o
S-ortopiridildisulfuro,
R es un grupo alacano-diilo,
arileno o aralquileno alcarileno,
alquilen-oxaalquileno o
alquilen-oligooxa-alquileno o
alquil-oligopeptidil-alquilo; e
Y es un grupo hidrazida, amina o
N-hidroxisuccinimido.
25. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 24, en el que el polisacárido presenta por lo
menos 10 unidades de ácido siálico.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que el polisacárido presenta por lo menos 50 unidades de ácido
siálico.
27. Procedimiento según la reivindicación 25 ó
26, en el que las unidades de ácido siálico se encuentran unidas
2\rightarrow8 y/o 2\rightarrow9 entre sí.
28. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 27, en el que el ácido polisiálico funcional
es un ácido polisiálico maleimido-funcional y se
hace reaccionar con un polipéptido o una proteína que presenta por
lo menos una unidad de Cys libre desprotegida por lo que el grupo
maleimido forma un enlace tioéter con el grupo tiol de una unidad
de Cys formando una proteína o un polipéptido polisialilados.
29. Procedimiento en el que un compuesto según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 se hace reaccionar con un
polipéptido o con una proteína que presenta por lo menos una unidad
Cys libre y desprotegida por lo que dicho grupo funcional forma un
enlace tioéter con el grupo tiol de una unidad Cys para formar un
conjugado del polisacárido con el polipéptido o la proteína.
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