ES2735809T3 - Derivativos del ácido siálico para la derivatización y conjugación de proteínas - Google Patents
Derivativos del ácido siálico para la derivatización y conjugación de proteínas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2735809T3 ES2735809T3 ES04768074T ES04768074T ES2735809T3 ES 2735809 T3 ES2735809 T3 ES 2735809T3 ES 04768074 T ES04768074 T ES 04768074T ES 04768074 T ES04768074 T ES 04768074T ES 2735809 T3 ES2735809 T3 ES 2735809T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- group
- sialic acid
- aldehyde
- protein
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical class CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 title claims abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 89
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 88
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 title description 26
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 title description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 81
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims abstract description 52
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims abstract description 51
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 30
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims abstract description 26
- 150000002009 diols Chemical group 0.000 claims abstract description 23
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims abstract description 18
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 6
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 claims abstract 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 110
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 41
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 36
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 claims description 30
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 29
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 26
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 24
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 15
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 10
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 9
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 claims description 5
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 150000003141 primary amines Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 81
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 72
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 41
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 39
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 37
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 37
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 24
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 19
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 19
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 18
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 12
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 12
- -1 sialic acid compound Chemical class 0.000 description 12
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 12
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 11
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 11
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 11
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 11
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 10
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 10
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 8
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 7
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 7
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000001426 native polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 5
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 150000007857 hydrazones Chemical group 0.000 description 4
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 4
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 4
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 4
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 4
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 3
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 3
- 102100021852 Neuronal cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 3
- 101710130688 Neuronal cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 3
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 125000001976 hemiacetal group Chemical group 0.000 description 3
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 description 2
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 2
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 229960003272 asparaginase Drugs 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M asparaginate Chemical compound [O-]C(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N ferricyanide Chemical compound [Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- DCYOBGZUOMKFPA-UHFFFAOYSA-N iron(2+);iron(3+);octadecacyanide Chemical compound [Fe+2].[Fe+2].[Fe+2].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] DCYOBGZUOMKFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 125000000467 secondary amino group Chemical class [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003419 tautomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- MEZJQXVOMGUAMP-UHFFFAOYSA-N 1-(2-methylnaphthalen-1-yl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound CC1=CC=C2C=CC=CC2=C1N1C(=O)C=CC1=O MEZJQXVOMGUAMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- JGLMVXWAHNTPRF-CMDGGOBGSA-N CCN1N=C(C)C=C1C(=O)NC1=NC2=CC(=CC(OC)=C2N1C\C=C\CN1C(NC(=O)C2=CC(C)=NN2CC)=NC2=CC(=CC(OCCCN3CCOCC3)=C12)C(N)=O)C(N)=O Chemical compound CCN1N=C(C)C=C1C(=O)NC1=NC2=CC(=CC(OC)=C2N1C\C=C\CN1C(NC(=O)C2=CC(C)=NN2CC)=NC2=CC(=CC(OCCCN3CCOCC3)=C12)C(N)=O)C(N)=O JGLMVXWAHNTPRF-CMDGGOBGSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 241000463291 Elga Species 0.000 description 1
- 241000617590 Escherichia coli K1 Species 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 208000022120 Jeavons syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-OZRXBMAMSA-N N-acetyl-beta-D-mannosamine Chemical group CC(=O)N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-OZRXBMAMSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical group CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091006006 PEGylated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006335 Phosphate-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058514 Phosphate-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- OHRWHIOLZGLRKH-UHFFFAOYSA-M [Na+].NCC(O)=O.NCC(O)=O.NCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O Chemical compound [Na+].NCC(O)=O.NCC(O)=O.NCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O OHRWHIOLZGLRKH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000102 alkali metal hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000008046 alkali metal hydrides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-N anhydrous cyanic acid Natural products OC#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000181 anti-adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000000732 arylene group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010277 boron hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001728 carbonyl compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940105657 catalase Drugs 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 1
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N hydrazine group Chemical group NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 description 1
- 150000004678 hydrides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000619 immunotoxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000004179 indigotine Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004190 ion pair chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 1
- RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N pentamethylene Natural products C1CCCC1 RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006267 polysialylation Effects 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003351 prussian blue Drugs 0.000 description 1
- 239000013225 prussian blue Substances 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/28—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/44—Antibodies bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
- C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H5/00—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium
- C07H5/04—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium to nitrogen
- C07H5/06—Aminosugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
- C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
- C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate
- C07K17/12—Cellulose or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
Un procedimiento de producción de un derivativo aldehído de un ácido siálico en el que un material de partida que tiene una unidad de ácido siálico en el terminal reductor y una unidad de sacárido terminal en el extremo no reductor que tiene un grupo diol vecinal se somete a las etapas secuenciales de: a) oxidación selectiva preliminar para oxidar el grupo diol vecinal a un aldehído b) reducción para abrir reductivamente el anillo en la unidad de ácido siálico terminal reductor, por lo que se forma un grupo diol vecinal, y en el que el aldehído formado en la etapa a) también se reduce para formar un grupo hidroxi que no es parte de un grupo diol vecinal; y c) oxidación selectiva para oxidar el grupo diol vecinal formado en la etapa b) para formar un grupo aldehído.
Description
DESCRIPCIÓN
Derivativos del ácido siálico para la derivatización y conjugación de proteínas
La presente invención se refiere a derivativos de compuestos tales como polisacáridos que tienen al menos unidades siálicas terminales, y que preferiblemente consisten esencialmente solo en unidades de ácido siálico, que tienen un grupo aldehído para reacción con sustratos en el extremo terminal reductor y procedimientos para producirlos. Los derivativos son útiles para la conversión a otros derivativos reactivos y para la conjugación con sustratos que contienen grupos amina, tales como péptidos, proteínas, fármacos, sistemas de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas), virus, células, por ejemplo, células animales, microbios, polímeros sintéticos etc.
Los ácidos polisiálicos (PSA) son polímeros no ramificados naturales del ácido siálico producidos por ciertas cepas bacterianas y en mamíferos en ciertas células [Roth et. al., 1993]. Se pueden producir en diversos grados de polimerización desde n = aproximadamente 80 o más residuos de ácido siálico hasta n = 2 por hidrólisis ácida limitada o por digestión con neuraminidasas, o por fraccionamiento de las formas naturales derivadas de bacterias del polímero. La composición de diferentes ácidos polisiálicos también varía de manera tal que existen formas homopoliméricas, es decir, el ácido polisiálico unido en alfa-2,8 que comprende el polisacárido capsular de la cepa K1 de E. coli y los meningococos del grupo B, que también se encuentra en la forma embrionaria de la molécula de adhesión celular neuronal (N-CAM). También existen formas heteropoliméricas, tales como el ácido alfa-2,8 alfa-2,9 polisiálico de la cepa K92 de E. coli y los polisacáridos del grupo C de N. meningitidis. El ácido siálico también se puede encontrar en copolímeros alternos con monómeros distintos del ácido siálico, tales como el grupo W135 o el grupo Y de N. meningitidis. Los ácidos polisiálicos tienen funciones biológicas importantes que incluyen la evasión de los sistemas inmune y del complemento por bacterias patógenas y la regulación de la adhesividad glial de las neuronas inmaduras durante el desarrollo fetal (en las que el polímero tiene una función antiadhesiva [Muhlenhoff et. al., 1998; Rutishauser, 1989; Troy, 1990, 1992; Cho and Troy, 1994], aunque no se conocen receptores para los ácidos polisiálicos en los mamíferos. El ácido polisiálico unido a alfa-2,8 de la cepa K1 de E. coli también se conoce como "ácido colomínico" y se usa (en diversas longitudes) para ilustrar la presente invención.
La forma alfa-2,8 enlazada de ácido polisiálico, entre los polisacáridos bacterianos, es únicamente no inmunogénica (que no provoca respuestas de células T ni de anticuerpos en sujetos mamíferos, incluso cuando se conjugan con proteínas portadoras inmunogénicas) que pueden reflejar su estado como un polímero de mamíferos (así como una bacteria). Las formas más cortas del polímero (hasta n = 4) se encuentran en los gangliósidos de la superficie celular, que están ampliamente distribuidos en el cuerpo, y se cree que imponen y mantienen de manera efectiva la tolerancia inmunológica al ácido polisiálico. En los últimos años, se han explotado las propiedades biológicas de los ácidos polisiálicos, en particular las del ácido polisiálico homopolimérico unido a alfa-2,8, para modificar las propiedades farmacocinéticas de las proteínas y las moléculas de fármacos de bajo peso molecular [Gregoriadis, 2001; Jain et. al., 2003; USA- 5846,951: WO-A-0187922]. La derivatización del ácido polisiálico da lugar a mejoras dramáticas en la vida media en circulación para una serie de proteínas terapéuticas, incluidas la catalasa y la asparaginasa [Fernandes and Gregoriadis, 1996 and 1997], y también permite que dichas proteínas se usen frente a anticuerpos preexistentes producidos como una consecuencia indeseable (y en ocasiones inevitable) de la exposición previa a la proteína terapéutica [Fernandes and Gregoriadis, 2001]. En muchos aspectos, las propiedades modificadas de las proteínas polisialiladas son comparables a las proteínas derivadas con polietilenglicol (PEG). Por ejemplo, en cada caso, las vidas medias aumentan y las proteínas y los péptidos son más estables para la digestión proteolítica, pero la retención de la actividad biológica parece ser mayor con el PSA que con el PEG [Hreczuk-Hirst et. al., 2002]. Además, hay preguntas sobre el uso de PEG con agentes terapéuticos que se deben administrar de manera crónica, ya que el PEG es muy lentamente biodegradable [Beranova et.al., 2000] y las formas de alto peso molecular tienden a acumularse en los tejidos [Bendele, et al., 1998; Convers, et al., 1997]. Se ha encontrado que las proteínas PEGiladas generan anticuerpos anti-PEG que también podrían influir en el tiempo de residencia del conjugado en la circulación sanguínea (Cheng et. al., 1990). A pesar de la historia establecida de PEG como un polímero administrado por vía parenteral conjugado con los agentes terapéuticos, se requerirá una mejor comprensión de su inmunotoxicología, farmacología y metabolismo (Hunter and Moghimi, 2002; Brocchini, 2003). Asimismo, existe preocupación sobre la utilidad de la PEG en agentes terapéuticos que pueden requerir dosis altas, ya que la acumulación de PEG puede conducir a toxicidad. El ácido polisiálico unido alfa-2,8 (PSA) ofrece, por lo tanto, una alternativa atractiva al PEG, ya que es un polímero biodegradable inmunológicamente invisible que forma parte natural del cuerpo humano y que se degrada, a través de las neuraminidasas tisulares, al ácido siálico, un sacárido tóxico.
Se ha descrito, en artículos científicos anteriores y en patentes concedidas, la utilidad de los ácidos polisiálicos naturales para mejorar las propiedades farmacocinéticas de los agentes terapéuticos de proteínas [Gregoriadis, 2001; Fernandes and Gregoriadis; 1996, 1997, 2001; Gregoriadis et. al., 1993, 1998, 2000; Hreczuk-Hirst et. al., 2002; Mital, 2003; Jain et. al., 2003, 2004; US-A-05846,951; WO-A-0187922]. Ahora, se describen nuevos derivatizados de PSA, que permiten nuevas composiciones y procedimientos de producción de proteínas derivadas de PSA (y otras formas de agente terapéutico). Estos nuevos materiales y procedimientos son particularmente apropiados para la producción de agentes terapéuticos derivatizados de PSA destinados al uso en humanos y animales, donde la definición química y molecular de las entidades farmacológicas es de gran importancia debido a los requisitos de seguridad de la ética médica y de las autoridades reguladoras (por ejemplo FDA, EMEA).
Los procedimientos se han descrito anteriormente para la unión de polisacáridos a agentes terapéuticos tales como proteínas [Jennings and Lugowski 1981, US-A-5846,951; WO-A-0187922_. Algunos de estos procedimientos dependen de la derivatización química del extremo "no reductor" del polímero para crear una unidad estructural de aldehído reactivo a la proteína (Fig. 1). Esto se debe a que el extremo reductor del PSA y otros polisacáridos solo es débilmente reactivo con las proteínas en las condiciones suaves necesarias para preservar la conformación de la proteína y la integridad química del PSA y la proteína durante la conjugación. Una unidad técnica de ácido siálico no reductor, ya que contiene dioles vecinales, se puede oxidar fácilmente (y selectivamente) con peryodato para producir una forma de monoaldehído, que es mucho más reactiva hacia las proteínas, y que comprende un elemento adecuadamente reactivo para la unión de proteínas mediante aminación reductora y otras químicas. Se ha descrito anteriormente en US-A-5846,951; WO-A-0187922. La reacción se ilustra en la figura 1 en la que
a) muestra la oxidación del ácido colomínico (ácido polisiálico unido a alfa-2,8 de E. coli) con peryodato de sodio para formar un aldehído reactivo a la proteína en el extremo no reductor y
b) muestra la reducción selectiva de la base de Schiff con cianoborohidruro de sodio para formar un enlace covalente irreversible estable con el grupo amino proteico.
De los diversos procedimientos, que se han descrito para unir ácidos polisiálicos a agentes terapéuticos [US-A-5846,951; WO-A-01879221], ninguno de estos está específicamente destinado a conjugar a través del extremo reductor, debido a su débil reactividad frente a las proteínas terapéuticas. Aunque teóricamente es una reacción útil, el logro de rendimientos aceptables de conjugado mediante la reacción de proteínas con el hemicetal del extremo reductor del PSA requiere tiempos de reacción que no sean propicios para la estabilidad de la proteína. En segundo lugar, se requieren concentraciones de reactantes (de exceso de polímero) que pueden ser inalcanzables o no económicas. Sin embargo, a pesar de la ineficacia de esta reacción, se ha observado que da lugar a subproductos no intencionales durante las reacciones de conjugación destinadas a producir conjugados con proteína a través de un aldehído introducido en el extremo no reductor (opuesto) del polímero. El potencial de tales subproductos es evidente en estudios publicados de catalasa, insulina y asparaginasa [Fernandes and Gregoriadis; 1996, 1997, 2001; Jain et. al., 2003], donde el hemicetal de la forma natural (químicamente no modificada) del polímero da lugar a conjugados de proteínas con un bajo nivel de eficiencia (menos del 5% de las proteínas se derivan, véanse más adelante en los ejemplos de referencia, y tabla 1) durante la aminación reductora.
La reactividad del extremo reductor del ácido colomínico, aunque débil hacia las dianas proteicas, es suficiente para ser problemático en la fabricación de conjugados químicamente definidos del tipo que probablemente prefieren las autoridades reguladoras para el uso terapéutico en el hombre y los animales. A diferencia del polímero de ácido colomínico natural, que es débilmente monofuncional, la forma oxidada de peryodato de PSA (que tiene un aldehído en un extremo y un hemicetal en el otro) inevitablemente da lugar a una complejidad de productos que complica seriamente la tarea de producir una conjugado molecularmente definido y farmacéuticamente aceptable (Fig. 2). La figura 2a es un diagrama esquemático que muestra la formación de subproductos durante la polisialilación (procedimiento original). La figura 2b es un diagrama esquemático más detallado que muestra la formación de subproductos durante la polisialilación (procedimiento original), específicamente
i) dímero asimétrico;
ii) polímero lineal;
iii) polímero ramificado; y
iv) diversas estructuras más complejas.
A primera vista, parecería una cuestión simple para purificar el producto de reacción deseado de los diversos productos no intencionados descritos en la figura 2, sin embargo, esto no es en absoluto sencillo, ya que las características fisicoquímicas de algunas de las formas pretendidas (carga de tamaño, etc.) son notablemente similares, de hecho, casi idénticas, a las de la forma prevista del producto. Esto frustraría los intentos de purificar las especies deseadas de la mezcla de reacción mediante técnicas tales como la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de permeación de gel (que se separan en función de la carga y el tamaño respectivamente), y también frustraría muchos otros procedimientos de purificación. Ahora, por lo tanto, hemos resuelto los problemas desarrollando un nuevo procedimiento para la conjugación de polisacáridos que tienen grupos de ácido siálico en el terminal reductor a las proteínas, por lo que la débil reactividad del extremo reductor se puede aprovechar para lograr un efecto beneficioso, y que evita la complejidad del producto descrito en la figura 2(b) usando el procedimiento establecido (Fig. 1) de la aminación reductora de proteínas con ácido colomínico natural oxidado con peryodato.
Jennings and Lugowski, en el documento US 4,356,170, describen la derivatización de polisacáridos bacterianos a proteínas a través de una unidad terminal reductora activa que implica una etapa de reducción preliminar, luego una etapa de oxidación. Sugieren la complejidad del producto descrita en la figura 2 (b) usando el procedimiento establecido (Fig. 1) de aminación reductora de proteínas con ácido colomínico natural oxidado con peryodato.
Jennings and Lugowski, en el documento US 4,356,170, describen la derivatización de polisacáridos bacterianos a proteínas a través de una unidad terminal reductora activa que implica una etapa de reducción preliminar, luego una etapa de oxidación. Sugieren este enfoque donde la unidad terminal reductora es N-acetil manosamina, glucosa, glucosamina, ramnosa y ribosa.
En el documento EP-A-0454898, un grupo amino de una proteína está unido a un grupo aldehído producido reduciendo y oxidando parcialmente la unidad estructural de azúcar terminal reductor de un glicosaminoglicano. Los glicosaminoglicanos tratados de esta manera incluyen ácido hialurónico, sulfato de condroitina, heparina, sulfato de heparano y sulfato de dermatán. Ninguno de estos compuestos tiene una unidad de ácido siálico en el terminal reductor.
En la invención se proporciona un nuevo procedimiento de producción de un derivativo de aldehído de un compuesto de ácido siálico en el que un material de partida que tiene una unidad de ácido siálico en su terminal reductor y una unidad de sacárido terminal en el extremo no reductor que tiene un grupo diol vecinal está sujeto a etapas secuenciales de
a) oxidación selectiva preliminar para oxidar el diol vecinal a un aldehído
b) reducción para abrir reductivamente el anillo de la unidad de ácido siálico terminal reductor, por lo que se forma un grupo diol vecinal y en el que el grupo aldehído formado en la etapa a) también se reduce para formar un grupo hidroxilo que no es parte de un grupo diol vecinal; y
c) oxidación selectiva para oxidar el grupo diol vecinal formado en la etapa b) para formar un grupo aldehído. El material de partida es preferiblemente un di-, oligo- o poli-sacárido, aunque la invención puede tener utilidad para otros materiales de partida.
El material de partida usado en el procedimiento de la invención debe tener preferiblemente la unidad de ácido siálico en el extremo terminal reductor unida a la unidad adyacente a través de su átomo de carbono ocho. En la etapa c) el grupo 6, 7-diol se oxida para formar un aldehído en el átomo de carbono 7.
En una realización alternativa, donde la unidad de ácido siálico en el extremo terminal reductor se une a la unidad adyacente a través del átomo de carbono 9, en la etapa b) se forma un grupo 7, 8 diol y se oxida para formar un aldehído en el átomo de carbono 8.
Según una realización particular de la invención, el material de partida tiene un ácido siálico terminal en el extremo terminal no reductor y en la etapa a) la etapa de oxidación selectiva oxida la unidad de ácido siálico terminal no reductor en el grupo diol vecinal 7, 8 para formar un 7-aldehído; y la etapa de reducción b) reduce el grupo 7-aldehído al alcohol correspondiente. Este aspecto de la invención proporciona derivativos de ácido siálico que tienen un terminal no reductor pasivado, que permite la activación del terminal reductor para una reacción posterior. La etapa de oxidación de activación c) con etapas posteriores opcionales de convertir el grupo aldehído en otro grupo, tal como la aminación para formar una amina.
Preferiblemente, esta realización de la invención es parte de un procedimiento en el que se requiere que el material de partida se conjugue posteriormente a otra molécula a través de esa unidad. En dicho procedimiento, la unidad terminal reductora se activa mediante una reacción que de lo contrario habría activado una proporción de las unidades terminales no reductoras de ácido siálico si no fuera por el procedimiento de pasivación (etapas a) y b)). Dicha reacción es la oxidación selectiva de la unidad estructural diol vecinal en la etapa c).
En la invención, el material de partida polisacárido preferido puede comprender unidades distintas al ácido siálico en la molécula. Por ejemplo, las unidades de ácido siálico pueden alternarse con otras unidades de sacáridos. Preferiblemente, sin embargo, el polisacárido consiste sustancialmente solo en unidades de ácido siálico. Preferiblemente estos se unen 2 ^ 8 y/o 2 ^ 9.
Preferiblemente, el material de partida de polisacárido tiene al menos 2, más preferiblemente al menos 5, más preferiblemente al menos 10, por ejemplo al menos 50, unidades de sacárido. Por ejemplo, un polisacárido puede comprender al menos 5 unidades de ácido siálico.
El ácido polisiálico se puede derivar de cualquier fuente, preferiblemente una fuente natural tal como una fuente bacteriana, por ejemplo, K1 o K92 de E. coli, meningococos del grupo B, o incluso leche de vaca o N-CAM, el polímero de ácido siálico puede ser un polímero heteropolimérico tal como el grupo 135 o el grupo V de N. meningitidis. El ácido polisiálico puede estar en forma de una sal o el ácido libre. Puede estar en forma hidrolizada, de manera que el peso molecular se haya reducido luego después de la recuperación de una fuente bacteriana. El ácido polisiálico puede ser un material que tiene una amplia distribución de pesos moleculares, tales como que tiene una polidispersidad de más de 1,3, por ejemplo, tanto como 2 o más. Preferiblemente, la polidispersidad del peso molecular es inferior a 1,2, por ejemplo, tan baja como 1,01.
Una población de ácidos polisiálicos que tienen una amplia distribución de pesos moleculares se puede fraccionar en fracciones con polidispersidades inferiores, es decir, en fracciones con pesos moleculares medios diferentes. El fraccionamiento es preferiblemente cromatografía de intercambio aniónico, usando para la elución una solución reguladora básica apropiada. Se ha encontrado un medio de intercambio aniónico apropiado i) un medio de preparación tal como un material de intercambio iónico fuerte basado en agarosa activada, que tiene grupos colgantes de iones de amonio cuaternario (es decir, una base fuerte). La solución reguladora de elución no es reactiva y es preferiblemente volátil, por lo que el producto deseado se puede recuperar de la base en cada fracción por evaporación. Ejemplos apropiados son aminas, tales como trietanolamina. La recuperación puede ser por liofilización, por ejemplo. El procedimiento de fraccionamiento es apropiado para un material de partida de ácido polisiálico, así como para los derivativos. De este modo, la técnica se puede aplicar antes o después de las etapas esenciales del procedimiento de esta invención.
Se cree que esta es la primera vez que se aplica cromatografía de intercambio iónico para fraccionar un polisacárido iónico con pesos moleculares por encima de aproximadamente 5 kDa, especialmente ácido polisiálico de tales MW en base al peso molecular. En realizaciones preferidas de la invención, el procedimiento incluye la etapa de fraccionar una población de polisacárido ionizable con un MW superior a 5 kDa usando cromatografía de intercambio iónico usando en la solución reguladora de elución una base o ácido que es preferiblemente volátil. Como el polisacárido tiene grupos ácido carboxílico y el intercambio iónico es un intercambio aniónico. Preferiblemente, la solución reguladora de elución contiene una amina, más preferiblemente trietanolamina. Más preferiblemente, los polisacáridos se recuperan de las fracciones por liofilización. Este procedimiento se puede aplicar para el fraccionamiento de CA que tienen otras unidades estructurales reactivas (maleimida o yodoacetato, etc.) y otros polímeros cargados naturales (por ejemplo, sulfato de dextrano) y sintéticos (por ejemplo, ácido poliglutámico; polilisina en este último caso mediante cromatografía de intercambio catiónico). Se cree que también es la primera vez que se usa el IEC para separar polisacáridos iónicos en combinación con técnicas de precipitación y/o procedimientos de ultrafiltración. El procedimiento IEC debe eliminar los subproductos de producción que permanecen en los PSA y CA disponibles comercialmente, tales como las endotoxinas.
En las etapas de oxidación a) y c) la oxidación selectiva se debe llevar a cabo preferiblemente en condiciones de tal manera que no haya una escisión de la cadena media del esqueleto de un material de partida (polimérico) de cadena larga, que no tiene sustancialmente ninguna reducción de peso molecular. Se pueden usar enzimas que sean capaces de llevar a cabo esta etapa. Más convenientemente la oxidación es una oxidación química. La reacción se puede llevar a cabo con reactivos inmovilizados tales como perrenuteno a base de polímero. El procedimiento más directo se lleva a cabo con reactivos disueltos. El oxidante es adecuadamente perrutenato, o, preferiblemente, peryodato. La oxidación se puede llevar a cabo con peryodato en una concentración en el intervalo de 1 mM a 1 M, a un pH en el intervalo de 3 a 10, una temperatura en el intervalo de 0 a 60 °C, durante un tiempo en el intervalo de 1 minuto a 48 horas.
En el procedimiento, la etapa b) es una etapa en la que se reduce la unidad de ácido siálico en el extremo reductor. Por lo general, la unidad en el extremo reductor del material de partida tiene la forma de un anillo de cetal y la reducción en la etapa a) abre el anillo y reduce la cetona a un alcohol. El grupo hidroxilo en el átomo de carbono 6 es, de este modo, parte de una unidad estructural de diol vecinal.
Las condiciones de reducción apropiadas para la etapa b pueden usar hidrógeno con catalizadores o, preferiblemente, hidruros, tales como borohidruros. Estos se pueden inmovilizar, tal como el borohidruro soportado por Amberlite (marca registrada). Preferiblemente, se usan hidruros de metales alcalinos tales como el borohidruro de sodio como agente reductor, en una concentración en el intervalo de 1 |iM a 0,1M, un pH en el intervalo de 6,5 a 10, una temperatura en el intervalo de 0 a 60 °C y un período en el intervalo de 1 min a 48 horas. Las condiciones de reacción se seleccionan de modo que los grupos carboxilo colgantes en el material de partida no se reduzcan. Cuando se ha llevado a cabo una etapa preliminar de oxidación, el grupo aldehído generado se reduce a un grupo alcohol que no forma parte de un grupo diol vecinal. Otros agentes reductores apropiados son el cianoborohidruro en condiciones ácidas, por ejemplo cianoborohidruro soportado en polímero o cianoborohidruro de metal alcalino, ácido L-ascórbico, metabisulfito de sodio, L-selectride, triacetoxiborohidruro, etc.
Entre la etapa de oxidación a) y la etapa de reducción b) y entre la etapa b) y la etapa de oxidación c), el intermedio respectivo se debe aislar de los agentes oxidantes y reductores, respectivamente, antes de ser sometido a la etapa subsiguiente. Cuando las etapas se llevan a cabo en la fase de solución, el aislamiento se puede realizar mediante técnicas convencionales, tales como gastar el exceso de agente oxidante usando etilenglicol, diálisis del polisacárido y ultrafiltración para concentrar la solución acuosa. La mezcla de productos de la etapa de reducción se puede separar nuevamente mediante diálisis y ultrafiltración. Puede ser posible idear reacciones llevadas a cabo con reactivos oxidantes y reductores inmovilizados, lo que hace que el aislamiento del producto sea sencillo.
La etapa de oxidación selectiva, etapa c) se lleva a cabo adecuadamente en condiciones similares a la etapa de oxidación preliminar tal como se describió anteriormente. Asimismo, el agente de oxidación se debe agotar antes de la recuperación del producto usando etilenglicol. El producto se recupera posteriormente por medios apropiados, tales como diálisis y ultrafiltración.
El procedimiento del procedimiento de la invención que implica una oxidación, luego reducción, luego etapa de oxidación produce un producto activado que tiene una única unidad estructural de aldehido reactivo derivado del terminal reductor.
Los grupos aldehído son apropiados para conjugarse con sustratos que contienen grupos amina o compuestos de hidrazina. Los procedimientos en los que el producto activado de la etapa de oxidación c) se conjuga posteriormente con el compuesto de sustrato forman un aspecto adicional de la invención. Preferiblemente, la reacción de conjugación es como se describe en nuestras publicaciones anteriores mencionadas anteriormente, que implica la conjugación con una amina para formar una base de Schiff, preferiblemente seguida de reducción para formar una unidad estructural de amina secundaria. El procedimiento es de particular valor para derivar proteínas, de las cuales el grupo amina es adecuadamente el grupo amina épsilon de un grupo lisina o el grupo amino N-terminal. El procedimiento es de particular valor para la derivatización de agentes terapéuticamente activos proteínas o péptidos, como citoquinas, hormonas de crecimiento, enzimas, hormonas, anticuerpos o fragmentos. Alternativamente, el procedimiento se puede usar para derivar sistemas de administración de fármacos, tales como liposomas, por ejemplo haciendo reaccionar el aldehído con un grupo amina de un componente formador de liposomas. Otros sistemas de administración de medicamentos se describen en nuestro caso anterior US-A-5846951. Otros materiales que se pueden derivar incluyen virus, microbios, células, incluyendo células animales y polímeros sintéticos.
Alternativamente, el sustrato puede tener un grupo hidrazina, en cuyo caso el producto es una hidrazona. Esta se puede reducir si se desea, para una estabilidad adicional, a una hidrazida de alquilo.
En otra realización preferida, a la etapa de oxidación c) le sigue la reacción del o cada grupo aldehído con un compuesto enlazante, que comprende un grupo amina o un grupo hidrazida y otro grupo funcional apropiado para la derivatización selectiva de proteínas u otros compuestos terapéuticamente activos o sistemas de administración de fármacos. Dicho enlazante puede, por ejemplo, comprender un compuesto que tiene un sustituyente de grupo funcional para la reacción específica con grupos sulfhidrilo y un grupo orgánico dibásico que se une al grupo amina o hidrazida y al grupo funcional. La reacción de una unidad estructural de aldehído con el grupo amino o hidrazida forma un conjugado reactivo apropiado para unirse a un sustrato que tiene un grupo tiol (sulfhidrilo). Tales conjugados tienen un valor particular para la derivatización selectiva y dirigida al sitio de proteínas y péptidos.
La derivatización de proteínas y sistemas de administración de fármacos puede dar como resultado una vida media aumentada, estabilidad mejorada, inmunogenicidad reducida y/o control de solubilidad y, por consiguiente, biodisponibilidad y propiedades farmacocinéticas, o puede mejorar los activos de solubilidad o viscosidad de soluciones que contienen el activo derivativo.
Según la invención, también se proporciona un nuevo compuesto que es un derivativo aldehído de un di-, oligo- o polisacárido que comprende unidades estructurales de ácido siálico, en el que la unidad terminal en el extremo reductor es un grupo Or en el que R se selecciona de
-CH2-CHO,
-CH2CH2NHR1, CH2CH=N-NHR1 y CH2CH2NHNHR1 en las que R1 es H, alquilo C1-24, aril alcanoilo C2-6, o un polipéptido o una proteína unida a través del terminal N o del grupo amina de la cadena lateral de un residuo de lisina, un sistema de administración de fármacos o es un grupo orgánico que tiene un sustituyente funcional adaptado para la reacción con un grupo sulfhidrilo y la unidad estructural terminal en el extremo no reductor se pasiva.
El nuevo compuesto puede comprender unidades de sacárido de cadena media entre las dos unidades terminales. Las unidades de la cadena media pueden consistir solo en unidades de ácido siálico o, alternativamente, pueden comprender otras unidades de sacáridos además de las unidades terminales que se derivan de unidades de ácido siálico. El compuesto puede formarse en general como se describe anteriormente en proporción con el procedimiento de la invención.
El nuevo compuesto puede ser un sustrato polisialilado, que comprende al menos un grupo de ácido polisiálico (polisacárido) conjugado en cada molécula de sustrato, la conjugación que incluye un enlace secundario de amina, hidrazona o alquil hidrazida a través del terminal reductor del ácido polisiálico, y está sustancialmente libre de reticulación a través de un extremo no reductor del grupo de ácido polisiálico a otra molécula de sustrato. El sustrato puede ser, por ejemplo, un compuesto biológicamente activo, por ejemplo un compuesto farmacéuticamente activo, especialmente un péptido o proteína terapéutica, o un sistema de administración de fármacos. Tales activos son en general como se describe anteriormente.
El nuevo compuesto puede tener la fórmula general I
en la que R se selecciona de
-CH2-CHO,
-CH2CH2NHR1, CH2CH=N-NHR1 y CH2CH2NHNHR1 en las que R1 es H, alquilo C1-24, aril alcanoilo C2-6, o un polipéptido o una proteína unida a través del terminal N o el grupo y-amina de un residuo de lisina, un sistema de administración de fármacos o es un grupo orgánico que tiene un sustituyente funcional adaptado para la reacción con un grupo sulfhidrilo; R3 es H y R4 es OH
n es 0 o más; y
GlyO es un grupo glicosilo.
en la que R es un grupo
el compuesto de la fórmula general I es el polisacárido que es un derivativo de ácido polisiálico que tiene un grupo aldehido en la unidad terminal reductora.
en la que R es un grupo
CH2CH=N-NHR1 o CH2CH2NHNHR1 el compuesto es un conjugado formado por reacción del derivativo aldehído del ácido polisiálico con una hidrazida R1NHNH2. Una hidrazida es preferiblemente una acil hidrazida (R1 tiene un grupo carbonilo terminal).
en la que R es un grupo
o CH2CH2NHR1, el compuesto es un conjugado formado al hacer reaccionar el derivativo aldehído del ácido polisiálico con un grupo de amina primaria que contiene el compuesto R1NH2.
R1 puede ser el residuo de un péptido o proteína terapéutica, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, una enzima u otro compuesto biológicamente activo como se describió anteriormente. El grupo R1 puede comprender una unidad estructural de enlazante del compuesto activo al ácido polisiálico.
Alternativamente, R1 puede ser el residuo de un reactivo enlazante, por ejemplo, para formar un ácido polisiálico derivativo apropiado para conjugar con grupos distintos de grupos aminas o hidrazidas en compuestos activos. Ejemplos son reactivos enlazantes de fórmula.
que es un compuesto N-maleimido, en el que R2 es un grupo orgánico dibásico, por ejemplo, un arileno oligo (alcoxi) alcano o, preferiblemente, un grupo alcanodiilo, por ejemplo un grupo alcano C2-12 diilo.
Los grupos glicosilo comprenden preferiblemente unidades de ácido siálico y, más preferiblemente, consisten solo en tales unidades, 2-8 y/o 2-9 unidas, por ejemplo, alternando 2-8/2-9, entre sí.
La invención proporciona además composiciones que comprenden los nuevos compuestos y un diluyente, así como composiciones farmacéuticas que comprenden nuevos compuestos en los que R1 tiene actividad biológica, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal, intradérmica, tópica o intratraqueal.
El nuevo procedimiento es de particular valor para la creación de un ácido polisiálico monofuncional (PSA). Se basa en una comprensión del equilibrio tautomérico del anillo del extremo reductor de los PSA, por ejemplo el ácido colomínico (CA) que se describe en la figura 3. El residuo del ácido siálico del extremo reductor del PSA forma espontáneamente una cetona del anillo abierto mediante tautomerización (Fig. 3). En el equilibrio dinámico entre el anillo y las estructuras lineales del residuo del ácido siálico del extremo reductor, la unidad estructural de cetona está presente solo en una subpoblación de moléculas de PSA en cualquier momento. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, en este documento se destaca que la reactividad del hemicetal del extremo reductor es insuficiente para ser de utilidad práctica para la unión de PSA a proteínas, por lo que los procedimientos descritos anteriormente no emplean este sitio en el polímero para la unión a proteínas u otros fármacos. De este modo, como se ilustra en la figura 3, en solución, el residuo de ácido siálico terminal en el extremo reductor del ácido polisiálico existe en un equilibrio tautomérico. La forma de anillo abierto, aunque en baja abundancia en el equilibrio, es débilmente reactiva con los grupos de proteína amina, y puede dar lugar a aductos covalentes con proteínas en presencia de cianoborohidruro de sodio.
En la realización preferida de la invención, para lograr productos mejor definidos de conjugación de proteínas con PSA, ahora se ha creado una forma químicamente modificada de ácido polisiálico que es monofuncional. La nueva forma implica modificaciones químicas en ambos extremos de la molécula de ácido polisiálico natural. A diferencia de la forma original de la reacción (Fig. 1), en la que el polímero se conjuga predominantemente en la orientación 2 a 8, con el “extremo reductor” más externo, la nueva forma del polímero se adhiere exclusivamente en la orientación opuesta.
La nueva forma monofuncional preferida del ácido polisiálico u otro derivativo aldehído de polisacárido es más propicia para la síntesis y fabricación de un producto farmacéuticamente aceptable, ya que evita la complejidad considerable que de otro modo se crea inadvertidamente mediante el uso de formas poliméricas con extremos reductores no modificados (Fig. 2). La producción de la nueva forma del polímero (Fig. 4) implica una oxidación selectiva, preferiblemente por peryodato como en nuestras divulgaciones anteriores, para introducir una función aldehído en el extremo no reductor. Sin embargo, a diferencia de la técnica anterior ilustrada en la figura 1, esta unidad estructural de aldehído se destruye luego por reducción, por ejemplo con borohidruro. En el otro extremo del polímero, la etapa de reducción de borohidruro también bloquea simultáneamente la abertura de la estructura de anillo del extremo reductor, reduciendo el hemicetal. Esta reducción simultánea de la cetona a una unidad estructural de hidroxilo introduce una nueva funcionalidad diol que ahora es susceptible de oxidación selectiva en la segunda etapa de oxidación. Cuando el polímero natural ha sido oxidado (sucesivamente) con peryodato, reducido con borohidruro y oxidado por segunda vez con peryodato, se crea una nueva forma de polímero, que es verdaderamente monofuncional, con un solo grupo reactivo (un aldehído) solo en el extremo reductor (Fig. 3).
La reactividad de la proteína (por aminación reductora) de los diversos intermedios descritos en el procedimiento de "doble oxidación" de la figura 4 se describe en la tabla 2. En particular, estos datos demuestran que el intermedio "CAOR" (ácido colomínico - un ácido polisiálico - oxidado/reducido), creado por la reducción de borohidruro del polímero oxidado de peryodato, es inerte hacia las dianas proteicas, lo que demuestra que tanto sus unidades estructurales de aldehído como hemicetal han sido destruidos por la reducción de borohidruro. En un segundo ciclo de oxidación con peryodato del intermedio CAOR 'inerte a proteínas', se crea un nuevo derivativo de ácido polisiálico (CAORO) que es nuevamente reactivo hacia las proteínas (Tabla 2) y, además, es de carácter verdaderamente monofuncional, con un solo grupo aldehído en el 'extremo reductor' del polímero, y que no es reactivo hacia las proteínas en su otro extremo. El PSA monofuncional puede dar lugar solo a la unión de una sola orientación a las proteínas, con el extremo no reductor más externo, y es incapaz de reticular inadvertidamente las proteínas (Fig. 5). Este nuevo esquema de reacción (Fig. 4), conocido como el procedimiento de "doble oxidación" evita con elegancia la necesidad de purificar el producto deseado de los diversos productos no deseados (descritos en la figura 2), que se evitan completamente en este nuevo esquema de reacción.
La siguiente es una breve descripción de los dibujos.
La figura 1a es un esquema de reacción que muestra la activación de la técnica anterior de la unidad terminal de ácido siálico no reductor;
La figura 1b es un esquema de reacción que muestra la aminación reductora de la técnica anterior de la unidad estructural de aldehído del producto del esquema de reacción 1a usando una unidad estructural de proteína-amina;
La figura 2a es un diagrama esquemático que muestra las reacciones secundarias potenciales que tienen lugar en la reacción de la figura 1b que implican al terminal reductor;
La figura 2b representa esquemáticamente los subproductos potenciales de las reacciones secundarias de la figura 2a;
La figura 3 es un esquema de reacción que muestra el tautomerismo entre las formas cetal y de anillo cerrado de la unidad de ácido siálico terminal reductor de un PSA;
La figura 4a es un esquema de reacción que muestra las reacciones de oxidación de oxidación-reducción preferidas de PSA;
La figura 4b proporciona las condiciones apropiadas para las etapas del esquema de la figura 4 y explica las abreviaturas usadas para los materiales de partida, productos intermedios y productos finales;
La figura 5 es un diagrama esquemático similar a la figura 2b pero muestra los productos de la reacción de la figura 4;
La figura 6 muestra los resultados del análisis GPC de los productos del ejemplo 1;
La figura 7 muestra los resultados de SDS-PAGE del ejemplo 2;
La figura 8 muestra la farmacocinética de la vida media en circulación de los conjugados probados in vivo en ratones en el ejemplo 3;
La figura 9 muestra los resultados del ejemplo 6.
La invención se ilustra adicionalmente en los ejemplos que se acompañan.
Ejemplos
Materiales
Se obtuvieron carbonato de amonio, etilenglicol, polietilenglicol (8kDa), cianoborohidruro de sodio (> 98% de pureza), meta-peryodato de sodio y marcadores de peso molecular de Sigma Chemical Laboratory, Reino Unido. El ácido colomínico usado, los ácidos polisiálicos K1 de E. coli unidos a a(2 ^ 8) lineales (promedio de 22,7 kDa, alta polidispersidad 1,34, 39kDa p.d. 1,4; 11kDa, p.d. 1,27) fue de Camida, Irlanda, yoduro radiactivo (Na125I) fue comprado de Amersham, Reino Unido. Otros materiales incluyeron 2,4 dinitrofenil hidrazina (Aldrich Chemical Company, Reino Unido), tubos de diálisis (límites de corte de 3,5kDa y 10kDa; Medicell International Limited, Reino Unido), Sepharose SP HiTrap, columnas PD-10 (Pharmacia, Reino Unido), geles de tris-glicina poliacrilamida (4-20% y 16%), dodecilsulfato de sodio tris-glicina y solución reguladora de carga (Novex, Reino Unido). El agua desionizada se obtuvo de una unidad de purificación de agua Elgastat Opción 4 (Elga Limited, Reino Unido). Todos los reactivos usados fueron de grado analítico. Se usó un lector de placas (Dynex Technologies, Reino Unido) para las determinaciones espectrofotométricas en ensayos de proteína o Ca . Se adquirieron ratones criados en CD 1 (8-9 semanas; 29-35 g de peso corporal) de Charles River (Reino Unido) y se aclimataron durante al menos una semana antes de su uso.
Procedimientos
Determinación de proteínas y ácidos colomínicos.
La estimación cuantitativa de ácidos polisiálicos (como ácido siálico) con el reactivo de resorcinol se llevó a cabo mediante el procedimiento de resorcinol [Svennerholm, 1957] como se describe en otro lugar [Gregoriadis et al., 1993; Fernandes and Gregoriadis, 1996, 1997]. La Fab (proteína) se midió mediante el procedimiento colorimétrico BCA.
Ejemplo de referencia 1
Los conjugados de proteína de PSA covalente generados por la aminación reductora con cianoborohidruro de sodio usando la forma natural de ácido polisiálico (ácido colomínico, CA) de E. coli, a través de su extremo reductor débilmente reactivo. CA = ácido colomínico; CAO = ácido colomínico oxidado como en Fernandes and Gregoriadis, 1996; Jain, et al., 2003. Se usó cianoborohidruro de sodio (NaCNBHa) a una concentración de 4 mg ml-1.
Los resultados se muestran en la tabla 1. Las proporciones molares en la columna 1 son la proporción de CA(O) inicial a proteína. (n = 3, ± desviación estándar).
Tabla 1
Ejemplo 1 - Preparación de ácido polisiálico monofuncional:
1a Activación del ácido colomínico
La solución de metaperyodato de sodio 0,1 M recién preparada (NaIO4) se mezcló con CA (100 mg de CA/ml de NaIO4) a 20 °C y la mezcla de reacción se agitó magnéticamente durante 15 minutos en la oscuridad. Luego, se añadió un volumen doble de etilenglicol a la mezcla de reacción para gastar el exceso de NaIO4 y la mezcla se dejó agitar a 20 °C, durante 30 minutos más. El ácido colomínico oxidado se dializó (tubo de diálisis cortado con un peso molecular de 3,5 kDa) extensivamente (24 h) contra una solución reguladora de carbonato de amonio al 0,01% (pH 7,4) a 4 °C. Se usó la ultrafiltración (por encima del peso molecular de corte 3,5 kDa) para concentrar la solución de CAO del tubo de diálisis. Después de concentrar hasta el volumen requerido, el filtrado se liofilizó y se almacenó a -40 °C hasta su uso posterior.
1b Reducción del ácido colomínico
El ácido colomínico oxidado (CAO; 22,7 kDa) se redujo en presencia de borohidruro de sodio. El borohidruro de sodio 0,15 mM recién preparado (NaBH4; en NaOH 0,1 M diluido a pH 8-8,5 diluyendo con una solución diluida de H2SO4) se mezcló con CAO (100 mg CA/ml) a 20 °C y la mezcla de reacción se agitó hasta 2 h. en la oscuridad. El pH se redujo a 7 al completar la reacción. El ácido colomínico oxidado/reducido (CAOR) se dializó (tubo de diálisis cortado de peso molecular de 3,5 kDa) contra una solución reguladora de carbonato de amonio al 0,01%, pH (7) a 4 °C. Se usó ultracentrifugación para concentrar la solución de CAOR del tubo de diálisis. El filtrado se liofilizó y se almacenó a 4 °C hasta que se requirió más. La determinación de cualquier contenido de aldehído se determinó como se describe en "determinación de la oxidación del CA".
1c Reoxidación de CA
Después de la confirmación de que no había contenido de aldehído, el ácido colomínico oxidado/reducido (CAOR) se oxidó nuevamente como se informó bajo la activación del ácido colomínico, excepto que el CAOR se incubó con solución de peryodato durante un tiempo más prolongado (hasta 1 h). El grado de oxidación en el producto CAORO se midió también en polvo liofilizado obtenido en esta etapa.
1d Determinación del estado de oxidación de CA y derivativos.
La estimación cualitativa del grado de oxidación del ácido colomínico se realizó con 2,4 dinitrofenilhidrazina (2,4-DNPH), que produce 2,4 dinitrofenil-hidrazonas poco solubles en la interacción con compuestos carbonílicos. (CA) no oxidado, (CAO) oxidado, (CAOR) reducido y (CAORO) reoxidados (5 mg cada uno), se añaden al reactivo 2,4-DNPH (1,0 ml), las soluciones se agitaron y luego se dejaron reposar a 37 °C hasta que se observó un precipitado cristalino [Shriner et. al., 1980]. El grado (cuantitativo) de la oxidación de CA se midió con un procedimiento [Park and Johnson, 1949] basado en la reducción de iones ferricianuro en solución alcalina a ferrocianuro férrico (azul persa), que luego se mide a 630 nm. En este caso, la glucosa se usó como estándar.
1e cromatografía de permeación de gel
Se disolvieron muestras de ácido colomínico (CA, CAO, CAOR y CAORO) en NaNO3 (0,2M), CH3CN (10%; 5mg/ml) y se sometieron a cromatografía en más de 2x columnas de GMPWxl con detección por índice de refracción (sistema GPC: bomba de solvente VE1121 GPC, detector VE3580 RI y compilación con el software Trisec 3 (Viscotek Europe Ltd) Las muestras (5 mg/ml) se filtraron sobre una membrana de nylon de 0,45 |im y se procesaron a 0,7 cm/min con NaNO30,2 M y CH3CN (10%) como la fase móvil.
Resultados
El ácido colomínico (CA), un ácido polisiálico, es un homopolímero lineal unido en alfa-2,8 de los residuos de ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) (Fig. 1a). Sin embargo, el peryodato es un poderoso agente oxidante y, aunque es selectivo [Fleury and Lange, 1932] para los carbohidratos que contienen grupos hidroxilo en los átomos de carbono adyacentes, puede causar una escisión dependiente del tiempo de los residuos internos de Neu5Ac. Por lo tanto, en el presente trabajo, la exposición de los ácidos colomínicos a la oxidación se limitó a 15-60 min. Utilizando peryodato
de 100 mM a temperatura ambiente [Lifely et. al., 1981]. Además, cuando el peryodato se descompone al exponerse a la luz para producir especies más reactivas [Dyer, 1956], las mezclas de reacción se mantuvieron en la oscuridad. La integridad de los residuos de Neu5Ac unidos a alfa-2,8 internos después del tratamiento con peryodoto y borohidruro se analizó mediante cromatografía de permeación de gel y los cromatógrafos obtenidos para los materiales (CAO) oxidado, (CAOR) oxidado reducido, (CAORO) doble oxidado se compararon con el de cA nativo. Se encontró (Fig. 6) que la oxidación (15 minutos) (CAO) (6b), la reducción (CAOR) (6c), la oxidación doble (1 hora) (CAORO) (6d) y el CA nativo (6a) exhiben unos perfiles de elución casi idénticos, sin evidencia de que las etapas sucesivas de oxidación y reducción den lugar a una fragmentación significativa de la cadena del polímero. Los picos pequeños son indicativos de sales de solución reguladora.
La medición cuantitativa del estado de oxidación de CA se realizó mediante la reducción del ion ferricianuro en una solución alcalina a ferrocianuro (azul de Prusia) [Park and Johnson, 1949] usando glucosa como estándar [los resultados se muestran en la tabla 2]. La tabla 2 muestra que se encontró que el ácido colomínico oxidado tiene una cantidad de agente reductor más que estequiométrica (> 100%), es decir, 112% en moles de contenido aparente de aldehído que comprende el poder reductor combinado del hemicetal del extremo reductor y el aldehído introducido (en el otro extremo). No se observó reactividad en CAOR, lo que demuestra que la neutralización tanto del aldehído como del hemicetal de CAO se había logrado con éxito mediante la reducción de borohidruro. Después del segundo ciclo de oxidación del peryodato, el contenido de aldehído del polímero se restableció al 95% en CAORO (dentro de un error experimental del 10%), lo que demuestra la introducción exitosa de una nueva unidad estructural de aldehído en el extremo reductor.
Los resultados del ensayo cuantitativo de los intermedios de ácido colomínico en el procedimiento de doble oxidación usando ferricianuro (Tabla 2) fueron consistentes con los resultados de las pruebas cualitativas realizadas con 2,4 dinitrofenilhidrazina que dio un precipitado de color amarillo tenue con el CA nativo, y color naranja intenso con las formas del polímero que contienen aldehído, lo que resulta en un precipitado de color naranja intenso después de diez minutos de reacción a temperatura ambiente.
Tabla 2
Tabla 2: Grado de oxidación de diversos compuestos intermedios de ácido colomínico en el esquema de reacción de doble oxidación usando glucosa como estándar (100%, 1 mol de aldehído por mol de glucosa; n = 3 ± s.d).
Ejemplo 2 - Preparación de conjugados de Fab-ácido colomínico
Fab se disolvió en PBS 0,15 M (pH 7,4) y se unió covalentemente a diferentes ácidos colomínicos (CA, CAO, CAOR y CAORO) mediante aminación reductora en presencia de cianoborohidruro de sodio (NaCNBHa). El ácido colomínico de cada etapa de la síntesis (material de partida y productos de cada uno de los ejemplos 1a a c) junto con Fab en una proporción molar CA:Fab (100:1) se hicieron reaccionar en PBS 0,15 M (pH 7,4; 2 ml) que contenía cianoborohidruro de sodio (4 mg/ml) en recipientes sellados con agitación magnética a 35±2 °C en un horno. Las mezclas se sometieron luego a precipitación con sulfato de amonio ((NH4)2SO4) añadiendo la sal lentamente mientras se agita continuamente, para lograr una saturación del 70% p/v. Las muestras, agitadas durante 1 h a 4 °C, se centrifugaron durante 15 min (5000xg) y las pellas que contenían Fab polisialilada se suspendieron en una solución saturada de (NH4)2SO4 y se centrifugaron nuevamente durante 15 min (5000xg). Los precipitados recuperados se redisolvieron en 1 ml de solución reguladora de fosfato de Na 0,15 M complementado con NaCl al 0,9% (pH 7,4; PBS) y se dializaron extensamente (24 h) a 4 °C frente al mismo PBS. Los dializados se ensayaron luego para determinar el contenido de ácido siálico y Fab, y el rendimiento de conjugación se expresó en términos de proporción molar CA:Fab. Los controles incluyeron someter la proteína nativa al procedimiento de conjugación en presencia de CA no oxidado o en ausencia de CA, en las condiciones descritas. La agitación se mantuvo al mínimo para evitar la desnaturalización concomitante de la proteína. La Fab polisialilada se caracterizó además por cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico y SDS-PAGE.
2b cromatografía de intercambio iónico
Se sometieron muestras de cero (control) y 48 h (0,5 ml) de las mezclas de reacción a cromatografía de intercambio iónico (IEC) en una columna de intercambio catiónico Sepharose SP (1 ml; velocidad de flujo 1 ml/min; solución reguladora de fosfato de sodio unión/lavado 50 mM, pH 4,0; solución reguladora de elución, solución reguladora de fosfato de sodio 50 mM, pH 4,0 que contiene cloruro de sodio 1 M). Las columnas se lavaron, se eluyeron y las fracciones de los eluentes se analizaron para determinar el contenido de CA y proteína (Fab). Las columnas PD-10 se usaron para desalar muestras antes de aplicar a la columna.
2c Electroforesis en gel SDS-poliacrilamida
Se empleó SDS-PAGE (MiniGel, Unidad de gel vertical, modelo VGT 1, modelo de fuente de alimentación Consort E132; VWR, Reino Unido) para detectar cambios en el tamaño molecular de Fab tras la polisialilación. SDS-PAGE de Fab y sus conjugados (con CA, CAO, CAOR y CAORO) de muestras de 0 (control) y 48 h de las mezclas de reacción, así como un control de procedimiento (CA no oxidado), se llevó a cabo usando un 4-20% de gel de poliacrilamida. Las muestras se calibraron frente a una amplia gama de marcadores de peso molecular.
En experimentos previos [Jain et. al., 2003; Gregoriadis, 2001] con otras proteínas, se encontró que el rendimiento óptimo de la conjugación molar de CA: Fab (derivado de IgG de oveja) requería una temperatura de 35±2 °C en solución reguladora PBS 0,15 M a pH 6-9 durante 48 h. La especie de imina (base de Schiff) formada en estas condiciones entre el polímero aldehído y la proteína se redujo con éxito con NaCNBH3 para formar una amina secundaria estable [Fernandes and Gregoriadis, 1996; 1997]. La exposición de la proteína al CA natural oxidado con peryodato genera un aducto de la proteína de CA base de Schiff metaestable (según se informa para la polisialilación de la catalasa) [Fernandes and Gregoriadis, 1996]. Del mismo modo, en la reacción de formas oxidadas de CA con Fab, se crea primero un aducto de base de Schiff metaestable, mediante incubación del polímero oxidado con Fab durante 48 h a 37 °C, que luego se consolidó mediante reducción selectiva (aminación reductora) con NaCNBH3 (lo que reduce la estructura de la imina de la base de Schiff, pero no la unidad estructural de aldehído del polímero). Con el fin de caracterizar la reactividad de la proteína de los diversos intermedios de CA del 'procedimiento de doble oxidación' Fab se sometió a una aminación reductora en presencia de CA natural (CA), CA oxidado (CAO), CA oxidado-reducida (CAOR) y CA 'Doble oxido' (CAORO). Para estos estudios se usó un PsA de 22,7 kDa, con una proporción molar CA: Fab de (100:1). Después de 48 h de incubación en presencia de NaCNBH3, se aislaron conjugados de Fab de las mezclas de reacción por precipitación con sulfato de amonio (como se describe en los "Ejemplos") y los resultados se expresaron en términos de proporciones molares de CA:Fab en los conjugados resultantes (Tabla 3 ).
Tabla 3: Síntesis de compuestos de Fab (proteína) ácido colomínico.
Es evidente a partir de la tabla 3 que cuando se usó CA natural no oxidado (en presencia de cianoborohidruro), se observó un nivel significativo pero bajo de conjugación (que resultó en una proporción molar de 0,21: 1, CA: Fab) a través de la reacción con el grupo hemiacetal de CA en su extremo reductor.
La formación de los conjugados de CA-Fab se confirmó adicionalmente por la coprecipitación de las dos unidades estructurales tras la adición de (NH4)2SO4 (el CA como tal no precipita en presencia de la sal). La evidencia de conjugación también se confirmó mediante cromatografía de intercambio iónico (IEC, no se muestra) y electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE; Fig. 7).
Para la cromatografía de intercambio iónico, la Fab polisialilada obtenida por precipitación de (NH4) 2SO4 se redisolvió en una solución reguladora de fosfato de sodio (50 mM, pH 4,0) y se sometió a IEC usando una columna Sepharose SP HiTrap (intercambio catiónico). En contraste con los resultados que indican una resolución completa de CA (en el lavado) y Fab (en fracciones eluidas), tanto el CA como la Fab de las muestras de reacción de 48 h coeluyeron en las fracciones de lavado, lo que demuestra la presencia de conjugado CA-Fab.
La figura 7 describe el análisis de los conjugados Fab de anticuerpo descritos anteriormente. Estos datos confirman que las distribuciones de peso molecular de los dos conjugados son muy similares (como se esperaba, ya que los subproductos obtenidos del CA bifuncional asimétricamente constituyen solo un pequeño porcentaje de la población total de moléculas). También es evidente a partir de la figura 7 que si los conjugados Fab se prepararon a partir de
CA bifuncional asimétricamente (es decir, CA natural oxidado con peryodato) o a partir de PSA monofuncional, que fueron creados conjugados de una amplia distribución de pesos moleculares, elevados del peso molecular del control Fab no derivado. Esto es consistente con la polidispersidad conocida del polímero natural informado en nuestros trabajos anteriores publicados. La figura 7 también confirma que la aminación reductora con CA monofuncional da lugar a un conjugado Fab con un rendimiento comparable al del procedimiento anterior basado en el CA natural oxidado con peryodato (descrito en la figura 1). También es evidente a partir de la figura 7 que en cada muestra de conjugado solo quedaban cantidades traza de Fab sin derivar. Las cantidades de trazas de Fab restante se eliminaron de estos conjugados mediante cromatografía de intercambio iónico antes de los estudios in vivo (Ejemplo 3 a continuación).
Ejemplo 3 - Estudios in vivo
Las muestras de fragmentos de IgG Fab de oveja o conjugados con CAO o CAORO se marcaron radiactivamente con I125 de la siguiente manera: se retiró el 10% en volumen de cada una de estas muestras (~100 |il) y se colocaron en tubos de IODO-gen nuevos. Se añadió una muestra de 20 |il de PBS que contenía 200 mCi de 125I (como NaI) a la proteína o conjugado y los tubos se taparon y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Los contenidos de los tubos se transfirieron luego a filtros centrífugos de 500 |il (límite 3,5 kDa m.w.) y las muestras se centrifugaron a 6.500 rpm en una microcentrífuga. El eluyente se descartó y el volumen en el retenido (por encima de la membrana) se completó hasta 500 |il. Este procedimiento se repitió 5 veces más, después de lo cual se evaluó la radioactividad anterior (proteína) e inferior (yodo libre) de la membrana para una muestra de 5 |il usando un contador Packard Cobra Gamma. Si los recuentos debidos a I125 libre eran inferiores al 5% de los de la fracción conjugada, no se llevó a cabo ninguna purificación adicional. Si el I125 libre era > 5%, el ciclo de purificación se repetía y las muestras se reevaluaban.
A los ratones CD1 (29-35 g de peso corporal) se les administró 40 |ig (100 |il de volumen en PBS) de proteína por ratón (~ 1.6 mg/kg) por vía i.v. (vena de la cola) como inyección única y luego se tomaron muestras de 50 |il de sangre (usando capilares graduados con heparina) a intervalos de tiempo de una vena de la cola diferente y se añaden a 500 |il de PBS. El último sangrado registrado fue un sangrado total para permitir suficientes recuentos. Las muestras se centrifugaron luego a 3000 rpm durante 10 minutos y se registró el sobrenadante y se colocaron en tubos contadores gamma. Las muestras se contaron junto con muestras representativas de la proteína inyectada en un contador gamma automático Packard Cobra II. Los recuentos registrados se expresaron como un porcentaje de la dosis original inyectada.
Muestras de conjugados de Fab radioyodados y Fab de CAO y CAORO, e inyectados por vía intravenosa en ratones para monitorear la vida media en la circulación sanguínea: La figura 8 muestra la farmacocinética de los conjugados de Fab Vs Fabs-ácido colomínico preparados por el procedimiento original (usando CAO) y por el nuevo procedimiento de doble oxidación (usando CAORO). Estos resultados demuestran que CAO-Fab y CAORO-Fab dieron lugar a tiempos de residencia marcados y significativamente más largos en la circulación, que en el caso de Fab no derivada, dando lugar a aumentos de 6,28 veces y 5,28 veces (respectivamente) en valores AUC en comparación con Fab nativa
Ejemplo 4 - Síntesis de conjugado de maleimida
El CAORO sintetizado en el ejemplo 1c anterior se hizo reaccionar con 5 equivalentes molares de hidrazida de N-[ácido p-maleimidopropiónico] en acetato de sodio 0,1 M durante 2 horas a 37 °C. El producto hidrazona se precipitó en etanol, se resuspendió en acetato de sodio y se precipitó nuevamente en etanol, se redisolvió en agua y se liofilizó. El producto es útil para la conjugación específica del sitio con los grupos tiol de las unidades estructurales de cisteína en proteínas y péptidos.
El derivado aldehído del ácido polisiálico monofuncional también podría hacerse reaccionar con un compuesto de enlace que tiene una unidad estructural de hidrazida y una unidad estructural de N-maleimida para formar una hidrazona estable que tiene una funcionalidad maleimida activa útil para reaccionar con un grupo tiol.
Ejemplo 5 - Síntesis de conjugados de insulina-ácido colomínico
Para la preparación de conjugados de rh-insulina se usó ácido polisiálico activado (ácido colomínico oxidado (CAO)) y ácido polisiálico monofuncional (ácido colomínico oxidado- reducido-oxidado (CAORO)) preparado en el ejemplo 1.
Preparación de conjugados de insulina-ácido colomínico.
La insulina se disolvió en un volumen mínimo de HCl 15 mM seguido de dilución con PBS 0,15 M (pH 7,4) y se unió covalentemente a diferentes ácidos colomínicos (CA, CAO y CAORO monofuncional). El ácido colomínico (22,7 kDa) junto con insulina (2 mg) en una proporción molar CA: insulina (25:1) se hicieron reaccionar durante 48 h en PBS 0,15 M (pH 7,4; 2 ml) que contenían cianoborohidruro de sodio (4 mg/ml) en recipientes sellados con agitación magnética a 35±2 °C en una incubadora. Las mezclas se sometieron luego a precipitación con sulfato de amonio
((NH4)2SO4) añadiendo la sal lentamente mientras se agita continuamente, para lograr una saturación del 70% p/v. Las muestras se agitaron durante 1 hora a 4 °C, luego se centrifugaron (5000xg) durante 15 minutos y las pellas se suspendieron en una solución saturada de (NH4)2SO4 y se centrifugaron nuevamente durante 15 minutos (5000xg). Los precipitados recuperados se redisolvieron en 1 ml de solución reguladora de fosfato de Na 0,15 M complementado con NaCl al 0,9% (pH 7,4; PBS) y se dializaron extensamente (24 h) a 4 °C frente al mismo PBS. Luego, los dializados se analizaron para determinar el contenido de ácido siálico y proteína y el rendimiento de conjugación se expresó en términos de proporción molar CA: insulina (como en el ejemplo 1). Los controles incluyeron someter la proteína nativa al procedimiento de conjugación en presencia de CA no oxidado o en ausencia de CA, en las condiciones descritas. La agitación se mantuvo al mínimo para evitar la desnaturalización concomitante de la proteína. La insulina polisialilada se caracterizó además por cromatografía de intercambio iónico y SDS-PAGE. Los resultados se expresan en términos de proporciones molares CA: insulina en los conjugados resultantes (Tabla 4).
Tabla 4: Síntesis de compuestos de insulina (proteína) ácido colomínico
Es evidente a partir de la tabla 4 que cuando se usó CA natural no oxidado (en presencia de cianoborohidruro), se observó un nivel significativo pero bajo de conjugación (que resultó en una proporción molar de 0,07: 1, CA: insulina) a través de la reacción con el grupo hemiacetal de CA en su extremo reductor.
La formación de los conjugados de CA-insulina se confirmó adicionalmente mediante la coprecipitación de las dos unidades estructurales tras la adición de (NH4)2SO4 (el CA como tal no precipita en presencia de la sal). La evidencia de conjugación también se confirmó mediante cromatografía de intercambio iónico (IEC) y electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
Ejemplo 6 - Estudios in vivo
La insulina y las construcciones de insulina polisialilada del ejemplo 5 se probaron para determinar su capacidad para reducir el nivel de glucosa en sangre en ratones criados T/O hembra normales (22-24 gramos de peso corporal). Los animales se dividieron en grupos de cinco, se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) con insulina (0,3 unidades por ratón en cloruro de sodio al 0,9% o con la misma equivalencia de proteínas de la insulina polisialilada) y se midieron los niveles de glucosa en muestras de sangre a intervalos de tiempo usando un kit de ensayo de glucosa (Accu-Chek Advantage, Roche, Reino Unido).
Resultados
La actividad farmacológica de las construcciones de insulina polisialilada se comparó con la de la insulina intacta en ratones normales inyectados por vía subcutánea y sangrados a intervalos de tiempo. Los niveles de glucosa en sangre de los ratones para las 3 insulinas se muestran en la figura 9. Los puntos de datos muestran el promedio de 5 muestras y las barras de error de los valores s.e.m. Los resultados en la figura 9 muestran claramente que las insulinas polisialiladas (preparadas por el procedimiento original (usando CAO) y por el nuevo procedimiento de oxidación doble (usando CAORO monofuncional)) ejercieron una reducción más prolongada de los niveles de glucosa en sangre. De este modo, mientras que los niveles de glucosa alcanzaron valores nadir a las 0,75 horas para volver a los niveles normales dos horas después del tratamiento con insulina intacta, los niveles de glucosa en ratones tratados con el péptido polisialilado, aunque también los más bajos a 0,75 h, volvieron a los valores normales a las 6 horas. Estos resultados demuestran que el CAO-insulina y el CAORO-insulina dieron lugar a tiempos de residencia marcados y significativamente más largos en la circulación, que en el caso de insulina no derivada, dando lugar a aumentos en el área por encima de la curva en comparación con la insulina nativa.
La solución reguladora se cambió en agua desionizada por ultrafiltración repetida a 4 °C. Las muestras se analizaron para determinar el peso molecular promedio y otros parámetros mediante GPC (como se informó en el ejemplo 1e) y PAGE nativo (teñido con azul de Alcian).
Fraccionamiento a menor escala.
Las siguientes muestras se fraccionaron usando un sistema idéntico de lavado y gradiente en una escala menor (matriz de 1-5 ml; 0,2-3 gramos de ácido colomínico):
Ácido colomínico (CA, 22,7kDa, pd 1,34; CA, 39 kDa, pd = 1,4), ácido colomínico-aldehído (CAO, 22,7 kDa, pd 1,34), ácido colomínico monofuncional (CAORO, 22,7kDa; pd 1,34), ácido colomínico amina (CA-NH2, 22,7kDa, pd 1,34), ácido colomínico maleimida (CAM, como en el ejemplo 4 y el m.w. de CA producido en todo el seguimiento).
Las fracciones estrechas de CA producidas usando el procedimiento anterior se oxidaron con peryodato 10 mM y se analizaron mediante cromatografía de permeación de gel (GPC) y PAGE nativo para la alteración bruta del polímero.
Resultados
Tabla 4 Cromatografía de intercambio iónico de CA22,7: aumento de escala (matriz de 75 ml, 3 g de CA)
El ácido colomínico y sus derivativos (22,7 kDa) se fraccionaron exitosamente en varias especies estrechas con una polidispersidad menor a 1,1 con m.w. promedios de hasta 46 kDa con diferentes% de poblaciones. Figuras 9 y 10; La tabla 4 muestra los resultados de la separación del material de 22,7 kDa en una escala de 5 ml. La figura 9 es el resultado de GPC y la figura 10 es una PAGE nativa.
Este procedimiento fue escalable de 1 ml a 900 ml de matriz con el perfil de fraccionamiento casi idéntico en cada escala (no se muestran todos los resultados).
El fraccionamiento de un polímero más grande (CA, 39 kDa, pd 1,4) produjo especies de hasta 90 kDa. Este procedimiento se puede usar con éxito para el fraccionamiento de incluso lotes grandes de polímero. La figura 11 muestra los resultados de PAGE nativa para las 3 muestras de CA suministradas y para las fracciones separadas por intercambio iónico analizadas como en la tabla 4. Los resultados de PAGE muestran que las fracciones de intercambio iónico están dispersas por poco. Esto concuerda con los datos de GPC que se muestran en la figura 12 que muestra los resultados para 3 de las fracciones separadas del CA de 22,7 kDa. Los volúmenes de retención se muestran en la tabla 5.
Tabla 5
Muestra MW Mn PD
1 18727 15016 1,25
2 27677 25095 1,10
3 40950 40279 1,02
El material de 22,7 kDa se separa en una escala mayor. Usando GPC se analizan las fracciones de intercambio iónico. Se recuperaron las siguientes fracciones que se muestran en la tabla 6 (véanse las figuras).
Todas las fracciones estrechas se oxidaron con éxito con peryodato 10 mM y se tomaron muestras de diferentes etapas del procedimiento de producción y se analizaron por GPC y la PAGE nativa no mostró cambios en el peso molecular y la polidispersidad. Los datos para algunas de las muestras se muestran en la figura 13.
2.3 Precipitación del ácido colomínico
Se usó precipitación de etanol diferencial para precipitar diferentes longitudes de cadena de ácido colomínico.
Resultados
La precipitación de etanol diferencial mostró que las CA más pequeñas requerían más etanol (EtOH). El polímero de 22,7 kDa ancho p.d. se precipitó con 70% de EtOH dando un rendimiento > 80% del polímero del producto. Se requirió una concentración de 80% de EtOH para precipitar > 80% de un MW a 6,5kDa (pd <1,1). Este procedimiento también elimina cualquier sal que contamine el producto.
2.4 Fraccionamiento del ácido colomínico por filtración.
Las muestras de 22,7 kDa se purificaron mediante ultrafiltración sobre membranas cortadas de diferente peso molecular (5, 10, 30, 50 y 100 kDa). En todos los casos, el retenido fue examinado por GPC y PAGE nativa.
Resultados
Las muestras de 22,7 kDa se purificaron mediante ultrafiltración sobre membranas cortadas de diferente peso molecular mostraron que había una disminución en la polidispersidad del polímero y un cambio hacia un peso molecular más alto con un aumento en el corte de la membrana (Figura 14).
Los procedimientos combinados y la cromatografía de pares iónicos también pueden ser para el fraccionamiento de los polímeros.
Ejemplo 5 - Síntesis de la hormona del crecimiento (GH) - conjugados de ácido colomínico (dispersos amplios y estrechos)
Se usó ácido colomínico oxidado (CAO; 22,7 kDa) y ácido colomínico-disperso estrecho-oxidado (NCAO; 27,7kDa pd = 1,09; 40,9 kDa. Pd = 1,02) preparado en el ejemplo de referencia 2.2 para la preparación de GH conjugados.
Preparación de conjugados de hormona de crecimiento-ácido colomínico.
La hormona de crecimiento se disolvió en PBS 0,15 M (pH 7,4) y se unió covalentemente a diferentes ácidos colomínicos (CAO y NCAO). Se añadieron individualmente diferentes CA (22 kDa, CAO; 27,7 kDa & 40,9 kDa, NCA) a GH (2 mg) en una proporción molar de CA: GH (12,5:1), se añadió cianoborohidruro de sodio a una concentración final de 4 mg/ml. Las mezclas de reacción se sellaron y se agitaron magnéticamente durante 24 horas a 35±2 °C. Las mezclas se sometieron luego a precipitación con sulfato de amonio ((NH4)2SO4) añadiendo la sal lentamente mientras se agitaba continuamente, para lograr una saturación del 70% p/v, se agitó durante 1 hora a 4 °C, luego se centrifugó (5000 xg) durante 15 minutos y las pellas se resuspendieron en una solución saturada de (NH4)2SO4 y se centrifugaron de nuevo durante 15 minutos (5000xg). Los precipitados recuperados se redisolvieron en 1 ml de PBS a pH 7,4 y se dializaron extensamente (24 h) a 4°C contra la misma solución reguladora. Los controles incluyeron someter la proteína nativa al procedimiento de conjugación en presencia de CA no oxidado o en ausencia de CA. La agitación se mantuvo al mínimo para evitar la desnaturalización concomitante de la proteína. La GH polisialilada se caracterizó por SDS-PAGE. La GH polisialilada se pasó a través de cromatografía de intercambio aniónico como se describe en el ejemplo de referencia 2 y las fracciones del producto se sometieron a SDS PAGE.
Resultados
Los resultados (Figura 15) muestran que en el pozo de control (con GH) la migración de la muestra es similar a la de la GH nueva. En los carriles conjugados hay cambios en las bandas que por lo general indican un aumento en la masa indicativa de una GH polisialilada. El ancho de banda se redujo significativamente en el caso de conjugados con polímeros dispersos estrechos en comparación con conjugados con polímeros dispersos amplios. Además, los conjugados de Gh (con un amplio polímero dispersado) se separaron en diferentes especies mediante cromatografía de intercambio aniónico (Figura 16).
Ejemplo 6 - Síntesis de conjugados de insulina-ácido colomínico
Para la preparación de conjugados de rh-insulina se usó ácido polisiálico activado (ácido colomínico oxidado (CAO)) y ácido polisiálico monofuncional (ácido colomínico oxidado-reducido-oxidado (CAORO)) preparado en el ejemplo 1.
Preparación de conjugados de insulina-ácido colomínico.
La insulina se disolvió en un volumen mínimo de HCl 15 mM seguido de dilución con PBS 0,15 M (pH 7,4) y se unió covalentemente a diferentes ácidos colomínicos (CA, CAO y CAORO monofuncional). El ácido colomínico (22 kDa) junto con la insulina (2 mg) en una proporción molar CA: insulina (25: 1) se hizo reaccionar durante 48 h en PBS 0,15 M (pH 7,4; 2 ml) que contenía cianoborohidruro de sodio (4 mg/ml) en recipientes sellados con agitación magnética a 35±2 °C en una incubadora. Las mezclas se sometieron luego a precipitación con sulfato de amonio
((NH4)2SO4) añadiendo la sal lentamente mientras se agita continuamente, para lograr una saturación del 70% p/v. Las muestras se agitaron durante 1 h a 4 °C, luego se centrifugaron (5000xg) durante 15 minutos y las pellas se suspendieron en una solución saturada de (NH4)2SO4 y se centrifugaron nuevamente durante 15 minutos (5000xg). Los precipitados recuperados se redisolvieron en 1 ml de solución reguladora de fosfato de Na 0,15 M complementado con NaCl al 0,9% (pH 7,4; PBS) y se dializaron extensamente (24 h) a 4 °C frente al mismo PBS. Luego, los dializados se analizaron para determinar el contenido de ácido siálico y proteína y el rendimiento de conjugación se expresó en términos de proporción molar CA: insulina (como en el ejemplo 1). Los controles incluyeron someter la proteína nativa al procedimiento de conjugación en presencia de CA no oxidado o en ausencia de CA, en las condiciones descritas. La agitación se mantuvo al mínimo para evitar la desnaturalización concomitante de la proteína. La insulina polisialilada se caracterizó además por cromatografía de intercambio iónico y SDS-PAGE. Los resultados se expresan en términos de proporciones molares CA: insulina en los conjugados resultantes (Tabla 7).
Tabla 7: Síntesis de compuestos de insulina (proteína) ácido colomínico
Es evidente a partir de la tabla 4 que cuando se usó CA natural no oxidado (en presencia de cianoborohidruro), se observó un nivel significativo pero bajo de conjugación (que resultó en una proporción molar de 0,07:1, CA:insulina) a través de la reacción con el grupo hemiacetal de CA en su extremo reductor.
La formación de los conjugados de CA-insulina se confirmó adicionalmente mediante la coprecipitación de las dos unidades estructurales tras la adición de (NH4)2SO4 (el CA como tal no precipita en presencia de la sal). La evidencia de conjugación también se confirmó mediante cromatografía de intercambio iónico (IEC) y electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
Ejemplo 7 - Estudios in vivo
La insulina y las construcciones de insulina polisialilada del ejemplo 6 se probaron para determinar su capacidad para reducir el nivel de glucosa en sangre en ratones T/O criados hembra normales (22-24 gramos de peso corporal). Los animales se dividieron en grupos de cinco, se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) con insulina (0,3 unidades por ratón en cloruro de sodio al 0,9% o con la misma equivalencia de proteínas de la insulina polisialilada) y se midieron los niveles de glucosa en muestras de sangre a intervalos de tiempo usando un kit de ensayo de glucosa (Accu-Chek Advantage, Roche, Reino Unido).
Resultados
La actividad farmacológica de las construcciones de insulina polisialilada se comparó con la de la insulina intacta en ratones normales inyectados por vía subcutánea y sangrados a intervalos de tiempo. Los niveles de glucosa en sangre de los ratones para las 3 insulinas se muestran en la figura 17. Los puntos de datos muestran el promedio de 5 muestras y las barras de error son los valores s.e.m. Los resultados en la figura 17 muestran claramente que las insulinas polisialiladas (preparadas por el procedimiento original (usando CAO) y por el nuevo procedimiento de oxidación doble (usando CAORO monofuncional)) ejercieron una reducción más prolongada de los niveles de glucosa en sangre. De este modo, mientras que los niveles de glucosa alcanzaron valores nadir a las 0,75 horas para volver a los niveles normales dos horas después del tratamiento con insulina intacta, los niveles de glucosa en ratones tratados con el péptido polisialilado, aunque también los más bajos a 0,75 h, volvieron a los valores normales a las 6 horas. Estos resultados demuestran que el CAO-insulina y el CAORO-insulina dieron lugar a tiempos de residencia marcados y significativamente más largos en la circulación, que en el caso de insulina no derivada, dando lugar a aumentos en el área por encima de la curva en comparación con la insulina nativa.
Referencias
Bendele, A., Seely, J., Richey, C., Sennello, G., Shopp, G., Renal tubular vacuolation in animals treated with polyethylene- glycol conjugated proteins, Toxicological sciences, 42 (1998) 152-157.
Beranova, M., Wasserbauer, R., Vancurova, D., Stifter, M., Ocenaskova, J., Mora, M., Biomaterials, 11 (2000) 521-524.
Brocchini, S., Polymers in medicine: a game of chess. Drug Discovery Today, 8, (2003) 111-112.
Cheng T, Wu, M., Wu,P., Chern, J, Roffer, SR., Accelerated clearance of polyethylene glycol modified proteins by anti-polyethylene glycol IgM. Bioconjugate chemistry, 10 (1999) 520-528.
Cho, J.W. and Troy, F. A., Polysialic acid engineering: Synthesis of polysialylated neoglycosphingolipid by using the polytransferase from neuroinvasive E.coli K1, Proceedings of National Academic Sciences, u Sa , 91 (1994) 11427-11431.
Convers, C. D., Lejeune, L., Shum, K., Gilbert, C., Shorr, R.G.L, Physiological effect of polyethylene glycol conjugation on stroma-free bovine hemoglobin in the conscious dog after partial exchange transfusion, Artificial organ, 21 (1997) 369-378.
Dyer, J.R., Use of periodate oxidation in biochemical analysis, Methods of Biochemical Analysis, 3 (1956) 111-152.
Fernandes, A.I., Gregoriadis, G., Polysialylated asparaginase: preparation, activity and pharmacokinetics, Biochimica et Biophysica Acta, 1341 (1997) 26-34.
Fernandes, A.I., Gregoriadis, G., Synthesis, characterization and properties of polysialylated catalase, Biochimica et Biophysica Acta, 1293 (1996) 92-96.
Fernandes, A.I., Gregoriadis, G., The effect of polysialylation on the immunogenicity and antigenicity of asparaginase: implications in its pharmacokinetics, International Journal of Pharmaceutics, 217 (2001) 215 224.
Fleury, P., Lange, J., Sur l'oxydation des acides alcools et des sucres par I'acid periodique, Comptes Rendus Academic Sciences, 195 (1932) 1395-1397.
Gregoriadis, G., Drug and vaccine delivery systems, in: PharmaTech, World Markets Research Centre Limited, London (2001) 172-176.
Gregoriadis, G., Fernandes, A., McCormack, B., Mital, M., Zhang, X, Polysialic acids: Potential for long circulating drug, protein, liposome and other microparticle constructs, in Gregoriadis, G and McCormack, B (Eds), Targeting of Drugs, Stealth Therapeutic Systems, Plenum Press, New York (1998) 193-205.
Gregoriadis, G., Fernandes, A., Mital, M., McCormack, B., Polysialic acids: potential in improving the stability and pharmacokinetics of proteins and other therapeutics, Cellular and Molecular Life Sciences, 57 (2000) 1964-1969.
Gregoriadis, G., McCormack, B., Wang, Z., Lifely, R., Polysialic acids: potential in drug delivery, FEBS Letters, 315 (1993) 271-276.
Hreczuk-Hirst, D., Jain, S., Genkin, D., Laing, P., Gregoriadis, G., Preparation and properties of polysialylated interferon-D-2b, AAPS Annual Meeting, 2002, Toronto, Canada, M1056
Hunter, A. C, Moghimi, S. M., Therapeutic synthetic polymers: a game of Russian Roulette. Drug Discovery Today, 7 (2002) 998-1001.
Jain, S., Hirst, D. H., McCormack, B., Mital, M., Epenetos, A., Laing, P., Gregoriadis, G., Polysialylated insulin: synthesis, characterization and biological activity in vivo, Biochemica et. Biophysica Acta, 1622 (2003) 42-49. Jain, S., Hirst, D.H., Laing, P., Gregoriadis, G., Polysialylation: The natural way to improve the stability and pharmacokinetics of protein and peptide drugs, Drug Delivery Systems and Sciences, 4(2) (2004) 3-9.
Jennings, H. J., Lugowski, C., Immunogenicity of groups A, B, and C meningococal polysaccharide tetanus toxoid conjugates, Journal of Immunology, 127 (1981) 1011-1018.
Lifely, R., Gilhert, A.S., Moreno, C.C., Sialic acid polysaccharide antigen of Neisseria meningitidis and Escherichia coli: esterification between adjacent residues, Carbohydrate Research, 94 (1981) 193-203.
Mital, M., Polysialic acids: a role for optimization of peptide and protein therapeutics, Ph.D. Thesis, University of London, 2003 (submitted).
Muflenhoff, M., Ectehardt, M., Gerardy-Schohn, R., Polysialic acid: three-dimensional structure, biosynthesis and function, Current opinions in Structural Biology, 8 (1998) 558-564.
Park, J.T., Johnson, M.J., A submicrodetermination of glucose, Journal of Biological Chemistry, 181 (1949) 149-151.
Roth, J., Rutishauser, U., Troy, F.A. (Eds.), Polysialic acid: from microbes to man, Birkhauser Verlag, Basel, Advances in Life Sciences, 1993.
Rutishauser, U., Polysialic acid as regulator of cell interactions in: R.U. Morgoles andR.K. Margalis (eds.), Neurobiology of Glycoconjugates, pp 367-382, Plenum Press, New York, 1989.
Shriner, R. L., Fuson, R.D.C., Curtin, D.Y., Morill, T.C., The Systematic Identification of Organic Compounds, 6th ed., Wiley, New York, 1980.
Svennerholm, L., Quantitative estimation of sialic acid II: A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method, Biochimca et Biophysica Acta, 24 (1957) 604-611.
Troy, F. A. Polysialylation of neural cell adhesion molecules, Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 2 (1990) 430-449.
Troy, F.A. , Polysialylation: From bacteria to brain, Glycobiology, 2 (1992) 1-23.
Claims (30)
1. Un procedimiento de producción de un derivativo aldehido de un ácido siálico en el que un material de partida que tiene una unidad de ácido siálico en el terminal reductor y una unidad de sacárido terminal en el extremo no reductor que tiene un grupo diol vecinal se somete a las etapas secuenciales de:
a) oxidación selectiva preliminar para oxidar el grupo diol vecinal a un aldehído
b) reducción para abrir reductivamente el anillo en la unidad de ácido siálico terminal reductor, por lo que se forma un grupo diol vecinal, y en el que el aldehído formado en la etapa a) también se reduce para formar un grupo hidroxi que no es parte de un grupo diol vecinal; y
c) oxidación selectiva para oxidar el grupo diol vecinal formado en la etapa b) para formar un grupo aldehído.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la unidad de ácido siálico en el terminal reductor se une a la unidad adyacente a través del átomo de carbono 8, por lo que en la etapa c) el grupo diol vecinal 6,7 se oxida para formar un aldehído en el átomo de carbono 7.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la unidad de sacárido en el extremo no reductor es una unidad de ácido siálico.
4. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que el material de partida es un di-, oligo- o poli-sacárido.
5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que el polisacárido es un ácido polisiálico que consiste sustancialmente solo en unidades de ácido siálico.
6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que el polisacárido tiene al menos 10 unidades de ácido siálico en la molécula.
7. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que la etapa de oxidación preliminar se lleva a cabo en condiciones tales que sustancialmente no hay escisión de cadena media de la cadena de polisacárido.
8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que la etapa de oxidación preliminar se lleva a cabo en solución acuosa en presencia de peryodato a una concentración en el intervalo de 1 mM a 1M, un pH en el intervalo de 3 a 10, una temperatura en el intervalo de 0 a 60 °C y un tiempo en el intervalo de 1 min a 48 horas.
9. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que la etapa b) se lleva a cabo en condiciones tales que los grupos carboxilo colgantes en el material de partida no se reducen.
10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que la etapa b) se lleva a cabo en solución acuosa en presencia de borohidruro en una concentración en el intervalo de 1 |iM a 0,1 M, un pH en el intervalo de 6,5 a 10, una temperatura en el intervalo de 0 a 60 °C y un período en el intervalo de 1 min a 48 h.
11. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que el derivativo aldehído se hace reaccionar con un sustrato que tiene un grupo de amina primaria o un grupo de hidrazida.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que el producto se reduce.
13. Un procedimiento según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que el sustrato es un péptido o una proteína.
14. Un procedimiento según la reivindicación 13, en el que el sustrato es un péptido terapéutico.
15. Un procedimiento según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que el sustrato es un compuesto que tiene un sustituyente de grupo funcional y un grupo orgánico dibásico que se une al grupo de amina o hidrazida y al grupo funcional.
16. Un procedimiento según la reivindicación 15, en el que el producto se hace reaccionar posteriormente con un compuesto que tiene un grupo tiol.
17. Un procedimiento según la reivindicación 16, en el que el compuesto que tiene un grupo tiol es una proteína.
18. Un procedimiento según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que el sustrato es un sistema de administración de fármacos, una célula, un virus o un polímero sintético.
19. Un compuesto que es un derivativo aldehido de un di-, oligo- o poli-sacárido que comprende al menos una unidad de ácido siálico, en el que la unidad terminal en el extremo reductor incluye una unidad estructural de aldehído o es un grupo OR, en el que R es seleccionado de
-CH2-CHO,
-CH2CH2NHR1, CH2CH=N-NHR1 y CH2CH2NHNHR1 en las que R1 es H, alquilo C1.24, aril alcanoilo C2-6, o un polipéptido o una proteína unida a través del terminal N o el grupo y-amina de un residuo de lisina, al sistema de administración de fármacos o es un grupo orgánico que tiene un sustituyente funcional adaptado para la reacción con un grupo sulfhidrilo y que tiene una unidad pasivada en el extremo no reductor, obtenible mediante un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
20. Un compuesto según la reivindicación 19, que tiene la fórmula general I
en la que R3 es H, R4 es OH, GlyO es un grupo glicosilo y n es 0 o más.
21. Un compuesto según la reivindicación 19 o la reivindicación 20, que es un polisacárido en el que sustancialmente todas las unidades de sacárido son de ácido siálico, unidas 2-8, 2-9 o alternativamente 2-8/2-9, entre sí.
22. Un compuesto según la reivindicación 21, que tiene al menos 10 unidades de ácido siálico en la cadena de polisacárido.
23. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que R1 es una proteína o péptido o un sistema de administración de fármacos.
24. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 en el que R es
25. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 en el que R es
26. Un compuesto según la reivindicación 23 o la reivindicación 25, en el que R1 es un péptido o proteína terapéutica.
27. Un compuesto según la reivindicación 26, en el que el péptido o proteína terapéutica es un anticuerpo o fragmento.
28. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 en el que R1 es un grupo
en la que R2 es un grupo orgánico dibásico.
29. Una composición que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27 y un diluyente.
30. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 23 o la reivindicación 26 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP03254989 | 2003-08-12 | ||
| PCT/GB2004/003511 WO2005016974A1 (en) | 2003-08-12 | 2004-08-12 | Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2735809T3 true ES2735809T3 (es) | 2019-12-20 |
Family
ID=34178604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04768074T Active ES2735809T3 (es) | 2003-08-12 | 2004-08-12 | Derivativos del ácido siálico para la derivatización y conjugación de proteínas |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7807824B2 (es) |
| EP (1) | EP1654290B1 (es) |
| JP (1) | JP4566194B2 (es) |
| KR (1) | KR101113726B1 (es) |
| ES (1) | ES2735809T3 (es) |
| RU (1) | RU2333223C2 (es) |
| WO (2) | WO2005016949A2 (es) |
Families Citing this family (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005016949A2 (en) | 2003-08-12 | 2005-02-24 | Lipoxen Technologies Limited | Sialic acid derivatives |
| JP5026266B2 (ja) * | 2004-08-12 | 2012-09-12 | リポクセン テクノロジーズ リミテッド | 分別 |
| US7645860B2 (en) | 2006-03-31 | 2010-01-12 | Baxter Healthcare S.A. | Factor VIII polymer conjugates |
| CN103169984B (zh) | 2006-07-25 | 2016-08-03 | 利普生技术有限公司 | N末端聚唾液酸化 |
| GB0615067D0 (en) * | 2006-07-28 | 2006-09-06 | Ttp Communications Ltd | Reconfigurable signal processing scheme |
| ES2521490T3 (es) | 2006-12-15 | 2014-11-12 | Baxter International Inc. | Conjugado de factor VIIa - ácido (poli)siálico con una vida media in vivo prolongada. |
| EP2409994A3 (en) | 2007-02-28 | 2012-08-15 | Lipoxen Technologies Limited | Reduction of endotoxin in polysialic acids |
| ES2351655T3 (es) * | 2007-03-16 | 2011-02-09 | Bien-Air Holding Sa | Instrumento manual para empleo dental y quirúrgico. |
| DK2349341T3 (da) * | 2008-10-15 | 2014-01-06 | Baxter Int | Pegylering af rekombinante blodkoagulationsfaktorer i nærvær af bundne antistoffer |
| TW201042257A (en) * | 2009-05-26 | 2010-12-01 | Baxter Int | Detection of antibody that binds to water soluble polymer-modified polypeptides |
| EP3093029A1 (en) * | 2009-07-27 | 2016-11-16 | Baxalta GmbH | Blood coagulation protein conjugates |
| ES2590679T3 (es) * | 2009-07-27 | 2016-11-23 | Lipoxen Technologies Limited | Glicopolisialilación de proteínas diferentes a proteínas de coagulación de la sangre |
| WO2011017055A2 (en) | 2009-07-27 | 2011-02-10 | Baxter International Inc. | Blood coagulation protein conjugates |
| US20120263701A1 (en) | 2009-08-24 | 2012-10-18 | Volker Schellenberger | Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same |
| RU2522846C2 (ru) * | 2009-11-30 | 2014-07-20 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Промышленности И Торговли Российской Федерации | Лекарственный препарат и способ улучшения реологических свойств мокроты и ингаляционное применение такого препарата |
| WO2011101242A1 (en) | 2010-02-16 | 2011-08-25 | Novo Nordisk A/S | Factor viii molecules with reduced vwf binding |
| DK2598172T3 (da) | 2010-07-30 | 2019-07-01 | Baxalta GmbH | Nukleofile katalysatorer til oximforbindelse |
| MX345608B (es) | 2010-12-22 | 2017-02-07 | Baxalta Inc | Materiales y metodos para conjugar un derivado de acido graso soluble en agua a una proteina. |
| EP2714093A1 (en) | 2011-05-27 | 2014-04-09 | Baxter International Inc. | Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same |
| EP2717898B1 (en) | 2011-06-10 | 2018-12-19 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Pro-coagulant compounds and methods of use thereof |
| MX354705B (es) | 2011-09-23 | 2018-03-16 | Novo Nordisk As | Analogos de glucagon novedosos. |
| KR102212098B1 (ko) | 2012-01-12 | 2021-02-03 | 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. | 키메라 인자 viii 폴리펩티드들과 이의 용도 |
| SG11201404885RA (en) | 2012-02-15 | 2014-09-26 | Amunix Operating Inc | Factor viii compositions and methods of making and using same |
| US10370430B2 (en) | 2012-02-15 | 2019-08-06 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Recombinant factor VIII proteins |
| AU2013204754C1 (en) | 2012-05-16 | 2018-10-11 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage |
| AU2013270682A1 (en) | 2012-06-08 | 2014-12-11 | Biogen Ma Inc. | Procoagulant compounds |
| CA2875247A1 (en) | 2012-06-08 | 2013-12-12 | Biogen Idec Ma Inc. | Chimeric clotting factors |
| SG11201500045RA (en) | 2012-07-11 | 2015-02-27 | Amunix Operating Inc | Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof |
| MY174727A (en) | 2013-04-18 | 2020-05-11 | Novo Nordisk As | Stable, protracted glp-1/glucagon receptor co-agonists for medical use |
| CN113831415A (zh) | 2013-06-28 | 2021-12-24 | 比奥贝拉蒂治疗公司 | 具有xten的凝血酶可裂解连接子和其用途 |
| US10548953B2 (en) | 2013-08-14 | 2020-02-04 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof |
| EP3903599A1 (en) | 2013-09-25 | 2021-11-03 | Bioverativ Therapeutics Inc. | On-column viral inactivation methods |
| US10584147B2 (en) | 2013-11-08 | 2020-03-10 | Biovertiv Therapeutics Inc. | Procoagulant fusion compound |
| BR112016015512B1 (pt) | 2014-01-10 | 2023-12-19 | Bioverativ Therapeutics Inc | Proteína quimérica, composição farmacêutica e seus usos |
| US10188739B2 (en) | 2014-02-27 | 2019-01-29 | Xenetic Biosciences, Inc. | Compositions and methods for administering insulin or insulin-like protein to the brain |
| US10570184B2 (en) | 2014-06-04 | 2020-02-25 | Novo Nordisk A/S | GLP-1/glucagon receptor co-agonists for medical use |
| PE20170702A1 (es) | 2014-09-26 | 2017-06-24 | Bayer Pharma AG | Derivados estabilizados de adrenomedulina y uso de los mismos |
| EA201700181A1 (ru) | 2014-10-14 | 2017-09-29 | Галозим, Инк. | Композиции аденозиндеаминазы-2 (ада-2), их варианты и способы использования |
| MA40835A (fr) | 2014-10-23 | 2017-08-29 | Biogen Ma Inc | Anticorps anti-gpiib/iiia et leurs utilisations |
| MA40861A (fr) | 2014-10-31 | 2017-09-05 | Biogen Ma Inc | Anticorps anti-glycoprotéines iib/iiia |
| AU2016301303B2 (en) | 2015-08-03 | 2021-10-07 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor IX fusion proteins and methods of making and using same |
| JP2019510022A (ja) | 2015-12-03 | 2019-04-11 | バクスアルタ インコーポレイテッド | 半減期が延長されリガンド結合性が低下した第ｖｉｉｉ因子 |
| MA45473A (fr) | 2016-04-04 | 2019-02-13 | Shire Human Genetic Therapies | Inhibiteur de c1 estérase conjugué et ses utilisations |
| CZ308106B6 (cs) * | 2016-06-27 | 2020-01-08 | Contipro A.S. | Nenasycené deriváty polysacharidů, způsob jejich přípravy a jejich použití |
| DK3506935T3 (en) | 2016-09-02 | 2024-04-02 | Sanofi Pasteur Inc | Neisseria meningitidis-vaccine |
| CR20190481A (es) * | 2017-03-22 | 2020-01-06 | Genentech Inc | Composiciones de anticuerpo optimizados para el tratamiento de trastornos oculares |
| US20200179524A1 (en) | 2017-04-25 | 2020-06-11 | Lipoxen Technologies Limited | Methods of treating multiple myeloma cancers expressing high levels of epo-receptor using psa-epo |
| WO2018197547A1 (en) | 2017-04-25 | 2018-11-01 | Lipoxen Technologies Limited | Methods of treating diseases related to net formation with parenteral administration of polysialylated dnase i |
| CA3094112A1 (en) | 2018-03-28 | 2019-10-03 | Bristol-Myers Squibb Company | Interleukin-2/interleukin-2 receptor alpha fusion proteins and methods of use |
| CN114903978A (zh) | 2018-07-03 | 2022-08-16 | 百时美施贵宝公司 | Fgf-21配制品 |
| US20220023430A1 (en) | 2018-11-13 | 2022-01-27 | Lipoxen Technologies Limited | Glycopolysialylation of blinatumomab |
| KR20210151780A (ko) * | 2019-02-04 | 2021-12-14 | 제네틱 바이오사이언시스, 인코포레이티드 | 글리코폴리시알화된 치료 단백질 사용 방법 |
| CN114174326A (zh) | 2019-06-18 | 2022-03-11 | 拜耳公司 | 长期稳定的肾上腺髓质素类似物及其用途 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US375006A (en) * | 1887-12-20 | Lafayette w | ||
| US375008A (en) * | 1887-12-20 | Die for making wood type | ||
| US375010A (en) * | 1887-12-20 | Chaeles a | ||
| US4356170A (en) | 1981-05-27 | 1982-10-26 | Canadian Patents & Development Ltd. | Immunogenic polysaccharide-protein conjugates |
| US5097020A (en) * | 1983-07-05 | 1992-03-17 | The University Of Rochester | Immunogenic conjugates |
| JPS63264493A (ja) * | 1986-12-29 | 1988-11-01 | Mect Corp | 活性カルボニル基を持つシアル酸誘導体 |
| HU218146B (hu) | 1989-12-14 | 2000-06-28 | National Research Council Of Canada | Továbbfejlesztett meningokokkusz-poliszacharid-konjugátum vakcina |
| JP2975632B2 (ja) * | 1990-03-30 | 1999-11-10 | 生化学工業株式会社 | グリコサミノグリカン修飾プロテイン |
| US5846951A (en) * | 1991-06-06 | 1998-12-08 | The School Of Pharmacy, University Of London | Pharmaceutical compositions |
| GB9112212D0 (en) * | 1991-06-06 | 1991-07-24 | Gregoriadis Gregory | Pharmaceutical compositions |
| US5352670A (en) * | 1991-06-10 | 1994-10-04 | Alberta Research Council | Methods for the enzymatic synthesis of alpha-sialylated oligosaccharide glycosides |
| US5329028A (en) * | 1992-08-05 | 1994-07-12 | Genentech, Inc. | Carbohydrate-directed cross-linking reagents |
| AUPO284096A0 (en) * | 1996-10-08 | 1996-10-31 | Macquarie Research Limited | Glycan derivatives |
| EP1035137A1 (en) * | 1999-03-12 | 2000-09-13 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Method for the reductive amination of polysaccharides |
| DE60116137T2 (de) * | 2000-05-16 | 2006-08-24 | Lipoxen Technologies Ltd. | Derivatisierung von proteinen in wässrigem lösungsmittel |
| US7691826B2 (en) * | 2003-08-12 | 2010-04-06 | Lipoxen Technologies Limited | Polysialic acid derivatives |
| WO2005016949A2 (en) * | 2003-08-12 | 2005-02-24 | Lipoxen Technologies Limited | Sialic acid derivatives |
| CN103169984B (zh) * | 2006-07-25 | 2016-08-03 | 利普生技术有限公司 | N末端聚唾液酸化 |
-
2004
- 2004-08-12 WO PCT/GB2004/003484 patent/WO2005016949A2/en active Application Filing
- 2004-08-12 KR KR1020067002900A patent/KR101113726B1/ko active IP Right Grant
- 2004-08-12 RU RU2006107546/04A patent/RU2333223C2/ru active
- 2004-08-12 JP JP2006523058A patent/JP4566194B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-08-12 US US10/568,043 patent/US7807824B2/en active Active
- 2004-08-12 ES ES04768074T patent/ES2735809T3/es active Active
- 2004-08-12 WO PCT/GB2004/003511 patent/WO2005016974A1/en active Application Filing
- 2004-08-12 EP EP04768074.9A patent/EP1654290B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-10-04 US US12/897,523 patent/US8653255B2/en active Active
-
2014
- 2014-01-15 US US14/155,855 patent/US9452224B2/en active Active
-
2016
- 2016-09-26 US US15/276,471 patent/US10406209B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US9452224B2 (en) | 2016-09-27 |
| EP1654290A1 (en) | 2006-05-10 |
| US20140220046A1 (en) | 2014-08-07 |
| KR20060096981A (ko) | 2006-09-13 |
| US20070191597A1 (en) | 2007-08-16 |
| US8653255B2 (en) | 2014-02-18 |
| JP2007501889A (ja) | 2007-02-01 |
| EP1654290B1 (en) | 2019-03-13 |
| RU2006107546A (ru) | 2007-09-20 |
| WO2005016974A1 (en) | 2005-02-24 |
| US7807824B2 (en) | 2010-10-05 |
| KR101113726B1 (ko) | 2012-02-27 |
| WO2005016949A3 (en) | 2005-03-31 |
| US20110082077A1 (en) | 2011-04-07 |
| JP4566194B2 (ja) | 2010-10-20 |
| RU2333223C2 (ru) | 2008-09-10 |
| WO2005016949A2 (en) | 2005-02-24 |
| US10406209B2 (en) | 2019-09-10 |
| US20170007706A1 (en) | 2017-01-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2735809T3 (es) | Derivativos del ácido siálico para la derivatización y conjugación de proteínas | |
| ES2593318T3 (es) | Derivados de ácido siálico | |
| US10155045B2 (en) | Activated sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation | |
| US10494449B2 (en) | Fractionation of charged polysaccharide | |
| JP2008510025A (ja) | シアル酸誘導体 | |
| EP0413675A2 (en) | Method for producing synthetic N-linked glycoconjugates |