HU218146B - Továbbfejlesztett meningokokkusz-poliszacharid-konjugátum vakcina - Google Patents

Továbbfejlesztett meningokokkusz-poliszacharid-konjugátum vakcina Download PDF

Info

Publication number
HU218146B
HU218146B HU9201966A HU196692A HU218146B HU 218146 B HU218146 B HU 218146B HU 9201966 A HU9201966 A HU 9201966A HU 196692 A HU196692 A HU 196692A HU 218146 B HU218146 B HU 218146B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
polysaccharide
gbmp
group
conjugate
modified
Prior art date
Application number
HU9201966A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT64480A (en
Inventor
Harold J. Jennings
Francis Michon
Original Assignee
National Research Council Of Canada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Research Council Of Canada filed Critical National Research Council Of Canada
Publication of HUT64480A publication Critical patent/HUT64480A/hu
Publication of HU218146B publication Critical patent/HU218146B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1228—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K16/1232—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia from Escherichia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

A sziálsavmaradék N-acetil-csoportjainak N-acil-csoportokra valókicserélésével módosított Neisseria meningitidis B csoportúpoliszacharid (GBMP) fokozott immunválaszt vált ki. Emellett minimálismennyiségű olyan ellenanyag képződik, amely a módosítatlan B csoportúN. meningitidis és E. coli K1 burokpoliszachariddal, valamint azokkalközös epitóppal bíró egyéb szöveti sejtekkel keresztreagál. Amódosított poliszacharidok fiziológiásan elfogadható fehérjével,például tetanusz toxoiddal konjugálva specifikus védő ellenanyagok éselhanyagolható mennyiségű emberi és állati neurális sejt tapadásiantigénnel keresztreagáló ellenanyagok termelődését váltják ki, ilymódon hatékony védelmet nyújtanak a B csoportú meningokokkuszok és E.coli K1 okozta fertőzések ellen. ŕ

Description

A találmány tárgyát kémiailag módosított B csoportú Neisseria meningitidis poliszacharidok képezik. A találmány kiterjed olyan vakcinákra is, melyekben az adott módosított poliszacharidok proteinhordozóhoz vannak kapcsolva.
A B csoportú N. meningitidis és az E. coli KI okozta agyhártyagyulladás a világ súlyos egészségügyi gondja. A B csoportú agyhártyagyulladás mind endémiásan, mind epidémiásan előfordul, és az összes feljegyzett meningokokkusz okozta agyhártya-gyulladásos eseteknek körülbelül a feléért tehető felelőssé, míg a KI-pozitív E. coli az újszülötteknél előforduló agyhártyagyulladások legfőbb okozója. Jelenleg a kereskedelemben nem áll rendelkezésre vakcina a B csoportba tartozó meningokokkuszok és az E. coli KI okozta megbetegedések ellen. Ez nagyrészt annak a ténynek tudható be, hogy a B csoportú meningokokkusz poliszacharid (GBMP) csak kevéssé immunogén emberben. Néhány mostanában leírt potenciális vakcina a GBMP-nek a külső membránproteinekkel alkotott komplexére épül, egyelőre azonban nincs világos bizonyíték ezek emberben való hatékonyságára vonatkozólag.
A közelmúltban szintetikus, kémiailag módosított (N-propionilezett) B poliszacharid-protein (N-PrGBMP-protein) konjugátumra alapozott új vakcinát fejlesztettek ki. A vakcina egérben magas titerű IgG ellenanyagválaszt vált ki, amely nemcsak protektív, hanem keresztreakciót mutat a módosítatlan GBMP-vel is (például N-acetil-GBMP) (lásd 4 727 136 számú amerikai egyesül államokbeli szabadalmi leírást).
Bizonyított tény, hogy egy keresztreagáló ellenanyagok termelését kiváltó vakcina, mint amilyen a 4 727 136 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett vakcina, csak az immuntolerancia áttörése árán lehet sikeres. Ezt a feltevést igazolja egy, mind a natív N-Ac-GBMP-ben, mind a humán és állati szövetben megtalálható, alfa-(2-8)-kötésben levő, sziálsavmaradékok láncából (legkevesebb 10 maradékból) álló közös epitóp azonosítása [Jennings, Contrib. Microbiol. Immunoi. Basel, Karger, 10, 151-165 (1989)]. Ezek a poliszialozilláncok fejlődési antigénekként szerepelnek, és főleg az embrionális neurális sejt tapadásával hozták őket kapcsolatba a magzati állapotban [Finné és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 112, 482 (1983)]. A születés utáni fejlődés során ezeket az antigéneket egy szabályozási folyamat visszaszorítja [Friedlander és munkatársai, J. Cell Bioi., 101, 412 (1985)], expresszálódnak azonban érett humán szövetben beteg izmok regenerációjakor [Cashman és munkatársai, Ann. Neuron., 21, 481 (1987)], daganatos sejtekben [Roth és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 299 (1988)], természetes ölősejtekben (NK) és CD3+T-sejtekben [Husmann és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 19,1761 (1989)]. Bár az immuntolerancia áttörésének következményeit ezen magzati antigének ellen még nem állapították meg, általánosan elfogadott, hogy a keresztreakció miatt az N-PrGBMP-protein konjugátumot az engedélyező hatóságok alapos vizsgálatnak vetnék alá a kereskedelmi forgalmazás engedélyezése előtt, jelentős költséget és késedelmet okozva a vakcina biztonságosságának bizonyításóhoz szükséges komplex kísérletek miatt.
A találmány tárgya tehát egy olyan vakcina, amely az N-Pr-GBMP-proteinéhez képest fokozott immunogén tulajdonságokkal rendelkezik. A találmány tárgyát képezi továbbá egy, az emberi és állati neurális sejt tapadási antigénnel (embrionális N-CAM) jelentősen csökkent keresztreakciót mutató vakcina.
A találmány egyrészt Neisseria meningitidis módosított B poliszacharidjára vonatkozik, amelyben a sziálsav N-acetil-csoportjait (két szénatomos) 4-8 szénatomos acilcsoportokra cseréljük ki.
A találmány másrészt egy antigén hatású konjugátumra vonatkozik, amely az N-(4-8 szénatomos acil)poliszacharidot egy immunológiailag megfelelő fehérjéhez kapcsolva tartalmazza, és amely fokozott immunogenitással rendelkezik, miközben keresztreagáló ellenanyagok termelését jelentősen csökkent mértékben vált ki.
A találmány kiteljed továbbá egy vakcinára, amely az N-(4-8 szénatomos acil)-poliszacharid-protein konjugátumot tartalmazza a gyógyszergyártásban szokásos hordozó vagy hígító segédanyagok mellett. A találmány szerinti vakcinák tartalmazhatnak emberi felhasználásra alkalmas, terápiásán hatásos mennyiségű adjuvánst is, például alumínium-foszfátot vagy alumíniumhidroxidot.
A találmány szerinti vakcina N. meningitidis és E. coli KI fertőzések ellen emlősök immunizálására alkalmazható. Az immunizálás abban áll, hogy a találmány szerinti vakcina immunológiailag hatásos mennyiségét ilyen fertőzéseknek kitett emlősöknek, többek között az embernek parenterálisan adagoljuk. A vakcinát rendszerint testtömeg-kilogrammonként körülbelül 1-50 pg, például 5-25 pg mennyiségben adagoljuk.
A találmány továbbá olyan gamma-globulinfrakcióra vonatkozik, amely B csoportú N. meningitis és E. coli KI okozta agyhártyagyulladás ellen képes védelmet nyújtani. A frakciót úgy állítjuk elő, hogy egy emlőst a találmány szerinti vakcinával immunizálunk. A frakciót ezután a fenti organizmusok okozta fertőzés elleni védelem létrehozása vagy a fennálló fertőzés kezelése céljából adagoljuk. Ebből következik, hogy a találmány szerinti immunogén vakcinakonjugátumok terápiás hatású antiszérumforrását képezhetik kedvező immunogén tulajdonságuk miatt, mivel minimális mennyiségű emberi és állati neurális sejt tapadási antigénnel (embrionális N-CAM) keresztreagáló ellenanyagok termelését váltják ki. A találmány szerinti konjugátum hasznos lehet monoklonális ellenanyagok és esetleg antiidiotípus ellenanyagok előállításához is.
Kísérleteink során úgy találtuk, hogy a fent említett, 4 727 136 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett N-Pr-GBMP-protein konjugátummal kiváltott baktericid és protektív ellenanyagok többsége nincs kapcsolatban az embrionális N-CAMval keresztreagáló ellenanyagokkal. Valójában, a protektív aktivitás zömét az N-Pr-GBMP-specifíkus ellenanyag-populáció tartalmazza, amely nem keresztreagál embrionális N-CAM-val. Ennek alapján feltételezhető,
HU 218 146 Β hogy az N-Pr-GBMP a B csoportba tartozó meningokokkuszok felszínén található egyedi baktericid epitopot utánoz. A találmány azon a felismerésen alapul, hogy lehetséges olyan kémiailag módosított GBMP-k szintézise, amelyek a baktericid epitopot utánozzák, és amelyek konjugált formában nemcsak fokozott immunogenitást fejtenek ki, hanem alapjában véve nem váltják ki az embrionális N-CAM-val keresztreagáló ellenanyagok termelődését.
Találmányunk esetében számos különböző, kémiailag módosított GBMP-t szintetizáltunk és konjugáltunk proteinnel, ezt követően a konjugátumot egérbe adtuk be, és a hatásukat az N-Pr-GBMP-protein konjugátuméval összehasonlítottuk. Meglepő módon azt találtuk, hogy az N-(4-8 szénatomos acil)-GBMP-protein konjugátumok, például az η-butanoil-, izobutanoil-, n-pentanoil-, izopentanoil-, neopentanoil-, hexánod-, heptanoil-, oktanoil- és különösen az N-butanoil- (N-Bu) GBMP-fehérje konjugátumok alapvetően utánozzák a baktericid epitopot, lényegesen csökkent keresztreagáló ellenanyag-termelés kiváltása mellett.
A B csoportba tartozó meningokokkusz poliszacharidot N. meningitidisbol izoláltuk a gyakorlatban ismert eljárások szerint. Egy esetben úgy jártunk el, hogy a B csoportú meningokokkuszokat (98IB törzs) 37 °C-on fermentorban, 1 liter desztillált vízben 30 gramm dehidrált Todd Hewitt-levest (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) használva növesztettük. A fermentorban való szaporítás előtt a liofilezett törzset először egy gyertyás edényben növesztettük 37 °C-on 5 térfogat% birkavért tartalmazó agarlemezeken (Difco Laboratories, Detroit, Michigan). A baktériumokat ezután 1,0 liter Todd Hewitt-levesbe oltottuk (mint fent) egy Erlenmeyer-lombikban, amelyet 37 °C-on 7 óráig 190 percenkénti fordulatszámmal rázattunk. Ezt az inokulumot vittük át a fermentorba. A fermentorban való szaporítás után (16 óra) a baktériumokat formaiin 0,75%-os végkoncentrációban való hozzáadásával elöltük. A baktériumokat folyamatos centrifugálással eltávolítottuk, és a felülúszóból a B csoportú meningokokkusz poliszacharidot izoláltuk és megtisztítottuk, alapvetően amint azt Bundle és munkatársai leírták [J. Bioi. Chem., 249, 4797-4801 (1974)], azzal az eltéréssel, hogy a proteint a nyers poliszacharidot tartalmazó oldatból hideg (4 °C-os) 90%-os fenollal való keveréssel vontuk ki forró (50-60 °C-os) fenol helyett. Az utóbbi eljárás biztosította, hogy a GMBP-t nagy molekulatömegű formában kapjuk meg.
Az E. coli (018:Kl:H7) (NRCC 4283) törzset 37 °C-on szaporítottuk fermentorban, desztillált vízben oldott Brain Heart Infúsionban (BHI 37 gramm/liter) (Difco Laboratories, Detroit, Michigan). A fermentorban való szaporítás előtt a liofilezett törzset 50 ml BHIoldatban növesztettük (lásd fent) Erlenmeyer-lombikban, amelyet 37 °C-on 7 óráig 200 percenkénti fordulatszámmal rázattunk. Az inokulumot ezután fermentorba vittük át.
Az E. coli KI burokpoliszacharid izolálásánál és tisztításánál alkalmazott eljárások azonosak voltak a B csoportú meningokokkusz poliszacharid esetében fent ismertetettekkel.
Megjegyzendő, hogy a fent leírt izolálási és tisztítási eljárások nem az egyedül alkalmazható módszerek és egyéb ismert módszerek is rendelkezésre állnak, például Watson és munkatársai által [J. Immunoi., 81, 331 (1958)] és a fent említett 4 727 136 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetettek.
A natív poliszacharidot N-dezacetileztük, hogy a molekula sziálsavmaradék részein reaktív aminocsoportot kapjunk. Az N-dezacetilezést bármely ismert módszer szerint végezhetjük, például bázikus vizes közegben magas hőmérsékleten, például körülbelül 90-100 °C-on és körülbelül 13-14 pH-nál. Bázikus vizes közegként megfelel egy vizes alkálifém-hidroxid-oldat, például körülbelül 2 mol/1 töménységű nátrium-hidroxid. Más eljárás szerint hidrazin vizes oldata is alkalmazható. Az N-dezacetilezés mértéke körülbelül 30-100% lehet a körülményektől függően. Az N-dezacetilezett terméket kinyerhetjük például hűtéssel, neutralizálással, kívánt esetben tisztítással és liofilezéssel.
Az N-dezacetilezési eljárás előtt a natív poliszacharid átlagos molekulatömege körülbelül 500 000-800 000 dalton. Az N-dezacetilezés eredményeképpen körülbelül 10 000-50 000 dalton átlagos molekulattömeggel rendelkező poliszacharidffagmensek keletkeznek.
Az N-dezacetilezett poliszacharidfragmenseket ezután N-acilezzük, hogy a megfelelő N-acilezett terméket kapjuk.
Az N-acilezést úgy végezhetjük, hogy az N-dezacetilezett poliszacharidot 7,5-9,0 pH-jú vizes közegben feloldjuk, majd a megfelelő savanhidridet hozzáadjuk, az oldékonyság növelése érdekében adott esetben egy alkoholt adagolunk, és a reakcióelegyet a reakció lezajlásáig 10 °C-on tartjuk. A reakcióelegy kívánt esetben tisztítható például dialízissel. Az N-acilezett termék kinyerésének tipikus módja a liofilezés. A reakció körülbelül 10-20 óra alatt lezajlik. Az N-acilezés mértéke. amint azt analitikai módszerekkel, tipikusan 'H-NMR-módszerrel mértük, legalább 90% és valószínűleg 100%-hoz közeli érték. Az N-acilezési reakció nem eredményezi a fragmensek molekulatömegének számottevő csökkenését.
A találmány értelmében előnyös, ha konjugációs célokra olyan N-acilezett anyagot választunk, amely körülbelül 30-200 sziálsavmaradéknak megfelelő molekulatömegű. Ezt általában az N-acilezett GBMP Ultragel AcA 44 (60-140 pm szemcseátmérő) oszlopon végzett gélszűrésével, eluensként PBS-t használva értek el. A szétválasztásra megfelelő membránszűrő is alkalmazható.
000-40 000 dalton, például 10 000-15 000 dalton molekulatömegű N-acilezett terméket használtunk a találmány szerinti megoldás megvalósításához. Ezt az oszlopról kapott eluátumból a fenti átlagos molekulatömeggel rendelkező N-acil-GBMP-t tartalmazó frakciók összegyűjtésével kaptuk. A találmány szerint magasabb átlagos molekulatömeggel rendelkező, például 30 000-40 000 daltonos N-acilezett termék is használható.
A találmány szerinti vakcinákat úgy állítjuk elő, hogy az N-acilezett poliszacharidot egy immunológiai3
HU 218 146 Β lag alkalmas hordozófehérjével konjugáljuk. Előnyös, ha a hordozófehérje önmaga is immunogén. Megfelelő hordozófehérjék például a tetanusz toxoid, diftéria toxoid, keresztreagáló anyagok (CRM-ek), előnyös a CRM|97 (Sclavo Ltd., Siena, Olaszország) és a bakteriális hordozófehéijék, például a meningokokkusz külső membránfehérjék.
A konjugálás bármely módja alkalmazható a módosított poliszacharidfragmensek hordozófehérjével való konjugálására. Előnyös például a 4 356 170 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módszer, azaz terminális aldehidcsoportok beiktatása (a cisz-vicinális hidroxilcsoportok oxidációjával) az N-acilezett poliszacharidba és az aldehidcsoportoknak a fehérje aminocsoportjaihoz való kapcsolása reduktív aminálása révén. A poliszacharid és a fehérje ezáltal -CH2-NH-protein kötéseken keresztül kapcsolódik egymáshoz.
Világos azonban, hogy a találmány szerinti konjugált vakcinák nem korlátozódnak a reaktív aminálással kapott vakcinákra. így a vakcinákat előállíthatjuk úgy is, hogy az N-acilezett poliszacharidot a hordozófehéijével adipin-dihidrazidon keresztül konjugáljuk [Schneerson R. és munkatársai, Preparation, Characterization and Immunogenicity of Haemophilus influenzáé type b Polysaccharide-Protein Conjugates, J. Exp. Med., 1952, 361-476 (1980); Láncé K. Gordon 4 644 059 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Eljárhatunk úgy is, hogy a Merck által kifejlesztett bináris kapcsolótechnológiát [Marburg S. és munkatársai, „Biomolecular Chemistry of Macromolecules: Synthesis of Bacterial Polysaccharide Conjugates with Neisseria meningitidis Membráné Protein”, J. Am. Chem. Soc., 108, 5282-5287 (1986)] vagy adott esetben a redukáló végek módszerét alkalmazzuk (Anderson, 4 673 574 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).
A kapott N-acilezett poliszacharid-protein konjugátumok nem rendelkeznek jelentős mértékű keresztkötésekkel és vizes közegben oldhatók. Ez a találmány szerinti konjugátumokat alkalmassá teszi arra, hogy vakcinaként használjuk.
A találmány szerinti N-acilezett poliszacharid-protein konjugátumokat in vitro rendszerben egérben vizsgáltuk, és általában kimutattuk, hogy az N-propionilezett poliszachariddal összehasonlítva jobb immunogén tulajdonságokkal rendelkezik. Megfigyeltük továbbá, hogy jelentősen csökkent a keresztreagáló ellenanyagok képződése. Ennek fényében feltételezzük, hogy a találmány szerinti vakcinák felhasználhatók B csoportú N. meningitidis vagy E. coli KI mikroorganizmusok okozta agyhártyagyulladás elleni védekezésben. Legnagyobb érdeklődésre tartanak számot a csecsemők védelmére szolgáló vakcinák, akik a leginkább fogékonyak bakteriális agyhártyagyulladásra.
A találmány szerinti vakcinákat rendszerint úgy készítjük el, hogy a konjugátumot valamely, a gyógyszergyártásban szokásos hordozóanyagban, például fiziológiás sóoldatban vagy egyéb injektálható folyadékban diszpergáljuk. A vakcinát parenterálisan adagoljuk, például bőr alá, intraperitoneálisan vagy izomba. A vakcinákban szokásos adalékanyagok, például stabilizátorok, mint a laktóz vagy szorbit és adjuvánsok, mint az alumínium-foszfát, -hidroxid vagy -szulfát is jelen lehetnek.
A vakcina újszülötteknek adagolható dózisa általában 5-25 pg vagy 1-10 pg/testtömeg-kilogramm között van.
A találmány szerinti megoldást a következő, nem korlátozó példákkal szemléltetjük.
Ν-Acetil-, N-propionil-, Ν-butanoil-, N-izobutanoil-, N-pentanoil- és N-hexanoil-GBMP-protein konjugátumokat állítottunk elő a vizsgálatok céljára, és az eredményeket az alábbi példákban tárgyaljuk.
A konjugátumok előállításánál felhasznált anyagok és módszerek (a) Anyagok
A propionsav-, vajsav-, izovajsav-, pentánsav- és hexánsavanhidridet és a kolominsavat a Sigma Chemicals Co.-tól szereztük be (St. Louis, MO). Mivel a kolominsav szerkezetileg azonos a B csoportú meningokokkusz poliszachariddal (GBMP), a továbbiakban GBMPként utalunk rá. A tetanusz toxoidot (TT) az Institut Armand Frappier-től szereztük be (Laval, Quebec), és az összes konjugátumnál használt monomer formát a fenti készítmény Bio-Gel A 0.5 (0,037-0,74 mm szemcseméret) töltettel ellátott, 1,6x90 centiméter méretű oszlopon (Bio-Rad, Richmond, CA) történő átengedésével nyertük, az oszlopot 0,01 mól/1-es foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal (PBS) (pH 7,4) egyensúlyoztuk ki és eluáltuk.
(b) A GBMP N-dezacetilezése
A GBMP-t (Na+-só) (1,0 gramm) 5 ml 2 mol/l-es nátrium-hidroxidban oldottuk és NaBH4 (150 mg) hozzáadása után az oldatot 110 °C-on hevítettük 6 órán át, csavaros kupakkal ellátott teflontartályban (60 ml).
Ez az eljárás alapvetően azonos volt a J. Immunoi., 134, 2651 (1985) és a 4 727 136 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint ismertetettel. A lehűtött hígított oldatot ezután kimerítő dializálásnak vetettük alá desztillált vízzel szemben 4 °C-on, majd liofileztük. Azt a tényt, hogy N-dezacetilezett GBMP-t nyertünk, az igazolja, hogy az 'H-NMR-spektrumából a metil-acetamido-csoport jele (szinglet delta 2,07-nél) hiányzik.
(c) A GBMP N-acilezése
N-dezacetilezett GBMP-t (1,0 gramm) 50 ml 5%-os vizes NaHCO3-ban oldottunk. Öt alikvothoz (10 ml fenti oldat) propionsav-, vajsav-, izovajsav-, pentánsav-, illetve hexánsavanhidrideket adtunk. Ezeket a reagenseket 3x0,5 ml-es egyenlő adagokban adagoltuk 3 óra alatt szobahőmérsékleten, míg az oldat pH-ját 0,5 n NaOH-val pH=8,0-on tartottuk. Az anhidridek adagolásával egyidejűleg metanolt (0,5 ml) adtunk az oldathoz azok oldékonyságának növelésére. Végezetül, az oldatokat 16 óráig 4 °C-on kevertük, kimerítően dializáltuk desztillált vízzel szemben 4 °C-on és liofileztük. Az egyes N-propionilezett, N-butanoilezett, N-izobutanoilezett, N-pentanoilezett és N-hexanoilezett GBMP-t több, mint 90%-ban nyertük ki. A teljes N4
HU 218 146 Β acilezés végbemenetelét minden esetben az N-dezacetilezett GBMP-nek megfelelő 'H-NMR-spektrumjel eltűnése igazolta.
(d) A különböző N-acilezett GBMP fragmensek méretének meghatározása
Ultragel AcA 44 (60-140 pm szemcseátmérőjű) töltettel ellátott oszlopot (IBF) használva gélszűrést végeztünk a kívánt átlagos molekulatömegű N-acilezett GBMP kinyerésére. Az oszlopról az FPLC-vel mért (lásd lentebb) KD0,5-0,7 között eluált frakciókat összegyűjtöttük, dializáltuk és liofileztük. Ez a KD-értékintervallum megfelel 30-50 sziálsavmaradékot hordozó N-acilezett GBMP-nek (10 000-15 000 dalton, tipikusan 12 000 dalton átlagos molekulatömeg). A KD 0,2-0,4 intervallumba eső, 30 000-40 000 dalton átlagos molekulatömeggel rendelkező fragmenseknek megfelelő frakciókat is összegyűjtöttük és konjugáltuk. így különösen a 0,2 és 0,7 KD-értékek között eluált N-acilezett termékekkel foglalkoztunk.
(e) Poliszacharidkonjugátumok
Az N-acilezett GBMP-be terminális aldehidcsoportokat vittünk be perjodátos oxidációval (lásd 4 356 170 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A fenti N-acilezett GBMP-fragmenseket 0,1 mol/1-es vizes NaIO4-ban (nátrium-metapeijodát) (10 ml) oxidáltuk 2 óra hosszat szobahőmérsékleten, sötétben. A feleslegben levő nátrium-peijodátot 1 ml etilénglikol hozzáadásával semlegesítettük, az oldatot kimerítően dializáltuk 4 °C-on, majd liofileztük. Az Ndezacetilezési folyamatban (kivéve a GBMP esetében) NaBH4 alkalmazásával az N-acilezett GBMP-terminális redukáló sziálsavmaradékai nyílt láncú poliolmaradékokká alakulnak. Az ilyen maradék perjodátra érzékeny [lásd J. Immunoi., 127, 1011 (1981) és a 4 356 170 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, Harold J. Jennings és munkatársai], így az N-acilezett GBMP-fragmensek mindkét végén aldehidcsoportokat hozunk létre.
Az oxidált fragmenseket (100 mg) 0,1 mol/1-es NaHCO3-(pH = 8,l) pufferben (2 ml) oldottuk, és TT-t (20 mg) adtunk az oldathoz. Végül nátrium-ciano-bórhidrid (NaCNBH3) (40 mg) hozzáadása után az oldatot kíméletesen kevertük szobahőmérsékleten. A konjugáció folyamatát FPLC segítségével követtük Superose 12 HR/30 (Pharmacia) gélszűrő oszlopon, amelyet izokraktikus körülmények között 1 ml/perc átfolyási sebességgel PBS-sel pH = 7,2-nél futtattunk, és mind a proteint, mind az N-acilezett GBMP-fragmenseket 214 nm-en figyeltük meg. A fragmensek 0,6, a TT 0,39, míg a konjugátumok 0,23 KD-értékekkel rendelkeztek. A konjugációs folyamat befejeződött, amikor az összes TT felhasználódását jelezve az FPLC-kromatogramon a KD 0,39-nek megfelelő csúcs eltűnt. Legtöbb esetben a konjugáció 2 nap alatt lezajlott, de összesen 4 napos reakcióidőt alkalmaztunk. Az esetleges el nem reagált aldehidcsoportokat végül nátrium-bór-hidriddel (20 milligramm) redukáltuk a gélszűrés előtt.
A poliszacharid-TT konjugátumokat a poliszacharidfragmensektől gélszűréssel elkülönítettük Bio Gél A oszlop és PBS mint eluens felhasználásával. A konjugátumot tartalmazó eluátumot desztillált vízzel szemben dializáltuk és liofileztük. Az N-acilezett GBMP-TT konjugátumok 12-30%, tipikusan 12-20% sziálsavat tartalmaztak, amint azt a Svennerholm L. által leírt rezorcinos módszerrel meghatároztuk [Quantitative Estimation of Sialic Acids, IIA Colorimetric Resorcinol-Hydrochloric Acid Method, Biochim. Biophys. Acta, 24, 604 (1957)]. Ez arra utal, hogy a konjugátumokban a poliszacharid: TT mólarány 2-3:1 volt. Immunizálás és immunvizsgálatok (a) Immunizálási eljárások
Húsz fehér nőstény CFI egeret (8-10 hetes) immunizáltunk intraperitoneálisan (3 alkalommal, 3 hetes időközökben) minden egyes N-acilezett GBMP-TT konjugátummal Freund-féle komplett adjuvánsban (FCA) (Difco, Detroit, MI). Minden immunizálás 2 pg sziálsavnak megfelelő konjugátumot (10-12 pg) tartalmazott. A harmadik oltás után tizenegy nappal az egereket elvéreztettük. A szérumokkal a következő vizsgálatokat végeztük el.
(b) Radioaktív antigénkötési vizsgálat
Ezt a próbát módosított Farr-technikával végeztük tríciummal külsőleg jelölt GBMP [Jennings H. J. és munkatársai, Determinant Specificities of the Groups B and C polysaccharides of Neisseria meningitidis, J. Immunok, 134, 2651 (1985)] vagy tríciummal jelzett N-Pr-GBMP segítségével [Jennings H. J. és munkatársai, Unique Intermolecular Bactericidal Epitope involving the Homo-Sialo Polysaccharide Capsule on the Cell Surface of Group B Neisseria meningitidis and Escherichia coli KI, J. Immunok, 142, 3585-3591 (1989)]. A radioaktív antigénkötési próbához úgy nyertük a reakcióelegyet, hogy az egyes N-acilezett GBMP-TT konjugátumokkal immunizált, 20-20 egérből álló csoportok összegyűjtött szérumának 20 pl-ét PBS-sel 100 pl-re hígítottuk és elkevertük 50 pl PBS-ben oldott tríciummal jelzett GBMPvel és N-Pr-GBMP-vel, Eppendorf polipropilén mikrokémcsövekben. Miután a csöveket 4 °C-on 16 óra hosszat inkubáltuk, 150 pl telített ammónium-szulfátot (pH 7,0) adtunk hozzá (4 °C-on), a csövek tartalmát összeráztuk és állni hagytuk 4 °C-on 30 percig. A csöveket 15 000 percenkénti fordulatszámon centrifugáltuk 10 percig, és 2 χ 130 pl alikvot mintát vettünk belőlük. A mintákat 2 ml vízzel és egy szcintillációs reagenst tartalmazó xilollal kevertük (ÁCS vizes szcintillációs folyadék), és a radioaktivitást folyadékszcintillációs számlálóban mértük. Az eredményeket az 1. táblázatban ismertetjük.
1. táblázat [3H]-mal jelölt N-Ac-GBMP kötődése különböző N-acil-GBMP-TT konjugátumok elleni egérszérumokhoz
Antiszérum % kötődés3
1 2 3 4
N-Pr-GBMP-TT 41 40 39 12
N-Bu-GBMP-TT 4 4 7 4
HU 218 146 Β
1. táblázat (folytatás)
Antiszérum % kötődés3
1 2 3 4
N-izoBu-GBMP-TT 9 - - -
N-Pen-GBMP-TT 36 - - -
N-Hex-GBMP-TT 16 - - -
“ A négy kötési kísérlet 20 immunizált egér kevert antiszérumával készült.
Az 1. és a további táblázatokban használt rövidítések: az N-Ac, N-Pr, N-Bu, N-izoBu, N-Pen, N-Hex jelentése Ν-acetil-, N-propionil-, Ν-butanoil-, N-izobutanoil-, Ν-pentanoil-, N-hexanoil-csoport. Az 1, 2, 3 és 4 számok négy ismételt kísérletet jelentenek. Az 1. táblázat egyértelműen mutatja, hogy az N-Ac-GBMP (amely a magzati N-CAM-mal azonos epitopot hordoz) kevésbé kötődik a N-Bu-GBMP, N-izoBu-GBMP, N-PenGBMP és N-Hex-GBMP által kiváltott antiszérumhoz, mint ahhoz, amelyet N-Pr-GBMP-vel termeltünk. Az 1. táblázatból látható, hogy az N-Bu, N-izoBu, N-Pen és N-Hex-poliszacharid konjugátumok kevésbé keresztreagáló ellenanyagok termelődését váltják ki, mint az N-Pr konjugátum.
(c) Mennyiségi kicsapásos analízis
Ezeket a kísérleteket Kábát és Mayer által leírt módszerrel végeztük [Experimental immunochemistry, Charles C. Thomas, Springfield, 22. oldal (1961)]. NAcil-GBPM-TT-ellenes szérum 100 μΐ-es alikvotjait (PBS-ben ötszörösére hígítva) csövekben a következő anyagok növekvő koncentrációival reagáltattuk: N-acetil- (kolominsav), N-propionil-, Ν-butanoil-, N-izobutanoil-, N-pentanoil- és N-hexanoil-GBMP, 200 μΐ össztérfogatban (PBS-sel kiegészítve). Ezeknek a származékoknak a magasabb molekulatömegű frakcióit használtuk a kísérletekben és ezeket az Ultragel AcA 44 oszlop (KD: 0,4, FPLC-vel meghatározva) eluátumából nyertük, melyet ezt megelőzően az N-acilezett GBMP-fragmentumok méretének meghatározására használtunk. A csöveket 4 napig 4 °C-on inkubáltuk, tartalmukat naponta megkevertük, majd centrifugáltuk, és az ellenanyag fehérjemennyiségét Lowry és munkatársai [Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent, J. Bioi. Chem., 1933, 265 (1951)] módszerével határoztuk meg. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaltuk össze.
2. táblázat
N-acil-GBMP-TT elleni egérszérum kicsapása3 különböző N-acil-GBMP-ket alkalmazva kicsapó antigénként
Antiszérum N-acil-GBMP antigén
N- acetil N- propil N- butil N- pentil N- hexil
N-Pr-GBMP-TT 0,16 0,40 0,20 0,15 0,15
N-Bu-GBMP-TT 0,04 1,15 2,60 3,20 1,90
Antiszérum N-acil-GBMP antigén
N- acetil N- propil N- butil N- pentil N- hexil
N-Pen-GBMP-TT 0,13 0,38 0,44 6,35 3,55
N-Hex-GBMP- TT 0,02 0,08 0,80 4,15 4,40
3 Λ kicsapott ellenanyag maximális mennyisége mg-ban 1 ml antiszérumra vonatkoztatva.
Ami a keresztreaktivitást illeti, a 2. táblázat első oszlopa azt mutatja, hogy az N-Bu és az N-Hex konjugátumok nagyon kevés keresztreagáló ellenanyag termelődését váltják ki az N-Pr konjugátumhoz képest. Látható az is, hogy az N-Pen konjugátum kevesebb keresztreagáló ellenanyag termelődését váltja ki, mint az N-Pr konjugátum.
Az immunogenitásra vonatkozólag, a homológ válasz szempontjából a második táblázatból kitűnik, hogy az N-Bu (2,60), N-Pen (6,35) és az N-Hex (4,40) GBMP-TT konjugátumok immunogénebb hatásúak, mint az N-Pr GBMP-analóg (0,40).
(d) ELISA
EIA mikrotitrálólemezek (Flows Labs, Mississauga, Ontario, Kanada) rekeszeit PBS-ben hígított GBMP-, N-Pr-GBMP vagy az N-Bu-GBMP-BSA konjugátumok 10 pg/ml oldatával érzékenyítettük (100 μΐ/rekesz). A lemezeket 18 óráig 4 °C-on tartottuk, majd az érzékenyítés után PBS-ben oldott 1%-os marhaszérum-albuminnal mostuk 10 percig szobahőmérsékleten (blokkoló lépés). A rekeszekbe azután Nacil-GBMP-TT-ellenes egérszérum PBS-ben készített 10-szeres sorozathígításának 100 μΐ-ét adtuk, és a lemezeket 1 óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk. SBT-vel való mosás után a lemezeket 1 óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk 50 μΐ peroxidázzal jelölt kecske antiegér konjugátum (Kirkegard and Perry Laboratories) megfelelő hígításával, majd a rekeszek tartalmát leszívtuk, és a lemezeket ötször mostuk SBT-vel. Végül 50 μΐ tetrametilénkék-peroxidáz szubsztrátot (TMB) (Kirkegard and Perry Laboratories) adtunk minden rekeszhez, és 10 perc elteltével a fényelnyelést Multiscan spektrofotométerrel mértük 450 nm-nél (Flow Laboratories, Mississauga, Ontario, Kanada). Az eredményeket a 3. táblázat mutatja.
3. táblázat
Kevert N-acil-GBMP-TT konjugátum elleni egérszérum ELISA-titrálása N-acil-GBMP-BSAellenes konjugátumokkal szemben
Érzékeny! tőantigén Antiszérumok literei3
N-Pr- GBMPb N-Bu- GBMP11 N-IsoBu- GBMPb
N-Ac-GBMP-BSA 7 800 1 000 7 000
N-Pr-GBMP-BSA 40 000 39 000 9 800
HU 218 146 Β
3. táblázat (folytatás)
Érzékenyítőantigén Antiszérumok titcreia
N-Pr- GBMP1’ N-Bu- GBMP15 N-lsoBu- GBMPb
N-Bu-GBMP-BSA 26 000 52 000 9 700
N-IsoBu-GBMP-BSA - - 25 000
aTiter (GM)=a 450 nm-en mert maximális fényelnyclés 50%-os értékéhez tartozó szérumhígitás reciprok értéke. b Homológ N-acil-GBMP-TT konjugátummal egérben termelt Nacil-fajlagos antiszérum.
Ami a keresztreaktivitást illeti, a 3. táblázatból jól látható, hogy az N-Bu-GBMP-TT konjugátum kevesebb keresztreagáló ellenanyag termelődését váltja ki az N-Ac-GBMP (1000) ellen, mint az N-Pr-GBMP-TT konjugátum (7800). Ennek oka, hogy a GBMP kevésbé kötődik az N-Pr-GBMP-TT konjugátum által kiváltott ellenanyaghoz, mint az N-Bu-GBMP-TT konjugátum által kiváltotthoz. Ugyanez vonatkozik az N-izoBuGBMP-TT konjugátumra.
Ami az immunogenitást illeti, az N-Bu konjugátum immunogénebb, mint az N-Pr analóg, amint azt az 52 000-es (N-Bu) és 42 000-es (N-Pr) homológkötési titerek mutatják.
(e) Radioaktív kötés gátlásának vizsgálata
PBS-ben (80 pl) oldott nagyobb molekulatömegű N-acil-GBMP mint gátlóanyag növekvő koncentrációját adtuk 20 μΐ N-Pr-GBMP-TT konjugátum elleni egérszérumhoz, amely szérummennyiség elegendő a [3H]-mal jelölt N-Pr-GBMP 50%-ának megkötéséhez gátlóanyag nélkül. A csöveket 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk, majd 50 μΐ, PBS-ben oldott [3H]-mal jelölt N-Pr-GBMP-t mértünk hozzá. Óvatos keverés után a csöveket 4 °C-on 16 órán át inkubáltuk, és a próbát pontosan úgy végeztük, ahogy azt a fentiekben a radioaktív antigénkötési próbánál leírtuk. A gátlás százalékos értékét az alábbi képlet segítségével számítottuk ki:
Gátlási százalék=100 X [(beütésszám a gátlóanyag jelenlétében mínusz a beütésszám gátlóanyag nélkül)/ (beütésszám ellenanyag nélkül mínusz a beütésszám gátlóanyag nélkül)].
Eredményeinket a 4. táblázatban adjuk meg.
4. táblázat [3H]-mal jelölt N-Pr-GBMP kötődésének gátlása N-Pr-GBMP-TT konjugátum által kiváltott egér IgG2a IgG2b(A)aés IgG, (B)a ellenanyagokhoz
Gátlóanyagb A B
N-Ac-GBMP >50,0 >50,0
N-Pr-GBMP 0,6 0,3
N-Bu-GBMP 0,3 0,2
N-izoBu-GBMP >50,0 -
Gátlóanyagb A B
N-Pen-GBMP 2,3 2,5
N-Hex-GBMP 10,2 10,0
a Ezek N-Pr-GBMP-TT elleni poliklonális egérszérum frakciói, ahogy azt Jennings és munkatársai leírták [J. Immunoi., 142, 3585-3591 (1987)].
b \ gátlóanyag 50%-os gátlást adó mennyisége mikrogrammban
Baktericidpröbák
Ezeket a próbákat Jennings és munkatársai által leírt módszer szerint végeztük [J. Exp. Med. 165, 1207-1211 (1987)]. Ezekben a próbákban B típusú Neisseria meningitidis törzset (M 986) használtunk. Eredményeinket az 5. táblázatban adjuk meg.
5. táblázat [3H]-mal jelölt N-Pr-GBMP kötődése különböző N-acil-GBMP-TT elleni egérszérumhoz és a megfelelő antiszérumok baktériumölő titerei
Antiszérum Antiszérum mennyisége (pl)a Baktériumölő titer1’
N-Pr-GBMP-TT 13 128
N-Bu-GBMP-TT 10 64
N-izoBu-GBMP-TT - 64
N-Pen-GBMP-TT 24 64
N-Hex-GBMP-TT >100 8
N-Ac-GBMP-TT >100 8
a i\z 50%-os kötődéshez szükséges antiszérum (PBS-sel ötszörösére hígítva) mennyisége μΐ-ben.
b Hígítási kísérlet: egy hígitásnyi különbség, például 128 viszonyít\ a 64-hez, a kísérleti hibán belül van.
A 4. táblázat azt illusztrálja, hogy az N-Bu-GBMP épp olyan hatásos gátlóanyag, mint az N-Pr-GBMP, ami az utóbbi saját homológ ellenanyagaihoz való kötődését illeti. Ezért N-Bu-GBMP alkalmazása N-Pr-GBMP helyett nem vezet az N-Pr-GBMP tulajdonságainak lényeges elvesztéséhez. Az 5. táblázat azt mutatja, hogy az NBu-GBMP épp olyan jól kötődik az N-Pr-GBMP konjugátum által kiváltott ellenanyagokhoz, mint az N-PrGBMP. Mind az N-Bu-GBMP-TT, mind az N-PrGBMP-TT által kiváltott ellenanyagoknak hasonló baktériumölő titerük van. Ez bizonyítja, hogy az Ν-Bu-, NizoBu- és az N-Pen-GBMP az N-Pr-GBMP-vel azonos hatásfokkal képes utánozni a baktericid epitopot a B csoportba tartozó meningokokkuszok felszínén.

Claims (22)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Neisseria meningitidis módosított B csoportú poliszacharidja, azzal jellemezve, hogy a sziálsav-maradék N-acetil-csoportjait 4-8 szénatomos acilcsoport he7
    HU 218 146 Β lyettesíti, és a módosított poliszacharid átlagos molekulatömege 10 000 és 50 000 dalton közötti.
  2. 2. E. coli KI burokpoliszacharid, azzal jellemezve, hogy a sziálsavmaradék N-acetil-csoportjait 4-8 szénatomos acilcsoport helyettesíti, és a módosított poliszacharid átlagos molekulatömege 10 000 és 50 000 dalton közötti.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti módosított poliszacharid, azzal jellemezve, hogy a 4-8 szénatomos acilcsoport az η-butanoil-, izobutanoil-, n-pentanoil-, n-hexanoil-, n-heptanoil- és n-oktanoil-csoport valamelyike.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti módosított poliszacharid, azzal jellemezve, hogy az acilcsoport az n-butanoil-, izobutanoil-, n-pentanoil- és n-hexanoil-csoport valamelyike.
  5. 5. A 2. igénypont szerinti módosított poliszacharid, azzal jellemezve, hogy a 4-8 szénatomos acilcsoport az η-butanoil-, izobutanoil-, n-pentanoil-, η-hexanoil-, nheptanoil- és n-oktanoil-csoport valamelyike.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti módosított poliszacharid, azzal jellemezve, hogy az acilcsoport az n-butanoil-, izobutanoil-, n-pentanoil- és n-hexanoil-csoport valamelyike.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti módosított poliszacharid, azzal jellemezve, hogy mintegy 90-100%-ban acilezve van.
  8. 8. A 2. igénypont szerinti módosított poliszacharid, azzal jellemezve, hogy mintegy 90-100%-ban acilezve van.
  9. 9. Antigénhatású konjugátum, azzal jellemezve, hogy egy immunológiailag alkalmas feltétjéhez konjugálva Neisseria meningitidis módosított B csoportú poliszacharidját tartalmazza, amelyben a sziálsavmaradék N-acetil-csoportját N-(4-8 szénatomos acil)-csoport helyettesíti.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy acilcsoportként η-butanoil-, izobutanoil-, pentánod-, hexánod-, heptanod- vagy oktanoilcsoportot tartalmaz.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy acilcsoportként η-butanoil-, izobutanoil-, pentánod- vagy hexanoilcsoportot tartalmaz.
  12. 12. A 9. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy fehérjeként tetanusz toxoidot, diftéria toxoidot, valamely keresztreagáló anyagot (CRM) vagy bakteriális fehérje hordozóanyagot tartalmaz.
  13. 13. A 9. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a fehérje és a poliszacharid egy -CH2-NH-fehérje kötésen keresztül kovalensen kapcsolódik.
  14. 14. A 12. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy CRM-ként CRM197-et tartalmaz.
  15. 15. Vakcina, azzal jellemezve, hogy egy, a 9. igénypont szerinti konjugátumot és a gyógyszergyártásban szokásos injektálható hordozóanyagot tartalmaz.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy egy fiziológiailag elfogadható adjuvánst is tartalmaz.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy adjuvánsként alumínium-hidroxidot, alumínium-foszfátot vagy alumínium-szulfátot tartalmaz.
  18. 18. Eljárás N. meningitidis és E. coli KI okozta agyhártyagyulladás elleni passzív védettséget nyújtó gamma-globulinfrakció előállítására, azzal jellemezve, hogy egy emlőst a 15. igénypont szerinti vakcinával immunizálunk, az emlősből antiszérumot nyerünk ki, és a gamma-globulinfrakciót elválasztjuk.
  19. 19. N. meningitidis és E. coli KI okozta agyhártyagyulladás elleni passzív védettséget nyújtó gammaglobulinffakció, azzal jellemezve, hogy a 18. igénypont szerinti eljárással készült.
  20. 20. Eljárás Neisseria meningitidis módosított B csoportú poliszacharidja és E. coli KI burokpoliszacharid előállítására, amelyekben a sziálsavmaradék N-acetilcsoportjait 4-8 szénatomos acilcsoport helyettesíti, és a módosított poliszacharid átlagos molekulatömege 10 000 és 50 000 dalton közötti, azzal jellemezve, hogy a természetes sziálsavmaradék N-acetil-csoportjait 4-8 szénatomos acdcsoportokkal cseréljük ki.
  21. 21. Eljárás poliszacharidkonjugátum előállítására, azzal jellemezve, hogy a 20. igénypont szerinti eljárással előállított, módosított poliszacharidot kovalens kötéssel proteinhez kötjük.
  22. 22. Eljárás vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 21. igénypont szerinti eljárással előállított poliszacharidkonjugátumot a gyógyszergyártásban szokásos hordozóanyaggal és/vagy egyéb segédanyaggal keverve vakcinává alakítunk.
HU9201966A 1989-12-14 1990-12-13 Továbbfejlesztett meningokokkusz-poliszacharid-konjugátum vakcina HU218146B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US44819589A 1989-12-14 1989-12-14
PCT/CA1990/000437 WO1991008772A1 (en) 1989-12-14 1990-12-13 Improved meningococcal polysaccharide conjugate vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT64480A HUT64480A (en) 1994-01-28
HU218146B true HU218146B (hu) 2000-06-28

Family

ID=23779371

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9201966A HU218146B (hu) 1989-12-14 1990-12-13 Továbbfejlesztett meningokokkusz-poliszacharid-konjugátum vakcina
HU9201966A HU9201966D0 (en) 1989-12-14 1990-12-13 An improved vaccine of meningococcus-polysaccharide conjunction

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9201966A HU9201966D0 (en) 1989-12-14 1990-12-13 An improved vaccine of meningococcus-polysaccharide conjunction

Country Status (30)

Country Link
US (3) US5576002A (hu)
EP (1) EP0504202B1 (hu)
JP (1) JP2637845B2 (hu)
KR (1) KR0158436B1 (hu)
CN (4) CN1049223C (hu)
AR (1) AR243934A1 (hu)
AT (1) ATE121947T1 (hu)
AU (1) AU641715B2 (hu)
BR (1) BR9007917A (hu)
CA (1) CA2071811C (hu)
CZ (1) CZ283530B6 (hu)
DE (1) DE69019164T2 (hu)
DK (1) DK0504202T3 (hu)
ES (1) ES2071288T3 (hu)
FI (2) FI104539B (hu)
HR (1) HRP920872A2 (hu)
HU (2) HU218146B (hu)
IE (1) IE68414B1 (hu)
IL (1) IL96676A (hu)
IN (1) IN171747B (hu)
NO (2) NO305275B1 (hu)
NZ (1) NZ236471A (hu)
PH (1) PH30305A (hu)
PL (2) PL166035B1 (hu)
RO (1) RO111416B1 (hu)
RU (1) RU2105568C1 (hu)
SI (1) SI20008B (hu)
WO (1) WO1991008772A1 (hu)
YU (1) YU24391A (hu)
ZA (1) ZA9010065B (hu)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5648241A (en) * 1989-09-15 1997-07-15 The General Hospital Corporation Conjugate vaccine against group B streptococcus
EP0504202B1 (en) * 1989-12-14 1995-05-03 National Research Council Of Canada Improved meningococcal polysaccharide conjugate vaccine
KR100293017B1 (ko) * 1992-09-24 2001-09-17 루시에 라포인테-쇼우, 카르타 커티 케이 그룹b스트렙토코쿠스ii형및v형다당류-단백질결합백신
US5439808A (en) * 1993-07-23 1995-08-08 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis
US6153406A (en) * 1993-07-23 2000-11-28 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane protein P2 from Haemophilus influenzae type B
US5679654A (en) * 1994-09-02 1997-10-21 Brigham & Women's Hospital, Inc. Capsular polysaccharide immunomodulator
US5700787A (en) * 1994-09-02 1997-12-23 Brigham & Women's Hospital, Inc. Capsular polysaccharide immunomodulator
US5747287A (en) * 1995-04-28 1998-05-05 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis
US6284884B1 (en) 1995-06-07 2001-09-04 North American Vaccine, Inc. Antigenic group B streptococcus type II and type III polysaccharide fragments having a 2,5-anhydro-D-mannose terminal structure and conjugate vaccine thereof
ATE400295T1 (de) * 1995-06-07 2008-07-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Vakzine mit einem polysaccharide antigen- trägerprotein konjugat und freiem trägerprotein
US5811102A (en) 1995-06-07 1998-09-22 National Research Council Of Canada Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines
ZA97248B (en) * 1996-01-18 1997-07-18 Rohm & Haas Method for identifying and quantifying polymers utilizing immunoassay techniques
WO1998008874A1 (en) 1996-08-27 1998-03-05 Chiron Corporation Monoclonal antibodies that define unique meningococcal b epitopes and their use in the preparation of vaccine compositions
WO1998008543A1 (en) † 1996-08-27 1998-03-05 Chiron Corporation Neisseria meningitidis serogroup b glycoconjugates and methods of using the same
US6426074B1 (en) * 1997-03-19 2002-07-30 The Brigham And Women's Hospital Inc. Group B Streptococcus vaccine
JP2002506448A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 カイロン コーポレイション 抗髄膜炎菌ワクチン組成物を使用して成体を免疫する方法
ATE421527T1 (de) 1997-08-27 2009-02-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Molekular-mimetika von meningokokkus b epitopen
ES2346022T3 (es) 1997-12-23 2010-10-07 Baxter Healthcare S.A. Procedimiento para la extraccion y el aislamiento de polisacaridos capsulares bacterianos para su uso como vacunas o ligandos a proteinas como vacunas de conjugados.
DE69941574D1 (de) * 1998-08-19 2009-12-03 Baxter Healthcare Sa Immunogenes beta-propionamido-gebundenes polysaccharid-protein konjugat geeignet als impfstoff und hergestellt bei verwendung von n-acryloyliertem polysaccharid
US6436653B1 (en) 1998-12-15 2002-08-20 Exiqon A/S Method for introduction of reporter groups into bacterial lipopolysaccharide-derived carbohydrates and the subsequent coupling of such derivatives onto solid surfaces
US7083777B1 (en) * 1999-04-02 2006-08-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Immunomodulating polymers
US6518037B2 (en) * 1999-11-12 2003-02-11 University Of Iowa Research Foundation Two-component system that controls bacterial membrane synthesis
GB9928196D0 (en) * 1999-11-29 2000-01-26 Chiron Spa Combinations of B, C and other antigens
SV2003000753A (es) 2000-12-05 2003-06-16 Brigham & Womens Hospital Uso de polisacaridos zwitterionicos para la especifica modulacion del progreso inmunologico
AU2002252638A1 (en) 2001-04-17 2002-10-28 Children's Hospital Oakland Research Institute Molecular mimetics of meningococcal b epitopes which elicit functionally active antibodies
GB0115176D0 (en) * 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
GB0121591D0 (en) * 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
DE60325565D1 (de) * 2002-03-26 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Modifizierte saccharide mit verbesserter stabilität in wasser
EP1638581A2 (en) * 2003-03-31 2006-03-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Zwitterionic immunomodulators for the treatment of asthma and allergy
US7731967B2 (en) 2003-04-30 2010-06-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compositions for inducing immune responses
EP1654290B1 (en) 2003-08-12 2019-03-13 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation
KR20070060069A (ko) 2004-06-23 2007-06-12 칠드런즈 하스피틀 앤드 리써치 센터 앳 오클랜드 다당류 유도체 및 면역반응의 유도에서의 용도
US8148335B2 (en) 2004-06-23 2012-04-03 Children's Hospital & Research Center Oakland De-N-acetyl sialic acid antigens, antibodies thereto, and methods of use in cancer therapy
GB0428394D0 (en) * 2004-12-24 2005-02-02 Chiron Srl Saccharide conjugate vaccines
PT1896065E (pt) 2005-06-27 2011-08-31 Glaxosmithkline Biolog Sa Processo para a preparação de vacinas
US8206726B2 (en) 2006-02-06 2012-06-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Zwitterionic polysaccharides for promotion of immune system maturation and health
GB0611914D0 (en) 2006-06-15 2006-07-26 Teti Giuseppe Peptides that mimic non-human cross-reactive protective epitopes of the group Bmeningococcal capsulsar polysaccharide
EP1872791A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-02 Institut Pasteur Use of bacterial polysaccharides for biofilm inhibition
AU2008265767B2 (en) * 2007-06-20 2014-11-13 Pfizer Ireland Pharmaceuticals Modified polysaccharides for conjugate vaccines
EP3067048B1 (en) 2007-12-07 2018-02-14 GlaxoSmithKline Biologicals SA Compositions for inducing immune responses
WO2010083477A2 (en) 2009-01-16 2010-07-22 University Of Maryland, Baltimore Broad spectrum vaccine against non-typhoidal salmonella
WO2013009945A1 (en) 2011-07-12 2013-01-17 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lipid-containing psa compositions, methods of isolation and methods of use thereof
EP2752403A1 (de) * 2013-01-08 2014-07-09 Sika Technology AG Amin für emissionsarme Epoxidharz-Produkte
WO2017031431A1 (en) 2015-08-19 2017-02-23 President And Fellows Of Harvard College Lipidated psa compositions and methods
EP3484441A4 (en) 2016-07-15 2020-03-18 President and Fellows of Harvard College GLYCOLIPID COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
MX2019009011A (es) * 2017-01-31 2019-09-26 Pfizer Composiciones de neisseria meningitidis y metodos respectivos.

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4057685A (en) * 1972-02-02 1977-11-08 Abbott Laboratories Chemically modified endotoxin immunizing agent
US4356170A (en) * 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
US4673574A (en) * 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4619828A (en) * 1982-07-06 1986-10-28 Connaught Laboratories, Inc. Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines
US4496538A (en) * 1982-07-06 1985-01-29 Connaught Laboratories, Inc. Haemophilus influenzae b polysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccine
US4644059A (en) * 1982-07-06 1987-02-17 Connaught Laboratories, Inc. Haemophilus influenzae B polysaccharide-diptheria toxoid conjugate vaccine
US4695624A (en) * 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4727136A (en) * 1985-10-01 1988-02-23 Canadian Patents And Development Ltd. Modified meningococcal group B polysaccharide for conjugate vaccine
EP0504202B1 (en) * 1989-12-14 1995-05-03 National Research Council Of Canada Improved meningococcal polysaccharide conjugate vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
NO922316D0 (no) 1992-06-12
NO973311D0 (no) 1997-07-17
SI20008B (en) 2001-02-28
EP0504202B1 (en) 1995-05-03
HRP920872A2 (en) 1997-06-30
JPH05505392A (ja) 1993-08-12
DK0504202T3 (da) 1995-10-02
CN1100656A (zh) 1995-03-29
ATE121947T1 (de) 1995-05-15
US5902586A (en) 1999-05-11
IE68414B1 (en) 1996-06-12
AR243934A1 (es) 1993-09-30
YU24391A (sh) 1995-12-04
HUT64480A (en) 1994-01-28
WO1991008772A1 (en) 1991-06-27
IL96676A0 (en) 1991-09-16
IL96676A (en) 1996-09-12
NZ236471A (en) 1992-10-28
CZ628490A3 (en) 1997-12-17
PL166035B1 (pl) 1995-03-31
PH30305A (en) 1997-02-20
NO922316L (no) 1992-08-14
KR0158436B1 (ko) 1998-12-01
NO307835B1 (no) 2000-06-05
NO973311L (no) 1992-08-14
RU2105568C1 (ru) 1998-02-27
ES2071288T3 (es) 1995-06-16
CN1049223C (zh) 2000-02-09
DE69019164D1 (de) 1995-06-08
SI20008A (sl) 2000-02-29
CN1036504C (zh) 1997-11-26
IE904513A1 (en) 1991-06-19
CN1100428A (zh) 1995-03-22
FI104539B (fi) 2000-02-29
CN1055541A (zh) 1991-10-23
US5683699A (en) 1997-11-04
CN1072506C (zh) 2001-10-10
CN1036522C (zh) 1997-11-26
FI19991917A (fi) 1999-09-09
NO305275B1 (no) 1999-05-03
DE69019164T2 (de) 1995-09-07
IN171747B (hu) 1992-12-26
CA2071811C (en) 2003-11-04
HU9201966D0 (en) 1992-10-28
JP2637845B2 (ja) 1997-08-06
PL166659B1 (pl) 1995-06-30
AU641715B2 (en) 1993-09-30
ZA9010065B (en) 1992-02-26
EP0504202A1 (en) 1992-09-23
CN1096516A (zh) 1994-12-21
AU6898791A (en) 1991-07-18
PL288271A1 (en) 1991-12-16
FI922737A0 (fi) 1992-06-12
RO111416B1 (ro) 1996-10-31
BR9007917A (pt) 1992-10-20
CA2071811A1 (en) 1991-06-15
CZ283530B6 (cs) 1998-04-15
US5576002A (en) 1996-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU218146B (hu) Továbbfejlesztett meningokokkusz-poliszacharid-konjugátum vakcina
CA2223567C (en) Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines
US7595307B2 (en) Polysaccharide derivatives and uses in induction of an immune response