PL166035B1 - Sposób wytwarzania koniugatu antygenowego PL - Google Patents
Sposób wytwarzania koniugatu antygenowego PLInfo
- Publication number
- PL166035B1 PL166035B1 PL90288271A PL28827190A PL166035B1 PL 166035 B1 PL166035 B1 PL 166035B1 PL 90288271 A PL90288271 A PL 90288271A PL 28827190 A PL28827190 A PL 28827190A PL 166035 B1 PL166035 B1 PL 166035B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- gbmp
- polysaccharide
- protein
- group
- antibodies
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 40
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 13
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 30
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 27
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 241000588677 Neisseria meningitidis serogroup B Species 0.000 claims abstract description 3
- -1 n-octyl Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 5
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 claims description 3
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 claims description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims description 2
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 125000003136 n-heptyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 claims 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 241000617590 Escherichia coli K1 Species 0.000 abstract description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 abstract description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 abstract 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 23
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 7
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 230000006181 N-acylation Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical group CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 3
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 2
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- PKHMTIRCAFTBDS-UHFFFAOYSA-N hexanoyl hexanoate Chemical class CCCCCC(=O)OC(=O)CCCCC PKHMTIRCAFTBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 206010058780 Meningitis neonatal Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- OHLUUHNLEMFGTQ-UHFFFAOYSA-N N-methylacetamide Chemical group CNC(C)=O OHLUUHNLEMFGTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910020889 NaBH3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 239000010200 folin Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N hydrochloric acid Substances Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002801 octanoyl group Chemical group C(CCCCCCC)(=O)* 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N pentanoic acid group Chemical group C(CCCC)(=O)O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical group 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 230000008927 postnatal maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1228—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K16/1232—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia from Escherichia (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0258—Escherichia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania koniugatu antygenowego, znamienny tym, ze polisacharyd grupy B Neisseria meningitidis zawierajacy N-acetylowa grupe w reszcie kwasu sialowego modyfikuje sie przez zastapienie grupy N-acetylowej grupaN-C4-C8 -acylowa i tak otrzymany modyfikowany polisacharyd sprzega sie z immunologicznie odpowiednim nosnikiem bial- kowym. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania koniugatu antygenowego, zawierającego chemicznie modyfikowane polisacharydy grupy B Neisseria meningitidis, służącego do wytwarzania szczepionki.
Zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych (meningitis) spowodowane przez N.meningitidis grupy B oraz E.Coli K1 pozostaje ważnym problemem w zdrowiu światowym. Zapalenie opon grupy B występuje zarówno w endemicznych jak i epidemicznych sytuacjach i wynosi w przybliżeniu połowę wszystkich zarejestrowanych przypadków dwoinkowego zapalenia opon mózgowych, podczas gdy K1-pozytywne E.Coli są główną przyczyną meningitis u noworodków. Obecnie brak jak dostępnej w handlu szczepionki przeciw chorobie spowodowanej przez dwoinki zapalenia opon grupy B i E.Coli K1. W większej części jest to spowodowane faktem, że grupa B dwoinkowego polisacharydu GBMP (group B meningococcal polysaccharide) jest słabo immunogenna u ludzi. Istnieje kilka dotychczas opisanych projektów szczepionek, opartych na kompleksach GBMP z zewnętrznymi membranami proteinowymi, lecz jak dotychczas nie stwierdzono ich skuteczności u ludzi.
Ostatnio opisano nowy projekt szczepionki, opartej na syntetycznym, chemicznie modyfikowanym połączeniu (N-propionylowanej) grupy B polisacharydu-proteiny (N-Pr-GBMpproteina). Szczepionka wzbudza u myszy wysokie miano EgG przeciwciał, które nie tylko nie są ochronne, lecz również krzyżowo reagują z niemodyfikowanym GBMP (to jest N-acetyloGBMP). Koncepcja ta jest opisana w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 727 136.
Wywnioskowano, że szczepionka, która podnosi poziom krzyżowo-reaktywnych przeciwciał, jak opisano w opisie St. Zjedn. Ameryki nr 4 727 136, mogłaby tylko być skuteczna kosztem zniszczenia immunotolerancji. Hipoteza ta jest poparta przez identyfikację zwykłego epitopu, składającego się z łańcucha a-(2-8)-powiązanych reszt kwasu sialowego (z wymogiem minimum 10 reszt) zarówno w rodzimym N-Ac-GBMP jak i ludzkich i zwierzęcych tkankach (Jennings, Contrib. Microbiol. Immunol., Bazylea, Karger, 1989, t. 10, 151-165). Te łańcuchy polisialosylowe (reszt kwasu sialowego) działają jako rozwijające antygeny i są w większej części związane ze stanem płodowym w przyczepności embrionowej neutralnej komórki (Finne i wsp. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1983,112,482). W czasie dojrzewaniapost-natalnego, antygen ten jest regulowany w dół (Friedlander i wsp., J. Cell Biol. 1985, 101,412), lecz pojawia się u dojrzałych ludzi w trakcie regeneracji schorowanych mięśni (Cashman i wsp. Ann. Neuron,
166 035
1987, 21, 481) w komórkach rakowych (Roth i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 1988, 85, 299) i w naturalnych komórkach bójczych (NK) i CD3+T (Husmann i wsp., Eur. J. Immunol., 1989, 19, 1761). Mimo, że konsekwencje utraty tolerancji wobec antygenów płodowych nie zostały jeszcze stwierdzone, ogólnie uznano, że z powodu reakcji krzyżowej połączenia N-Pr-GBMPproteina będą poddane surowemu badaniu przez agencje licencyjne, co w rezultacie powoduje wysokie koszty i opóźnienie, z. powodu przeprowadzenia doświadczeń koniecznych do wykazania bezpieczeństwa szczepionki przed jej zatwierdzeniem do komercjalnej sprzedaży.
Celem. wynalazku jest opracowanie szczepionki wykazującej zwiększone właściwości immunogenne w porównaniu z N-Pr-GBMP-proteiną. Celem jest również opracowanie szczepionki wykazującej zasadniczo zredukowane krzyżowe reagowania z GBMP.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania koniugatu antygenowego, zawierającego modyfikowany polisacharyd grupy B Neisseria meningitidis, mający N-acetylowe (C2) grupy reszty kwasu sialowego zastąpione przez grupę C^-Cs-acylową.
Sposób według wynalazku obejmuje etap łączenia N-C4-Cg-acylowanego polisacharydu z odpowiednim immunologicznie białkiem. Otrzymany koniugat antygenowy ma zwiększoną immunogenność przy zasadniczo zredukowanym wzbudzaniu krzyżowo reagujących przeciwciał.
Otrzymany koniugat służy do wytwarzania szczepionki, zawierającej ten koniugat N-C4C8-acylopolisacharyd-białk^wo, w połączeniu' z odpowiednim nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Szczepionki mogą również zawierać terapeutycznie efektywną ilość dodatku przeznaczonego do stosowania u ludzi, np. fosforanu glinu lub wodorotlenku glinu.
Sposób szczepienia ssaków przeciw zakażeniom N meningitidis i E. Coli K1 polega na podawaniu pozajelitowo ssakom, które poddane zostały zakażeniu, w tym, ludzi, immunologicznie efektywnej ilości szczepionki. Szczepionkę zazwyczaj podaje się w ilości około 1-50 mikrogramów na kilogram wagi ciała, np. 5-25 pg/kg.
W ostatnich doświadczeniach stwierdzono, że większość bakteriobójczych i ochronnych' przeciwciał wywołanych przez połączenie N-Pr-GBMP-proteina, opisane w wymienionej wyżej publikacji Jenningsa i opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 727 136 nie jest związana z przeciwciałami reagującymi z GBMP. W świetle tego należy sądzić, że N-Pr-GBMP imituje unikalny bakteriobójczy epitop na powierzchni grupy B dwoinki zapalenia opon.
Niniejszy wynalazek opiera się na stwierdzeniu, że możliwe jest chemiczne zsyntetyzowanie modyfikowanego GBMP, który imituje bakteriobójczy epitop i który w postaci połączenia nie tylko wykazuje zwiększoną immunogeniczność, lecz również zapobiega zasadniczo wzbudzaniu przeciwciał, które krzyżowo reagują z GBMP.
Dokonano syntezy wielu różnych chemicznie modyfikowanych GBMP i indywidualnie przyłączono do proteiny, a następnie wstrzykiwano połączenia myszom. Wyniki porównywano w wynikami otrzymanymi dla połączenia N-Pr-GBMP-proteina. Nieoczekiwanie stwierdzono, że połączenia N-C4-Cs-acylo GBMP-proteina, np. połączenia n-butanoilo-, izobutanoilo-, n-pentanoilo-, izopentanoilo-, neopentanoilo-, heksanoilo-, heptanoilo- i oktanoilo-, a zwłaszcza N-butanoilo (N-Bu) GBMP-proteina zasadniczo naśladuje bakteriobójczy epitop przy zasadniczej redukcji wzbudzania krzyżowo reagujących przeciwciał.
GBMP wyizolowuje się z bakterii N. meningitidis metodami znanymi w tej dziedzinie techniki. W jednej z tych metod dwoinkę zapalenia opon mózgowych grupy B (szczep 98 1B) hoduje się w temperaturze 37°C w fermentatorze z zastosowaniem 30 g odwodnionej brzeczki Todd Hewitfa (wytwarzanej przez Difco Laboratories, Detroit, Michigan) na · 1 litr wody destylowanej. Przed rozpoczęciem hodowli w fermentatorze inicjuje się hodowlę liofilizowanego szczepu w słoju w temperaturze 37°C na płytkach z 5% wag. agarem z krwi owczej (wytwarzanym przez Difco Laboratories, Detroit, Michigen). Następnie bakterie przenosi się kolby Erlenmeyer a zawierającej określoną powyżej brzeczkę Told Hewitfa w ilości 1 litra, po czym kolbę wstrząsa się w temperaturze 37°C w czasie 7h przy 190 obrotach na minutę. Otrzymane inokulum wprowadza się następnie do fermentatora. Po hodowaniu w fermentatorze w czasie 16 h bakterie zabija się przez dodanie formaliny do końcowego stężenia wynoszącego 0,75%. Bakterie wydziela się na drodze ciągłego odwirowania, a GBMP wyizolowuje się z supernatantu i oczyszcza zasadniczo w sposób opisany przez Bundle i współprac. w J. Biol.
166 035
Chem., 249, 4797-4801 (1974) z tym wyjątkiem, że białko ekstrahuje się przez mieszanie roztworu surowego polisacharydu z zimnym o temperaturze 4°C 90% fenolem w miejsce gorącego o temperaturze 50-60°C. Ten właśnie sposób zapewnia to, że wytwarza się GBMP w postaci o wysokim ciężarze cząsteczkowym.
Bakterie E.coli (018 i K1: H7) (NRCC 4283) hoduje się w temperaturze 37°C w fermentatorze z destylowaną wodą zawierającą odwodnioną infuzję sercowo-mózgową (BHJ) w ilości 37 g/litr (wytwarzaną przez Difco Laboratories, Detroit, Michigan). Przed hodowlą w fermentatorze, liofilizowany szczep poddaje się hodowli w 50 ml określonego powyżej roztworu (BHJ) w kolbie Erlenmeyera, którą wstrząsa się w temperaturze 37°C w czasie 7h przy 200 obrotach na minutę. Hodowlę tę przenosi się do 1,5 litra określonego powyżej BHJ i prowadzi hodowlę w tym samych warunkach jak opisano powyżej w czasie 7h. Następnie inokulum przenosi się do fermentatora. Do wyizolowania i oczyszczania polisacharydu E.coli K1 stosuje się to samo postępowanie jakie opisano do wydzielania GBMP.
Należy podkreślić, że do wyizolowania i oczyszczania można stosować nie tylko opisane powyżej postępowanie lecz przydatne są także inne metody postępowania, np. metoda opisana przez Watso’a i współprac. w J.Immunol., 81, 331 (1958) oraz przedstawiona w wyżej wymienionym opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 727 136.
Rodzimy polisacharyd poddaje się N-deacetylowaniu z otrzymaniem reaktywnej grupy aminowej w resztach kwasu sialowego. N-deacetylowanie można prowadzić znaną metodą, np. w zasadowym, wodnym środowisku w podwyższonej temperaturze, np. około 90-110°C, i przy wartości pH około 13-14. Jako zasadowe wodne środowisko stosuje się odpowiednio wodny roztwór wodorotlenku metalu alkalicznego, np. wodorotlenku sodu o stężeniu około 2M. Alternatywnie można zastosować hydrazynę w roztworze wodnym. Stopień N-deacetylowania może być różny i wynosi około 30%-100% w zależności od warunków. Korzystnie, N-deacetylowanie osiąga wartość około 90-100%. N-deacetylowany produkt można wydzielić, np. przez chłodzenie, zobojętnianie oczyszczanie, w miarę potrzeby, i liofilizację.
Przed N-deacetylowaniem, rodzimy polisacharyd ma średni ciężar cząsteczkowy w zakresie około 500 000 - 800 000.
W wyniku N-deacetylowania, wytwarza się fragmenty polisacharydu o średnim ciężarze cząsteczkowym w zakresie około 10 000 - 50 000.
Następnie, fragmenty N-deacetylowanego polisacharydu poddaje się N-acylowaniu z wytworzeniem odpowiadającego N-acylowanego produktu. N-acylowanie można prowadzić przez rozpuszczenie N-deacetylowanego polisacharydu w środowisku wodnym o wartości pH około 7,5-9,0. Następnie, dodaje się odpowiedni bezwodnik acylowy, ewentualnie z alkoholem dla zwiększenia rozpuszczalności i chłodzi do temperatury poniżej 10°C aż do zakończenia reakcji. W razie potrzeby, - środowisko reakcji można oczyszczać, np. na drodze dializy, po czym N-acylowany produkt wydziela się, zasadniczo na drodze liofilizacji. Reakcja zasadniczo kończy się w czasie około 10-20h. Stopień N-acylowania, mierzony metodami analitycznymi, zazwyczaj 'H-NMR wynosi co najmniej 90% i dochodzi do 100%. Reakcja N-acylowania nie wpływa w znaczący sposób na redukcję masy cząsteczkowej fragmentów wielocukrowych.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku dobiera się N-acylowany materiał o średnim ciężarze cząsteczkowym odpowiadającym około 30-200 resztom kwasu sialowego. Osiąga się to zasadniczo na drodze filtracji żelowej N-acylowanego GBMP z użyciem kolumny wypełnionej żelem, stanowiącym mieszaninę poliacyloamidu i agarozy-Ultragel (znak towarowy) AcA 44 (średnica perełek 60-140 cm) oraz jako eluentu roztworu soli, buforowanego fosforanem (PBS).
W sposobie według wynalazku stosuje się N-acylowany materiał o średnim ciężarze cząsteczkowym 10 000 - 40 000 np. 10 000 - 15 000. Otrzymuje się go przez zbieranie frakcji eluentu z kolumny zawierającej N-acylowany GBMP materiał o średnim ciężarze cząsteczkowym. N-acylowany materiał o wyższym średnim ciężarze cząsteczkowym np. w zakresie 30 000 - 40 000, jest odpowiedni również do zastosowania w sposobie według wynalazku.
Szczepionkę sposobem według wynalazku wytwarza się przez łączenie N-acylowanego polisacharydu z immunologicznie odpowiednim białkiem nośnikowym. Korzystnie, samo białko
166 035 nośnikowe jest immunogenem. Przykładami odpowiednich białek nośnikowych są anatoksyna tężca, anatoksyna błonicy, materiały reakcji krzyżowych (CRMs), korzystnie CRM197 produkowany przez Sclavo Ltd., Siena, Włochy oraz białkowe nośniki bakteryjne, np. białka zewnętrznej membrany dwoinki zapalenia opon mózgowych.
Do łączenia zmodyfikowanych fragmentów polisacharydu z białkiem nośnikowym można stosować każdy sposób łączenia. Korzystny sposób łączenia przedstawia opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 356 170, tj. sposób polegający na wprowadzeniu terminalnych grup aminowych na drodze redukcyjnego aminowania. Polisacharyd i białko są więc połączone przez wiązanie -CH2-NH-białkowe. Jednakże, zrozumiałym jest, że konjugowane szczepionki wytwarzane sposobem według wynalazku nie ograniczają się do wytwarzania na drodze redukcyjnego aminowania. Tak więc, szczepionki te można również otrzymać na drodze sprzęgania N-acylowanego polisacharydu z białkiem nośnikowym z zastosowaniem odstępnika (spacer) dihydrazydoadypinowego w sposób opisany przez Schneerson’a R. i współprac. w Preparation, Characterization and Immunogenicity of Haemophilus influenzae type b Polysaccharide-Protein Conjugates, J. Exp. Med., 1952, 361 - 476 (1980) oraz przedstawiony w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 4 644 059 na rzecz Lauce K.Gordon’a. Alternatywnie można stosować technologię dwuskładnikowego odstępnika rozwinięcia przez Merck’a jaką opisał Marburg S. i współprac. w Biomolecular Chemistry of Macromolecules; Synthesis of Bacterial Polysacharide Conjugates with Neisseria meningitide Membrane Protein”, J.Am.Chem. Soc., 108,5282-5287 1986) albo w miarę możliwości, metodologię końców redukcyjnych, przedstawioną przez Anderson’a w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 4 673 574.
Uzyskane N-acylowane połączenia polisacharyd-białko nie wykazują znaczącego usieciowania i są rozpuszczalne w roztworach wodnych. Powoduje to, że połączenia wytwarzane sposobem według wynalazku nadają się dobrze do zastosowania jako szczepionki.
Uzyskane połączenia N-acylowany polisacharyd-białko wytworzone sposobem według wynalazku poddawane są testom in vitro u myszy i wykazują ulepszone właściwości immunogenne w porównaniu z N-propionylowanym polisacharydem. Ponadto, obserwuje się zredukowane wytwarzanie antyciał reaktywnych krzyżowo. W świetle tego, należy wierzyć, że szczepionki wytwarzane sposobem według wynalazku są użyteczne przeciw zapaleniu opon mózgowych powodowanemu przez mikroorganizmy N.meningitidis grupy B albo E. coli K1. Szczególnie interesujące są szczepionki do uodpornienia niemowląt, które są najbardziej wrażliwe na bakteryjne zapalenia opon mózgowych.
Szczepionkę sposobem według wynalazku wytwarza się zwykle przez dyspersję koniugatu w odpowiednim farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, takim jak fizjologiczna solanka lub inna ciecz odpowiednia do iniekcji. Szczepionkę podaje się pozajelitowo, np. podskórnie, dootrzewnowo lub domięśniowo. Można również stosować zwykłe dodatki do szczepionek, np. stabilizatory, takie jak laktoza lub sorbit oraz adjuwanty, takie jak fosforan, wodorotlenek lub siarczan glinu.
Odpowiednia dawka szczepionki dla niemowląt mieści się w zakresie około 5-25 mikrogramów albo około 1-10 mikrogramów na kilogram ciężaru wagowego pacjenta.
Następujące przykłady ilustrują wynalazek. Do oceny przygotowano połączenia N-acetylo-, N-propionylo-, N-butanoilo, N-izobutanoilo, N-pentanoilo i N-heksanoilo-GBMP-proteina, a wyniki przedstawiono w przykładach.
Materiały i sposoby wytwarzania połączeń
a) materiały
Bezwodniki prop ion o wy, masłowy, izomasłowy, pentanowy i heksanowy razem z kwasem kolominowym otrzymano z Sigma Chemicals Co., St.Louis, MO. Ponieważ kwas kolominowy jest strukturalnie identyczny Z GMBP, oznacza się go dalej jako GBMP. Anatoksynę tężcową (TT) otrzymano z Institut Armand Frappier, Laval, Quebec, a jej postać monomeryczną, stosowaną we wszystkich połączeniach otrzymano przez przepuszczenie powyższego preparatu przez złoże żelu z agarozy-Biol-Gel (znak towarowy) A 0,5 (200-400 mesh) kolumna (1,6 x 90 cm) (Biol-Rad, Richmond, CA), zrównoważona i eluowana za pomocą 0,01 M buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) (pH 7,4).
166 035
b) N-deacetylowanie GBMP
1,0 g GBMP (sól Na+) rozpuszczono w 5 ml 2M NaOH i po dodaniu 150 mg NaBHj roztwór ogrzewano w 110°C w ciągu 6 godzin w pojemniku (60 ml) z nakręconą nasadką z politetrafluoroetylenu. Procedura ta jest zasadniczo taka, jak opisana w J.Immunol., 134, 2651 (1985) i w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 727 136. Oziębiony rozcieńczony roztwór wyczerpująco dializowano w wodzie destylowanej w 4°C i liofilizowano. Fakt otrzymania N-deacetylowanego GBMP stwierdzono przez nieobecność sygnału metyloacetamidowego (singlet przy delta 2,07) w widmie 1H-NMR N-deacetylowanego GBMP.
c) N-acylowanie GBMP
1,0 g N-deacetylowanego GBMP rozpuszczono w 50 ml 5% wodnego NaHCO3. Do pięciu indywidualnych próbek (10 ml powyższego roztworu) dodano bezwodniki propionowy, masłowy, izomasłowy, pentanowy lub heksanowy. Odczynniki te dodano 3 x 0,5 ml w ciągu 3 godzin w temperaturze pokojowej, przy czym roztwór utrzymywano przy pH 8,0 za pomocą 0,5 N NaOH. Przy każdym dodawaniu bezwodnika dodawano jednocześnie 0,5 ml metanolu w celu zwiększenia rozpuszczalności. Otrzymane roztwory mieszano w ciągu 16 godzin w 4°C, wyciągowo dializowano w wodzie destylowanej; w 4°C i liofilizowano. Poszczególne N-propionylowane, N-butanoilowane, N-izobutanoilowane, N-pentanoilowane i N-heksanoilowane GBMP otrzymano z wydajnością powyżej 90%. W każdym przypadku, zasadniczo pełne N-acylowanie potwierdzono przez zanikanie w widmie ]H-NMR N-deacetylowanego GBMP.
d) Określanie wielkości fragmentów różnych N-acylowanych GBMP.
Dla otrzymania żądanej średnicy masy cząsteczkowej N-acylowanego GBMP zastosowano filtrację przez żel, używając Ultragel (znak towarowy) AcA 44 (średnica złoża 60-140 μm) kolumna (IBF). Eluowane z kolumny frakcje przy Kd 0,5 do Kd 0,7 zmierzone przez FLpC (patrz poniżej) zbierano, dializowano i liofilizowano. Zakres wartości Kd odpowiada N-acylowanemu GBMP o około 30-50 resztach kwasu sialowego średnia masa cząsteczkowa 1)000 - 15000 zazwyczaj 12000). Zbierano również i sprzęgano frakcje w zakresie Kd 0,2-0,4, odpowiadające fragmentom o średniej masie cząsteczkowej w zakresie 30000-40000.
Tak więc pożądany jest materiał eluowany w zakresie Kd 0,2-0,7.
e) Połączenia polisacharydowe
Końcowe grupy aldehydowe wprowadzano do N-acylowanego GBMP przez utlenianie nadjodanem (patrz opis patentowy St.Zjedn.Ameryki nr 4 356 170). Powyższe N-acylowane fragmenty GBMP utleniano w 0,1 M wodnym NaJOą (metanadjodan sodu) (10 ml) w ciągu 2 godz. w temperaturze pokojowej w ciemności. Nadmiar nadjodanu rozkładano dodaniem 1 ml glikolu etylenowego i roztwór wyczerpująco dializowano w 4°C i liofilizowano. Zastosowanie NaBH4 w procesie N-deacetylowania (oprócz GBMP) daje w wyniku przekształcenie końcowych zredukowanych reszt kwasu sialowego każdego z N-acylowanych GBMP, do otwartych reszt łańcucha poliolu. Ten rodzaj reszt jest wrażliwy na nadjodan (patrz J.Immunol., 127, 1011 (1981) i opis patentowy St.Zjedn. Ameryki nr 4 356 17o) i prowadzi w rezultacie do wprowadzenia grup aldhydowych do N-acylowanych fragmentów GBMP na obydwu końcach.
100 mg utlenionych fragmentów rozpuszczono w 0,1 M NaHCO3 (pH 8,1) i dodano do roztworu 2 ml buforu i 20 mg TT. Następnie dodano 40 mg cyjanoborowodorku sodu (NaCNBHs) i roztwór łagodnie mieszano w temperaturze pokojowej. Przebieg reakcji sprzęgania śledzono przy pomocy FPLC, stosując kolumnę filtracyjną z żelem, zawierającą Superose (znak towarowy) 12 HRd/30 (Pharmacia), przy równomiernym przepływie (1 ml/min) buforu PBS o pH 7,2 z monitorowaniem zarówno białek jak i N-acylowanych fragmentów GBMP przy długości fali 214 nm.
Fragmenty wykazywały Kd0,6TT Kd0,39 akoniugaty Kd0,23. Proces sprzęgania kończy się gdy wszystkie Tt wyczerpią się, co określa brak piku w chromatogramie FPLC, odpowiadającego składnikowi o wartości Kd 0,39. W większości przypadków łączenie zostało zakończone w ciągu 2 dni, lecz całkowity czas reakcji trwał 4 dni. Potencjalne nieprzereagowane grupy aldehydowe redukowano na koniec dodatkiem 20 mg borowodorku sodu przed filtrowaniem przez żel.
Połączenia polisacharyd -TT oddzielano od fragmentów polisacharydu przez filtrację przez żel, stosując kolumnę z żelem z agorozy Bio Gel A z PBS jako eluentem. Eluent zawierający
166 035 koniugat dializuje się w wodzie destylowanej i lifilizuje. Połączenia N-acylowany GBMP-TT zawierają 12-30%, zazwyczaj 12-20% kwasu sialowego, jak określono metodą rezorcynolową opisaną przez Svennerholma L., Quantitative Estimation of Sialic Acids II A Colorimetric Resorcinal-Hydrochloric Acid Methol, Biochim Biophys. Acta 24, 604 (1957). To wskazuje, że koniugaty mają stosunek molowy polisacharydu do TT równy 2-3:1.
Szczepienie i próby immunologiczne
a) Procedury szczepienia
Dwadzieścia samic białych myszy CFI, mających 8-10 tygodni zaszczepiono dootrzewnowo (3 razy, w odstępach 3 tygodni) za pomocą każdego z połączeń N-acylowanego GBMP-TT z dodatkiem Reunda (FCA) (Difco, Detroit, MI). Każda porcja szczepionki zawierała wystarczającą ilość połączenia (10-12 gm) odpowiadającą zawartości 2 gg kwasu sialowego . Po upływie jedenastu dni po trzecim wstrzyknięciu, myszy uśmiercano. Przeprowadzono następujące testy z surowicami.
b) Próba wiązania radioaktywnego antygenu
Próbę tę przeprowadzono przez modyfikację techniki Farra, stosując znakowany in vitro [3H] GBMP (Jennings H.J. i wsp., Determinant Specificities of the Groups B i C polisacharydów z Neiseria meningitidis, J. Immunol, 134, 2651 (1985) (lub znakowany [3h] N-Pr-GBMP ) Jennings H.J., i wsp. Unique Intermolecular Bactericidal Epitope involving the Homo-Sialo Polysaccharide Capsule on the Cell Surface of Group B Neisseria meningitidis and Escheirchia coli K1, J. Immunol, 142, 3585-3591, 1989). Mieszaninę reakcyjną dla próby wiązania radioaktywnego antygenu otrzymano przez zmieszanie w probówkach mikrotestowych polipropylenowych Eppendorfa 20 gl zebranego antiserum, od grup 20 myszy zaszczepionych każdym z indywidualnych N-acylowanych GBMP-TT połączeń, rozcieńczonych do 100 gm za pomocą PBS, za pomocą znakowanego [3h] GBMP i [3H]-oznaczonych N-Pr, GBMP w 50 gl PBS. Po inkubacji w 4°C w ciągu 16 godzin dodaje się 150 gl nasyconego (w 4°C) siarczanu amonu (pH 7,0), probówki wstrząsa się i odstawia w 4°C na 30 minut. Następnie probówki wiruje się przy 1500 obrotach na minutę w ciągu 10 minut, po czym pobiera się dwie próbki po 130 gl. Próbki miesza się z 2 ml wody i scyntylatorem ksylenowym (ACS) i oznacza ich reaktywność w liczniku scyntylacyjnym. Wyniki zestawiono tabeli 1.
Tabela 1 3
Wiązanie znakowanego [ H] N-Ac-GBMP z różnymi mysimi surowicami anti-N-acyloGBMP-TT
| Antiserum | % wiązania3 | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| N-Pr-GBMP-TT | 41 | 40 | 39 | 12 |
| N-Bu-GBMP-TT | 4 | 4 | 7 | 4 |
| N-IzoBu-GBMP-TT | 9 | - | - | - |
| N-Pen-GBMP-TT | 36 | - | - | - |
| N-Hex-GBMP-TT | 16 | - | - | - |
a- cztery próby wiązania prowadzono na zbiorczych surowicach odpornościowych 20 zaszczepionych myszy.
Stosowane skróty:
N-Ac = N-acetyloN-Pr = N-propionyloN-Bu = N-butanoiloN-izoBu = N-izobutanoiloN-Pen = N-pentanoilo
N-Hex = N-heksanoilo
Oznaczenia 1, 2, 3 i 4 są wynikami czterech powtórzonych doświadczeń.
Tabela 1 ukazuje, że N-Ac-GBMP (niosąca ten sam epitop co płodowy N-CAM) wiąże się słabiej z surowicą odpornościową wywołanego przez N-Bu-GBMP, N-izoBu-GBMP, N-PenGBMP i N-Hex-GBMP niż dla wywołanego przez N-Pr-GBMP. Można więc wywnioskować z
16(5035 tabeli 1, że połączenia N-Bu-, N-izoBu-, N-Pen- i N-Hex-polisacharyd w mniejszym stopniu powodują powstanie krzyżowo reagujących przeciwciał niż połączenie N-Pr-.
c) Ilościowa analiza precypitacyjna
Doświadczenia te przeprowadzono metodą Kabat’ a i Mayer' a (Experimental Immunochemistry, Charles C.Thomas, Springfield, str.22, 1961). Próbki (100 pl) surowiec anty-N-acylGBMP-TT (rozcieńczone 5-krotnie w PBS) poddawano w probówkach działaniu wzrastających stężeń N-acetylo- (kwas kolominowy), N-propionylo-, N-butanoilo-, N-izobutanoilo-, N-pentanoilo- i N-hexanoilo-GBMP, w całkowitej objętości 200 pl (dopełnionej PBS). W doświadczeniach tych użyto pochodnych z frakcji o wyższym ciężarze cząsteczkowym. Zostały one otrzymane z eluatów z kolumny Ultragel AcA (Kd= 0,4, oznaczone metodą FPCL), uprzednio używanej do pomiarów wielkości fragmentów N-acylowanych GBMP. Probówki inkubowano przez 4 dni w 4°C przy codziennym mieszaniu, odwirowano i ilość białka przeciwciała oznaczano metodą Lowry i wsp., (Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent, J.Biol.Chem., 1951, 1933, 265). Rezultaty przedstawiono w tabeli 2.
Tabela 2
Wytrącanie a) mysich surowic anty-N-acylo-GBMP-TT przy użyciu różnych N-acylo-GBMP jako antygenów strącających
| Surowica odpornościowa | Antygen N-acylo-GBMP | ||||
| N-acetyl | N-propyl | N-butyl | N-pentyl | N-hexyl | |
| N-Pr-GBMP-TT | 0,16 | 0,40 | 0,20 | 0,15 | 0,15 |
| N-Bu-GBMP-TT | 0,04 | 1,15 | 2,60 | 3,20 | 1,80 |
| N-Pen-GBMP-TT | 0,13 | 0,38 | 0,44 | 6,35 | 3,55 |
| N-Hex-GBMP-TT | 0,02 | 0,08 | 0,80 | 4,15 | 4,40 |
a) Maksymalna ilość wytrąconego przeciwciała wyrażona w mg/ml surowicy odpornościowej.
Jeśli chodzi o reakcję krzyżową, to pierwsza kolumna w tabeli 2 wskazuje, iż niewiele przeciwciał dających odczyn krzyżowy indukuje się w wyniku działania sprzężeń N-Bu i N-Hex w porównaniu ze sprzężeniem N-Pr. Można również zauważyć, że sprzężenie N-Pen powoduje powstawanie mniejszej ilości przeciwciał dających reakcję krzyżową niż sprzężenie N-Per. Biorąc pod uwagę immunogenność, w znaczeniu odpowiedzi homologicznej, z tabeli 2 wynika, że sprzężenia N-Bu (2,60), N-Pen-(6,35) i N-Hex-(4,40) GBMP-TT są bardziej immunogenne niż analogiczne sprzężenie N-Pr-GBMP (0,40).
d) Test ELISA
Studzienki EIA płytek serologicznych (Flow Labs, Missisauga, Ontario,Canada) pokrywano roztworami GBMP-, N-Pr-GBMP- lub N-Bu-GBMP- sprzężonymi z BSA, o stężeniu 10 pg/ml w PBS, w ilości 100 pl na 1 studzienkę. Płytki pozostawiono na 18 godzin w 4°C i przemywano 1% roztworem BSA w PBS przez 10 min w temperaturze pokojowej (etap blokowania). Następnie do studzienek dodawano po 100 pl seryjnie 10-krotnie rozcieńczanych mysich surowic anty-N-Acyło-GBMP-TT i płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po przemyciu SBT płytki inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej z 50 pl odpowiednio rozcieńczonej koziej anty-mysiej immunoglobuliny sprzężonej z peroksydazą (Kirkegard and Perry Laboratories), a następnie zawartość studzienek odsączano i płytki przemywano pięciokrotnie SBT. W końcu, do każdej studzienki dodawano po 50 pl substratu peroksydazy - błękitu czterometylenowego (TMB) (Kirkegard and Perry Laboratories) i po 10 minutach oznaczano przy pomocy spektrofotometru Multiscan (Flow Laboratories, Mississauga, Ontario). Rezultaty przedstawiono w tabeli 3.
166 035
Tabela 3
Miareczkowanie zbiorczej mysiej surowicy anty-N-acylo-GBMP-TT w teście ELISA przy użyciu N-acylo-GBMP-BSA
| Antygen powlekający | • a) Miana surowic odpornościowych | ||
| a.N-Pr-GBMPb) | a.N-Bu-GBMPb) | a.N-Izobu-GBMPb) | |
| N-Ac-GBMP-BSA | 7 800 | 1 000 | 7 000 |
| N-Pr-GBMP-BSA | 40 000 | 39 000 | 9 800 |
| N-Bu-GBMP-BSA | 26 000 | 52 000 | 9 700 |
| N-IzoBu-GBMP-BSA | - | - | 25 000 |
a) Miano (GM) = odwrotność rozcieńczenia przy 50% maksymalnej absorbancji, przy długości fali 450 nm.
b N-acylo specyficzne surowice odpornościowe indukowane u myszy przy zastosowaniu homologicznych sprzężeń N-acylo-GBMP-TT.
Jeśli chodzi o odczyn krzyżowy to z tabeli 3 widać, że sprzężony N-Bu-GBMP-TT indukuje mniej przeciwciał dających reakcję krzyżową w stosunku do N-Ac-GBMP (1000) niż sprzężenie N-Pr-GBMP-TT (7800). Jest to spowodowane tym, że GBMP mniej wiąże się z przeciwciałem indukowanym przez N-Pr-GBMP-TT niż z przeciwciałem indukowanym przez N-Bu-GBMP-TT. Podobne uwagi stosuje się do sprzężenia N-izoBu-GBMP-TT.
Co się tyczy immunogenności, to sprzężenie N-Bu jest bardziej immunogenne niż analogiczne N-Pr, na co wskazują miana wiązania homologicznego 52 000 (N-Bu) i 40 000 (N-Pr).
e) Próba na hamowanie wiązania radioaktywności
Roztwory o wzrastającym stężeniu N-acylo-GBMP w PBS, pochodzących z frakcji o wyższej masie cząsteczkowej, dodawano (w ilości 80 gl) w charakterze inhibitora do 20 gl mysiej surowicy anty-N-Pr-GBMP-TT co stanowiło ilość wystarczającą do związania 50% znakowanego 3H-N-Pr-GBMP w nieobecności inhibitora. Po delikatnym wymieszaniu probówki inkubowano 16 godzin w 4°C, a testy przeprowadzano dokładnie tak jak to opisano uprzednio dla testu wiązania radioaktywnego przeciwciała. Procent hamowania wiązania obliczano stosując następujący wzór:
procent hamowania = 100 x cpm z inhibitorem - cpm bez inhibitora cpm pez przeciwciała - cpm bez inhibitora (cpm = ilość zliczeń na 1 min)
Rezultaty przedstawiono w tabeli 4.
Tabela 4
Zahamowanie wiązania znakowanego 3H-N-Pt-GBMP z przeciwciałami IgG2A, IgG2b (A)a i IgG1 (B)a indukowanymi u myszy sprzężonym związkiem anty-N-Pr-GBMP-TT
| Inhibitor b | A | B |
| N-Ac-GBMP | >50,0 | >50,0 |
| N-Pr-GBMP | 0,6 | 0,3 |
| N-Bu-GBMP | 0,3 | 0,2 |
| N-IzoBu-GBMP | >50,0 | - |
| N-Pen-GBMP | 2,3 | 2,5 |
| N-Hex-GBMP | 10,2 | 10,0 |
a) Frakcje mysiej poliklonalnej surowicy anty-N-Pr-GBMP-TT opisane w pracy Jennings'ai wsp., J.Immunol. 1989, 142, 3585-3591.
Ilość mikrogramów inhibitora dająca 50% zahamowanie wiązania.
166 035
Próby właściwości bakteriobójczych. Testy te przeprowadzano według metody Jennings’a i wsp. (J.Exp. Med., 1987, 165, 1207-1211). W testach używano Neisseria meningitidis szczep B (M 986). Rezultaty podano w tabeli 5.
Tabela 5
Wiązanie znakowanego' H-N-Pr-GBMP z różnymi mysimi surowicami anty-N-acylo-GBMP-TT oraz miano aktywności bakteriobójczej odpowiednich surowic odpornościowych
| Surowica odpornościowa | Ilość surowicy odpornościowej3) (pl) | Miano aktywności bakteriobójczej^ |
| N-Pr-GBMP-TT | 13 | 128 |
| N-Bu-GBMP-TT | 10 | 64 |
| N-IzoBu-GBMP-TT | ND | 64 |
| N-Pen-GBMP-TT | 24 | 64 |
| N-Hex-GBMP-TT | > 100 | 8 |
| N-Ac-GBMP-TT | > 100 | 8 |
a) Ilość pl surowicy odpornościowej (5-krotnie rozcieńczonej PBS) wymagana do 50% wiązania.
b) Doświadczenie z rozcieńczaniem: różnica jednego rozcieńczenia, np. 128 w porównaniu do 64 leży w zakresie błędu doświadczalnego.
Tabela 5 wykazuje, iż N-Bu-GBMP jest równie dobrym inhibitorem jak N-Pr-GBMP przy wiązaniu tego drugiego związku do jego własnych homologicznych przeciwciał. Tak więc zastosowanie N-Bu-GBMP w miejsce N-Pr-GBMP nie powoduje żadnej istotnej utraty właściwości wykazywanych przez N-Pr-GBMP. Tabela 5 przedstawia też, że N-Bu-GBMP wiąże się równie dobrze jak N-Pr-GBMP z przeciwciałami indukowanymi przez N-Pr-GBMP-TT. Surowice odpornościowe indukowane zarówno przez N-Bu-GBMP-TT jak i N-Pr-GBMP-TT wykazują podobne miana bakteriobójcze. Dowodzi to, iż N-Bu-, N-IzoBu- i N-Pen-GBMP są równocenne z N-Pr-GBMP pod względem zdolności imitowania bakteriobójczego epitopu na powierzchni meningokoków grupy B.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,00 zł.
Claims (6)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania koniugatu antygenowego, znamienny tym, że polisacharyd grupy B Neisseria meningitidis zawierający N-acetylową grupę w reszcie kwasu sialowego modyfikuje się przez zastąpienie grupy N-acetylowej grupą N-CU-Cs-acylową i tak otrzymany modyfikowany polisacharyd sprzęga się z immunologicznie odpowiednim nośnikiem białkowym.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sprzęganie prowadzi się przez wprowadzenie końcowych grup aldehydowych do N-acylowanego polisacharydu i sprzęga się grupy aldehydowe z grupami aminowymi proteiny za pomocą redukcyjnego aminowania.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako grupę C4-Cs-acylową wprowadza się grupę n-butylową, izobutylową, n-pentylową, n-heksylową, n-heptylową lub n-oktylową.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako białko stosuje się anatoksynę tężcową, anatoksynę błonicy, materiał reagujący krzyżowo (CRM) i bakteryjny nośnik białkowy.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako CRM stosuje się CRM197.
- 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko i polisacharyd wiąże się kowalencyjnie poprzez wiązanie -CH2NH-proteina.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44819589A | 1989-12-14 | 1989-12-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL288271A1 PL288271A1 (en) | 1991-12-16 |
| PL166035B1 true PL166035B1 (pl) | 1995-03-31 |
Family
ID=23779371
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL90302476A PL166659B1 (pl) | 1989-12-14 | 1990-12-14 | Sposób wytwarzania frakcji gamma globuliny zdolnej do biernej ochrony przeciw zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych PL |
| PL90288271A PL166035B1 (pl) | 1989-12-14 | 1990-12-14 | Sposób wytwarzania koniugatu antygenowego PL |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL90302476A PL166659B1 (pl) | 1989-12-14 | 1990-12-14 | Sposób wytwarzania frakcji gamma globuliny zdolnej do biernej ochrony przeciw zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych PL |
Country Status (30)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5576002A (pl) |
| EP (1) | EP0504202B1 (pl) |
| JP (1) | JP2637845B2 (pl) |
| KR (1) | KR0158436B1 (pl) |
| CN (4) | CN1049223C (pl) |
| AR (1) | AR243934A1 (pl) |
| AT (1) | ATE121947T1 (pl) |
| AU (1) | AU641715B2 (pl) |
| BR (1) | BR9007917A (pl) |
| CA (1) | CA2071811C (pl) |
| CZ (1) | CZ283530B6 (pl) |
| DE (1) | DE69019164T2 (pl) |
| DK (1) | DK0504202T3 (pl) |
| ES (1) | ES2071288T3 (pl) |
| FI (2) | FI104539B (pl) |
| HR (1) | HRP920872A2 (pl) |
| HU (2) | HU9201966D0 (pl) |
| IE (1) | IE68414B1 (pl) |
| IL (1) | IL96676A (pl) |
| IN (1) | IN171747B (pl) |
| NO (2) | NO305275B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ236471A (pl) |
| PH (1) | PH30305A (pl) |
| PL (2) | PL166659B1 (pl) |
| RO (1) | RO111416B1 (pl) |
| RU (1) | RU2105568C1 (pl) |
| SI (1) | SI20008B (pl) |
| WO (1) | WO1991008772A1 (pl) |
| YU (1) | YU24391A (pl) |
| ZA (1) | ZA9010065B (pl) |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5648241A (en) * | 1989-09-15 | 1997-07-15 | The General Hospital Corporation | Conjugate vaccine against group B streptococcus |
| AU641715B2 (en) * | 1989-12-14 | 1993-09-30 | National Research Council Of Canada | Improved meningococcal polysaccharide conjugate vaccine |
| ES2160601T3 (es) * | 1992-09-24 | 2001-11-16 | Brigham & Womens Hospital | Vacunas de conjugado de polisacaridos de estreptococos del grupo b tipo ii y tipo v-proteina. |
| US5439808A (en) * | 1993-07-23 | 1995-08-08 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis |
| US6153406A (en) * | 1993-07-23 | 2000-11-28 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane protein P2 from Haemophilus influenzae type B |
| US5700787A (en) * | 1994-09-02 | 1997-12-23 | Brigham & Women's Hospital, Inc. | Capsular polysaccharide immunomodulator |
| US5679654A (en) * | 1994-09-02 | 1997-10-21 | Brigham & Women's Hospital, Inc. | Capsular polysaccharide immunomodulator |
| US5747287A (en) * | 1995-04-28 | 1998-05-05 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis |
| EP1090642B8 (en) * | 1995-06-07 | 2010-08-11 | GlaxoSmithKline Biologicals s.a. | Vaccines comprising a polysaccharide antigen-carrier protein conjugate and free carrier protein |
| US5811102A (en) | 1995-06-07 | 1998-09-22 | National Research Council Of Canada | Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines |
| US6284884B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-09-04 | North American Vaccine, Inc. | Antigenic group B streptococcus type II and type III polysaccharide fragments having a 2,5-anhydro-D-mannose terminal structure and conjugate vaccine thereof |
| ZA97248B (en) * | 1996-01-18 | 1997-07-18 | Rohm & Haas | Method for identifying and quantifying polymers utilizing immunoassay techniques |
| ATE252602T1 (de) | 1996-08-27 | 2003-11-15 | Chiron Corp | Meningokokkus b-epitop ausbildende monoklonale antikoerper und deren verwendung zur herstellung von impfstoffzusammenstellungen |
| ATE208629T1 (de) | 1996-08-27 | 2001-11-15 | Chiron Corp | Neisseria meningitidis serogruppe b glykokonjugate und verfahren zu deren verwendung |
| US6426074B1 (en) * | 1997-03-19 | 2002-07-30 | The Brigham And Women's Hospital Inc. | Group B Streptococcus vaccine |
| EP0994723A1 (en) | 1997-06-24 | 2000-04-26 | Chiron Corporation | Methods of immunizing adults using anti-meningococcal vaccine compositions |
| PT1630168E (pt) | 1997-08-27 | 2011-07-20 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Compostos miméticos moleculares de péptidos de meningococos do serogrupo b |
| ES2611464T3 (es) | 1997-12-23 | 2017-05-09 | Pfizer Ireland Pharmaceuticals | Polisacárido capsular bacteriano para su uso como vacuna o para su unión a proteínas en vacunas de conjugados |
| NZ509986A (en) * | 1998-08-19 | 2003-10-31 | Baxter Healthcare S | Immunogenic beta-propionamido-linked polysaccharide and oligosaccharide protein conjugates as vaccines |
| US6436653B1 (en) | 1998-12-15 | 2002-08-20 | Exiqon A/S | Method for introduction of reporter groups into bacterial lipopolysaccharide-derived carbohydrates and the subsequent coupling of such derivatives onto solid surfaces |
| US7083777B1 (en) * | 1999-04-02 | 2006-08-01 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Immunomodulating polymers |
| US6518037B2 (en) * | 1999-11-12 | 2003-02-11 | University Of Iowa Research Foundation | Two-component system that controls bacterial membrane synthesis |
| GB9928196D0 (en) * | 1999-11-29 | 2000-01-26 | Chiron Spa | Combinations of B, C and other antigens |
| SV2003000753A (es) | 2000-12-05 | 2003-06-16 | Brigham & Womens Hospital | Uso de polisacaridos zwitterionicos para la especifica modulacion del progreso inmunologico |
| RU2322451C2 (ru) | 2001-04-17 | 2008-04-20 | Новартис Вэксинс Энд Диагностикс, Инк. | Молекулярные миметики эпитопов менингококка в, которые вызывают выработку функционально активных антител |
| GB0115176D0 (en) * | 2001-06-20 | 2001-08-15 | Chiron Spa | Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines |
| GB0121591D0 (en) * | 2001-09-06 | 2001-10-24 | Chiron Spa | Hybrid and tandem expression of neisserial proteins |
| AR045702A1 (es) | 2001-10-03 | 2005-11-09 | Chiron Corp | Composiciones de adyuvantes. |
| DK1490409T3 (da) * | 2002-03-26 | 2009-03-23 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Modificerede saccharider med forbedret stabilitet i vand |
| WO2004089407A2 (en) * | 2003-03-31 | 2004-10-21 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Zwitterionic immunomodulators for the treatment of asthma and allergy |
| US7731967B2 (en) | 2003-04-30 | 2010-06-08 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Compositions for inducing immune responses |
| JP4566194B2 (ja) | 2003-08-12 | 2010-10-20 | リポクセン テクノロジーズ リミテッド | タンパク質の誘導体化及び結合のためのシアル酸誘導体 |
| WO2006002402A2 (en) | 2004-06-23 | 2006-01-05 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Polysaccharide derivatives and uses in induction of an immune response |
| US8148335B2 (en) | 2004-06-23 | 2012-04-03 | Children's Hospital & Research Center Oakland | De-N-acetyl sialic acid antigens, antibodies thereto, and methods of use in cancer therapy |
| GB0428394D0 (en) * | 2004-12-24 | 2005-02-02 | Chiron Srl | Saccharide conjugate vaccines |
| US8329184B2 (en) | 2005-06-27 | 2012-12-11 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Process for manufacturing vaccines |
| US8206726B2 (en) | 2006-02-06 | 2012-06-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Zwitterionic polysaccharides for promotion of immune system maturation and health |
| GB0611914D0 (en) | 2006-06-15 | 2006-07-26 | Teti Giuseppe | Peptides that mimic non-human cross-reactive protective epitopes of the group Bmeningococcal capsulsar polysaccharide |
| EP1872791A1 (en) | 2006-06-30 | 2008-01-02 | Institut Pasteur | Use of bacterial polysaccharides for biofilm inhibition |
| US20100189740A1 (en) * | 2007-06-20 | 2010-07-29 | Francis Michon | Modified polysaccharides for conjugate vaccines |
| ES2664753T3 (es) | 2007-12-07 | 2018-04-23 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Composiciones de inducción de respuestas inmunes |
| WO2010083477A2 (en) | 2009-01-16 | 2010-07-22 | University Of Maryland, Baltimore | Broad spectrum vaccine against non-typhoidal salmonella |
| WO2013009945A1 (en) | 2011-07-12 | 2013-01-17 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Lipid-containing psa compositions, methods of isolation and methods of use thereof |
| EP2752403A1 (de) * | 2013-01-08 | 2014-07-09 | Sika Technology AG | Amin für emissionsarme Epoxidharz-Produkte |
| WO2017031431A1 (en) | 2015-08-19 | 2017-02-23 | President And Fellows Of Harvard College | Lipidated psa compositions and methods |
| US11491181B2 (en) | 2016-07-15 | 2022-11-08 | President And Fellows Of Harvard College | Glycolipid compositions and methods of use |
| PE20191107A1 (es) * | 2017-01-31 | 2019-08-26 | Pfizer | Composiciones de neisseria meningitidis y metodos respectivos |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4057685A (en) * | 1972-02-02 | 1977-11-08 | Abbott Laboratories | Chemically modified endotoxin immunizing agent |
| US4356170A (en) * | 1981-05-27 | 1982-10-26 | Canadian Patents & Development Ltd. | Immunogenic polysaccharide-protein conjugates |
| US4673574A (en) * | 1981-08-31 | 1987-06-16 | Anderson Porter W | Immunogenic conjugates |
| US4644059A (en) * | 1982-07-06 | 1987-02-17 | Connaught Laboratories, Inc. | Haemophilus influenzae B polysaccharide-diptheria toxoid conjugate vaccine |
| US4619828A (en) * | 1982-07-06 | 1986-10-28 | Connaught Laboratories, Inc. | Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines |
| US4496538A (en) * | 1982-07-06 | 1985-01-29 | Connaught Laboratories, Inc. | Haemophilus influenzae b polysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccine |
| US4695624A (en) * | 1984-05-10 | 1987-09-22 | Merck & Co., Inc. | Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency |
| US4727136A (en) * | 1985-10-01 | 1988-02-23 | Canadian Patents And Development Ltd. | Modified meningococcal group B polysaccharide for conjugate vaccine |
| AU641715B2 (en) * | 1989-12-14 | 1993-09-30 | National Research Council Of Canada | Improved meningococcal polysaccharide conjugate vaccine |
-
1990
- 1990-12-13 AU AU68987/91A patent/AU641715B2/en not_active Ceased
- 1990-12-13 RO RO92-0789A patent/RO111416B1/ro unknown
- 1990-12-13 HU HU9201966A patent/HU9201966D0/hu unknown
- 1990-12-13 RU SU5052391A patent/RU2105568C1/ru active
- 1990-12-13 HU HU9201966A patent/HU218146B/hu unknown
- 1990-12-13 BR BR909007917A patent/BR9007917A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-12-13 AT AT91900142T patent/ATE121947T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-12-13 CA CA002071811A patent/CA2071811C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-13 DE DE69019164T patent/DE69019164T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-13 KR KR1019920701403A patent/KR0158436B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-12-13 DK DK91900142.0T patent/DK0504202T3/da active
- 1990-12-13 WO PCT/CA1990/000437 patent/WO1991008772A1/en active IP Right Grant
- 1990-12-13 EP EP91900142A patent/EP0504202B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-13 ES ES91900142T patent/ES2071288T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-13 JP JP3500908A patent/JP2637845B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-14 IL IL9667690A patent/IL96676A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-12-14 CN CN90110444A patent/CN1049223C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-14 SI SI9110243A patent/SI20008B/sl not_active IP Right Cessation
- 1990-12-14 AR AR90318627A patent/AR243934A1/es active
- 1990-12-14 PL PL90302476A patent/PL166659B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-12-14 IN IN1033/CAL/90A patent/IN171747B/en unknown
- 1990-12-14 ZA ZA9010065A patent/ZA9010065B/xx unknown
- 1990-12-14 IE IE451390A patent/IE68414B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-12-14 YU YU24391A patent/YU24391A/sh unknown
- 1990-12-14 PL PL90288271A patent/PL166035B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-12-14 PH PH41724A patent/PH30305A/en unknown
- 1990-12-14 NZ NZ236471A patent/NZ236471A/en unknown
- 1990-12-14 CZ CS906284A patent/CZ283530B6/cs unknown
-
1992
- 1992-06-12 FI FI922737A patent/FI104539B/fi active
- 1992-06-12 NO NO922316A patent/NO305275B1/no unknown
- 1992-10-02 HR HRP-243/91A patent/HRP920872A2/hr not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-11-22 CN CN93114764A patent/CN1072506C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1993-11-22 CN CN93119467A patent/CN1036504C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1993-11-22 CN CN93114763A patent/CN1036522C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-05-05 US US08/238,600 patent/US5576002A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/485,623 patent/US5683699A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-07-17 NO NO973311A patent/NO307835B1/no unknown
- 1997-10-17 US US08/953,771 patent/US5902586A/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-09-09 FI FI991917A patent/FI19991917A/fi unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL166035B1 (pl) | Sposób wytwarzania koniugatu antygenowego PL | |
| US5969130A (en) | Meningococcal polysaccharide conjugate vaccines | |
| JP2004505885A (ja) | Ｎ−アクリロイル化ポリサッカリドを用いて産生されたワクチンとして有用な免疫原性β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体 | |
| JPH11507964A (ja) | ２，５−アンヒドロ−ｄ−マンノース末端構造を持つ、抗原性グループｂ連鎖球菌▲ｉｉ▼型および▲ｉｉｉ▼型多糖断片とその複合ワクチン | |
| AU3486499A (en) | Conjugate vaccines for the prevention of dental caries | |
| MXPA03010283A (es) | Conjugados inmunogenicos de acido hialuronico de peso molecular bajo con toxinas de polipeptido. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20081214 |