FI104539B - Menetelmä muunnellun Neisseria meningitidis ryhmä B polysakkaridin tai muunnellun E. coli K1 kotelomaisen polysakkaridin valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä muunnellun Neisseria meningitidis ryhmä B polysakkaridin tai muunnellun E. coli K1 kotelomaisen polysakkaridin valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI104539B FI104539B FI922737A FI922737A FI104539B FI 104539 B FI104539 B FI 104539B FI 922737 A FI922737 A FI 922737A FI 922737 A FI922737 A FI 922737A FI 104539 B FI104539 B FI 104539B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- gbmp
- polysaccharide
- group
- butanoyl
- protein
- Prior art date
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims description 40
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims description 40
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 35
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 15
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 title claims description 12
- 241000617590 Escherichia coli K1 Species 0.000 title claims description 7
- -1 n-butanoyl Chemical group 0.000 claims description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 12
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 10
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 3
- 125000003104 hexanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims description 2
- 125000000268 heptanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 125000002801 octanoyl group Chemical group C(CCCCCCC)(=O)* 0.000 claims description 2
- 125000003774 valeryl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 24
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 7
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 5
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 5
- 230000006181 N-acylation Effects 0.000 description 5
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- NNPPMTNAJDCUHE-UHFFFAOYSA-N isobutane Chemical compound CC(C)C NNPPMTNAJDCUHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N n-pentane Natural products CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000588677 Neisseria meningitidis serogroup B Species 0.000 description 2
- 102000011830 Neural cell adhesion Human genes 0.000 description 2
- 108050002172 Neural cell adhesion Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N Valeric acid Natural products CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001273 butane Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- PKHMTIRCAFTBDS-UHFFFAOYSA-N hexanoyl hexanoate Chemical class CCCCCC(=O)OC(=O)CCCCC PKHMTIRCAFTBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000001282 iso-butane Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N n-butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 206010027249 Meningitis meningococcal Diseases 0.000 description 1
- 201000010924 Meningococcal meningitis Diseases 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- KRVSOGSZCMJSLX-UHFFFAOYSA-L chromic acid Substances O[Cr](O)(=O)=O KRVSOGSZCMJSLX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000010200 folin Substances 0.000 description 1
- AWJWCTOOIBYHON-UHFFFAOYSA-N furo[3,4-b]pyrazine-5,7-dione Chemical compound C1=CN=C2C(=O)OC(=O)C2=N1 AWJWCTOOIBYHON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009756 muscle regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical group 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1228—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K16/1232—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia from Escherichia (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0258—Escherichia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
104539
Menetelmä muunnellun Neisseria meningitidis ryhmä B polysakkaridin tai muunnellun E. coli K1 kotelomaisen polysakkaridin valmistamiseksi *
Esillä oleva keksintö koskee kemiallisesti muunneltua Neisseria meningitidis ryhmä 5 B polysakkarideja. Keksintö tarjoaa myös rokotteita, joissa vastaavat muunnellut polysakkaridit on konjugoitu proteiinikantajaan.
Aivokalvontulehdus, jonka aiheuttaa ryhmän B N. meningitidis ia E. coli Kl, säilyy suurena maailmanlaajuisena terveysongelmana. Ryhmän B aivokalvontulehdusta esiintyy sekä endeemisissä että epideemisissä tiloissa ja se on syypää arviolta puo-10 leen kaikista tilastoiduista meningokokki-aivokalvontulehdustapauksista, kun taas K1-positiivinen E. coli on johtava aivokalvontulehduksen syy neonaateissa. Hakemuksen tekemishetkellä ei ole rokotetta kaupallisesti saatavilla tautia vastaan, jonka aiheuttavat ryhmän B meningokokki ja E. coli Kl. Tämä johtuu suurelta osalta siitä tosiseikasta, että ryhnän B meningokokkipolysakkaridi (GBMP) on vain vähän im-15 munogeeninen ihmisissä. On joitakin äskettäin raportoituja mahdollisia rokotteita, jotka perustuvat GBMP.n komplekseihin pintamembraaniproteiinien kanssa, mutta vielä ei ole selvää todistetta niiden tehokkuudesta ihmisissä.
Viime aikoina on kehitetty uusi rokotteen muoto, joka perustuu synteettiseen kemiallisesti muokattuun (N-propionyloituun) ryhmän B polysakkaridiproteiini (N-Pr-20 GBMP-proteiini) -konjugaattiin. Rokote indusoi hiirissä korkeita IgG-vasta-aineiden pitoisuuksia, jotka vasta-aineet eivät ole vain suojaavia, vaan myös ristireagoivat muuntelemattoman GBMP (so. N-asetyyli-GBMP) kanssa. Tämä muoto on kuvattu ja patentoitu US-patentissa 4 727 136, julkaistu helmikuun 23., 1988, keksijänä Harold J. Jennings et ai. 1 2 3 4 5 6
On päätelty, että rokote, joko synnyttää ristireaktiivisia vasta-aineita kuten sellainen, 2 joka on kuvattu US-patentissa 4 727 136, voisi olla onnistunut vain immuunitole- 3 ranssin rikkomisen kustannuksella. Tämä hypoteesi on todistettu oikeaksi sellaisen 4 yleisen epitoopin tunnistamisella, joka sisältää a-(2-8)-liitetyn sylkihappotähteen (kymmenen tähteen minimivaatimuksella) sekä natiivissa N-Ac-GBMP:ssä sekä ih- 5 * 6 misen että eläimen kudoksissa (Jennings, Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Kar-ger, 1989, voi. 10, 151-165). Nämä polysialosyylihappotähteet toimivat kehittyvinä antigeeneinä ja ne on suurelta osin yhdistetty sikiön tilaan embryonisessa neuraali-sessa soluadheesiossa (Finne et ai., Biochem, Biophys. Res Commun.. 1983, 112, 482). Syntymän jälkeisen kypsymisen aikana tämä antigeeni säätyy alas (Fried- 2 104539 lander et ai, J. Cell Biol. 1985, 101, 412), mutta sitä ilmentyy aikuisissa ihmisissä sairastuneiden lihasten regeneraation aikana (Cashman et ai, Ann. Neuron., 1987, 21, 481) tuumorisoluissa (Roth et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.. 1988, 85, 299) ja luonnollisissa tappaja (NK) ja CD3+T -soluissa (Husmann et ai., Eur, J, Immunol., 1989, 5 19, 1761). Vaikka toleranssin rikkomisen seurauksia noille sikiön antigeeneille ei ole vielä näytetty toteen, on yleisesti tunnustettu, että johtuen tästä ristireaktiivisuu-desta viranomaiset tutkisivat tarkasti N-Pr-GBMP-proteiinikonjugaatin, jolloin aiheutuisi huomattavat kustannukset ja viivytykset johtuen monimutkaisista kokeista, jotka ovat tärkeitä todistettaessa rokotteen turvallisuus, ennen sen hyväksymistä 10 kaupallisille markkinoille.
Esillä olevan keksinnön kohde on rokotteen kehittäminen, jolla rokotteella on parannetut immunogeeniset ominaisuudet, verrattuna N-Pr-GBMP-proteiinirokottee-seen. Keksinnön kohteena on myös rokotteen tarjoaminen, joka rokote osoittaa oleellisesti pienentynyttä ristireaktiivisuutta ihmisen ja eläimen hermosoluadheesio-15 antigeenin kanssa (sikiön N-CAM).
Yhdessä esillä olevan keksinnön mukaisessa näkökulmassa tarjotaan menetelmä muunnellun Neisseria meningitidisin B-polysakkaridin valmistamiseksi, jossa polysakkaridin sylkihappotähteen N-asetyyli (C2) -ryhmät on korvattu C4-C8-asyyli-ryhmällä.
20 Toisessa näkökulmassa tarjotaan antigeenisen konjugaatin valmistusmenetelmä, joka konjugaatti käsittää N-C4-C8-asyylipolysakkaridin, joka on konjugoitu immunologi-sesti sopivaan proteiiniin, jolla on parannettu immunogeenisyys oleellisesti pienen-; tyneen ristireaktiivisten vasta-aineiden indusoitumisen kanssa.
Hakemuksessa esitetään myös rokote, joka käsittää N-C4-C8-asyylipolysakkaridi-25 konjugaatin yhdessä sopivan kantajan tai laimentunen kanssa. Rokotteet voivat käsittää myös terapeuttisesti tehokkaan määrän apuainetta, joka on sopiva ihmiskäyttöön, esimerkiksi aluminiumfosfaatti tai aluminiumhydroksidi.
I .. Hakemuksessa esitetään myös menetelmä nisäkkäiden immunisoimiseksi N, menin gitidis- ia E, coli K1 -infektioita vastaan, joka menetelmä käsittää sen, että annostel-30 laan parenteraalisesti nisäkkäisiin, jotka ovat sellaisten infektioiden kohteena, mukaan lukien ihmiset, immunologisesti tehokas määrä keksinnön mukaista rokotetta. Rokote annostellaan tyypillisesti määrissä noin 1-50 mikrogrammaa kehon painoki- loa kohti, esimerkiksi 5-25 mikrogrammaa kehon painokiloa kohti.
3 104539
Hakemus taijoaa myös gammaglobuliinifraktion, joka kykenee suojaamaan aivokalvontulehdusta vastaan, jonka on aiheuttanut ryhmän B N. meningitidis ja E. coli K1. Fraktio tuotetaan immunisoimalla nisäkästä keksinnön mukaisella rokotteella. Sitten fraktio annostellaan yksilöön suojan tarjoamiseksi tai meneillään olevan infektion 5 hoitamiseksi, jonka aiheuttaa edellä mainitut organismit. Tästä on ymmärrettävä, että immunogeeniset rokotekonjugaatit tarjoavat terapeuttisen antiseerumin lähteen niiden edullisen immunogeenisyyden valossa minimivasta-aineiden indusoimisella, jotka ovat ristireaktiivisia ihmisen ja eläimen hermosoluadheesioantigeenin sikiön N-CAM:n kanssa. Hakemuksen mukaiset konjugaatit ovat myös käyttökelpoisia 10 monoklonaalisten vasta-aineiden synnyttämiseksi ja mahdollisesti antidiotyyppisten vasta-aineiden synnyttämiseksi.
Viimeaikaisissa kokeissamme on keksitty, että useimmat bakterisidiset ja suojaavat vasta-aineet, jotka indusoi N-Pr-GBMP-proteiinikonjugaatti, joka on kuvattu edellä mainitussa Jennings et ai. US-patentissa 4 727 136, eivät liity sikiön N-CAM ristire-15 aktiivisiin vasta-aineisiin. Tosiasiassa suurin osa suoja-aktiivisuudesta sisältyy N-PR-GBMP-spesifiseen vasta-ainepopulatioon, joka ei ristireagoi sikiön N-CAM:n kanssa. Tämän valossa on uskottu, että N-Pr-GBMP matkii uniikkia bakterisidista epitooppia ryhmän B meningokokin pinnalla.
Esillä oleva keksintö perustuu siihen havaintoon, että on mahdollista syntetisoida 20 kemiallisesti muunneltuja GBMP:itä, jotka matkivat bakterisidistä epitooppia ja jotka, konjugoidussa muodossaan, eivät vain osoita suurentunutta immunogeenisyyttä vaan välttävät oleellisesti vasta-aineiden, jotka ristireagoivat sikiön N-CAM:n kanssa, indusoitumista.
«
Esillä olevaan keksintöön päätyessä lukuisia erilaisia kemiallisesti muunneltuja 25 GBMP:itä on syntetisoitu ja konjugoitu yksittäisesti proteiiniin, mitä seuraa konju-gaattien injektio hiiriin ja tehot verrattuna niihin, joita tuottaa N-Pr-GBMP-proteii-nikonjugaatti. Yllättävästi on keksitty, että N-C4-C8-asyyli GBMP-proteiinikonju-gaatit, esimerkiksi n-butanoyyli, isobutanoyyli, n-pentanoyyli, neopentanoyyli, hek-' ' sanoyyli, heptanoyyli ja oktanoyyli, ja erityisesti N-butanoyyli (N-Bu) GBMP-pro- 30 teiinikonjugaatti, oleellisesti matkivat bakteeriepitooppia ja oleellisesti pienentävät ; ristireaktiivisten vasta-aineiden indusoitumista.
Ryhmän B meningokokkipolysakkaridi eristetään N. meningitidiksestä menetelmillä, jotka ovat tunnettuja tekniikan tasossa. Yhdessä sellaisessa menetelmässä ryhmän B meningokokkeja (kanta 98IB) kasvatettiin 37 °C:ssa fermenttorissa käyttä-35 mällä 30 g dehydratoitua Todd Hewitt Broth'ia (Difco Laboratories, Detroit, Michi- 4 104539 gan) litraa kohti tislattua vettä. Ennen fermenttorissa kasvattamista, lyofilisoitua kantaa kasvatettiin aluksi purkissa 37 °C:ssa 5 %:ssa (v/v) Sheeps' Blood Agar (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) -levyillä. Bakteerit siirrettiin sitten 1,0 litraan Todd Hewitt Broth'ia (kuten edellä) Erlenmeyer-pullossa, jota sekoitettiin 5 37 °C:ssa 7 tuntia 190 rpm:ssä. Tämä rokote siirrettiin sitten fermenttoriin. Ferment- torikasvatuksen jälkeen (16 tuntia) bakteerit tapettiin lisäämällä formaliinia 0,75 %:n lopulliseen konsentraatioon. Bakteerit siirrettiin jatkuvalla sentrifugoinnil-la ja ryhmän B meningokokki-polysakkaridi eristettiin supernatant!sta ja puhdistettiin oleellisesti kuten viitteessä Bundle et ai., J. Biol. Chem.. 249, 4797-4801 (1974) 10 on kuvattu, paitsi että proteiini uutettiin sekoittamalla raa'an polysakkaridin liuosta kylmän (4 °C) 90%:n fenolin kanssa kuuman (50-60 °C) sijasta. Tämä jälkimmäinen menetelmä varmistaa, että tuotetaan GBMP .n korkeamolekyylipainomuotoa.
E. colia (018:K1:H7) (NRCC 4283) kasvatettiin 37 °C:ssa fermenttorissa tislatussa vedessä, joka sisälsi dehydratoitua Brain Heart Infusion -liuosta (BHI; 37 g/litra) 15 (Difco Laboratories, Detroit, Michigan). Ennen fermenttorissa kasvattamista lyofilisoitua kantaa kasvatettiin 50 ml:ssa BHI-liuosta (sama kuin edellä) Erlenmeyer-pullossa, jota ravistettiin 37 °C:ssa 7 tuntia 200 rpm:ssä. Sitten tämä kasvatus siirrettiin 1,5 litraan BHLtä (sama kuin edellä) ja kasvatettiin samoissa olosuhteissa kuin edellä 7 tuntia. Rokote siirrettiin sitten fermenttoriin.
20 Menettelyt, joita käytettiin E. coli Kl:n kapselipolysakkaridin eristämiseen ja puhdistamiseen, olivat samanlaisia kuin edellä on kuvattu ryhmän B meningokokkipoly-sakkaridin eristämiseksi.
j · On ymmärrettävä, että edellä kuvatut eristämis- ja puhdistusmenettelyt eivät ole ai noita, joita voidaan käyttää, ja että muita julkaistuja menetelmiä on saatavilla, esi-25 merkiksi kuten viiteessä Watson et ai., J. Immunol.. 81, 331 (1958) ja edellä mainitussa US-patentissa 4 727 136 on kuvattu.
Natiivi polysakkaridi on N-deasetyloitu, jotta tarjotaan reaktiivinen amiiniryhmä I . molekyylin sylkihappotähdeosissa. N-deasetylointi voidaan suorittaa millä tahansa tunnetulla menetelmällä, esimerkiksi emäksisessä vesipitoisessa väliaineessa kohote-30 tuissa lämpötiloissa, esimerkiksi 90 °C:sta 100 °C:seen, ja pH:ssa noin 13-14. ·
Emäksinen vesipitoinen väliaine on sopivasti vesipitoinen alkalimetallihydroksidi-liuos, esimerkiksi noin 2 M natriumhydroksidi. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää hydratsiinia vesipitoisessa liuoksessa. N-deasetyloinnin aste voi vaihdella noin 30 %:sta 100%:iin, olosuhteista riippuen. On edullista saavuttaa noin 90-100 %:n 5 104539 N-deasetylaatio. N-deasetyloitu tuote voidaan saada talteen esimerkiksi jäähdyttämällä, neutraloimalla, puhdistamalla, haluttaessa, ja lyofilisoimalla.
«*
Ennen N-deasetylointimenettelyä natiivilla polysakkaridilla on keskimääräinen mo-; lekyylipaino rajoissa noin 500 000 - 800 000 daltonia. N-deasetylaation tuloksena 5 tuotetaan polysakkaridin fragmentteja, joiden keskimäärinen molekyylipaino vaihte-lee välillä noin 10 000 - 50 000 daltonia.
Sitten N-deasetyloidut polysakkaridifragmentit N-asyloidaan vastaavan N-asyloidun tuotteen tuottamiseksi. N-asylointi voidaan suorittaa liuottamalla N-asetyloitu polysakkaridi vesipitoiseen väliaineeseen, jonka pH on noin 7,5-9,0, mitä seuraa sopi-10 van asyylianhydridin lisääminen, mahdollisesti alkoholin kanssa liukoisuuden lisäämiseksi, ja jäähdytetään alle 10 °C:een kunnes reaktio on täydellinen. Reaktioväli-aine voidaan puhdistaa haluttaessa esimerkiksi dialyysillä, ja sitten otetaan N-asyloi-tu tuote talteen, tyypillisesti lyofilisoimalla. Reaktio on oleellisesti täydellinen noin 10-20 tunnin sisällä. N-asyloinnin aste, kuten mitattu analyyttisillä tekniikoilla, 15 tyypillisesti !H NMR:llä, on ainakin 90 %, ja todennäköisesti lähellä 100 %:a. N-asylointireaktiotuote ei tuota yhtään oleellisesti fragmenttien molekyylipainon pienenemistä.
On edullista valita konjugaatiotarkoituksiin N-asyloitu materiaali, jonka keskimääräinen molekyylipaino vastaa noin 30-200 sylkihappotähdettä. Tämä saavutetaan 20 yleensä N-asyloidun GBMP:n geelisuodatuksella käyttämällä Ultragel (tavaramerkki) AcA 44 (helmen läpimitta 60-140 pm) -kolonnia ja käyttämällä PBS:ää eluentti-na. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää sopivaa koon mukaan seulovaa kalvoa.
N-asyloitua ainetta, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 10 000 - 40 000, esimerkiksi 10 000 - 15 000 daltonia, käytetään keksintöä varten. Tämä saavutetaan ke-25 räämällä kolonnin, joka sisältää N-asyloitua GBMP-materiaalia, jonka keskimääräinen molekyylipaino on edellä määritelty, eluaatin fraktiot. N-asyloidun materiaalin, jolla on korkeampi keskimääräinen molekyylipaino, esimerkiksi rajoissa 30 000 -. . 40 000 daltonia, on osoitettu myös olevan käyttökelpoinen keksinnön mukaisesti.
Rokotteet tuotetaan konjugoimalla N-asyloitu polysakkaridi immunologisesti sopi-30 van kantajaproteiinin kanssa. Edullisesti kantajaproteiini itsessään on immunogeeni. Esimerkkejä sopivista kantajaproteiineista ovat tetanustoksoidi, difteriatoksoidi, ris-tireagoivat materiaalit (CRM), edullisesti CRM197, jota saadaan firmasta Sclavo Ltd., Siena, Italia, ja bakteeriproteiinikantajat, esimerkiksi meningokokki-ulko-membraaniproteiinit.
104539 ο
Mitä tahansa konjugaation muotoa voidaan käyttää konjugoimaan muunnellut po-lysakkaridifragmentit kantajaproteiinin kanssa. Edullinen menetelmä on sellainen, joka on kuvattu US-patentissa 4 356 170, so. tuomalla terminaalisia aldehydiryhmiä (cis-vikinaalisten hydroksyyliryhmien hapetuksen kautta) n-asyloituun polysakkari-5 diin ja kytkemällä aldehydiryhmät proteiinin aminoryhmiin pelkistävällä aminaatiol-la. Polysakkaridit ja proteiinit liitetään siten -CH2-NH-proteiinisidosten kautta.
On kuitenkin ymmärrettävä, että hakemuksen mukaiset konjugaattirokotteet eivät rajoitu vain niihin, jotka on tuotettu pelkistävällä animaatiolla. Siten rokotteet voidaan valmistaa myös konjugoimalla N-asyloitu polysakkaridi kantajaproteiinin 10 kanssa käyttämällä adipiinidihydratsidivälikettä, kuten viitteessä Schneerson, R., et ai., Preparation, Characterization and Immunogenicity of Haemophilus influenzae type b Polysaccharide-Protein Conjugates, J, Exp. Med.. 1952, 361-476 (1980) ja US-patentissa 4 644 059, Lance K. Gordon, on kuvattu. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää binääristä väliketeknologiaa, jonka on kehittänyt firma Merck, kuten viit-15 teessä Marburg, S., et ai., "Biomolecular Chemistry of Macromolecules: Synthesis of Bacterial Polysaccharide Conjugates with Neisseria meningitidis Membrane Protein", J. Amer. Chem. Soc.. 108, 5282-5287 (1986) on kuvattu tai mahdollisesti päiden pelkistys -metodologiaa, kuten johon US-patentissa 4 673 574, Anderson, on viitattu.
20 Syntyvillä N-asyloiduilla polysakkaridi-proteiinikonjugaateilla ei ole merkittävää ristisitoutumista ja ne ovat liukoisia vesiliuoksiin. Tämä tekee keksinnön mukaisista konjugaateista hyviä ehdokkaita rokotekäyttöön.
Syntyvät N-asyloidut polysakkaridiproteiinikonjugaatit on testattu in vitro -kokeilla hiirissä, ja niillä on yleisesti osoitettu olevan parantuneet immunogeeniset ominai-25 suudet verrattuna N-propionyloituun polysakkaridiin. Lisäksi oleellisesti ristireak-tiivisten vasta-aineiden pienentynyttä muodostumista havaitaan. Tämän valossa uskotaan, että hakemuksen mukaiset rokotteet ovat käyttökelpoisia aivokalvontulehdusta vastaan, jonka aiheuttaa ryhmän B N. meningitidis- tai E. coli K1 -organismit.
/ Erityisen mielenkiintoisia ovat rokotteet, joilla suojataan ihmislapsia, jotka ovat 30 herkimpiä bakteeriaivokalvontulehdukselle.
l «
Hakemuksen mukaiset rokotteet on tyypillisesti muodostettu dispergoimalla konju-gaatti mihin tahansa sopivaan farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan, kuten fysiologinen suolaliuos tai injektoitavat nesteet. Rokote annostellaan parenteraalisesti, esimerkiksi ihonalaisesti, vatsakalvonsisäisesti tai lihaksensisäisesti. Tavanomaisia 7 104539 rokotteiden lisäaineita voi olla läsnä, esimerkiksi stabiloijat, kuten laktoosi tai sorbitoli ja apuaineet, kuten aluminiumfosfaatti, -hydroksidi tai -sulfaatti.
Sopiva annos rokotteelle ihmisen pikkulapsia varten on yleisesti rajoissa noin 5-25 t mikrogrammaa tai noin 1-10 mikrogrammaa kehon painokiloa kohti.
5 Esimerkit
Keksintöä valaistaan seuraaavilla ei-rajoittavilla esimerkeillä. N-asetyyli-, N-propionyyli-, N-butanoyyli-, N-isobutanoyyli-, N-pentanoyyli- ja N-heksanoyyli-GBMP-proteiinikonjugaatit on valmistettu arvioimistarkoituksia varten, ja tuloksista on keskusteltu esimerkeissä.
10 Materiaalit ja menetelmät konjugaattien valmistamiseksi (a) Materiaalit
Propaani-, butaani-, isobutaani-, pentaani- ja heksaanihappoanhydridit yhdessä ko-lomiinihapon kanssa saatiin firmalta Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO, Yhdysvallat. Koska kolomiinihappo on rakenteeltaan identtinen ryhmän B meningokokki-15 polysakkaridin (GBMP) kanssa, siihen viitataan siten GBMPinä. Tetanustoksoidi (TT) saatiin Institut Armand Frappier'stä, Laval, Quebec, ja sen monomeerinen muoto, jota käytettiin kaikissa konjugaatioissa, saatiin laittamalla edellä oleva valmiste Βίο-Gel (tavaramerkki) A 0,5 (200-400 seula) -kolonnin (1,6 x 90 cm) (Bio-Rad, Richmond, CA., Yhdysvallat) läpi, tasapainotettiin ja eluoitiin 0,01 M fosfaat-20 tipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS) (pH 7,4).
(b) GBMP: n N-deasetylointi GBMP (Na+-suola) (1,0 g) liuotettiin 5 mhaan 2 M NaOH:ta ja NaBRi:n (150 mg) lisäämisen jälkeen liuosta kuumennettiin 110°C:ssa 6 tuntia kierrekorkillisessa Teflon (tavaramerkki) -säiliössä (60 ml). Tämä menettely on oleellisesti kuvattu 25 viitejulkaisussa J. Immunol.. 134, 2651 (1985) ja US-patentissa 4 727 136, molemmat nimellä Harold J. Jennings, et ai. Jäähdytettyä laimennettua liuosta sitten dia- lysoitiin voimakkaasti tislattua vettä vasten 4 °C:ssa ja lyofilisoitiin. Se tosiseikka, * _ että saatiin N-deasetyloitu GBMP, määritettiin metyyliasetamidosignaalin (singletti deltassa 2,07) N-deasetyloidun GBMP:n *H NMR-spektrissä, puuttumisen kautta.
8 104539 (c) GBMP:n N-asyloinnit N-asetyloitu GBMP (1,0 g) liuotettiin 50 ml:aan 5 % NaHC03-vesiliuosta. Viiteen yksittäiseen osaan (10 ml edellä olevaa liuosta) lisättiin joko propaani-, butaani-, isobutaani-, pentaani- tai heksaanihappoanhydridiä. Näitä reagensseja lisättiin 3 x 5 0,5 ml:n osissa 3 tunnin ajanjakson aikana huoneenlämpötilassa, samalla kun liuok sen pH:ta pidettiin 8,0:ssa 0,5 N NaOH:lla. Metanolia (0,5 ml) lisättiin samanaikaisesti kunkin anhydridin lisäyksen aikana niiden liukoisuuden kasvattamiseksi. Lopuksi liuoksia sekoitettiin 16 tuntia 4 °C:ssa, dialysoitiin voimakkaasti tislattua vettä vasten 4 °C:ssa ja lyofilisoitiin. Yksittäiset N-propionyloitu, N-butanoyloitu, N-iso-10 butanoyloitu, N-pentanoyloitu ja N-heksanoyloitu GBMP:t saatiin kaikki yli 90 %:n saannoissa. Kussakin tapauksessa oleellisesti täydellinen N-asylointi varmistettiin vastaavan N-deasetyloidun GBMP:n NMR-spektrissä häviämisellä.
(d) Erilaisten N-asyloitujen GBMPeiden fragmenttien koonmukainen erottelu
Geelisuodatusta, käyttämällä Ultragel (tavaramerkki) AcA 44 (helmen halkaisija 60-15 140 pm) -kolonnia (IBF Biotechnics, Savage, MD.) PBS eluenttina käytettiin halu tun keskimääräisen molekyylipainon N-asyloidun GBMP-aineen saamiseksi. Fraktiot, jotka eluoituvat kolonnista KD:ssä 0,5-0,7 mitattuna FLPC:llä (katso jäljempänä) kerättiin, dialysoitiin ja lyofilisoitiin. Tämä Ko-arvojen alue vastaa N-asyloitua GBMP:tä, jossa on arviolta 30-50 sylkihappotähdettä (10 000 - 15 000 daltonin, 20 tyypillisesti 12 000 daltonin keskimääräinen molekyylipaino). Fraktiot KD-rajoissa 0,2-0,4 vastaavat fragmentteja, joiden molekyylipaino on rajoissa 30 000 - 40 000 daltonia, on myös kerätty ja konjugoitu. Siten N-asyloitu aine, joka eluoituu Ko-alueella 0,2-0,7, on erityisen mielenkiinnon kohteena.
(e) Polysakkaridikonjugaatit 25 Terminaaliset aldehydiryhmät liitetään N-asyloituun GBMP:hen perjodaattihapetuk-sella (katso US-patentti 4 356 170). Sitten N-asyloitu GBMP-fragmentti edeltä hapetettiin 0,1 M NaKVvesiliuoksella (natriummetaperjodaatti) (10 ml) 2 tuntia huoneenlämpötilassa pimeässä. Perjodaatin ylimäärä tuhottiin sitten lisäämällä 1 ml ety-leeniglykolia ja sitten liuos dialysoitiin 4 °C:ssa ja lyofilisoitiin. NaBH^n käyttö N-30 deasetylointimenetelmässä (paitsi GBMP:lle) tuottaa terminaalisten pelkistävien sylkihappotähteiden kussakin N-asyloidussa GBMP:ssä, transformaation, jotta avataan ketjun polyolitähteet. Tämän tyyppinen tähde on perjodaattiherkkä (katso J. Immunol., 127, 1011 (1981) ja US-patentti 4 356 170, Harold J. Jennings et ai.), <i 4 9 104539 siten saadaan aikaan aldehydiryhmien liittäminen N-asyloituihin GBMP-fragment-teihin kussakin päässä.
Hapetetut fragmentit (100 mg) liuotettiin 0,1 M NaHCC>3 (pH 8,1) puskuriin ( 2 ml) : ja TT:tä (20 mg) lisättiin liuokseen. Lopuksi natriumsyanoboorihydridin 5 (NaCNBH3) (40 mg) lisäämisen jälkeen liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa. Konjugaation tekoa seurasi FPLC käyttämällä geelisuodatuskolonnia, joka sisälsi Superosea (tavaramerkki) 12 HR10/30 (Pharmacia), ajettiin isokraattisesti 1 ml/min:ssa PBS-puskurissa pH7,2, sekä proteiinilla että N-asyloiduilla GBMP-frag-menteilla oli KD 0,6, TT:llä oli Kd 0,39 ja konjugaateilla oli KD 0,23. Konjugaatio 10 oli täydellinen, kun kaikki TT oli kehittynyt, kuten määritettiin piikin puutteesta FPLC-kromatogrammissa, joka vastaa komponenttia KD:ssä 0,39. Useimmissa tapauksissa konjugaatiot olivat täydellisiä 2 päivässä, mutta niiden annettiin olla paikallaan 4 päivän kokonaisreaktioajan. Mahdolliset reagoimattomat aldehydiryhmät pelkistettiin lopuksi natriumboorihydridillä (20 mg) ennen geelisuodatusta.
15 Polysakkaridi-TT-konjugaatit erotettiin polysakkaridifragmenteista geelisuodatuk-sella käyttämällä Bio Gel A -kolonnia ja PBS eluenttina. Eluaatti, joka sisälsi konju-gaatin, dialysoitiin tislattua vettä vasten ja lyofilisoitiin. N-asyloidut GBMP-TT-konjugaatit, jotka sisälsivät 12-30 %, tyypillisesti 12-20 % sylkihappoa, kuten määritetty resorsinolimenetelmällä, joka on kuvattu viiteeessä Svennerholm, L., Quanti-20 tative Estimation of Sialic Acids, II A Colorimetric Resorcinol-Hydrochlorid Acid Method, Biochim, Biopvs. Acta. 24, 604 (1957). Tämä osoittaa, että konjugaateilla oli polysakkaridin moolisuhde TT:hen 2-3 : 1 vastaavasti.
• Immunisaatio ja immunomääritys (a) Immunisaatiomenetelmät 25 Kaksikymmentä naaraspuolista valkoista CFI-hiirtä (8-10 viikkoa vanhoja) immunisoitiin vatsakalvonsisäisesti (3 kertaa 3 viikon välein) kullakin yksittäisellä N-asy-loidulla GBMP-TT-konjugaatilla Freundin täydellisessä apuaineessa (FCA) (Difco, Detroit, MI.). Kukin immunisaatio sisälsi riittävästi konjugaattia (10-12 pg) 2 pg sylkihapon sisällyttämiseksi. Yksitoista päivää kolmannen injektion jälkeen hiiriltä 30 otettiin verta. Seerumilla tehtiin seuraavat kokeet.
(b) Radioaktiivisen antigeenin sitoutumisen määritys Tämä määritys suoritettiin muunnellulla Farr-tekniikalla käyttämällä ulkoista [3H]-merkattua GBMP:tä (Jennings H. J., et ai., Determinant Specificities of the Groups 10 104539 B and C polysaccharides of Neisseria meningitidis. J. Immunol, 134, 2651 81985), tai [3H]-merkattua N-Pr-GBMP:tä (Jennings H. J., et al., Unique intermolecular Bactericidal Epitope involving the Homo-Sialo Polysaccharide Capsule on the cell Surface of Group B Neisseria meningitidis and Escherichia coli Kl, J. Immunol..
5 142, 3585-3591 (1989)). Reaktioseos radioaktiivisen antigeenin sitoutumisen määri tystä varten saatiin sekoittamalla Eppendorf-polypropyleenimikrokoeputkissa 20 μΐ yhdistettyjä antiseerumeita 20 hiiren, jotka oli imunisoitu kullakin yksittäisellä N-asyloidulla GBMP-TT-konjugaatilla, ryhmistä, laimennettuna 100 pl:aan PBS:llä, [3H]-merkatun GBMP:n ja [3H]-merkatun N-Pr-GBMP:n kanssa 50 pl:ssa PBS:ää.
10 4 °C:ssa 16 tunnin inkuboimisen jälkeen lisättiin 150 μΐ kylläistä (4 °C:ssa) ammo- niumsulfaattia (pH 7,0) putkiin ja putkia sekoitettiin ja jätettiin seisomaan 4 °C:ssa 30 minuutiksi. Putket sentrifugoitiin 15 000 rpm:ssä 10 minuuttia ja kaksi 130 μ!:η osaa otettiin putkista. Näytteet sekoitettiin 2 ml.n kanssa vettä ja tuikeainetta sisältävää ksyleeniä (ACS, vesipitoinen tuikeaine) ja seokset laskettiin nestetuikelaski-15 messa. Tulokset on annettu taulukossa 1.
Taulukko 1 [3H]-merkatun N-Ac-GBMP:n sitoutuminen erilaisiin hiiren anti-N-asyyli-GBMP-TT -konjugaattiseerumeihin.
Antiseerumi % sitoutuminen" 12 3 4 N-Pr-GBMP-TT 41 40 39 12 N-Bu-GBMP-TT 4 4 7 4 N-IsoBu-GBMP-TT 9 - - - N-Pen-GBMP-TT 36 N-Hex-GBMP-TT 16 20 8 Neljä sitoutumiskoetta suoritettiin yhdistetyissä antiseerumeissa 20 immunoi- dusta hiirestä.
i I m
Taulukossa 1 ja muissa taulukoissa käytetyt lyhenteet: N-Ac-, N-Pr-, N-Bu-, N-IsoBu-, N-Pen-, N-Hex- merkitsevät N-asetyyliä, N- « propionyyliä, N-butanoyyliä, N-isobutanoyyliä, N-pentanoyyliä ja N-heksanoyyliä. 1
Lukuarvot 1, 2, 3 ja 4 ovat neljän toistetun kokeen tuloksia. Taulukko 1 osoittaa ratkaisevasti, että N-Ac-GBMP (jolla on sama epitooppi kuin sikiön N-CAM:lla) sitoutuu vähemmän antiseerumiin, joka on indusoitu N-Bu-GBMP:llä, N-IsoBu- 104539 π GBMP:llä, N-Pen-GBMP:llä ja N-Hex-GBMP:llä, kuin n-PR-GBMP:llä indusoitu. Tästä ja taulukosta 1 voidaan päätellä, että N-Bu-, N-IsoBu-, N-Pen- ja N-Hex -polysakkaridikonjugaatit lisäävät vähemmän ristireaktiivisia vasta-aineita kuin N-
V
Pr-konjugaatti.
5 (c) Kvantitatiivinen saostusanalyysi Nämä kokeet suoritettiin viitteen Kabat ja Mayer, Experimental Immunochemistry, Charles C. Thomas, Springfield, s. 22 (1961) menetelmän mukaisesti. Anti-N-asyy- li-GBMP-TT-seerumien (laimennettuna 5 kertaa PBS:ään) osat (100 μΐ) saatettiin reagoimaan putkissa kasvavien N-asetyyli (kolomiinihappo)-, N-propionyyli-, N-10 butanoyyli-, N-isobutanoyyli-, N-pentanoyyli-ja N-heksanoyyli-GBMP:n konsent-raatioiden kanssa 200 μ1:η kokonaistilavuudessa (säädetty PBS:llä). Näiden johdannaisten suurempia moleyylipainofraktioita käytettiin näissä kokeissa ja ne saatiin Ultragel AcA 44 -kolonnin (KD 0,4 kuten mitattu FPLC.llä) eluaatista, jota aikaisemmin käytettiin N-asyloitujen GBMP:iden fragmenttien koon määrittämiseen. 15 Putkia inkuboitiin 4 °C:ssa 4 päivää päivittäin sekoittamalla, sentrifugoimalla, ja vasta-aineproteiinin määrä määritettiin viitteen Lowry et ai., Protein Measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 1933, 265 (1951) menetelmän mukaisesti. Tulokset on annettu taulukossa 2.
Taulukko 2 20 Hiiren anti-N-asyyli-GBMP-TT -seerumien saostaminen8 käyttämällä erilaisia N-asyyli-GBMP:itä saostusaineina.
: Antiseerumi N-asyyli-GBMP -antigeeni N-asetyyli N-propyyli N-butyyli N-pentyyli N-heksyyli N-Pr-GBMP- 0,16 0,40 0,20 0,15 0,15
TT
N-Bu-GBMP- 0,04 1,15 2,60 3,20 1,90
TT
N-Pen-GBMP- 0,13 0,38 0,44 6,35 3,55
TT
N-Hex- 0,02 0,08 0,80 4,15 4,40
GBMP-TT
8 Saostuneen vasta-aineen maksimimäärä ilmaistuna mg/ml antiseerumia 12 104539
Viitaten ristireaktiivisuuteen, taulukon 2 ensimmäinen palsta osoittaa, että N-Bu- ja N-Hex-konjugaatit tuottavat hyvin vähän ristireaktiivisia vasta-aineita verrattuna N-Pr-konjugaatin tuottamiin. Voidaan myös havaita, että N-Pen-konjugaatti tuottaa vähemmän ristireaktiivisia vasta-aineita kuin N-Pr-konjugaatti.
5 Viitaten immunogeenisyyteen, homologisen vasteen termeissä voidaan nähdä taulukosta 2, että N-Bu- (2,60), N-Pen- (6,35) ja N-Hex- (4,40) GBMP-TT -konjugaatit ovat immunogeenisempiä kuin N-Pr-GBMP-analogi (0,40).
(d) ELISA
EIA-mikrotitrauslevyn kaivot (Flow Labs, Mississauga, Ontario, Kanada) päällys-10 tettiin 10 pg/ml:n joko GBMP-, N-Pr-GBMP- tai N-Bu-GBMP-BSA-konjugaattien liuoksella PBS:ssä (100 μΐ/kaivo). Levyt jätettiin 18 tunniksi 4 °C:seen ja päällystämisen jälkeen ne pestiin 1 %:lla naudan seerumin albumiinia PBSissä 10 minuuttia huoneenlämpötilassa (estovaihe). Sitten kaivot täytettiin 100 piillä sarjan anti-hiiri-N-asyyli GBMP-TT-konjugaattiseerumeiden 10 kertaisia laimennoksia PBSissä ja 15 inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa. SBTillä pesun jälkeen levyjä inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa 50 piin kanssa sopivaa vuohen antihiiri-immunoglobulii-nin peroksidaasimerkattujen konjugaattien laimennoksia (Kirkegard and Perry Laboratories), sitten kaivojen sisällöt aspiroitiin ja levyt pestiin viisi kertaa SBTillä. Lopuksi 50 μΐ tetrametyleenisini-peroksidaasisubstraattia (TMB) (Kirkegard and Perry 20 Laboratories) lisättiin kuhunkin kaivoon ja 10 minuutin jälkeen absorbanssi 450 nmissä mitattiin Multiscan-spektrofotometrissä (Flow Laboratories, Mississauga, Ont.). Tulokset on annettu taulukossa 3.
Taulukko 3
Yhdistetyn hiiren anti-N-asyyli-GBMP-TT-konjugaattiseerumin ELISA-titraukset 25 N-asyyli-GBMP-BSA-konjugaatteja vasten Päällysantigeeni Antiseerumien tiitterit a. N-Pr-GBMPb b. N-Bu-GBMPb a. N-IsoBu- GBMPb N-Ac-GBMP-B S A 7 800 1 000 7 000 N-Pr-GBMP-BSA 40 000 39 000 9 800 N-Bu-GBMP-BSA 26 000 52 000 9 700 N-IsoBu-GBMP-BSA - - 25 000 13 104539 8 tiitteri (GM) = laimennuksen käänteisarvo 50 %:ssa maksimista absorbanssi 450 nm.ssä * b N-asyyli-spesifiset antiseerumit indusoitiin hiirissä homologisilla N-asyyli- GBMP-TT -konjugaateilla.
5 Viitaten ristireaktiivisuuteen, niin taulukosta 3 voidaan nähdä, että N-Bu-GBMP-TT-konjugaatti nostaa vähemmän ristireaktiivisia vasta-aineita suhteessa N-Ac-GBMP:hen (1000), kuinN-Pr-GBMP-TT-konjugaatti (7800) tekee. Syy tähän on se, että GBMP sitoutuu vähemmän vasta-aineeseen, jonka on indusoinut N-Pr-GBMP-TT-konjugaatti, kuin se, jonka on indusoinut N-Bu-GBMP-TT-konjugaatiin. Saman-10 laiset kommentit ovat soveltuvia N-IsoBut-GBMP-TT-konjugaatin yhteydessä.
Immunogeenisuuteen viitaten N-Bu-konjugaatti on immunogeenisempi kuin N-Pr-analogi, kuten on näytetty homologisessa tiitterissä 52 000 (N-Bu) ja 40 000 (N-Pr).
(e) Radioaktiivisen sitoutumisen inhibition määritys
Kasvavia suuremman molekyylikoon N-asyyli-GBMP-inhibiittorin konsentraatioita 15 PBS:ssä (80 μΐ) lisättiin 20 pl.aan hiiren anti-N-Pr-GBMP-TT-konjugaatin antiseerumia määrä, joka on riittävä sitomaan 50 % (3H)-merkatusta N-Pr-GBMP:stä inhibiittorin puuttuessa. Putkia inkuboitiin 1 tunti 37 °C:ssa ja 50 μΐ (3H)-merkattua N-Pr-GBMP:tä PBS:ssä lisättiin. Varovaisen sekoituksen jälkeen putkia inkuboitiin 4 °C:ssa 16 tuntia ja määritykset suoritettiin tarkalleen samoin kuin aikaisemmin on 20 kuvattu radioaktiivisen antigeenin sitoutumismäärityksessä. %-inhibitio laskettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa: : Prosenttinen inhibitio = 100 x [(cpm inhibiittorin kanssa - cpm ilman inhibiitto- ria)/(cpm ilman vasta-ainetta - cpm ilman inhibiittoria)].
Tulokset on annettu taulukossa 4.
·> 3 · 14 104539
Taulukko 4 [3H]-merkatun N-Pr-GBMP:n hiiren anti-N-Pr-GBMP-TT-konjugaatti-indusoituihin IgG2a, IgG2b (A)a ja IgGj (B)a -vasta-aineisiin sitoutumisen inhibitio
Inhibiittori11 A B
N-Ac-GBMP >50,0 >50,0 N-Pr-GBMP 0,6 0,3 N-Bu-GBMP 0,3 0,2 N-IsoBu-GBMP >50,0 N-Pen-GBMP 2,3 2,5 N-Hex-GBMP 10,2 10,0 5 8 Nämä olivat hiiren polyklonaalisen anti-N-Pr-GBMP-TT-seerumin fraktioita, jotka on kuvattu viiteessä Jennings et ai., J, Immunol,. 142, 3585-3591 (1989). b Inhibiittorin mikrogrammat, jotka antoivat 50 %:n inhibition.
Bakteerimääritvkset Nämä määritykset suoritettiin viitteessä Jennings et ai., J. Exp. Med.. 165, 1207-1211 (1987) kuvatun menetelmän mukaisesti.
10 Neisseria meningitidis -kantaa B (M 986) käytettiin näissä analyyseissä. Tulokset on annettu taulukossa 5.
Taulukko 5 j [ H]-merkatun N-Pr-GBMP:n sitoutuminen erilaisiin hiien anti-N-asyyli-GBMP-TT -konjugaattiseerumeihin ja vastaavien antiseerumien bakterisidiset tiitterit.
Antiseerumi μΐ antiseerumia* bakterisidinen tiitterib N-Pr-GBMP-TT 13 128 N-Bu-GBMP-TT 10 64 N-IsoBu-GBMP-TT ei määr. 64 N-Pen-GBMP-TT 24 64 N-Hex-GBMP-TT >100 8 N-Ac-GBMP-TT >100 8 15 8 μΐ antiseerumia (laimenmnettu 5-kertaisesti PBS:llä), joka vaadittiin 50 %:n sitoutumiseen.
b Laimennuskoe: yhden laimennoksen ero, esimerkiksi 128 verrattuna 64:ään, on kokeellisen virheen rajoissa.
15 104539
Taulukko 4 valaisee, että N-Bu-GBMP on yhtä hyvä inhibiittori kuin N-Pr-GBMP jälkimmäisen sitoutumisessa sen omiin homologisiin vasta-aineisiin. Siten N-Bu-' GBMP:n käyttäminen N-Pr-GBMP:n tilalla ei aiheuta mitään merkittävää ominai suuksien, joita N-Pr-GBMP osoittaa, häviötä. Taulukko 5 valaisee, että N-Bu-5 GBMP sitoutuu yhtä hyvin kuin N-Pr-GBMP vasta-aineisiin, joita indusoi N-Pr-GBMP-TT-konjugaatti. Sekä N-Bu-GBMP-TT:n että N-Pr-GBMP-TT-konjugaat-tien indusoimat antiseerumit antoivat samanlaisia bakterisidisia tiittereitä. Tämä todiste osoittaa N-Bu-, N-isoBu- ja N-Pen-GBMP:n yhtäläisyyttä suhteessa N-Pr-GBMP:hen niiden kyvyssä matkia bakterisidisia epitooppia ryhmän B meningoko-10 kin pinnalla.
Claims (13)
16 104539
1. Menetelmä muunnellun Neisseria meningitidis ryhmä B polysakkaridin tai muunnellun E. coli K1 kotelomaisen polysakkaridin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että natiivin polysakkaridin sylkihappotähteen N-asetyyliryhmät korvataan C4-C8- 5 asyyliryhmillä ja muunnellulla polysakkaridilla on keskimääräinen molekyylipaino rajoissa 10 000 - 50 000 daltonia.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että C4-C8-asyyli-ryhmä valitaan joukosta, johon kuuluu n-butanoyyli, isobutanoyyli, n-pentanoyyli, n-heksanoyyli, n-heptanoyyli ja n-oktanoyyli.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asyyliryhmä valitaan joukosta, johon kuuluu n-butanoyyli, isobutanoyyli, n-pentanoyyli ja n-heksanoyyli.
4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asyyliryhmä on n-butanoyyli.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että noin 27- 100. sylkihappotähteen N-asetyyliryhmistä on korvattu C4-C8-asyyliryhmillä.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että noin 90-100 % sylkihappotähteen N-asetyyliryhmistä on korvattu C4-C8-asyyliryhmiIlä.
7. Menetelmä antigeenisen konjugaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 20 muunneltu Neisseria meningitidis ryhmän B polysakkaridi, jonka sylkihappotähteen N-asetyyliryhmä on korvattu N-C4-C8-asyyliryhmällä, konjugoidaan immunologises-ti sopivaan proteiiniin.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asyyliryhmä valitaan joukosta, johon kuuluu n-butanoyyli, isobutanoyyli, pentanoyyli, heksano- ( 25 yyli, heptanoyyli ja oktanoyyli. i
9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asyyliryhmä valitaan joukosta, johon kuuluu n-butanoyyli, isobutanoyyli, pentanoyyli ja heksa-noyyli. 1 Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asyyliryhmä 30 on n-butanoyyli. 104539
11. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini valitaan joukosta, johon kuuluu tetanustoksoidi, difteriatoksoidi, ristireagoiva materiaali - (CRM) ja bakteeriproteiinikantaja.
12. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini ja 5 polysakkaridi ovat kovalenttisesti liittyneet -CH2-NH-proteiinisidoksen kautta.
13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CRM on CRM197.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44819589A | 1989-12-14 | 1989-12-14 | |
| US44819589 | 1989-12-14 | ||
| PCT/CA1990/000437 WO1991008772A1 (en) | 1989-12-14 | 1990-12-13 | Improved meningococcal polysaccharide conjugate vaccine |
| CA9000437 | 1990-12-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI922737A0 FI922737A0 (fi) | 1992-06-12 |
| FI104539B true FI104539B (fi) | 2000-02-29 |
Family
ID=23779371
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI922737A FI104539B (fi) | 1989-12-14 | 1992-06-12 | Menetelmä muunnellun Neisseria meningitidis ryhmä B polysakkaridin tai muunnellun E. coli K1 kotelomaisen polysakkaridin valmistamiseksi |
| FI991917A FI19991917A (fi) | 1989-12-14 | 1999-09-09 | Parannettu meningokokki-polysakkaridikonjugaattirokote |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI991917A FI19991917A (fi) | 1989-12-14 | 1999-09-09 | Parannettu meningokokki-polysakkaridikonjugaattirokote |
Country Status (30)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5576002A (fi) |
| EP (1) | EP0504202B1 (fi) |
| JP (1) | JP2637845B2 (fi) |
| KR (1) | KR0158436B1 (fi) |
| CN (4) | CN1049223C (fi) |
| AR (1) | AR243934A1 (fi) |
| AT (1) | ATE121947T1 (fi) |
| AU (1) | AU641715B2 (fi) |
| BR (1) | BR9007917A (fi) |
| CA (1) | CA2071811C (fi) |
| CZ (1) | CZ283530B6 (fi) |
| DE (1) | DE69019164T2 (fi) |
| DK (1) | DK0504202T3 (fi) |
| ES (1) | ES2071288T3 (fi) |
| FI (2) | FI104539B (fi) |
| HR (1) | HRP920872A2 (fi) |
| HU (2) | HU9201966D0 (fi) |
| IE (1) | IE68414B1 (fi) |
| IL (1) | IL96676A (fi) |
| IN (1) | IN171747B (fi) |
| NO (2) | NO305275B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ236471A (fi) |
| PH (1) | PH30305A (fi) |
| PL (2) | PL166659B1 (fi) |
| RO (1) | RO111416B1 (fi) |
| RU (1) | RU2105568C1 (fi) |
| SI (1) | SI20008B (fi) |
| WO (1) | WO1991008772A1 (fi) |
| YU (1) | YU24391A (fi) |
| ZA (1) | ZA9010065B (fi) |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5648241A (en) * | 1989-09-15 | 1997-07-15 | The General Hospital Corporation | Conjugate vaccine against group B streptococcus |
| AU641715B2 (en) * | 1989-12-14 | 1993-09-30 | National Research Council Of Canada | Improved meningococcal polysaccharide conjugate vaccine |
| ES2160601T3 (es) * | 1992-09-24 | 2001-11-16 | Brigham & Womens Hospital | Vacunas de conjugado de polisacaridos de estreptococos del grupo b tipo ii y tipo v-proteina. |
| US5439808A (en) * | 1993-07-23 | 1995-08-08 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis |
| US6153406A (en) * | 1993-07-23 | 2000-11-28 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane protein P2 from Haemophilus influenzae type B |
| US5700787A (en) * | 1994-09-02 | 1997-12-23 | Brigham & Women's Hospital, Inc. | Capsular polysaccharide immunomodulator |
| US5679654A (en) * | 1994-09-02 | 1997-10-21 | Brigham & Women's Hospital, Inc. | Capsular polysaccharide immunomodulator |
| US5747287A (en) * | 1995-04-28 | 1998-05-05 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis |
| EP1090642B8 (en) * | 1995-06-07 | 2010-08-11 | GlaxoSmithKline Biologicals s.a. | Vaccines comprising a polysaccharide antigen-carrier protein conjugate and free carrier protein |
| US5811102A (en) | 1995-06-07 | 1998-09-22 | National Research Council Of Canada | Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines |
| US6284884B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-09-04 | North American Vaccine, Inc. | Antigenic group B streptococcus type II and type III polysaccharide fragments having a 2,5-anhydro-D-mannose terminal structure and conjugate vaccine thereof |
| ZA97248B (en) * | 1996-01-18 | 1997-07-18 | Rohm & Haas | Method for identifying and quantifying polymers utilizing immunoassay techniques |
| ATE252602T1 (de) | 1996-08-27 | 2003-11-15 | Chiron Corp | Meningokokkus b-epitop ausbildende monoklonale antikoerper und deren verwendung zur herstellung von impfstoffzusammenstellungen |
| ATE208629T1 (de) | 1996-08-27 | 2001-11-15 | Chiron Corp | Neisseria meningitidis serogruppe b glykokonjugate und verfahren zu deren verwendung |
| US6426074B1 (en) * | 1997-03-19 | 2002-07-30 | The Brigham And Women's Hospital Inc. | Group B Streptococcus vaccine |
| EP0994723A1 (en) | 1997-06-24 | 2000-04-26 | Chiron Corporation | Methods of immunizing adults using anti-meningococcal vaccine compositions |
| PT1630168E (pt) | 1997-08-27 | 2011-07-20 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Compostos miméticos moleculares de péptidos de meningococos do serogrupo b |
| ES2611464T3 (es) | 1997-12-23 | 2017-05-09 | Pfizer Ireland Pharmaceuticals | Polisacárido capsular bacteriano para su uso como vacuna o para su unión a proteínas en vacunas de conjugados |
| NZ509986A (en) * | 1998-08-19 | 2003-10-31 | Baxter Healthcare S | Immunogenic beta-propionamido-linked polysaccharide and oligosaccharide protein conjugates as vaccines |
| US6436653B1 (en) | 1998-12-15 | 2002-08-20 | Exiqon A/S | Method for introduction of reporter groups into bacterial lipopolysaccharide-derived carbohydrates and the subsequent coupling of such derivatives onto solid surfaces |
| US7083777B1 (en) * | 1999-04-02 | 2006-08-01 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Immunomodulating polymers |
| US6518037B2 (en) * | 1999-11-12 | 2003-02-11 | University Of Iowa Research Foundation | Two-component system that controls bacterial membrane synthesis |
| GB9928196D0 (en) * | 1999-11-29 | 2000-01-26 | Chiron Spa | Combinations of B, C and other antigens |
| SV2003000753A (es) | 2000-12-05 | 2003-06-16 | Brigham & Womens Hospital | Uso de polisacaridos zwitterionicos para la especifica modulacion del progreso inmunologico |
| RU2322451C2 (ru) | 2001-04-17 | 2008-04-20 | Новартис Вэксинс Энд Диагностикс, Инк. | Молекулярные миметики эпитопов менингококка в, которые вызывают выработку функционально активных антител |
| GB0115176D0 (en) * | 2001-06-20 | 2001-08-15 | Chiron Spa | Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines |
| GB0121591D0 (en) * | 2001-09-06 | 2001-10-24 | Chiron Spa | Hybrid and tandem expression of neisserial proteins |
| AR045702A1 (es) | 2001-10-03 | 2005-11-09 | Chiron Corp | Composiciones de adyuvantes. |
| DK1490409T3 (da) * | 2002-03-26 | 2009-03-23 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Modificerede saccharider med forbedret stabilitet i vand |
| WO2004089407A2 (en) * | 2003-03-31 | 2004-10-21 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Zwitterionic immunomodulators for the treatment of asthma and allergy |
| US7731967B2 (en) | 2003-04-30 | 2010-06-08 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Compositions for inducing immune responses |
| JP4566194B2 (ja) | 2003-08-12 | 2010-10-20 | リポクセン テクノロジーズ リミテッド | タンパク質の誘導体化及び結合のためのシアル酸誘導体 |
| WO2006002402A2 (en) | 2004-06-23 | 2006-01-05 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Polysaccharide derivatives and uses in induction of an immune response |
| US8148335B2 (en) | 2004-06-23 | 2012-04-03 | Children's Hospital & Research Center Oakland | De-N-acetyl sialic acid antigens, antibodies thereto, and methods of use in cancer therapy |
| GB0428394D0 (en) * | 2004-12-24 | 2005-02-02 | Chiron Srl | Saccharide conjugate vaccines |
| US8329184B2 (en) | 2005-06-27 | 2012-12-11 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Process for manufacturing vaccines |
| US8206726B2 (en) | 2006-02-06 | 2012-06-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Zwitterionic polysaccharides for promotion of immune system maturation and health |
| GB0611914D0 (en) | 2006-06-15 | 2006-07-26 | Teti Giuseppe | Peptides that mimic non-human cross-reactive protective epitopes of the group Bmeningococcal capsulsar polysaccharide |
| EP1872791A1 (en) | 2006-06-30 | 2008-01-02 | Institut Pasteur | Use of bacterial polysaccharides for biofilm inhibition |
| US20100189740A1 (en) * | 2007-06-20 | 2010-07-29 | Francis Michon | Modified polysaccharides for conjugate vaccines |
| ES2664753T3 (es) | 2007-12-07 | 2018-04-23 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Composiciones de inducción de respuestas inmunes |
| WO2010083477A2 (en) | 2009-01-16 | 2010-07-22 | University Of Maryland, Baltimore | Broad spectrum vaccine against non-typhoidal salmonella |
| WO2013009945A1 (en) | 2011-07-12 | 2013-01-17 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Lipid-containing psa compositions, methods of isolation and methods of use thereof |
| EP2752403A1 (de) * | 2013-01-08 | 2014-07-09 | Sika Technology AG | Amin für emissionsarme Epoxidharz-Produkte |
| WO2017031431A1 (en) | 2015-08-19 | 2017-02-23 | President And Fellows Of Harvard College | Lipidated psa compositions and methods |
| US11491181B2 (en) | 2016-07-15 | 2022-11-08 | President And Fellows Of Harvard College | Glycolipid compositions and methods of use |
| PE20191107A1 (es) * | 2017-01-31 | 2019-08-26 | Pfizer | Composiciones de neisseria meningitidis y metodos respectivos |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4057685A (en) * | 1972-02-02 | 1977-11-08 | Abbott Laboratories | Chemically modified endotoxin immunizing agent |
| US4356170A (en) * | 1981-05-27 | 1982-10-26 | Canadian Patents & Development Ltd. | Immunogenic polysaccharide-protein conjugates |
| US4673574A (en) * | 1981-08-31 | 1987-06-16 | Anderson Porter W | Immunogenic conjugates |
| US4644059A (en) * | 1982-07-06 | 1987-02-17 | Connaught Laboratories, Inc. | Haemophilus influenzae B polysaccharide-diptheria toxoid conjugate vaccine |
| US4619828A (en) * | 1982-07-06 | 1986-10-28 | Connaught Laboratories, Inc. | Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines |
| US4496538A (en) * | 1982-07-06 | 1985-01-29 | Connaught Laboratories, Inc. | Haemophilus influenzae b polysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccine |
| US4695624A (en) * | 1984-05-10 | 1987-09-22 | Merck & Co., Inc. | Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency |
| US4727136A (en) * | 1985-10-01 | 1988-02-23 | Canadian Patents And Development Ltd. | Modified meningococcal group B polysaccharide for conjugate vaccine |
| AU641715B2 (en) * | 1989-12-14 | 1993-09-30 | National Research Council Of Canada | Improved meningococcal polysaccharide conjugate vaccine |
-
1990
- 1990-12-13 AU AU68987/91A patent/AU641715B2/en not_active Ceased
- 1990-12-13 RO RO92-0789A patent/RO111416B1/ro unknown
- 1990-12-13 HU HU9201966A patent/HU9201966D0/hu unknown
- 1990-12-13 RU SU5052391A patent/RU2105568C1/ru active
- 1990-12-13 HU HU9201966A patent/HU218146B/hu unknown
- 1990-12-13 BR BR909007917A patent/BR9007917A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-12-13 AT AT91900142T patent/ATE121947T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-12-13 CA CA002071811A patent/CA2071811C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-13 DE DE69019164T patent/DE69019164T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-13 KR KR1019920701403A patent/KR0158436B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-12-13 DK DK91900142.0T patent/DK0504202T3/da active
- 1990-12-13 WO PCT/CA1990/000437 patent/WO1991008772A1/en active IP Right Grant
- 1990-12-13 EP EP91900142A patent/EP0504202B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-13 ES ES91900142T patent/ES2071288T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-13 JP JP3500908A patent/JP2637845B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-14 IL IL9667690A patent/IL96676A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-12-14 CN CN90110444A patent/CN1049223C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-14 SI SI9110243A patent/SI20008B/sl not_active IP Right Cessation
- 1990-12-14 AR AR90318627A patent/AR243934A1/es active
- 1990-12-14 PL PL90302476A patent/PL166659B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-12-14 IN IN1033/CAL/90A patent/IN171747B/en unknown
- 1990-12-14 ZA ZA9010065A patent/ZA9010065B/xx unknown
- 1990-12-14 IE IE451390A patent/IE68414B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-12-14 YU YU24391A patent/YU24391A/sh unknown
- 1990-12-14 PL PL90288271A patent/PL166035B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-12-14 PH PH41724A patent/PH30305A/en unknown
- 1990-12-14 NZ NZ236471A patent/NZ236471A/en unknown
- 1990-12-14 CZ CS906284A patent/CZ283530B6/cs unknown
-
1992
- 1992-06-12 FI FI922737A patent/FI104539B/fi active
- 1992-06-12 NO NO922316A patent/NO305275B1/no unknown
- 1992-10-02 HR HRP-243/91A patent/HRP920872A2/hr not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-11-22 CN CN93114764A patent/CN1072506C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1993-11-22 CN CN93119467A patent/CN1036504C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1993-11-22 CN CN93114763A patent/CN1036522C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-05-05 US US08/238,600 patent/US5576002A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/485,623 patent/US5683699A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-07-17 NO NO973311A patent/NO307835B1/no unknown
- 1997-10-17 US US08/953,771 patent/US5902586A/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-09-09 FI FI991917A patent/FI19991917A/fi unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI104539B (fi) | Menetelmä muunnellun Neisseria meningitidis ryhmä B polysakkaridin tai muunnellun E. coli K1 kotelomaisen polysakkaridin valmistamiseksi | |
| JP4656728B2 (ja) | ブドウ球菌抗原及びワクチン | |
| US6756361B1 (en) | Enterococcus antigens and vaccines | |
| US6350449B1 (en) | Antibodies to meningococcal polysaccharide conjugate vaccines |