JPH05505392A - 修飾メニンゴコツクス多糖複合ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 修飾メニンゴコックス多糖複合ワクチン本発明は、ナイセリア　メニンギチジス の化学−修飾Ｂ群多糖を目的とする。本発明は又、各修飾多糖を蛋白質キャリヤ ーに複合させたワクチンを提供する。

世界における主要な健康上の問題として残っている。Ｂ群髄膜炎は、−地方流行 的及び一般流行的状況の両方で起こり、記録されているすべての流行性層を髄膜 炎の症例の約半分に上り、一方に１−陽性Ｅ、コリは、新生児の髄膜炎の主要な 原因である。現在、Ｂ群メニンゴコックス及びＥ、コリに１によって起こる病気 に対する、商業的に入手可能なワクチンはない。この大きな理由は、Ｂ群メニン ゴコックス多糖（ＧＢＭＰ）のヒトにおける免疫原性が低いことである。ＧＢＭ Ｐと外層膜蛋白質の複合体に基づくワクチン候補が、最近いくつか報告されてい るが、ヒトにおけるその有効性に対する明確な証明はまだない。

最近、合成化学修飾（Ｎ−プロピオニル化）８群多糖−蛋白質（Ｎ−Ｐｒ−ＧＢ ＭＰ−蛋白質）に基づ（ワクチンの新規概念が開発された。

ワクチンは、保護的であるばかりでな（非修飾ＣＢＭＰ　（すなわちＮ−アセチ ル−ＧＢＭＰ）と交叉反応性でもある高力価のＩｇＧ抗体をマウス中に誘起する 。この概念は、１９８８年２月２３日にＨａｒｏｌｄＪ、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ等に 与えられたＵ、Ｓ、特許４，７２７．１３６に記載され、フレイムされている。

Ｕ、　Ｓ、特許４，７２７．１３６に記載れさているような交叉反応性抗体を誘 起するワクチンは、免疫トレランスの破壊という犠牲においてのみ成功すると思 われてきた。この仮定は、本来のＮ−Ａｃ−ＧＢＭＰ及びヒトならびに動物組織 の両方において、α−（２−８）−結合シアル酸残基（１０残基中最低要求）の 鎖を含む共通エピトープを同定したことにより正当性が認められている（Ｊｅｎ ｎｉｎｇＬ　Ｃｏｎｔｒｉｂ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｂａ５ｅ ｌ、Ｋａｒｇｅｒ。

１９８９、Ｖｏｌ、１０．１５１−１６５）、　これらのポリシフ０シル鎖は発 生抗原として機能し、はとんどの場合神経胚細胞の胎児期癒着を伴ってきた（Ｆ ｉｎｎｅ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、、１９８３，１１２．４８２）、後天的成熟の間にこの抗原はダ ウンレギュレーションされるが（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ等、１．４８１）に腫 瘍細胞（Ｒｏｔｈ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。

の胎児抗原に対する耐性の破壊の結果はまだ確立されていないが、この交叉反応 性のためにＮ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ−蛋白質複合体は認可機関により綿密に検査され 、ワクチンの安全性を証明するのに必要な複雑な実験のために、商業的生産の認 可までにはかなりの出資があり、遅れる。

Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ−蛋白質の免疫原性と比較して強化された免疫原性を有する ワクチンの開発が、本発明の目的である。実質的にＧＢＭＰとの交叉反応性が減 少したワクチンの提供も本発明の目的である。

発明の要約 本発明のひとつの特徴において、シアル酸残基Ｎ−アセチル（Ｃ２）基がＣ，− Ｃ・アシル基により置換された、ナイセリア　メニンギチジスの修飾Ｂ多糖を提 供する。

他の特徴として、免疫学的に適した蛋白質と複合させたＮ−ｃ、−ｃ。

アシル多糖を含み、免疫原性が強化され、交叉反応性抗体の誘起が実質的に減少 した抗原複合体を提供する。

さらに別の特徴として、適したキャリヤー又は希釈剤と共にＮ−Ｃ４−Ｃ８アシ ル多糖−蛋白質複合体を含むワクチンを提供する。本発明のワクチンは、ヒトに 使用するのに適した治療有効量の補薬、例えばリン酸アルミニウム又は水酸化ア ルミニウムを含むこともできる。

さらに別の特徴として、Ｎ、メニンギチジス及びＥ、コリに１感染に対して哺乳 類を免疫感作する方法を提供する。その方法は、そのような感染にあい易い、ヒ トを含む哺乳類に免疫学上有効量の本発明のワクチンを非経口的に投与すること を含む。ワクチンは典型的に、体重１キログラム当たり約１−５０マイクログラ ム、例えば体重１キログラム当たり５−２５マイクログラムの量で投与する。

さらにもうひとつの特徴として本発明は、Ｂ群Ｎ、メニンギチジス及びＥ、コリ に１によって起こる髄膜炎に対する保護の可能なガンマグロブリン留分を提供す る。留分は、本発明のワクチンを用いて哺乳類を免疫感作することにより製造す る。その後留分を患者に投与し、上記生物により起こる感染に対する保護を与え 、又は進行中の感染症を治療する。

このことから、これらの好ましい免疫原性及びＧＢＭＰ交叉反応性抗体の誘起が 最小であることを考えると、本発明の免疫原性ワクチン複合体は、治療血清の供 給源となることが良くわかるであろう。本発明の複合体は単クローン性抗体、及 びおそらくアンチジオタイプ抗体の誘起にも有用であろう。

最近の我々の実験で、上記のＪｅｎｎ　ｉｎｇｓ等、Ｕ、Ｓ　特許４゜７２７． １３６に記載のＮ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ−蛋白質複合体によッテ起こるほとんどの殺 細菌性及び保護抗体は、ＧＢＭＰ交叉反応性抗体を伴わないことを見いだした。

実際にほとんどの保護活性は、ＧＢＭＰと交叉反応しないＮ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ− 特異的抗体集団に含まれる。この観点から、Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰがＢ群メニンゴ コックスの表面上の独特の殺細菌性エピトープを模倣すると思われる。

本発明は、殺細菌性エピトープを模倣し、その複合体の形態で免疫原性が強化さ れるばかりでな（、ＧＢＭＰと交叉反応する抗体の誘起を実質的に避けることが できる化学的修飾ＧＢＭＰの合成が可能であるという発見に基づいている。

本発明に到達する際に、多種類の化学修飾ＣＢＭＰを合成し、それぞれ蛋白質と 複合させ、その後複合体をマウスに注射してその効果をＮ−Ｐｒ−ＣＢＭＰ蛋白 質複合体による効果と比較した。驚くべきことに、Ｎ　Ｃ＜　ＣｓアシルＧＢＭ Ｐ−蛋白質複合体、例えばｎ−ブタノイル、イソ−ブタノイル、ｎ−ペンタノイ ル、イソ−ペンタノイル、ネオ−ペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル及 びオクタノイル、ならびに特にＮ−ブタノイル（Ｎ−Ｂｕ）　ＧＢＭＰ−蛋白質 複合体が、実質的に殺細菌性エピトープを模倣し、交叉反応性抗体の誘起を実質 的に減少させることを見いだした。

の方法で単離する。そのような方法のひとつにおいて、Ｂ群メニンゴコックス（ 株９８１Ｂ）を、蒸留水１リツトル当たり３０ｇの脱水ＴｏｄｄＨｅｗｉｔｔ　 Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｄｅｔｒｏｉ　ｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を用いて３７℃の発酵器中で成育した。

発酵器成育の前に、凍結乾燥した株を最初に３７℃のキャンドルジャー中、５％ （ｖ／ｖ）の５ｈｅｅｐｓ’　Ｂｌｏｏｄ　Ａｇａｒ　（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）プレート上で成育した 。その後細菌を、三角フラスコ中の１．０リツトルのＴｏｄｄ　Ｈｅｗｉｔｔ　 Ｂｒｏｔｈ（上記と同様）に移し、フラスコを３７℃にて７時間、１９０ｒｐｍ で振った。この接種材料をその後発酵器に移した。発酵器成育の後（１６時間） 、ホルマリンを最終濃度０．７５％まで加えることにより細菌を殺した。連続遠 心により細菌を除去し、上澄みからＢ群メニンゴコックス多糖を単離し、粗多糖 の溶液を熱（５０−６０℃）フェノールの代わりに９０％の冷（４℃）フェノー ルと共に撹拌して蛋白質を抽出する以外は基本的にＢｕｎｄ　１０等、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４９．４７９７−４８０１　（１９７４）に記載の方法で 精製した。この後者の方法は、高分子量のＧＢＭＰの製造を確実にする。

Ｅ、コリ（０１８：Ｋｌ：Ｈ７）（ＮＲＣＣ４２８３）は、３７℃の発酵器にて 脱水Ｂｒａｉｎ　Ｈｅａｒｔ　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ　（ＢＨＩ：３７ｇ／リットル ）　（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｏｒｏｉ　ｔ、Ｍｉｃｈ ｉｇａｎ）を含む蒸留水中で成育した。発酵器成育の前に、凍結乾燥した株を三 角フラスコ中の５０ｍ１のＢＨＩ（上記と同様）上で成育し、フラスコを３７℃ にて７時間、２０Ｏｒｐｍで振った。この成育株をその後１．５リツトルのＢＨ Ｉ（上記と同様）に移し、上記と同様の条件下で７時間成育した。接種材料をそ の後発酵器に移した。

Ｅ、コリに１の莢膜多糖の単離精製に用いた方法は、Ｂ群メニンゴコックス多糖 の単離に関して上記で記載した方法と同一である。

上記の単離精製法が使用できる唯一の方法ではなく、他の公開されている方法、 例えばＷａｔｓｏｎ等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、８１，３３１　（１９５８）及 び上記のＵ、Ｓ、特許４，７２７，１３６に記載の方法も使用することができる ことは、わかるであろう。

本来の多糖は、分子中のシアル酸残基の部分でＮ−説アセチル化され、活性アミ ン基を与える。Ｎ−説アセチル化は周知の方法、例えば塩基性水媒体中９０℃− １１０℃などの高温で、及びｐＨ約１３−１４にて行うことができる。塩基性水 媒体は、アルカリ金属ヒドロキシド水溶液、例えば約２Ｍの濃度の水酸化ナトリ ウムが適している。別法として水溶液中のヒドラジンを使用することができる。

Ｎ−説アセチル化の程度は、条件に依存して約３０％−１００％まで変化する。

約９０−１００％のＮ−悦アシル化を達成するのが好ましい。Ｎ−説アセチル化 物は、例えば冷却し、中和し、必要なら精製し、凍結乾燥することにより回収す ることができる。

Ｎ−説アセチル化法の前、本来の多糖の平均分子量は約５００，００ｏ−ｓｏｏ 、ｏｏｏダルトンの範囲である。Ｎ−説アセチル化の結果、平均分子量が約１０ ，０００−約５０，０００ダルトンの範囲の多糖のフラグメントが形成される。

Ｎ−説アセチル化多糖フラグメントを、その後Ｎ−アシル化し、対応するＮ−ア シル化生成物を製造する。Ｎ−アシル化は、ｐＨが約７．５−９．０の水性媒体 中にＮ−説アセチル化多糖を溶解し、任意に溶解度を増すためにアルコールと共 に適したアシル無水物を加え、反応が完了するまで１０℃以下に冷却することに より行うことができる。必要なら反応媒体を透析などにより精製することができ 、Ｎ−アシル化生成物を典型的に凍結乾燥などにより回収することができる。反 応は約１０−２０時間以内に実質的に完了する。典型的に’ＨＮＭＲなどの分析 法により測定したＮ−アシル化の程度は、少なくとも９０％であり、おそらく１ ００％近辺である。Ｎ−アシル化反応によりフラグメントの分子量の重大な減少 は起こらない。

本発明に従い、約３０−２００シアル酸残基に対応する平均分子量を有するＮ− アシル化材料を選ぶのが、複合の目的に好ましい。これは一般に、Ｕｌｔｒａｇ ｅｌ　（商標）ＡｃＡ　４４　（ビーズ直径が６０−１４０μｍ）カラムを用い 、溶離剤としてＰＢＳを用いたＮ−アシル化ＧＢＭＰのゲル濾過により行うこと ができる。別法として適したサイジング膜を使用することもできる。

平均分子量が１０，０００−４０．０００ダルトン、例えば１０，０００−１５ ，０００ダルトンのＮ−アシル化材料を本発明で使用する。

これは、カラムの溶離物中で上記の範囲の平均分子量のＮ−アシル化ＧＢＭＰ材 料を含む留分を集めることにより得ることができる。もつと高い平均分子量、例 えば３０．０００−４０，０００ダルトンの範囲のＮ−アシル化材料も本発明に 従い有用であることがわかった。

本発明のワクチンは、Ｎ−アシル化多糖を免疫学的に適したキャリヤー蛋白質と 複合させることにより製造する。キャリヤー蛋白質自身が免疫原であることが好 ましい。適したキャリヤー蛋白質の例は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソ イド、交叉反応材料（ＣＲＭＳ）、好ましくは５ｃｌａｖｏ　Ｌｔｄ、、５ｉｅ ｎａ、Ｉｔａｌｙから得られるＣＲＭ　Ｉ　９７、及び細菌蛋白質キャリヤー、 例えばメニンゴコックス外層膜蛋白質である。

修飾多糖フラグメントとキャリヤー蛋白質を複合させるために、いずれの複合法 も使用することができる。好ましい方法は、Ｕ、Ｓ、特許４゜３５６．１７０に 記載の方法、すなわち末端アルデヒド基を（シスー隣接ヒドロキシル基の酸化を 経て）Ｎ−アシル化多糖に導入し、アルデヒド基を還元的アミノ化により蛋白質 のアミノ酸とカップリングさせることによる方法である。それにより多糖及び蛋 白質が−ＣＨ２−ＮＨ−蛋白質結合を経て結合する。

しかし本発明の複合ワクチンは、還元的アミノ化により製造したものに限られな いことを理解しなければならない。従ってワクチンは、５ｃｈｎｅｅｒｓｏｎ、 Ｒ，、等、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎ ｄ　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕ ｅｎｚａｅ　ｔｙｐｅ　ｂ　Ｐｏ１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　 Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ。

Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１９５２．３６１−４７６　（１９８０）及びＬａｎｃ ｅ　Ｋ、ＧｏｒｄｏｎのＵ、Ｓ、特許４，６４４，０５９に記載の通り、アジピ ン酸ジヒドラジドスペーサーを用いてＮ−アシル化多糖とキャリヤー蛋白質を複 合させることによっても製造することができる。

別法として、Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｓ、、等、”ＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＣｈｅｍ ｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ 　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｐｏ１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ 　ｗｉｔｈ　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　Ｍｅｍｂｒａｎ ｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ”、Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、、１０８．５２８２−５２８７　（１９８６）に記載の通り 、Ｍｅｒｃｋにより開発された二重スペーサー法、又はおそらくＡｎｄｅｒｓｏ ｎがＵ、Ｓ、特許４，６７３，５７４で言及した還元末端法を使用することがで きる。

得られるＮ−アシル化多糖−蛋白質複合体は、大きな架橋を持たず、水溶液に可 溶性である。このため、本発明の複合体はワクチンとして使用するための優れた 候補となることができる。

得られた本発明のＮ−アシル化−多糖−蛋白質複合体を、マウスにおけるｉｎ　 ｖｉｔｒｏ試験により調べ、一般にＮ−プロピオニル化−多糖より優れた免疫原 性を有することが示された。さらに交叉反応性抗体の形成の実質的減少が観察さ れた。この観点から、本発明のワクチンはＢＵＮ、メニンギチジス又はＥ、コリ に１生物によって起こる髄膜炎に対して有用であると思われる。ワクチンは、細 菌性髄膜炎に最も罹り易いヒトの子供を保護するために特に興味深い。

本発明のワクチンは典型的に、適した製薬上許容できるキャリヤー、例えば生理 食塩水又は池の注射可能な液体に複合体を分散することにより形成する。ワクチ ンは非経口的に、例えば皮下、腹膜内、又は筋肉注射により投与する。ワクチン に通常用いられる添加剤、例えばラクトース又はソルビトールなどの安定剤、リ ン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム又は硫酸アルミニウムなどの補薬も含む ことができる。

ヒトの子供に対するワクチンの適した投薬量は、一般に体重１キログラム当たり 約５−２５マイクログラム、又は約１−１０マイクログラムの範囲である。

実施例 本発明を以下の実施例により例示するが、本発明を制限するものではない。評価 のためにＮ−アセチル、Ｎ−プロピオニル、Ｎ−ブタノイル、Ｎ−イソブタノイ ル、Ｎ−ペンタノイル及びＮ−ヘキサノイル＝ＧＢＭＰ−蛋白質複合体を製造し 、結果を実施例中で議論する。

プロピオン酸、ブタン酸、イソブタン酸、ペンタン酸及びヘキサン酸無水物、な らびにコロミン酸を、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏ、　、Ｓ　ｔ、Ｌ ｏｕ　ｉｓ、　ＭＯ，から入手した。コロミン酸はＢ群メニンゴコックス多糖（ ＧＢＭＰ）と構造的に同一なので、今後それをＧＢＭＰと呼ぶ。破傷風トキソイ ド（ＴＴ）をＩｎ５ｔｉｔｕｔ　Ａｒｍａｎｄ　Ｆｒａｐｐｉｅｒ、Ｌａｖａｌ 、Ｑｕｅｂｅｃから入手し、Ｂｌｏ−Ｇｅ１（商標）Ａｏ、５　（２００−４０ ０メツシユ）カラム（１゜６Ｘ９０ｃｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ 、ＣＡ、）に上記調剤を通過させ、０．ＯＩＭのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢ Ｓ）（ｐＨ７，４）を用いて平衡化及び溶離することにより、すべての複合体で 用いるモノマーの形態の破傷風トキソイドを得た。

ＧＢＭＰ　（Ｎａ”塩）（１，０ｇ）を２ＭのＮａＯＨ５ｍ１に溶解し、ＮａＢ Ｈ４（１５０ｍｇ）を加え、溶液をねじ込みキャー／プＴｅｆｌ。

ｎ（商標）容器（６０ｍＬ）中で１１０℃に６時間加熱した。この方法は基本的 にＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３４．２６５１　（１９８５）及びＵ、Ｓ、特許４ ．７２７，１３６に、両方共Ｈａｒｏｌｄ　Ｊ、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ等の名前で記 載されている。冷却した希釈溶液をその後４℃にて蒸留水に対して徹底的に透析 し、凍結乾燥した。Ｎ−説アセチル化ＧＢＭＰが得られたということは、Ｎ−説 アセチル化ＧＢＭＰのＩＨ−ｎｍｒスペクトルにおけるメチルアセトアミド信号 （デルタ２．０７における一重項）の不在により決定した。

（ｃ）ＧＢＭＰのＮ−アシル化 Ｎ−説アセチル化ＧＢＭＰ　（１，０ｇ）をＮ　ａ　ＨＣＯ３の５％水溶液５０ ｍＬに溶解した。５個の各アリコート（１０ｍＬの上記溶液）にプロピオン酸、 ブタン酸、イソブタン酸、ペンタン酸又はヘキサン酸無水物のいずれかを加えた 。これらの試薬は、室温にて３時間かけて３Ｘ０゜５ｍＬアリコートとして加え 、その間溶液のｐＨは０．５ＮのＮａＯＨを用いて８．０に保った。溶解度を増 すために、無水物を加える毎に同時にメタノール（０，５ｍＬ）を加えた。最後 に溶液を４℃にて１６時間撹拌し、４℃にて蒸留水に対して徹底的に透析し、凍 結乾燥した。それぞれＮ−プロピオニル化、Ｎ−ブタノイル化、Ｎ−イソブタノ イル化、Ｎ−ペンタノイル化及びＮ−ヘキサノイル化ＧＢＭＰが、すべて９０％ 以上の収率で得られた。それぞれの’ＨｎｍｒスペクトルにおいてＮ−説アセチ ル化ＧＢＭＰが消失していることにより、それぞれの場合に基本的に完全なＮ− アシル化が確認された。

（ｄ）種々のＮ−アシル化ＧＢＭＰのフラグメントのサイジングＵｌ　ｔ　ｒａ ｇｅ　Ｉ　（商標）ＡｃＡ　４４　（ビーズの直径が６０−１４０μｍ）カラム を用いたゲル濾過により、所望の平均分子量のＮ−アシル化ＧＢＭＰ材料を得た 。ＦＬＰＣ（下記参照）により測定してＫＤＯ。

５　ＫＤｏ、７でカラムから溶離する留分を集め、透析し、凍結乾燥した。この 範囲のＫ。値は、約３０−５０ンアル酸残基のＮ−アシル化ＧＢＭＰ　（平均分 子量が約１０．０００−１５．０００ダルトン、典型的に１２．０００ダルトン ）に対応する。平均分子量が３０．０００−４ｏ、ｏｏｏダルトンの範囲のフラ グメントに対応するＫ。が０．　２−０゜４の範囲の留分ち集め、複合させた。

従ってＫＯが０．　２−０．　７の範囲で溶離するＮ−アシル化材料が特に興味 深い。

（ｅ）多糖複合体 過ヨウ素酸酸化（Ｕ、Ｓ、特許４，３５６．１７０参照）によりＮ−アシル化Ｇ ＢＭＰに末端アルデヒド基を導入した。上記のＮ−アシル化ＧＢＭＰフラグメン トを、暗所室温にてＯ，ＬＭのＮａｌ０＜（メタ過ヨウ素酸ナトリウム）（１０ ｍＬ）中で２時間酸化した。その後１ｍＬのエチレングリコールを加えることに より過剰の過ヨウ素酸塩を分解し、４°Ｃにて溶液を徹底的に透析し、凍結乾燥 した。（ＧＢＭＰの場合を除き）Ｎ−説アセチル化法においてＮａＢＨ４を用い ると、各Ｎ−アシル化ＧＢＭＰの末端還元的シアル酸残基が開鎖ポリオール残基 に変換される結果となる。この種の残基は過ヨウ素酸感応性であり（Ｊ、ｉｍｍ ｕ且旦↓、、１２７．１０１１　（１９８１）及びＵ、　Ｓ、特許４．　３５６ ゜１７０　Ｈａｒｏｌｄ　Ｊ、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ等参照）、それによりアルデヒ ド基がＮ−アンル化ＧＢＭＰフラグメントの両端に導入される。

酸化したフラグメント（１００ｍｇ）をＯ，ＩＭのＮ　ａ　ＨＣＯｓ　（ｐ　Ｈ ８１）緩衝液（２ｍＬ）に溶解し、ＴＴ　（２０ｍｇ）を溶液に加えた。

最後に、ナトリウムシアノボロハイドライド（ＮａＣＮＢＨ３）（４０ｍｇ）を 添加し、溶液を穏やかに室温にて撹拌した。複合反応の後、５ｕｐｅｒｏｓｅ（ 商標）１２　ＨＲＩＯ／３０　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたＦＰＬＣにより 、ｐＨ７，２のＰＢＳ緩衝液中で１ｍＬ／分にて操作し、蛋白質及びＮ−アシル 化ＧＢＭＰフラグメントの両方を２１４ｎｍで監視した。フラグメントのに、は ０．　６、ＴＴのＫＯは０．３９、及び複合体のＫ。は０．２３であった。ＦＰ ＬＣクロマトグラムにおけるＫｏＯ，２３の成分に対応するピークの消失により 決定してすべてのＴＴが消費された時を、複合の完了とした。はとんどの場合複 合は２日で完了したが、合計反応時間として４日間放置した。ゲル濾過の前に、 有効な未反応アルデヒド基をナトリウムボロハイドライド（２０ｍｇ）を用いて 最終的に還元した。

多糖−ＴＴ複合体を、ＰＢＳを溶離剤としたＢｉｏ　Ｇｅｌ　Ａカラムを用いた ゲル濾過により多糖フラグメントから分離した。複合体を含む溶離剤を、蒸留水 に対して透析し、凍結乾燥した。５ｖｅｎｎｅ　ｒｈｏｌｍ、Ｌ、、Ｑｕａｎｔ ｉｔａｔｉｖｅ　Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ　。

ｆ　５ｉａｋｉｃ　Ａｃ１ｄ、ＩＩ　Ａ　ＣｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃＲｅｓｏｒ ｃｉｎｏｌ−Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｍｅｔｈｏｄ、Ｂｉｏｃｈ ｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、２４．６０４　（１９５７）に記載のレゾル シノール法で測定し、Ｎ−アシル化ＧＢＭＰ−ＴＴ複合体は１２−３０％、典型 的に１２−２０％のシアル酸を含んでいた。これは、複合体のＴＴに対する多糖 のモル比がそれぞれ２−３＝１であることを示している。

完全フロインドアジュバント（ＦＣＡ）（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｌ 、　’Ｉ中のそれぞれ個別のＮ−アシル化ＧＢＭＰ−ＴＴ複合体を用いて、２０ 匹の雌の白いＣＦＩマウス（８−１０週令）を腹膜内注射により免疫感作した（ ３週間間隔で３回）。それぞれの免疫感作には、２μｇのシアル酸を含むのに十 分な量の複合体（１０−１２μｇ）を用いた。３回目の注射の後１１日でマウス を放血させた。血清につき以下の試験を行った。

（ｂ）放射性抗原結合検定 この検定は、外的に［３Ｈ］−標識したＧＢＭＰ　（ＪｅｎｎｉｎｇｓＨ，Ｊ、 、等、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　 Ｇｒｏｕｐｓ　Ｂ　ａｎｄ　ＣｐｏｌｙｓａｃｃＨ］−標識Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ 　（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ　Ｈ，Ｊ、、等、Ｕｎｉｑｕｅ　Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａ］　Ｅｐｉｔｏｐｅ　ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ　ｔ ｈｅ　Ｈｏｍｏ−３ｉａ１ｏ　Ｐｏ１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　Ｃａｐｓｕｌｅ 　ｏｎ　ｔｈｅＣｅｌｌ　５ｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　Ｇｒｏｕｐ　Ｂ　Ｎｅ１ｓｓ ｅｒ（１９８９））を用いるファーテストの修正法により行った。放射性抗原− 結合検定のための反応混合物は、それぞれ個別のＮ−アシル化ＧＢＭＰ−ＴＴ複 合体で免疫感作した２０匹のマウスから採取し、ＰＢＳで１００μＬに希釈した プール抗血清２０μＬと、５０μＬのＰＢＳ中の［３）（コー標識ＧＢＭＰ及び ［３Ｈ］−標識Ｎ−Ｐｒ−ＣＢＭＰをエソペンドルフポリプロピレンミクロ試験 管中で混合することにより得た。４℃で１６時間インキュベートした後、１５０ μＬの飽和（４℃で）硫酸アンモニウム（ｐＨ７，０）を試験管に加え、試験管 を撹拌して４℃で３０分間放置した。試験管を１５．ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠 心し、１３０μＬのアリコート２個を試験管から採取した。アリコートを２ｍＬ の水及びシンチラントー含有キシレン（ＡＣＳシンチラント水溶液）と混合し、 混合物を液体シンチレーションカウンターでカウントした。結果を表１に示す。

表１ ［３Ｈ］−標識−Ｎ−Ａｃ−ＣＢＭＰの結合抗血清　％結合“ ａ　２０匹の免疫マウスからのプール抗血清につき４回の結合実験を行った。

表１及び他の表で用いた略字： Ｎ−Ａｃ　−、Ｎ−Ｐｒ、　Ｎ−Ｂｕ、　Ｎ−１５ｏＢｕ、　Ｎ−Ｐｅｎ、　Ｎ 　−Ｈｅｘ−は、Ｎ−アセチル、Ｎ−プロピオニル、Ｎ−ブタノイル−１Ｎ−イ ソブタノイル−１Ｎ−ペンタノイル−１及びＮ−ヘキサノイル−を示す。

数字１．　２．　３及び４は、４回繰り返した実験の結果である。表１は、Ｎ− Ｂｕ−ＧＢＭＰｌＮ−Ｉ　ｓｏＢｕ−ＧＢＭＰ、Ｎ−Ｐｅｎ−ＣＢＭＰ及びＮ− Ｈｅｘ−ＧＢＭＰにより誘起された抗血清へのＮ−Ａｃ−ＧＢＭＰ　（胎児Ｎ− ＣＡＭと同様のエピトープを有する）の結合が、Ｎ−Ｐｒ−ＣＢＭＰにより誘起 された抗血清への結合より少ないことを明確に示している。このことから、Ｎ− Ｂｕ−、Ｎ−Ｉ　５ｏＢｕ、Ｎ−Ｐｅｎ−及びＮ−Ｈｅｘ−多糖−複合体により 生ずる交叉反応性抗体がＮ−Ｐｒ−複合体より少ないことを表１から推論するこ とができる。

（ｃ）定量沈降分析 これらの実験は、Ｋａｂａｔ及びＭａｙｅｒ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍ ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｃ，Ｔｈ。

ｍａｓ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ｐ、２２　（１９６１）の方法により０μＬ 　（ＰＢＳで調節）として試験管内で反応させた。これらの実験では、誘導体中 の比較的分子量の大きい留分を使用し、それは以前にＮ−アシル化ＧＢＭＰのフ ラグメントのサイジングに使用したＵｌｔｒａｇｅｌ　ＡｃＡ　４４カラムの溶 離物（ＦＰＬＣで測定してに、がｏ、４）から得た。試験管を４℃にて毎日撹拌 しながら４日間インキュベートし、遠心し、Ｌ　ｏ　ｗ　ｒ　ｙ等、Ｐｒｏｔｅ ｉｎ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｗ蛋白質の量を測定した。結果を表２に示す。

表２ 沈降抗原として種々のＮ−アシルＧＢＭＰを用いたマウス抗−Ｎ−アシルーＧＢ ＭＰ−ＴＴ血清の沈降１アセチル　プロピル　ブチル　ペンチル　ヘキシルＮ− Ｐｒ−ＧＢＭＰ−ＴＴ Ｏ１１６領４０領２００．１５０．１５Ｎ−Ｂｕ−ＧＢＭＰ−ＴＴ Ｏ，０４１，１５２，６０３，２０１，９ＯＮ−Ｐｅｎ−ＧＢＭＰ−ＴＴ Ｏ，１３０，３８０，４４６，３５３，５５Ｎ−Ｈｅｘ−ＧＢＭＰ−ＴＴ Ｏ，０２０，０８０，８０４，１５４，４０ａ　ｍｇ／ｍＬ抗血清で表した沈降 抗体の最大量交叉反応性に関して、表２の第１列は、Ｎ−Ｐｒ複合体と比較して Ｎ−Ｂｕ及びＮ−Ｈｅｘ複合体により生ずる交叉反応性抗体が非常に少ないこと を示している。Ｎ−Ｐｅｎ複合体もＮ−Ｐｒ複合体より少量の交叉反応性抗体を 生ずることがわかる。

同族応答により免疫原性を見ると、表２から、Ｎ−Ｂ　ｕ　−（２，６０）、Ｎ −Ｐｅｎ−（６，３５）　、及びＮ−Ｈｅｘ−（４，４０）ＧＢＭＰ−ＴＴ複合 体がＮ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ類似体（０，４０）より免疫原性が高いことがわかる。

ＥＩＡ微量滴定プレート（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、０ｎ ｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）のウェルに、ＧＢＭＰ−１ＮＰｒＧＢＭＰ−又はＮ Ｂｕ−ＧＢＭＰ−ＢＳＡ複合体のいずれかを１０ａｇ／ｍＬでＰＢＳに溶解した 溶液（１００μＬ／ウエル）を塗布した。プレートを４℃に１８時間放置し、塗 布後室部にて、ＰＢＳ中１％の牛血清アルブミンで１０分間洗浄した（ブロッキ ング段階）。その後、抗−マウス−Ｎ−アシルＧＢＭＰ−ＴＴ複合体血清をＰＢ Ｓ中で順次１０倍に希釈した希釈液１００μＬをウェルに入れ、プレートを室温 で１時間インキュベートした。ＳＥＴで洗浄後、やぎ抗マウス免疫グロブリンペ ルオキシダーゼ標識複合体（Ｋｉｒｋｅｇａｒｄ　ａｎｄ　ＰｅｒｒｙＬａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ）の適した希釈液５０ｕＬと共にプレートを室温で１時間イン キュベートし、ウェルの内容物を吸引し、プレートをＳＢＴで５回洗浄した。最 後に各ウェルに５０μＬのテトラメチレンブルー−ペルオキシダーゼ基質（ＴＭ Ｂ）（Ｋｉ　ｒｋｅｇａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）を加え、１０分後にＭｕｌｔｉｓｃａｎ分光光度計（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔ、）で測定した。結果を表３に 示す。

表３ Ｎ−アシル−ＧＢＭＰ−ＢＳＡ複合体に対するマウス抗−Ｎ−アシルーＧＢＭＰ −ＴＴ複合体プール血清のＥＬＩＳＡ滴定 塗布抗原　抗血清の力価“ 抗Ｎ−Ｐｒ　抗Ｎ−Ｂｕ　抗Ｎ−Ｎ−１ｓｏｂｕ−ＧＢ’　−ＧＢＭＰゝ　−Ｇ ＢＭＰｂＮ−Ａｃ−ＧＢＭＰ−ＢＳＡ ７８００　１０００　７００Ｏ Ｎ−Ｐ　ｒ−ＧＢＭＰ−ＢＳＡ ４００００　３９０００　９８０Ｏ Ｎ−Ｂｕ−ＧＢＭＰ−ＢＳＡ ２６０００　５２０００　９７０Ｏ Ｎ−Ｉ　ｓｏＢｕ−ＧＢＭＰ−ＢＳＡ ａ　力価（ＧＭ）＝４５０ｎｍにおける最大吸収の５０％を示す希釈度の逆数。

ｂ　同族Ｎ−アシル−ＧＢＭＰ−ＴＴＴ合体によりマウス中に誘起されたＮ−ア シル特異的抗血清。

交叉反応性に関して表３から、Ｎ−Ｂｕ−ＧＢＭＰ−ＴＴＴ合体により生ずるＮ −Ａｃ−ＧＢＭＰに関する交叉反応性抗体（１０００）は、Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ −ＴＴＴ合体（７８００）より少ないことがわかる。

その理由は、ＧＢＭＰがＮ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ−ＴＴＴ合体による抗体と結合する 量が、Ｎ−Ｂｕ−ＧＢＭＰ−ＴＴＴ合体による抗体と結合する量より少ないため である。同様のことがＮ−Ｉ　ｓｏＢｕｔ−ＧＢＭＰ　−ＴＴＴ合体に関しても 当てはまる。

免疫原性に関して、５２．０００　（Ｎ−Ｂｕ）及び４０．０００　（Ｎ−Ｐ　 ｒ）という同族結合力価が示す通り、Ｎ”Ｂｕ複合体の方がＮ−Ｐｒ類似体より 免疫原性が高い。

−ＴＴ複合体抗血清に加えた。この量は、インヒビターの不在下で（３Ｈ）−標 識Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰの５０％が結合するのに十分な量である。

試験管を３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳに溶解した（３Ｈ）−標識Ｎ −Ｐｒ−ＧＢＭＰ５０μＬを加えた。穏やかに撹拌した後、試験管を４℃で１６ 時間インキュベートし、放射性抗原結合検定に関して前述した通りに分析を行っ た。％阻害は、次式を用いて算出した。

％阻害＝１００Ｘ　［（インヒビターを用いた場合のｃｐｍ−インヒビターを用 いない場合のｃｐｍ）／抗体を用いない場合のｃｐｍ−インヒビターを用いない 場合のｃｐｍ）］ 結果を表４に示す。

点」 マウス抗−Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ−ＴＴ複合体誘起Ｉ　ｇ　Ｇ２−”　、Ｉ　ｇ　 Ｇｚｂ（Ａ）’及びＩｇＧ１（Ｂ）”抗体への［３Ｈコー標識Ｎ−Ｐｒ−ＣＢＭ Ｐの結合の阻害 Ｎ−Ａｃ−ＧＢＭＰ　＞５０．０　＞５０．ＯＮ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ　０．　６　 ０．　３Ｎ−Ｂｕ−ＧＢＭＰ　鉤３０．２ Ｎ−Ｎ−ｌ５ｏＢｕ−ＧＢ　＞５０．０　−Ｎ−Ｐｅｎ−ＧＢＭＰ　２．　３　 ２．　５Ｎ−Ｈｅｘ−ＧＢＭＰ　１０．２　１０．０３５８５−３５９１　（１ ９８９）に記載の、マウス多クローン性抗−Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ−ＴＴ血清の留 分である。

ｂ　５０％阻害を示すインヒビターのマイクログラム。

段線菌性分析　これらの分析は、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ等、Ｊ、Ｅｘｐ。

竺二旦、、１６５．１２０７−１２１１　（１９８７）に記載の方法により行っ た。

これらの分析では、ナイセリア　メニンギチジス株Ｂ（Ｍ９８６）を用いた。結 果を表５に示す。

表５ 種々のマウス抗−Ｎ−アシルーＧＢＭＰ−ＴＴ複合体血清への［３）（コー標識 −Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰの結合及びそれぞれの抗血清の段線菌力価 抗血清　抗血清のμＬ“　段線菌力価５ａ　５０％結合に必要な抗血清（ＰＢＳ で５倍に希釈）のμＬ０ｂ　希釈実験：１回希釈の差、例えば６４に比較した１ ２８は、実験誤差範囲内である。

表４は、Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰのそれ自身の同族抗体に対する結合に関して、Ｎ− Ｂｕ−ＧＢＭＰがＮ−Ｐｒ−ＧＢＭＰと同程度に優れたインヒビターであること を示している。従ってＮ−Ｐｒ−ＧＢＭＰの代わりにＮ−Ｂｕ−ＧＢＭＰを使用 することにより、Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰが示す特性が重大に失われることはない。

表５は、Ｎ−Ｂｕ−ＧＢＭＰが、Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ−ＴＴＴ合体により生じた 抗体に、Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰと同程度に結合することを示している。Ｎ−Ｂｕ− ＧＢＭＰ−ＴＴ及びＮ−Ｐｒ−ＣＢＭＰ−ＴＴ両両会合体より生じた抗体は、類 似の段線菌力価を与える。この証明は、Ｂ群メニンゴコックスの表面の段線菌性 エピトープを模倣する能力において、Ｎ−Ｂｕ−、Ｎ−Ｉ　ｓｏＢｕ−及びＮ− Ｐｅｎ−ＧＢＭＰがＮ−Ｐｒ−ＧＢＭＰと同等であることを示唆している。

要　約 シアル酸残基Ｎ−アセチル基をＮ−アシル基に置換することにより修飾したナイ セリア　メニンギチジスＢ群多糖（ＧＢＭＰ）は、それに対する免疫応答が強ま る。さらに、非修飾Ｂ群メニンゴコックス及びＥ。

コリに１莢膜多糖、ならびに共通のエピトープを持つ多の組繊細胞と交叉反応す る抗体の誘起が小さくなる。修飾多糖と、破傷風トキソイドなどの生理学的に許 容できる蛋白質との複合により、ＧＢＭＰ−交叉反応性抗体の誘起が無視できる 程度の特異的保護抗体が生成され、それによＱＢ群メニンゴコックス及びＥ、コ リＫｌによって起こる感染に対する保護を与える。

補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成４年６月１２日

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．シアル酸残基Ｎ−アセチル基がＣ４−Ｃ８−アシル基により置換された、ナ イセリア　メニンギチジスの修飾Ｂ群多糖。
2. ２．シアル酸残基Ｎ−アセチル基がＣ４−Ｃ８−アシル基により置換された、Ｅ ．コリＫ１莢膜多糖。
3. ３．Ｃ４−Ｃ８アシル基をｎ−ブチル、イソブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシ ル、ｎ−ヘブチル及びｎ−オクチルから成る群より選ぶ、請求の範囲１に記載の 修飾多糖。
4. ４．アシル基をｎ−ブチル、イソブチル、ｎ−ペンチル及びｎ−ヘキシルから成 る群より選ぶ、請求の範囲３に記載の修飾多糖。
5. ５．Ｃ４−一Ｃ８アシル基をｎ−ブチル、イソブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキ シル、ｎ−ヘブチル及びｎ−オクチルから成る群より選ぶ、請求の範囲２に記載 の修飾多糖。
6. ６．アシル基をｎ−ブチル、イソブチル、ｎ−ペンチル及びｎ−ヘキシルから成 る群より選ぶ、請求の範囲５に記載の修飾多糖。
7. ７．平均分子量が１０，０００−５０，０００の範囲の、請求の範囲１に記載の 修飾多糖。
8. ８．平均分子量が１０，０００−５０，Ｏ００の範囲の、請求の範囲２に記載の 修飾多糖。
9. ９．Ｎ−アシル化度が約９０−１００％である、請求の範囲１に記載の修飾多糖 。
10. １０．Ｎ−アシル化度が約９０−１００％である、請求の範囲２に記載の修飾多 糖。
11. １１．シアル酸残基Ｎ−アセチル基がＮ−Ｃ４−Ｃ８アシル基に置換されたナイ セリア　メニンギチジスの修飾Ｂ群多糖を、免疫学的に適した蛋白質と複合させ て含む抗原性複合体。
12. １２．アシル基をｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘブチル及び オクチルから成る群より選ぶ、請求の範囲１１に記載の複合体。
13. １３．アシル基をｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル及びヘキシルから成る群よ り選ぶ、請求の範囲１２に記載の複合体。
14. １４．蛋白質を破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、交叉反応材料（ＣＲ Ｍ）及び細菌蛋白質キャリヤーから成る群より選ぶ、請求の範囲１１に記載の複 合体。
15. １５．蛋白質及び多糖を−ＣＨ２−ＮＨ−蛋白質結合を経て共有結合により結合 する、請求の範囲１１に記載の複合体。
16. １６．ＣＲＭがＣＲＭ１９７である、請求の範囲１４に記載の複合体。
17. １７．請求の範囲１１に記載の複合体及び製薬上許容できる注射可能なキャリヤ ーを含むワクチン。
18. １８．さらに生理学的に許容できる補薬を含む、請求の範囲１７に記載のワクチ ン。
19. １９．咳補薬を水酸化アルミ＝ウム、リン酸アルミニウム及び硫酸アルミニウム から成る群より選ぶ、請求の範囲１８に記載のワクチン。
20. ２０．Ｎ．メニンギチジス及びＥ．コリに感染し易い哺乳類に、治療上有効量の 請求の範囲１７に記載のワクチンを非経口的に投与する段階を含む、Ｎ．メニン ギチジス及びＥ．コリ感染に対して免疫感作する方法。
21. ２１．ワクチンを体重１キログラム当たり１−２５マイクログラムの投薬量で投 与する、請求の範囲２０に記載の方法。
22. ２２．請求の範囲１７に記載のワクチンで哺乳類を感作し、該哺乳類からガンマ グロブリンを回収することにより製造した、Ｂ群Ｎ．メニンギチジス及びＥ、コ リによって起こる髄膜炎に対する受動保護の可能なガンマグロブリン留分。