JP2637845B2

JP2637845B2 - 修飾メニンゴコツクス多糖複合ワクチン

Info

Publication number: JP2637845B2
Application number: JP3500908A
Authority: JP
Inventors: ジエニングス，ハロルド・ジエイ; マイコン，フランシス
Original assignee: NASHONARU RISAACHI KAUNSHIRU OBU KANADA
Current assignee: NASHONARU RISAACHI KAUNSHIRU OBU KANADA
Priority date: 1989-12-14
Filing date: 1990-12-13
Publication date: 1997-08-06
Anticipated expiration: 2012-08-06
Also published as: AR243934A1; ATE121947T1; NO973311L; SI20008A; WO1991008772A1; BR9007917A; NZ236471A; FI19991917A; HU9201966D0; ZA9010065B; CA2071811A1; IE904513A1; RU2105568C1; IN171747B; DE69019164T2; RO111416B1; FI104539B; CN1100656A; US5902586A; CN1096516A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ナイセリアメニンギチジスの化学−修飾
Ｂ群多糖を目的とする。本発明は又、各修飾多糖を蛋白
質キャリヤーに複合させたワクチンを提供する。

発明の背景Ｂ群N.メニンギチジス及びエシエリキアコリ（Eshe
ricnia coli）K1（以下、E.コリK1と称する場合あり）
によって起こる髄膜炎は、世界における主要な健康上の
問題として残っている。Ｂ群髄膜炎は、一地方流行的及
び一般流行的状況の両方で起こり、記録されているすべ
ての流行性脳脊髄膜炎の症例の約半分に上り、一方K1−
陽性E.コリは、新生児の髄膜炎の主要な原因である。現
在、Ｂ群メニンゴコックス及びE.コリK1によって起こる
病気に対する、商業的に入手可能なワクチンはない。こ
の大きな理由は、Ｂ群メニンゴコックス多糖（GBMP）の
ヒトにおける免疫原性が低いことである。GBMPと外層膜
蛋白質の複合体に基づくワクチン候補が、最近いくつか
報告されているが、ヒトにおけるその有効性に対する明
確な証明はまだない。

最近、合成化学修飾（Ｎ−プロピオニウ化）Ｂ群多糖
−蛋白質（Ｎ−Pr−GBMP−蛋白質）に基づくワクチンの
新規概念が開発された。ワクチンは、保護的であるばか
りでなく非修飾のGBMP（すなわちＮ−アセチル−GBMP）
と交叉反応性でもある高力価値のIgG交替をマウス中に
誘起する。この概念は、1988年２月23日にHarold J.Je
nnings等に与えられたU.S.特許4,727,136に記載され、
クレイムされている。

U.S.特許4.727,136に記載れさているような交叉反応
性抗体を誘起するワンチンは、免疫トレランスの破壊と
いう犠牲においてのみ成功すると思われてきた。この仮
定は、本来のＮ−Ac−GBMP及びヒトならびに動物組織の
両方において、α−（２−８）−結合シアル酸残基（10
残基中最低要求）の鎖を含む共通エピトープを同定した
ことにより正当性が認められている（Jennings,Contri
b.Microbiol.Immunol.Basel,Karger,1989,Vol.10,151−
165）。これらのポリシアロシル鎖は発生抗原として機
能し、ほとんどの場合神経胚細胞の胎児期癒着を伴って
きた（Finne等、Biocnem.Biophys.Res.Commun.,1983,11
2,482）。後天的成熟の間にこの抗原はダウンレギュレ
ーションされるが（Friedlander等、J.Cell.Biol.1985,
101,412）、疾患細胞の再生の間に（Cashman等、Ann.Ne
uron.,1987,21,481）に腫瘍細胞（Roth等、Proc.Natl.A
cad.Sci.,1988,85,299）及びナチュラルキラー（NK）な
らびにCD3⁺T細胞（Husmann等、Eur.J.Immunol.,1989,1
9,1761）において成人中に発現する。これらの胎児抗原
に対する耐性の破壊の結果はまだ確立されていないが、
この交叉反応性のためにＮ−Pr−GBMP−蛋白質複合体は
認可機関により綿密に検査され、ワンチンの安全性を証
明するのに必要な複雑な実験のために、商業的生産の認
可までにはかなりの出費があり、遅れる。

Ｎ−Pr−GBMP−蛋白質の免疫原性と比較して強化され
た免疫原性を有するワンチンの開発が、本発明の目的で
ある。実質的にヒト及び動物の神経細胞癒着抗原（胎児
Ｎ−CAM）との交叉反応性が減少したワンチンの提供も
本発明の目的である。

発明の要約本発明のひつとの特徴において、シアル酸残基Ｎ−ア
セチル（C₂）基がC₄−C₈アシル基により置換された、ナ
イセリアメニンギチジスの修飾Ｂ多糖を提供する。

他の特徴として、免疫学的に適した蛋白質と複合させ
たＮ−C₄−C₈アシル多糖を含み、免疫原性が強化され、
交叉反応性抗体の誘起が実質的に減少した抗原複合体を
提供する。

さらに別の特徴として、適したキャリヤー又は希釈剤
と共にＮ−C₄−C₈アシル多糖−蛋白質複合体を含むワン
チンを提供する。本発明のワンチンは、ヒトに使用する
のに適した治療有効量の補薬、例えばリン酸アルミニウ
ム又は水酸化アルミニウムを含むこともできる。

さらに別の特徴として、N.メニンギチジス及びE.コリ
K1感染に対して哺乳類を免疫感作する方法を提供する。
その方法は、そのような感染にあい易い、ヒトを含む哺
乳類に免疫学上有効量の本発明のワンチンを非経口的に
投与することを含む。ワンチンは典型的に、体重１キロ
グラム当たり約１−50マイクログラム、例えば体重１キ
ログラム当たり５−25マイクログラムの量で投与する。

さらにもうひとつの特徴として本発明は、Ｂ群N.メニ
ンギチジス及びE.コリK1によって起こる髄膜炎に対する
保護の可能なガンマグロブリン留分を提供する。留分
は、本発明のワンチンを用いて哺乳類を免疫感作するこ
とにより製造する。その後留分を患者に投与し、上記生
物により起こる感染に対する保護を与え、又は進行中の
感染症を治療する。このことから、これらの好ましい免
疫原性、及びヒトならびに動物の神経細胞癒着抗原であ
る胎児Ｎ−CAMと交叉反応性の抗体の誘起が最小である
ことを考えると、本発明の免疫原性ワンチン複合体は、
治療血清の供給源となることが良くわかるであろう。本
発明の複合体は単クローン性抗体、及びおそらくアンチ
ジオタイプ抗体の誘起にも有用であろう。

最近の我々の実験で、上記Jennigs等、U.S.特許4,72
7,136に記載のＮ−Pr−GBMP−蛋白質複合体によって起
こるほとんどの殺細菌性及び保護抗体は、胎児Ｎ−CAM
交叉反応性抗体を伴わないことを見いだした。実際にほ
とんどの保護活性は、胎児Ｎ−CAMと交叉反応しないＮ
−Pr−GBMP−特異的抗体集団に含まれる。この観点か
ら、Ｎ−Pr−GBMPがＢ群メインゴコックスの表面上の独
特の殺細菌性エピトープを模倣すると思われる。

本発明は、殺細菌性エピトープを模倣し、その複合体
の形態で免疫原性が強化されるばかりでなく、胎児Ｎ−
CAMと交叉反応する抗体の誘起を実質的に避けることが
できる化学的修飾CBMPの合成が可能であるという発見に
基づいている。

本発明に到達する際に、多糖類の化学修飾GBMPを合成
し、それぞれ蛋白質と複合させ、その後複合体をマウス
に注射してその効果をＮ−Pr−GBMP蛋白質複合体による
効果と比較した。驚くべきことに、Ｎ−C₄−C₈アシルGB
MP−蛋白質複合体、例えばｎ−ブタノイル、イソ−ブタ
ノイル、ｎ−ペンタノイル、イソ−ペンタノイル、ネオ
−ペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル及びオク
タノイル、ならびに特にＮ−ブタノイル（Ｎ−Bu） GB
MP−蛋白質複合体が、実質的に殺細菌性エピトープを模
倣し、交叉反応性抗体の誘起を実質的に減少させること
を見いだした。

発明の詳細な説明Ｂ群メニンゴコックス多糖は、N.メニンギチジスから
同業者に周知の方法で単離する。そのような方法のひと
つにおいて、Ｂ群メニンゴコックス（株981B）を、蒸留
水１リットル当たり30gの脱水Todd Hewitt Broth（Di
fco Laboratories,Detroit,Michigan）を用いて37℃の
発酵器中で成育した。発酵器成育の前に、凍結乾燥した
株を最初に37℃のキャンドルジャー中、５％（v/v）のS
heeps′ Blood Agar（Difco Laboratories,Detroit,
Michigan）プレート上で成育した。その後細菌を、三角
フラスコ中の1.0リットルのTodd Hewitt Broth（上記
と同様）に移し、フラスコを37℃にて７時間、190rpmで
振った。この接種材料をその後発酵器に移した。発酵器
成育の後（16時間、ホルマリンを最終濃度0.75％まで加
えることにより細菌を殺した。連続遠心により細菌を除
去し、上澄みからＢ群メニンゴコックス多糖を単離し、
粗多糖の溶液を熱（50−60℃）フェノールの代わりに90
％の冷（４℃）フェノールと共に攪拌して蛋白質を抽出
する以外は基本的にBundle等、J.Biol.Chem.,249,4797
−4801（1974）に記載の方法で精製した。この後者の方
法は、高分子量のGBMPの製造を確実にする。

E.コリ（018:K1:H7）（NRCC 4283）は、37℃の発酵
器にて脱水Brain Heart Infusion（BHI;37g/リット
ル）（Difco Laboratories,Detroit,Michigan）を含む
蒸留水中で成育した。発酵器成育の前に、凍結乾燥した
株を三角フラスコ中の50mlのBHI（上記と同様）上で成
育し、フラスコを37℃にて７時間、200rpmで振った。こ
の成育株をその後1.5リットルのBH（上記と同様）に移
し、上記と同様の条件下で７時間成育した。接種材料を
その後発酵器に移した。

E.コリK1の莢膜多糖の単離精製に用いた方法は、Ｂ群
メニンゴコックス多糖の単離に関して上記で記載した方
法と同一である。

上記の単離精製法が使用できる唯一の方法ではなく、
他の公開されている方法、例えばWatson等、J.Immuno
l.,81,331（1958）及び上記のU.S.特許4,727,136に記載
の方法も使用することができることは、わかるであろ
う。

本来の多糖は、分子中のシアル酸残基の部分でＮ−脱
アセチル化され、活性アミン基を与える。Ｎ−脱アセチ
ル化は周知の方法、例えば塩基性水媒体中90℃−110℃
などの高温で、及びpH約13−14にて行うことができる。
塩基性水媒体は、アルカリ金属ヒドロキシド水溶液、例
えば約2Mの濃度の水酸化ナトリウムが適している。別法
として水溶液中のヒドラジンを使用することができる。
Ｎ−脱アセチル化の程度は、条件に依存して約30％−10
0％まで変化する。約90−100％のＮ−脱アシル化を達成
するのが好ましい。Ｎ−脱アセチル化物は、例えば冷却
し、中和し、必要なら精製し、凍結乾燥することにより
回収することができる。

Ｎ−脱アセチル化法の前、本来の多糖の平均分子量は
約500,000−800,000ダルトンの範囲である。Ｎ−脱アセ
チル化の結果、平均分子量が約10,000−約50,000ダルト
ンの範囲の多糖のフラグメントが形成される。

Ｎ−脱アセチル化多糖フラグメントを、その後Ｎ−ア
シル化し、対応するＮ−アシル化生成物を製造する。Ｎ
−アシル化は、pHが約7.5−9.0の水性媒体中にＮ−脱ア
セチル化多糖を溶解し、任意に溶解度を増すためにアル
コールと共に適したアシル無水物を加え、反応が完了す
るまで10℃以下に冷却することにより行うことができ
る。必要なら反応媒体を透析などにより精製することが
でき、Ｎ−アシル化生成物を典型的に凍結乾燥などによ
り回収することができる。反応は約10−20時間以内に実
質的に完了する。典型的に¹H NMRなどの分析法により
測定したＮ−アシル化の程度は、少なくとも90％であ
り、おそらく100％近辺である。Ｎ−アシル化反応によ
りフラグメントの分子量の重大な減少は起こらない。

本発明に従い、約30−200シアル酸残基に対応する平
均分子量を有するＮ−アシル化材料を選ぶのが、複合の
目的に好ましい。これは一般に、Ultragel（商標）AcA
44（ビーズ直径が60−140μｍ）カラムを用い、溶離
剤としてPBSを用いたＮ−アシル化GBMPのゲル濾過によ
り行うことができる。別法とし適したサイジング膜を使
用することもできる。

平均分子量が10,000−40,000ダルトン、例えば10,000
−15,000ダルトンのＮ−アシル化材料を本発明で使用す
る。これは、カラムの溶離物中で上記の範囲の平均分子
量のＮ−アシル化GBMP材料を含む留分を集めることによ
り得ることができる。もっと高い平均分子量、例えば3
0,000−40,000ダルトンの範囲のＮ−アシル化材料も本
発明に従い有用であことがわかった。

本発明のワンチンは、Ｎ−アシル化多糖を免疫学的に
適したキャリヤー蛋白質と複合させることにより製造す
る。キャリヤー蛋白質自身が免疫原であることが好まし
い。適したキャリヤー蛋白質の例は、破傷風トキソイ
ド、ジフテリアトキソイド、交叉反応材料（CRMs）、好
ましくはSclavo Ltd.,Siena,Italyか得られるCRM₁₉₇、
及び細菌蛋白質キャリヤー、例えばメニンゴコックス外
層膜蛋白質である。

修飾多糖フラグメントとキィリヤー蛋白質を複合させ
るために、いずれの複合法も使用することができる。好
ましい方法は、U.S.特許4,356,170に記載の方法、すな
わち末端アルデヒド基を（シス−隣接ヒドロキシル基の
酸化を経て）Ｎ−アシル化多糖に導入し、アルデヒド基
を還元的アミノ化により蛋白質のアミノ酸とカップリン
グさせることによる方法である。これにより多糖及び蛋
白質が−CH₂−NH−蛋白質結合を経て結合する。

しかし本発明の複合ワンチンは、還元的アミノ化によ
り製造したものに限られないことを理解しなければなら
ない。従ってワンチンは、Schneerson,R.,等、Paeparat
ion,Characterization and Immunogenictiy of Hae
mophilus influenzae type ｂ Polysaccharide−Pr
otein Cojsugates,J.Exp.Med.,1952,361−476（1980）
及びLance K.GordonのU.S.特許4,644,059に記載の通
り、アジピン酸ジヒドラジドスペーサーを用いてＮ−ア
シル化多糖とキャリヤー蛋白質を複合させることによっ
ても製造することができる。別法として、Marburg,S.,
等、“Biomolecular Chemistry of Macromolecules:
Syntnesis of Bacterial Polysaccharide Conjugat
es with Neisseria meningitidis Membrane Prote
in"、J.Am.Chem.Soc.,108,5282−5287（1986）に記載の
通り、Merckにより開発された二重スペーサー法、又は
おそらくAndersonがU.S.特許4,673,574で言及した還元
末端法を使用することができる。

得られるＮ−アシル化多糖−蛋白質複合体は、大きな
架橋を持たず、水溶液に可溶性である。このため、本発
明の複合体はワンチンとして使用するための優れた候補
となることができる。

得られた本発明のＮ−アシル化−多糖−蛋白質複合体
を、マウスにおけるin vitro試験により調べ、一般に
Ｎ−プロピオニル化−多糖より優れた免疫原性を有する
ことが示された。さらに交叉反応性抗体の形成の実質的
減少が観察された。この観点から、本発明のワンチンは
Ｂ群N.メニンギチジス又はE.コリK1生物によって起こる
髄膜炎に対して有用であると思われる。ワクチンは、細
菌性髄膜炎に最も罹り易いヒトの子供を保護するために
特に興味深い。

本発明のワンチンは典型的に、適した製薬上許容でき
るキャリヤー、例えば生理食塩水又は他の注射可能な液
体に複合体を分散することにより形成する。ワンチンは
非経口的に、例えば皮下、腹膜内、又は筋肉注射により
投与する。ワンチンに通常用いられる添加剤、例えばラ
クトース又はソルビトールなどの安定剤、リン酸アルミ
ニウム、水酸化アルミニウム又は硫酸アルミニウムなど
の補薬も含むことができる。

ヒトの子供に対するワンチンの適した投薬量は、一般
に体重１キログラム当たり約５−25マイクログラム、又
は約１−10マイクログラムの範囲である。

実施例本発明を以下の実施例により例示するが、本発明を制
限するものではない。評価のためにＮ−アセチル、Ｎ−
プロピオニル、Ｎ−ブタノイル、Ｎ−イソブタノイル、
Ｎ−ペンタノイル及びＮ−ヘキサノイル−GBMP−蛋白質
複合体を製造し、結果を実施例中で議論する。

複合体製造の材料と方法（ａ）材料プロピオン酸、ブタン酸、イソブタン酸、ペンタン酸
及びヘキサン酸無水物、ならびにコロミン酸を、Sigma
Chemicanl Co.,St.Louis.MO.から入手した。コロミ
ン酸はＢ群メニンゴコックス多糖（GBMP）と構造的に同
一なので、今後それをGBMPと呼ぶ。破傷風トキソイド
（TT）をInstitut Armand Frappier,Laval,Quebecか
ら入手し、Bio−Gel（商標）A0.5（200−400メッシュ）
カラム（1.6x90cm）（Bio−Rad.Richmond,CA.）に上記
調剤を通過させ、0.01Mのリン酸塩緩衝生理食塩水（PB
S）（pH7.4）を用いて平衡化及び溶離することにより、
すべての複合体で用いるモノマーの形態の破傷風トキソ
イドを得た。

（ｂ）GBMPのＮ−脱アセチル化 GBMP（Na⁺塩）（1.0g）を2MのNaOH 5mlに溶解し、NaB
H₄（150mg）を加え、溶液をねじ込みキャップTeflon
（商標）容器（60mL）中で110℃に６時間加熱した。こ
の方法は基本的にJ.Immunol.，134,2651（1985）及びU.
S.特許4,727,136に、両方共Harold J.Jennings等の名
前で記載されている。冷却した希釈溶液をその後４℃に
て蒸留水に対し徹底的に透析し、凍結乾燥した。Ｎ−脱
アセチル化GBMPが得られたということは、Ｎ−脱アセチ
ル化GBMPの¹H−nmrスペクルにおけるメチルアセトアミ
ド信号（デルタ2.07における一重項）の不在により決定
した。

（ｃ）GBMPのＮ−アシル化Ｎ−脱アセチル化GBMP（1.0g）をNaHCO₃の５％水溶液
50mLに溶解した。５個の各アリオート（10mLの上記溶
液）にプロピオン酸、ブタン酸、イソブタン酸、ペンタ
ン酸又はヘキサン酸無水物のいずれかを加えた。これら
の試薬は、室温にて３時間かけて3x0.5mLアリコートと
して加え、その間溶液のpHは0.5NのNaOHを用いて8.0に
保った。溶解度を増すために、無水物を加える毎に同時
にメタノール（0.5mL）を加えた。最後に溶液を４℃に
て16時間攪拌し、４℃にて蒸留水に対して徹底的に透析
し、凍結乾燥した。それぞれＮ−プロピオニル化、Ｎ−
ビタノイル化、Ｎ−イソブタノイル化、Ｎ−ペンタノイ
ル化及びＮ−ヘキサノイル化GBMPが、すべて90％以上の
収率で得られた。それぞれの¹H nmrスペクトルにおい
てＮ−脱アセチル化GBMPが消失していることにより、そ
れぞれの場合に基本的に完全なＮ−アシル化が確認され
た。

（ｄ）種々のＮ−アシル化GBMPのフラグメントのサイジ
ング Ultragel（商標）AcA 44（ビーズの直径が60−140μ
ｍ）カラム（IBF Biotechnics,Savage,MD.）を用い、P
BSを溶離剤としたゲル濾過により、所望の平均分子量の
Ｎ−アシル化GBMP材料を得た。FLPC（下記参照）により
測定してK_D0.5−K_D0.7でカラムから溶離する留分を集
め、透析し、凍結乾燥した。この範囲のK_D値は、約30−
50シアル酸残基のＮ−アシル化GBMP（平均分子量が約1
0,000−15,000ダルトン、典型的に12,000ダルトン）に
対応する。平均分子量が30,000−40,000ダルトンの範囲
のフラグメントに対応するK_Dが0.2−0.4の範囲の留分も
集め、複合させた。従ってK_Dが0.2−0.7の範囲で溶離す
るＮ−アシル化材料が特に興味深い。

（ｅ）多糖複合体過ヨウ素酸酸化（U.S.特許4,356,170参照）によりＮ
−アシル化GBMPに末端アルデヒド基を導入した。上記の
Ｎ−アシル化GBMPフラグメントを、暗所室温にて0.1Mの
NaIO₄（メタ過ヨウ素酸ナトリウム）（10mL）中で２時
間酸化した。その後1mLのエチレングリコールを加える
ことにより過剰の過ヨウ素酸塩を分解し、４℃にて溶液
を徹底的に透析し、凍結乾燥した。（GBMPの場合を除
き）Ｎ−脱アセチル化法においてNaBH₄を溶いると、各
Ｎ−アシル化GBMPの末端還元的シアル酸残基が開鎖ポリ
オール残基に変換される結果となる。この種の残基は過
ヨウ素酸感応性だり（J.Immunol.,127,1011（1981）及
びU.S.特許4,356,170 Harold J.Jennings等参照）、
それによりアルデヒド基がＮ−アシル化GBMPフラグメン
トの両端に導入される。

酸化したフラグメント（100mg）を0.1MのNaHCO₃（pH
8.1）緩衝液（2mL）に溶解し、TT（20mg）を溶液に加え
た。最後に、ナトリウムシアノボロハイドライド（NaCH
BH₃）（40mg）を添加し、溶液を穏やかに室温にて攪拌
した。複合反応の後、Superose（商標）12 HR10/30（P
harmacia）を用いたFPLCにより、pH7.2のPBS緩衝液中で
1mL/分にて操作し、蛋白質及びＮ−アシル化GBMPフラグ
メントの両方を214nmで監視した。フラグメントのK_Dは
0.6、TTのK_Dは0.39、及び複合体のK_Dは0.23であった。F
PLCクロマトグラムにおけるK_D0.23の成分に対応するピ
ークの消失により決定してすべてのTTが消費された時
を、複合の完了とした。ほとんどの場合複合は２日で完
了したが、合計反応時間として４日間放置した。ゲル濾
過の前に、有効な未反応アルデヒド基をナトリウムボロ
ハイドライド（20mg）を用いて最終的に還元した。

多糖−TT複合体を、PBSを溶離剤としたBio Gel Ａ
カラムを用いたゲル濾過により多糖フラグメントから分
離した。複合体を含む溶離剤を、蒸留水に対して透析
し、凍結乾燥した。Svennerholm,L.,Quantitative Est
imation of Siakic Acid,II Ａ Colorimetric Re
sorcinol−Hydrochloric Acid Method,Biochim.Bioph
ys.Acta.24,604（1957）に記載のレゾルシノール法で測
定し、Ｎ−アシル化GBMP−TT複合体は12−30％、典型的
に12−20％のシアル酸を含んでいた。これは、複合体の
TTに対する多糖のモル比がそれぞれ２−3:1であること
を示している。

免疫感作及びイムノアッセイ（ａ）免疫感作法完全フロイントアジュバンド（FCA）（Difco,Detroi
t,MI.）中のそれぞれ個別のＮ−アシル化GBMP−TT複合
体を用いて、20匹の雌の白いCFIマウス（８−10週令）
を腹膜内注射により免疫感作した（３週間間隔で３
回）。それぞれの免疫感作には、２μｇのシアル酸を含
むのに十分な量の複合体（10−12μｇ）を用いた。３回
目の注射の後11日でマウスを放血させた。血清につき以
下の試験を行った。

（ｂ）放射性抗原結合検定この検定は、外的に［³H］−標識したGBMP（Jennings
H.J.,等、Determinant Specificities of the Gr
oups Ｂ and Ｃ polysacchairdes of Neisseria
meningitidis，J.Immunol.,134,2651（1985））又は
［³H］−標識Ｎ−Pr−GBMP（Jennings H.J.等、Unique
Intermolecular Bactericidal Epitope involving
the Homo−Sialo Polysaccharide Capsule on t
he Cell Surface of Group Ｂ Neisseria menin
gitidis and Escherichia coli K1,J.Immunol.,14
2,3585−3591（1989））を用いるファーテストの修正法
により行った。放射性抗原−結合検定のための反応混合
物は、それぞれ個別のＮ−アシル化GBMP−TT複合体で免
疫感作した20匹のマウスから採取し、PBSで100μＬに希
釈したプール抗血清20μＬと、50μＬのPBS中の［³H］
−標識GBMP及び［³H］−標識Ｎ−Pr−GBMPをエッペンド
ルフポリプロピレンミクロ試験管中で混合することによ
り得た。４℃で16時間インキュベートした後、150μＬ
の飽和（４℃で）硫酸アンモニウム（pH7.0）を試験管
に加え、試験管を攪拌して４℃で30分間放置した。試験
管を15,000rpmで10分間遠心し、130μＬのアリコート２
個を試験管から採取した。アリコートを2mLの水及びシ
ンチラント−含有キシレン（ACSシンチラント水溶液）
と混合し、混合物を液体シンチレーションカウンターで
カウントした。結果を表１に示す。

表１及び他の表で用いた略字：Ｎ −Ac−，Ｎ−Pr,Ｎ−Bu,Ｎ−IsoBu,Ｎ−Pen,Ｎ−Hex
は、Ｎ−アセチル、Ｎ−プロピオニル、Ｎ−ブタノイル
−、Ｎ−イソブタノイル−、Ｎ−ペンタノイル−、及び
Ｎ−ヘキサノイル−を示す。

数字1,2,3及び４は、４回繰り返した実験の結果であ
る。表１は、Ｎ−Bu−GBMP、Ｎ−IsoBu−GBMP、Ｎ−Pen
−GBMP及びＮ−Hex−GBMPにより誘起された抗血清への
Ｎ−Ac−GBMP（胎児Ｎ−CAMと同様のエピトープを有す
る）の結合が、Ｎ−Pr−GBMPにより誘起された抗血清へ
の結合より少ないことを明確に示している。このことか
ら、Ｎ−Bu−,N−IcoBu,N−Pen−及びＮ−Hex−多糖−
複合体により生ずる交叉反応性抗体がＮ−Pr−複合体よ
り少ないことを表１から推論することができる。

（ｃ）定量沈降分析これらの実験は、Kabat及びMayer,Experimental Imm
unochemistry Charles C.Thomas,Springfield,p.22
（1961）の方法により行った。抗−Ｎ−アシルGBMP−TT
血清（PBS中で５倍に希釈）のアリコート（100μＬ）
を、濃度を暫増させたＮ−アセチル（コロミン酸）、Ｎ
−プロピロニル、Ｎ−ブタノイル、Ｎ−イソブタノイ
ル、Ｎ−ペンタノイル及びＮ−ヘキサノイルGBMPと、全
体の体積を200μＬ（PBSで調節）として試験管内で反応
させた。これらの実験では、誘導体中の比較的分子量の
大きい留分を使用し、それは以前にＮ−アシル化GBMPの
フラグメントのサイジングに使用したUltragel AcA 4
4カラムの溶離物（FPLCで測定してK_Dが0.4）から得た。
試験管を４℃にて毎日攪拌しながら４日間インキュベー
トし、遠心し、Lowry等,Protein Measurement with
the Folin phenol reagent,J.Biol.Chem.,1933,265
（1951）の方法により抗体蛋白質の量を測定した。結果
を表２に示す。

交叉反応性に関して、表２の第１列は、Ｎ−Pr複合体
と比較してＮ−Bu及びＮ−Hex複合体により生ずる交叉
反応性抗体が非常に少ないことを示している。Ｎ−Pen
複合体もＮ−Pr複合体より少量の交叉反応性抗体を生ず
ることがわかる。

同族応答により免疫原性を見ると、表２から、Ｎ−Bu
−（2.60）、Ｎ−Pen−（6.35）、及びＮ−Hex−（4.4
0）GBMP−TT複合体がＮ−Pr−GBMP類似体（0.40）より
免疫原性が高いことがわかる。

（ｄ）ELISA EIA微量滴定プレート（Flow Labs,Mississauga,Onta
rio,Canada）のウェルに、GBMP−、ＮPrGBMP−又はＮBu
−GBMP−BSA複合体のいずれかを10μg/mLでPBSに溶解し
た溶液（100μL/ウェル）を塗布した。プレートを４℃
に18時間放置し、塗布後室温にて、PBS中１％の牛血清
アルブミンで10分間洗浄した（ブロッキング段階）。そ
の後、抗−マウス−Ｎ−アシルGBMP−TT複合体血清をPB
S中で順次10倍に希釈した希釈液100μＬをウェルに入
れ、プレートを室温で１時間インキュベートした。SBT
で洗浄後、やぎ抗マウス免疫グロブリンペルオキシダー
ゼ標識複合体（Kirkegard and Perry Laboratorie
s）の適した希釈液50μＬと共にプレートを室温で１時
間インキュベートし、ウェルの内容物を吸引し、プレー
トをSBTで５回洗浄した。最後に各ウェルに50μＬのテ
トラメチレンブルー−プルオキシダーゼ基質（TMB）（K
irkegard and Perry Laboratories）を加え、10分後
にMultiscan分光光度計（Flow Laboratories,Mississa
uga,Ont.）を用いて450nmにおける吸収を測定した。結
果を表３に示す。

ｂ同族Ｎ−アシル−GBMP−TT複合体によりマウス中に
誘起されたＮ−アシル特異的抗血清。

交叉反応性に関して表３から、Ｎ−Bu−GBMP−TT複合
体により生ずるＮ−Ac−GBMPに関する交叉反応性抗体
（1000）は、Ｎ−Pr−GBMP−TT複合体（7800）より少な
いことがわかる。その理由は、GBMPがＮ−Pr−GBMP−TT
複合体による抗体と結合する量が、Ｎ−Bu−GBMP−TT複
合体による抗体と結合する量より少ないためである。同
様のことがＮ−IsoBut−GBMP−TT複合体に関しても当て
はまる。

免疫原性に関して、52,000（Ｎ−Bu）及び40,000（Ｎ
−Pr）という同族結合力価が示す通り、Ｎ−Bu複合体の
方がＮ−Pr類似体より免疫原性が高い。

（ｅ）放射性結合阻害分析 PBS（80μＬ）に暫増する濃度で溶解した比較的大分
子のＮ−アシルGBMPインヒビターを20μＬのマウス抗−
Ｎ−Pr−GBMP−TT複合体抗血清に加えた。この量は、イ
ンヒビターの不在下で（³H）−標識Ｎ−Pr−GBMPの50％
が結合するのに十分な量である。試験管を37℃で１時間
インキュベートし、PBSに溶解した（³H）−標識Ｎ−Pr
−GBMP50μＬを加えた。穏やかに攪拌した後、試験管を
４℃で16時間インキュベートし、放射性抗原結合検定に
関して前述した通りに分析を行った。％阻害は、次式を
用いて算出した。

％阻害＝100x［（インヒビターを用いた場合のcpm−
インヒビターを用いない場合のcpm）／抗体を用いない
場合のcpm−インヒビターを用いない場合のcpc）］結果を表４に示す。

殺細菌性分析これらの分析は、Jennings等，J.Exp.
Med.,165,1207−1211（1987）記載の方法により行っ
た。

これらの分析では、ナイセリアメニンギチジス株Ｂ
（Ｍ 986）を用いた。結果を表５に示す。

表４は、Ｎ−Pr−GBMPのそれ自身の同族抗体に対する
結合に関して、Ｎ−Bu−GBMPがＮ−Pr−GBMPと同程度に
優れたインヒビターであることを示している。従ってＮ
−Pr−GBMPの代わりにＮ−Bu−GBMPを使用することによ
り、Ｎ−Pr−GBMPが示す特性が重大に失われることはな
い。表５は、Ｎ−Bu−GBMPが、Ｎ−Pr−GBMP−TT複合体
により生じた抗体に、Ｎ−Pr−GBMPと同程度に結合する
ことを示している。Ｎ−Bu−GBMP−TT及びＮ−Pr−GBMP
−TT両複合体により生じた抗体は、類似の殺細菌力価を
与える。この証明は、Ｂ群メニンゴコックスの表面の殺
細菌性エピトープを模倣する能力において、Ｎ−Bu−,N
−IsoBu−及びＮ−Pen−GBMPがＮ−Pr−GBMPと同等であ
ることを示唆している。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】本来の多糖のシアル酸残基Ｎ−アセチル基
がC₄−C₈−アシル基により置換され、修飾多糖の平均分
子量が10,000−50,000ダルトンの範囲である、ナイセリ
アメニンギチジスＢ群の修飾多糖。
【請求項２】本来の多糖のシアル残基Ｎ−アセチル基が
C₄−C₈−アシル基により置換された、収縮エシエリキア
コリK1莢膜多糖。
【請求項３】C₄−C₈アシル基をｎ−ブタノイル、イソブ
タノイル、ｎ−ペンタノイル、ｎ−へキサノイル、ｎ−
ヘプタノイル及びｎ−オクタノイルから成る群より選
ぶ、請求の範囲１に記載の修飾多糖。
【請求項４】アシル基をｎ−ブタノイル、イオブタノイ
ル、ｎ−ペンタノイル及びｎ−へキサノイルから成る群
より選ぶ、請求の範囲３に記載の修飾多糖。
【請求項５】C₄−C₈アシル基をｎ−ブタノイル、イソブ
タノイル、ｎ−ペンタノイル、ｎ−へキサノイル、ｎ−
ヘプタノイル及びｎ−オクタノイルから成る群より選
ぶ、請求の範囲２に記載の修飾多糖。
【請求項６】アシル基をｎ−ブタノイル、イソブタノイ
ル、ｎ−ペンタノイル及びｎ−へキサノイルから成る群
より選ぶ、請求の範囲５に記載の修飾多糖。
【請求項７】シアル酸残基Ｎ−アセチル基の27−100％
がC₄−C₈アシル基により置換された請求の範囲１に記載
の多糖。
【請求項８】シアル酸残基Ｎ−アセチル基の27−100％
がC₄−C₈アシル基により置換された請求の範囲２に記載
の多糖。
【請求項９】シアル酸残基Ｎ−アセチル基の90％−100
％がC₄−C₈アシル基により置換された、請求の範囲１に
記載の修飾多糖。
【請求項１０】シアル酸残基Ｎ−アセチル基の90％−10
0％がC₄−C₈アシル基により置換された、請求の範囲２
に記載の多糖。
【請求項１１】シアル酸残基Ｎ−アセチル基がＮ−C₄−
C₈アシル基に置換されたナイセリアメニンギチジスの
修飾Ｂ群多糖を、免疫学的に適した蛋白質と複合させさ
含む抗原性複合体。
【請求項１２】アシル基をｎ−ブタノイル、イソブタノ
イル、ペンタノイル、へキサノイル、ヘプタノイル及び
オクタノイルから成る群より選ぶ、請求の範囲11に記載
の複合体。
【請求項１３】アシル基をｎ−ブタノイル、イソブタノ
イル、ペンタノイル及びへキサノイルから成る群より選
ぶ、請求の範囲12に記載の複合体。
【請求項１４】蛋白質を破傷風トキソイド、ジフテリア
トキソイド、交叉反応材料（CRM）及び細菌蛋白質キャ
リヤーから成る群より選ぶ、請求の範囲11に記載の複合
体。
【請求項１５】蛋白質及び多糖を−CH₂−NH−蛋白質結
合を経て共有結合により結合する、請求の範囲11に記載
の複合体。
【請求項１６】CRMがCRM₁₉₇である、請求の範囲14に記
載の複合体。
【請求項１７】請求の範囲11に記載の複合体を有効成分
として含んでなる、ナイセリアメニンギチジスの感染
に対して哺乳類の免疫応答能を高めるためのワクチン。
【請求項１８】さらに生理学的に許容されるアジユバン
トを含む、請求の範囲17に記載のワンチン。
【請求項１９】該アジユバントを水酸化アルミニウム、
リン酸アルミニウム及び硫酸アルミニウムから成る群よ
り選ぶ、請求の範囲18に記載のワクチン。
【請求項２０】ナイセリアメニンギチジス及びエシエ
リキアコリに感染し易いヒト以外の哺乳類に、治療上
有効量の請求の範囲17に記載のワクチンを非経口的に投
与する段階を含む、ナイセリアメニンギチジス及びエ
シエリキアコリ感染に対して免疫感作する方法。
【請求項２１】ワクチンを体重１キログラム当たり１−
25マイクログラムの投薬量で投与する、請求の範囲20に
記載の方法。
【請求項２２】請求の範囲19に記載のワクチンでヒト以
外の哺乳類を感作し、該哺乳類からガンマグロブリンを
回収することにより製造した、Ｂ群ナイセリアメニン
ギチジス及びエシエリキアコリによって起こる髄膜炎
に対る受動保護の可能なガンマグロブリン画分。
【請求項２３】免疫に適するタンパク質に共役したナイ
セリアメニンギチジスＢ群又はエシエリキアコリK1
の修飾多糖を含んでなる抗原性複合体の製造方法であっ
て、該多糖のシアル酸残基Ｎ−アセチル基がＮ−C₄−C₈
−アシル基により置き換えられているものであり、かつ（ａ）ナイセリアメニンギチジスＢ群又はエシエリ
キアコリK1の多糖をＮ−脱アセチル化する工程、（ｂ）工程（ａ）でＮ−脱アセチル化された多糖をＮ
−アシル化してＮ−アシル化多糖を生成する工程、及び（ｃ）工程（ｂ）で得られたＮ−アシル化された多糖
を免疫に適するタンパク質キヤリヤーに共役させて前記
複合体を生成する工程、を含んでなる方法。
【請求項２４】該アシル基ｎ−ブタノイル、イソブタノ
イル、ペンタノイル、へキサノイル、ヘプタノイル及び
オクタノイル基から成る群より選ぶ、請求の範囲23に記
載の方法。