SI20008A - Izboljšano meningokokalno polisaharidno konjugirano cepivo - Google Patents

Izboljšano meningokokalno polisaharidno konjugirano cepivo Download PDF

Info

Publication number
SI20008A
SI20008A SI9110243A SI9110243A SI20008A SI 20008 A SI20008 A SI 20008A SI 9110243 A SI9110243 A SI 9110243A SI 9110243 A SI9110243 A SI 9110243A SI 20008 A SI20008 A SI 20008A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
group
polysaccharide
conjugate
protein
gbmp
Prior art date
Application number
SI9110243A
Other languages
English (en)
Other versions
SI20008B (en
Inventor
Harold J. Jennings
Francis Michon
Original Assignee
National Research Council Of Canada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Research Council Of Canada filed Critical National Research Council Of Canada
Publication of SI20008A publication Critical patent/SI20008A/sl
Publication of SI20008B publication Critical patent/SI20008B/sl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1228—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K16/1232—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia from Escherichia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

Polisaharid skupine B Neisseria meningitidis (GBMP), ki je modificiran tako, da ima ostanek sialinske kisline N-acetilne skupine nadomeščen z N-acilnimi skupinami, izkazuje naglašen imunski odgovor, poleg tega pa je minimalizirana indukcija protiteles, ki z nemodificirano skupino B meningokokalnih in E. coli K1 polisaharidov ovojnice in drugimi celičnimi tkivi, ki imajo skupen epitop, reagirajo navzkrižno. Konjugiranje modificiranega polisaharida s fiziološko sprejemljivim proteinom, kakršen je tetanusni toksoid, inducira nastanek specifičnih zaščitnih protiteles z zanemarljivim dvigom količine GBMP navzkrižno reaktivnih protiteles, s čimer omogočimo zaščito proti infekcijam, ki jih povzročajo meningokoki skupine B in E. coli K1.ŕ

Description

IZBOLJŠANO MENINGOKOKALNO POLISAHARIDNO KONJUGIRANO CEPIVO
Predmenti izum se nanaša na kemično modificirano skupino B polisaharidov Neisseria meninigitidis (Epidemični meningitis; Op. prev.). Izum poleg tega zagotavlja tudi izdelavo cepiv, v katerih so ustrezno modificirani poisaharidi konjugirani na proteinski nosilec.
Stanje tehnike
Meningitis, ki ga povzroča skupina B N.meningitidis in E.coli Ki ostaja glavni svetovni zdravstveni problem.
Skupina B meningitis se pojavlja v endemskih in epidemskih situacijah, izračunano pa je bilo, da obsega okoli polovico vseh zabeleženih primerov meningokokalnega meningitisa, medtem ko KI pozitivne E. coli povzročajo meningitis pri novorojenčkih. Trenutno proti boleznim, ki jih povzroča skupina B meningokokov in E. coli KI ne obstaja komercialno dostopno cepivo. To je v veliki meri pogojeno z dejstvom, da je meningokokalni polisaharid skupine B (GBMP), za ljudi slabo imunogena. Nedavno tega so bila predstavljena cepiva, osnovana na kompleksih GBMP z zunanjo proteinsko membrano, katerih učinkovitost pri ljudeh pa še vedno ostaja neznana.
Nedolgo tega je bil razvit nov koncept cepiv, ki je osnovan na sintetično kemično modificirani (Npropionilirani) skupini B polisaharid-protein (N-Pr-GBMPprotein) konjugatu. Cepivo inducira v miših visoke titre IgG protiteles, ki niso le zaščitna, temveč reagirajo z nemodificiranimi GBMP tudi križno (t.j. N-actil-GBMP). Ta koncept je bil opisan in zaščiten v ZDA patentu št. 4 727 136, z dne 23. februarja, 1988 od Harold J. Jennings et al.
Ugotovljeno je bilo, da je cepivo, ki poveča navzkrižno reaktivna protitelesa, kakršna so tista, ki so bila opisana v ZDA patentu št. 4 727 136, lahko učinkovito le na račun prekinitve imunske tolerance. Hipoteza je bila potrjena z identifikacijo splošnega epitopa, ki je sestavljen iz a-(28)-vezanih ostankov sialinske kisline (z minimalno potrebo 10 ostankov) v prirojenemu N-Ac-GBMP človeškem ali živalskem tkivu (Jennings, Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Krager, 1989, vol. 10, 151-165). Te polisialozilne verige delujejo kot razvijajoči antigeni in so v večini vezani s fetalnim stanjem v embrionski nevtralni celični adheziji (Finne et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 1983, 112, 482). Tekom post-natalnega dozorevanja se ta antigen zadržuje v supresiranem stanju (Friedlander et al., J. Celi Biol.,
1985, 101, 412), a se ekspresira v odraslih ljudeh tekom regeneracije obolelega mišičja (Cashman et al., Proč. Natl. Acad. Sci. 1988, 85, 299) in v naravnih morilskih celicah (NK) in CD3+T celicah (Husmann et al., Eur. J. Immunol.
1989, 19, 1761). Čeprav posledice tega prekinjanja tolerance na omenjene fetalne antigene še ni bila razjasnjena, pa v splošnem prevladuje mnenje, da morajo zaradi te navzkrižne reakcije, N-Pr-GBMP-protein konjugat resno proučiti v agencijah z ustreznimi pooblastili, kar pomeni izdatne stroške in zavlačevanje zaradi kompleksnosti eksperimentacije, ki je potrebna za dokazovanje varnosti cepiva pred odobritvijo te v komercialne namene.
Predmet tega izuma je razvoj cepiva, ki ima imunogene lastnosti, ki so ojačane glede na tiste za N-Pr-GBMPprotein. Poleg tega je predmet tega izuma tudi omogočanje cepiva, ki kaže zmanjšano navzkrižno reaktivnost z GBMP.
Opis izuma
V enem izmed aspektov tega izuma je podan modificirani B polisaharid Neisseriae meningitidis, ki ima sialinski kislinski ostanek, N-acetil (C2) skupine zamenjan s
C4-8 acilno skupino.
V drugem aspektu tega izuma pa je podan antigenski konjugat, ki obsega N-C4-C8 acilni polisaharid, konjugiran na imunološko ustrezen protein, ki ima naglašeno imunogenost z znatno zmanjšano možnostjo indukcije navzkrižno-reaktivnih protiteles.
V naslednjem aspektu tega izuma pa je podano tudi cepivo, ki vključuje N-C4-C8 acilni polisaharid-protein konjugat, skupaj z ustreznim nosilcem ali razredčevalcem. Cepiva tega preparata lahko vključujejo tudi terapevtsko učinkovito količino adjuvanta, ki je ustrezen za uporabo na ljudeh, npr. aluminijevega fosfata ali aluminijevega hidroksida.
V nadaljnjem aspektu tega izuma je podan postopek imunizacije sesalcev proti N. meninigitidis in E. coli KI inferkcijam in vključuje parenteralno vnašanje imunološko učinkovite doze cepiva tega izuma v sesalski osebek, vključno v človeka, z omenjenim načinom inficiranja. Cepivo dajemo v splošnem v količinah od okoli 1 do 50 mikrogramov na kilogram telesne teže, npr. 5-25 mikrogramov na kilogram telesne teže.
V še nadaljnjem aspektu tega izuma pa je podana gama globulinska frakcija, ki je sposobna ščititi proti meningitisu, ki ga povzroča skupina B N. meningitidis in E. coli KI. Frakcijo pridobimo z imunizacijo sesalcev s cepivom tega izuma. Frakcijo dajemo individualno, da bi tako zagotovili zaščito proti ali za zdravljenje infekcije v toku, ki je bila povzročena z zgoraj omenjenimi organizmi.
Iz tega je razvidno, da so imunogeni preparati konjugatov cepiva, izvor terapevtskega antiseruma v luči njihove ustrezne imunogenosti z minimalno indukcijo GBMP navzkrižno reaktivnih protiteles. Konjugat izuma se lahko prav tako uporabi tudi za porast števila monoklonalnih protiteles in mogoče tudi antidiotipičnih protiteles.
S prvimi eksperimenti smo ugotovili, da večina bakterijskih in zaščitnih protiteles induciranih z N-PrGBMP-proteinskim konjugatom, ki je bil opisan v naprej navedenemu Jennigs et al., ZDA patentu št. 4 727 136, ni povezana z GBMP navzkrižno reaktivnimi protitelesi. Dejansko je večina zaščitne aktivnosti vsebovana v N-Pr-GBMPspecifični populaciji protiteles, ki ne reagirajo navzkrižno z GBMP. V luči tega verjamemo, da N-Pr-GBMP podpira bakterijski epitop na površini skupine B meningokokov.
Izum je zasnovan na odkritju, da je mogoče sintetizirati kemično modificirane GBMP-je, ki podpirajo bakterijski epitop in ki v svoji konjugirani obliki ne kažejo le naglašene imunogenosti, temveč tudi močno znižujejo indikcijo protiteles, ki navzkrižno reagirajo z GBMP.
Pri odkritju tega izuma, so bili sintetizirani številni različni, kemično modificirani GBMPji, ki so bili nato individualno konjugirani na protein, čemur je sledila injekcija konjugata v miši, kar smo primerjali s tistimi spojinami, ki smo jih pridobili s pomočjo N-Pr-GBMPproteinskega konjugata. Na naše presenečenje smo ugotovili, da N-C4—C8 acil GBMP-proteinski konjugati, npr. n-butanoil, izo-butanoil, n-pentanoil, izo-pentanoil, neo-pentanotil, heksanoil, heptanoil in oktanoil ter še posebej N-butanoil (N-Bu) GBMP-proteinski konjugati, podpirajo bakterijski epitop z znatno zmanjšano indukcijo navzkrižno-reaktivnih protiteles.
Podroben opis izuma
Iz N. meningitidis je bila izolirana skupina B meningokokalnih polisaharidov, uporabili pa smo postopke, ki so v tej stroki že znani. V enem izmed postopkov smo v fermentatorju vzgojili B. meningokoke (vrsta 981B) pri
37°C, kjer smo uporabili 30 g dehidrirane Todd Hewitt juhe (Difco Laboratories, Detroit Michigan) na liter destilirane vode. Pred fermentacijsko rastjo je liofilizirana vrsta rastla v svetli posodi na 37°C na 5% (v/v - volumen/volumen, Op. prev.) agarnih ploščah ovčje krvi (Difco Laboratories, Detroit Michigan). Bakterije smo nato prenesli v 1,0 liter Todd Hewitt Broth (kakor je omenjeno spodaj) v erlenmajerici, ki smo jo vrteli in tako mešali 7 ur na 37°C pri 190 obr/min. Ta inokulum smo nato prenesli v fermentator. Po fermentirani rasti (16 ur) smo bakterije pobili z dodatkom formalina do končne koncentracije 0.75%. Bakterije smo nato odstranili z neprestanim centrifugiranjem, iz supernatanta pa smo izolirali skupino B meningokokalnih polisaharidov ter jih prečistili na način, ki je bil opisan s strai Bundle et al., J. Biol. Chem., 249, 4797-4801 (1974) z izjemo tega, da smo protein ekstrahirali z mešanjem raztopine surovega polisaharida s hladnim, 90% fenolom (4°C) namesto s toplim (50-60°C) . Ta zadnji postopek omogoča pridobivanje visoko-molekularnih oblik GBMP.
E.coli (018: KI: H7) (NRCC 4283) so rastle na 37°C v fermentatorju in destilirani vodi, ki je vsebovala dehidriramo možgansko srčno infuzijo (BHI, 37 g/1) (Difco Laboratories, Detroit, Michigan). Pred fermentno rastjo je liofilizirana vrsta rastla na 50 ml BHI raztopine (enak kakor prej) v erlenmajerici, ki smo jo mešali 7 ur na 37°C na 200 obr/min. To smo nato prenesli v 1,5 1 BHI (kakor spodaj), nato pa smo jo pustili rasti še 7 ur. Inokulum smo nato prenesli v fermentator.
Postopki, ki so bili uporabljeni pri izolaciji in prečiščevanju polisaharida ovojnice E. coli KI, so bili identični tistim, ki so opisani spodaj za izolacijo skupine B meningokokalnih polisaharidov. Ocenjujemo, da postopki izolacije in prečiščevanja , ki so opisani spodaj niso edini, ki jih lahko uporabimo, ter lahko namesto njih uporabimo tudi druge objavljene postopke, npr. tiste, ki jih je opisal Watson et al., J. Immunol. 81, 331 (1958) in tiste, ki so bili opisani v naprej omenjenem ZDA patentu št. 4 727 136.
Naravni polisaharid je bil N-deacetiliran, da bi tako zagotovili reaktivne amino skupine v ostanku sialinske kisline, ki je del molekule. To lahko izvedemo z znanimi postopki, npr. v bazičnem vodnem okolju na zvišanih temperaturah, npr. okoli 90-110°C na pH, ki znaša od okoli 13 do 14. Za bazično vodno okolje se priporoča uporaba vodne raztopine hidroksida alkalne kovine, kakršen je npr. natrijev hidroksid na okoli 2 M koncentracije. Poleg tega lahko uporabimo tudi hidrazin v vodni raztopini. Stopnja Ndeacetilacije se lahko, v odvisnosti od pogojev, spreminja od 30 do 100%. Priporočljivo pa je doseganje 90-100% stopnje N-deacetilacije. N-deacetilirani produkt lahko izločimo npr. s hlajenjem, nevtralizacijo, prečiščevanjem ali liofilizacijo.
Pred postopkom N-deacetilacije ima naravni polisaharid povprečno molekulsko maso v obsegu od 500.000 do 800.000 daltonov. Kakor produkt N-deacetilacije nastanejo fragmenti polisaharidov, ki imajo povprečno molekulsko maso od okoli 10.000 do 50.000 daltonov.
N-deacetilirani polisaharidni fragmenti se v tem stanju N-acetilirajo, da bi tako pridobili ustrezen N-acetiliran produkt. N-acetilacijo lahko izvedemo z razgrajevanjem Ndeacetiliranega polisaharida v vodnem okolju, katerega pH se giblje med 7,5 in 9,0, kar spremljamo z dodajanjem ustreznega acilnega anhidrida, po izbiri z alkoholom, da bi tako povečali topnost, ter s hlajenjem pod temperaturo 10°C do konca reakcije. Reakcijska sredstva lahko po potrebi prečistimo, npr. z dializo, N-aciliran proizvod pa lahko izločimo npr. z liofilizacijo. Reakcija se v glavnem konča v času 10 do 20 ur. Stopnjo N-acilacije, ki jo izmerimo z analitičnimi tehnikami, navadno z IH NMR, je vsaj 90% ali blizu 100%. Reakcija N-acilacije ne daje znatno znižanje molekulske mase fragmentov.
V skladu s predmetnim izumom je, zaradi konjugacije, prednostna, izbira N-aciliranega materiala, ki ima povprečno molekulsko maso, ki ustreza od okoli 30 pa do 200 ostankov sialinske kisline. To navadno omogočimo s pomočjo gel filtracije N-acetiliranega GBMP, kjer uporabimo Ultragel (Blagovna znamka; Op. prev.) AcA 44 (polmer kroglic znaša 60 do 140 mikrometrov) kolone in PBS za eluent. Alternativno temu lahko uporabimo tudi membrano ustrezne velikosti.
Pri tem izumu uporabljamo N-acilirani material molekulske mase od 10.000 do 40.000 Daltonov, npr. 10.000-15.000 Daltonov. Tega smo pridobili z zbiranjem frakcij eluata kolone, ki vsebuje N-acilirani GBMP material s povprečno molekulsko maso, ki pade v omenjeni obseg. Za N-acilirani material višje povprečne molekulske mase, npr. v obsegu od 30.000 do 40.000 Daltonov je bilo dokazano, da je uporaben v namene tega izuma.
Cepiva po predmetnem izumu pridobimo s konjugatom Naciliranega polisaharida z imunološko sprejemljivim nosilnim proteinom. Priporočamo, da naj bo pri tem imunogen tudi sam nosilni protein. Primeri ustreznih nosilnih proteinov so tetanusni toksoid, difteria toksoid, materiali, ki reagirajo navzkrižno (CRMs), prednostno CRM 197, ki smo ga dobili pri dobavitelju Sccavo Ltd., Siena, Italy in bakterijski proteinski nosilci, npr. proteini meningokokalne zunanje membrane.
Za konjugacijo modificiranih polisaharidnih fragmentov z nosilnih proteinom lahko uporabimo enega izmed že znanih načinov konjugacije. Najbolj priporočljiv postopek je bil opisan v ZDA patentu št. 4 356 170, ki opisuje uvajanje terminalnih aldehidnih skupin (preko oksidacije cisvicinalnih hidroksilnih skupin) v N-aciliran polisaharid in s povezovanjem aldehidnih skupin na proteinske amino skupine z reduktivno aminacijo. Polisaharid in protein se tako povežeta preko -CH2~NH-proteinske povezave.
Seveda pa moramo razumeti, da konjugirana cepiva tega izuma niso omejena na tista, ki so bila pridobljena s pomočjo reduktivne aminacije. Tako lahko cepiva pridobimo tudi s konjugiranjem N-aciliranega polisaharida z nosilnim proteinom, kjer uporabimo adipinski dihidrazidni držalec razdalje, kar je opisal Schneerson R. et al., Preparation, Characterization and Immunogenicity of Haemophilus influenzae type b Polysaccharide Protein Conjugates, J. Exp. Med. 1952, 361-476 (1980) ter v ZDA patentu št. 4 644 059 od Lance K. Gordona. Poleg tega lahko uporabimo tudi tehniko dvojnega držalca razdalje, ki jo je razvil Merck, kar sta opisala Marburg S. et al., Biomolecular Chemistry of Macromolecules : Synthesis of Bacterial Polysacharide Conjugates with Neisseria meningitidis Membrane Protein, J. Am. Chem. Soc., 108, 5 282-5287 (1986) ali mogoče metodologije zmanjšanja koncev, kakor jo je opisal Anderson v ZDA patentu št. 4 573 574.
Pridobljeni N-acilirani polisaharid-proteinski konjugati nimajo značilno izraženega navzkrižnega povezovanja in se dobro topijo v vodnih raztopinah. To pripravljanje konjugatov tega izuma je dober kandidat za uporabo pri izdelavi cepiv.
Dobljeni N-acilirani-polisaharid-proteinski konjugati tega izuma so bili testirani in vitro na miših, kjer je bilo dokazano, da imajo, v primerjavi z N-propioniranimpolisaharidom, izoljšane imunogene lastnosti. Poleg tega je bilo opaziti tudi znatno zmanjšanje tvorjenja navzkrižno reaktivnih protiteles. V luči teh ugotovitev verjamemo, da bodo cepiva tega izuma uporabna proti meningitisu, ki ga povzroča skupina B N. meningitidis ali E. coli KI organizmi. Še posebej zanimiva so cepiva, ki bi od bakterijskega meningitisa zaščitila otroke. Cepiva izuma se navadno pridobijo z disperziranjem konjugata v farmacevtsko sprejemljivem, kakršen je fiziološka raztopina soli ali druge tekočine, ki jih lahko injiciramo v človeka. Cepivo vnašamo parenteralno, npr. podkožno, intraperitonealno ali intramuskularno. Poleg tega so lahko prisotni tudi običajni aditivi, kot stabilizatorji, kakršna sta laktoza ali sorbitol in adjuvanti, kakršni so aluminijev fosfat, hidroksid in sulfat.
Ustrezna doza za otroke se navadno giblje v obsegu od okoli 5 do 25 mikrogramov, ali okoli 1 do 10 mikrogramov na kilogram telesne teže.
Primeri
Izum je ilustriran z naslednjimi, neomejujočimi primeri. Sinteizirali smo N-acetil, N-propionil, N-butanoil, Nizoutanoil, N-pentanoil in N-heksanoil-GBMP-proteinski konjugati, da bi jih lahko ocenili, o rezultatih pa razpravljamo v primerih.
Material in postopki za pridobivanje konjugatov (a) Material
Propionski, butanojski, izobutanojski, pentanojski in heksanojski anhidridi so bili, skupaj s kolominsko kislino, pridobljeni od Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO. Ker je kolominska kislina strukturno identična s skupino B meningokokalnega polisaharida (GBMP), jo nadalje označujemo kakor enako GBMP. Tetanusni toksoid (TT) smo dobili od Institute Armand Frappier, Lavel, Quebec, njegova monomerna oblika, ki je bila uporabljena v vseh konjugacij ah, pa je bila pridobljena s prevajanjem zgornjega preparata preko Bio-Gel (blagovna znamka; Op. prev.) A 0,5 (200-400) kolone (1,6 x 90 cm) (Bio-Rad, Richmond, CA), ki je bila uravnotežena in eluirana s fosfatno pufrirano fiziološko raztopino (PBS) (pH 7,4).
(b) N-deacilacija GBMP j a
GBMP (Na+ sol) (1,0 g) smo raztopili v 5 ml 2 M NaOH, kar smo spremljali z dodajanjem NaBH4 (50 mg) . Raztopino smo greli 6 ur na 110°C v sodu (60 ml) s Teflonskim čepom na fraf. Postopek je bil v večjem delu enak tistemu, ki je bil opisan v J. Immunol., 134, 2651 (1985) in ZDA patentu 4 727 136, oba od Harold J. Jennings et al.. Ohlajeno raztopino smo nato izčrpno dializirali napram destilirani vodi na 4°C, nato pa liofilizirali. Da je bil N-deacetilirani GBMP pridobljen, smo potrdili z odsotnostjo metilacetamidnega signala (singlet na delta 2,07) v IH NMR spektru Ndeacetiliranega GBMPja.
(c) N-acilacije GBMPja
N-acetilirani GBMP (1,0 g) smo raztopili v 50 ml 5% vodne raztopine NaHCO3. 5 induvidualnim alikvotom (10 ml zgoraj omenjene raztopine) smo dodali propionski, butanoinski , izobutanoinski ali heksanoinsi anhidrid. Te reagense smo dodali v 3 x 0,5 ml alikvotih tokom 3 ur na sobni temperaturi, raztopino pa smo med tem vzdrževali na pH 8,0 s pomočjo 0,5 N NaOH. Simultano z vsakim dodatkom anhidrida smo dodajali tudi metanol (0,5 ml), da bi tako povečali njegovo topnost. Na koncu, raztopine še mešamo 16 ur na 4°C, nakr jih izčrpno dializiramo napram destilirani vodi na 4°C, nakar jih liofiliziramo. Tako individualno pridobimo Npropioniliran, N-butanoiliran, N-izobutaniliran, Npentanoiliran in N-heksanoiliran GBMP v doprinosih, ki presegajo 90%. V vsakem primeru pa se konec N-acilacije potrdi z izginotjem v ustreznem 1H-NMR spektru Ndeaciliranega GBMP.
(d) Urejanje različnih N-aciliranih GBMPjev po velikosti fragmentov
Da bi dobili želj ene povprečne molekulske mase Nacetiliranega GBMP materiala smo izvedli gel filtracijo, kjer smo uporabili Ultragel (tržno ime) AcA 44 (polmer kroglic 60-140 pm) kolono (IBF). Frakcije, ki so bile zrane iz eluirane kolone na KD 0,5 do 0,7, kakor je bilo izmerjeno s pomočjo FLPC (glej nižje) so bile zbrane, dializirane in liofilizirane. Omenjeni obseg KD vrednosti ustreza Naciliranemu GBMP z 30 do 50 ostanki sialinske kisline (povprečna molekulska masa znaša 10.000-15.000 Daltonov, tipično pa 12.000 Daltonov). Frakcije, ki spadajo v območje KD od 0,2 do 0,4, kar ustreza fragmentom, ki imajo povprečno molekulsko maso v obsegu od 30.000 do 40.000 Daltonov, so bile prav tako zbrane in konjugirane. Tako je še posebej zanimiv N-acilirani material, eluiran v KD območju 0,2 do 0,7.
(e) Polisaharidni konjugati
Terminalne aldehidne skupine uvajamo v N-acilirani GBMP s perjodatno oksidacijo (glej ZDA patent št. 4 356 170). Nacilirane GBMP fragmente smo nato oksidirali v 0,1 M vodnem Nalo4 (natrijev metaperjodat) (10 ml) tokom 2 ur na sobni temperaturi in v temi. Presežek perjodata smo nato razgradili z dodatkom 1 ml etilen glikola, raztopino pa smo izčrpno dializirali na 4°C in liofilizirali. Uporaba NaBH4 daje v postopku N-deacilacije (z izjemo za GBMP) transformacijo terminalnih ostankov sialinske kisline vsakega izmed N-aciliranih GBMP v odprt verigo polionskih ostankov. Ta tip ostankov je občutljiv na perjodat (glej J. Immunol., 127, 1011 (1981) in ZDA patent št. 4 356 170, Harold J. Jennings et al.), kar privede do uvajanja aldehidnih skupin v N-acilirani GBMP fragment na obeh koncih.
Oksidirane fragmente (100 mg) smo raztopili v 0,1 M NaHCO3 (pH 8,1) pufru (2 ml), nakar raztopini dodamo TT (20 mg). Nato dodamo še natrijev cianoborohidrid (NaCNBH3) (40 mg), raztopino pa počasi mešamo pri sobni temperaturi. Tok konjugacije spremljamo s pomočjo FPLC, uporabljamo pa gel filtracijsko kolono, ki vsebuje Superose (tržno ime) 12 HR10/30 (Pharmacia), izokratično na lml/min v PBS pufru na pH 7,2. Protein in N-acilirani fragment spremljamo na 214 nm. Fragmenti imajo KD 0,23. Konjugacija se konča, ko se porabi ves TT, kar ugotovimo z izginotjem vrha v FPLC kromatografu, ki ustreza komponenti na KD 0,39. V večini primerov se konjugacija konča v roku 2 dni, kljub temu pa ostaja za skupen reakcijski čas, čas 4 dni. Potencialno nezreagirane aldehidne skupine se končno reducirajo z natrijevim borohidridom (20 mg) pred gel filtracijo. Polisaharidne TT konjugate ločimo od polisaharidnih fragmentov z gel filtracijo, kjer uporabimo Bio gel A kolono s PBS kot eluentom. Eluent, ki vsebuje konjugat dializiramo napram destilirani vodi, nakar ga liofiliziramo. N-acilirani GBMP-TT konjugati vsebujejo od 12 do 30%, najpogosteje od 12 do 20% sialinske isline, kakor smo ugotovili s pomočjo rezorcinske metode, ki jo je opisal Svenneholm L., Quantitative Estimation of Sialic Acids, II A Colorimetric Resorcinol-Hydrochloric Acid Method, Biochem. Biophys. Acta, 24, 604 (1957). Rezultati so pokazali, da znaša molarni odnos konjugatov polisaharidov proti TT, 2-3 : 1, v tem vrstnem redu.
Imunizacija in imunske preiskave (a) Postopki imunizacije samic belih miši CFI (starih od 8 do 10 tednov), smo imunizirali intraperitonealno (3 krat na tromesečne intervale), kjer smo vsako od miši imunizirali individualno z N-aciliranim GBMP-TT konjugatom v Freundovem adjuvantu (FCA) (Difco, Detroit, MI). Pri vsaki imunizaciji smo uporabili dovolj veliko količino konjugata (10-12 gg), da smo s tem omogočili vnašanje 2 gg sialinske kisline. 11 dni po tretji injekciji so bili miši slabokrvne. Na serumu smo nato izvedli naslenje preiskave.
(b) Radioaktivna preiskava vezanja antigena
To preiskavo smo izvedli s pomočjo modificirane Farrove tehnike, kjer smo uporabili zunanje /3H/-obeležen GBMP (Jennings H. J. et al., Determinant Specificities of Groups B and C Polysaccharides of Neisseria Meningitidis, J. Immunol., 134, 2651 (1985) ali /3H/-obeležen N-Pr-GBMP (Jennings H. J., et al., Unique Intermolecular Bactericidal Epitope, ki vključuje Homo-Sialo Polisaharidno ovojnico na površini celične skupine B Neisseria meningitidis in Escherichia Coli KI, J. Immunol., 142, 3585-3591 (1989). Reakcijsko zmes za radioaktivno preiskovanje vezanja antigena smo dobili z mešanjem v Eppendorffovih propilenskih mikro testnih epruvetah, 20 gl zbranega antiseruma iz skupine 20 miši, ki so bile vsaka posebej imunizirane z Naciliranim GBMP-TT konjugatom, smo razredčili do 100 gl s PBS, z /3H/-obeleženim GBMP in /3H/-obeleženim N-Pr-GBMP v 50 gl PBS-a. Po inkubaciji na 4°C, ki je trajala 16 ur, smo v epruvete dodali 150 gl nasičenega (na 4°C) amonijevega sulfata (pH 7,0), nakar smo te premešali nato pa jih pustili stati na 4°C v trajanju 30 minut. Epruvete smo nato centrifugirali na 15.000 obr/min. 10 minut, iz cevi pa smo vzeli 2 alikvota, veličine 130 gl. Alikvote smo zmešali z 2 ml vode in kisline, ki vsebuje scintilant (ASC vodeni scintilat), zmesi pa so bile preštete v tekočem scintilacijskem števcu. Rezultati so podani v tabeli 1.
Tabela 1
Vezava /3H/-obeleženega N-Ac-GBMP na različne mišje anti-N-acil-GBMP-TT konjugirane serume.
Antiserum Odstotek vezave3
1 2 3 4
N-Pr-GBMP-TT 41 40 39 12
N-Bu-GBMP-TT 4 4 7 4
N-IsoBu-GBMP-TT 9 - - -
N-Pen-GBMP-TT 36 - - -
N-Hex-GBMP-TT 16 - - -
Opomba:
a- Na zbranem antiserumu iz 20 imuniziranih miši so bili izvedeni 4 eksperimenti tvorjenja vezi.
Oznake, ki smo jih uporabili v Tabeli 1 in v drugih tabelah so naslednje:
Ν-Ac-, N-Pr-, Ν-Bu-, N-IsoBu-, Ν-Pen-, N-Hextand- za Nacetil-, Ν-propionil-, N-butanoil-, Ν-izobutanoil-, Npentanoil- in N-heksanoil-.
Številke 1, 2, 3 in 4 so rezultati 4 ponovljenih eksperimentov. Tabela 1 prikazuje zaključek, da se N-Ac-GBMP (ki nosi epitop kot fetalni N-CAM) veže manj na antiserum, ki je bil induciran s pomočjo N-Bu-GBMP, N-IsoBu-GBMP, NPen-GBMP in N-Hex-GBMP kakor na tistega, ki je bil induciran s pomočjo N-Pr-GBMP. Iz tega lahko zaključimo, da Ν-Bu-, NIsoBu-, Ν-Pen- in N-Hex-polisaharid-konjugati povišajo manj navzkrižno-reaktivna protitelesa kot N-Pr-konjugata.
(c) Kvantitativne analize z obarjanjem
Ti eksperimenti so bili izvedeni s pomočjo metode po Kabat in Mayer, Experimental Immunochemistry Charles C. Thomas, Springfield, str. 22 (1961). Alikvote (100 μΐ) anti-N-acil
GBMP-TT seruma (razredčeni 5 krat v PBS), smo zreagirali v epruvetah z rastočimi koncentracijami N-acetil (kolominska kislina), N-propionil, N-butanoil, N-izobutanoil, Npentanoil in N-heksanoil GBMP v skupni prostornini 200 μΐ (uravnovešeno s PBS). Frakcije večih molekulskih mas teh derivatov smo uporabili v teh eksperimentih, dobljene pa so bile iz eluata Ultragel AcA kolone (KD 0,4, kot je bilo izmerjeno s FPLC) in so bile predhodno uporabljene do velikosti fragmentov od N-acetiliranega GBMP. Epruvete smo inkubirali na 4°C 4 dni z vsakodvnevnim mešanjem. Za tem jih centrifugiramo, količino proteinov protiteles pa določimo po metodi od Lowry et al., Protein Measurment with Folin phenol Reagent, J. Biol. Chem., 1933, 265 (1951). Rezultati so podani v Tabeli 2.
Tabela 2
Usedanje3 mišjega anti-N-acil-GBMP-TT seruma pri uporabi različnih N-acil GBMPjev kot antigenov obarjanja.
Antiserum N-acil-GBMP antigen
N-acetil N-propil N-butil N-pentil N-heksil
N-Pr-GBMP-TT 0,16 0,40 0,20 0,15 0,15
N-Bu-GBMP-TT 0,04 1,15 2,60 3,20 1, 90
N-Pen-GBMP-TT 0,13 0,38 0,44 6,35 3,55
N-Hex-GBMP-TT 0,02 0,08 0,80 4,15 4,40
a- Maksimalna količina usedline protieles je izražena v mg/ml antiseruma
Glede na navzkrižno reaktivnost, nam prvi stolpec Tabele 2 kaže, da se s pomočjo N-Hex konjugata producira le malo navzkrižno-reaktivnih protiteles, če rezultat primerjamo z
N-Pr-konjugatom. Poleg tega lahko opazimo tudi, da N-Pen konjugat prav tako proizvede manj navzkrižno-reaktivnih protiteles od N-Pr-konjugata.
Glede na imunogenost se, v terminih homolognega odgovora, lahko iz Tabele 2 razbere, da so N-Bu (2,60), N-Pen-(6,35) in N-Hex-(4,40)- GBMP-TT konjugati bolj imunogeni kot N-PrGBMP analog (0,40).
(d) ELISA
Izvore mikrotitracijskih plošč (Proizvajalca Flow Labs, Maddissauga, Ontario, Kanada) smo prekrili z 10 μΐ raztopine GBMP-, N-Pr-GBMP ali N-Bu-GBMP-BSA konjugatom v PBS (100 μΐ/izvor). Plošče smo nato pustili 18 ur na 4°C, nato pa smo jih po prekrivanju sprali z 1% albuminskim serumom goveda v PBS tokom 10 minut na sobni temperaturi (blokadna stopnja). Izvore smo nato napolnili z 100 μΐ. serijskih-10-kratnih razredčenj v PBSu anti-mišjega-N-acil-GBMP-TT konjugiranega seruma, plošče pa smo nato inkubirali 1 uro na sobni temperaturi. Po spiranju s SBT smo plošče inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi z 50 μΐ ustreznih razredčenih kozjih antimišjih imunoglobulinskih peroksidazno obeleženih konjugatov (Kirkegard anrd Perry Laboratories), nakar smo vsebino izvora posesali, plošče pa smo 5 krat sprali s SBT. Na koncu smo vsakemu izvoru dodali 50 μΐ Tetrametilen modroperoksidaznega sustrata (TMB) (Kirkegard and Perry
Laboratories), po 10 minutah pa smo jih preiskali z
Multiscan spektrofotometrom (Flow Laboratories, Mississauga, Ont.). Rezultati so podani v Tabeli 3.
Tabela 3
ELISA titracije zbranega mišjega anti-N-acil-GBMP-TT konjugiranega seruma napram N-acil-GBMP-BSA konjugata.
Titri3 antiseruma
43 Λ
Oj Oj 1
S S 3
Antigen m m CQ
o o o -¾
1 1 ω fr
prevleke n Oj 3 0Q H S 1 «
1 z 1 Z Z o
fO <0 <ϋ
N-Ac-GBMP-BSA 7800 1000 7000
N-Pr-GBMP-BSA 40000 39000 9800
N-Bu-GBMP-BSA 26000 52000 9700
N-IsoBu-GBMP-BSA - - 25000
a - titer (GM) - recipročno razredčenje na 50% maksimalne absorbcije pri 450 nm.
b - N-acil specifični antiserum, induciran v miših s pomočjo homolognih N-acil-GBMP-TT-konjugatov.
Glede na navzkrižno reaktivnost lahko iz Tabele 3 vidimo, da N-Bu-GBMP konjugat poveča manj navzkrižno reaktivna protitelesa v primerjavi s N-Ac-GBMP (1000) od N-Pr-GBMP-TT konjugata (7800) . Razlog je v tem, da se GBMP veže slabše na protielesa, ki so bila inducirana z N-Pr-GBMP-TT konjugatom, kakor na tista, ki so bila inducirana z N-Bu-GBMP-TT konjgatom. Podoben kometar velja tudi za N-IsoBut-GBMP-TT konjugat.
Glede na imunogenost, je N-Bu konjugat bolj imunogen kot N-Pr analog, kar je bilo dokazano s pomočjo homologno vezajočih titrov od 52.000 (N-Bu) in 40.000 (N-Pr).
(e) Radioaktivno preiskovanje inhibicije tvorjenja vezi
Rastoča koncentracija večje molekulske mase N-Acil-GBMP inhibitorja v PBS (80 μΐ), smo dodali v 20 μΐ mišjega antiN-Pr-GBMP-TT konjugatnega seruma. Količina je dovolj velika, da lahko veže 50% /3H/-obeleženega-GBMP v odsotnosti inhibitorja. Epruvete smo inkubirali 1 uro na 37°C, nakar smo dodali 50 μΐ /3H/-obeleženega N-Pr-GBMP v PBSu. Po rahlem mešanju smo epruvete inkubirali na 4°C 16 ur, preiskave pa smo izvedli na enak način, kot je bilo opisano že prej za radioaktivno preiskovanje antigenskega tvorjenja vezi. S podano formulo je bil izračunan procent inhibicije (%I) 0 _ 100 x (cpm z inhibitorjem - cpm brez inhibitorja) (cpm brez protiteles - cpm brez inhibitorja)
Rezultati so podani v Tabeli 4.
Tabela 4
Inhibicija tvorbe vezi s /3H/-obeleženega N-Pr-GBMP na mišji anti-N-Pr-GBMP-TT konjugat inducirana IgG2a, IgG2b (A)a in IgGi (B)a protitelesa
Inhibitor D A B
N-Ac-GBMP več kot 50,0 več kot 50,0
N-Pr-GBMP 0,6 0,3
N-Bu-GBMP 0,3 0,2
N-IsoBu-GBMP-TT več kot 50,0 —
N-Pen-GBMP 2,3 2,5
N-Hex-GBMP 10,2 10,0
a - te frakcije mišjega poliklonalnega anti-N-Pr-GBMP-TT seruma so bile opisane v Jennings et al., J. Immunol., 142, 3585-3591 (1989).
b - Mikrogrami inhibitorja za nastanek 50% inhibicije
Bakterijske preiskave
Te preiskave smo izvedli s pomočjo metode, ki so jo opisali Jennings et al., J. Exp. Med., 1207-1211 (1987).
V teh preiskavah je bila uporabljena Meisseria meningitidis vrste B (M 986) , rezultati pa so podani v spodnji Tabeli 5.
Tabela 5
Tvorba vezi s /3H/-obeleženim N-Pr-GBMP na različne antiN-acil-GBMP-TT konjugirane serume in bakterijski titri ustreznih antiserumov.
Antiserum pL antiseruma a Bakterijski titer D
N-Pr-GBMP-TT 13 128
N-Bu-GBMP-TT 10 64
N-IsoBu-GBMP-TT NP 64
N-Pen-GBMP-TT 24 64
N-Hex-GBMP-TT več kot 100 8
N-Ac-GBMP-TT več kot 100 8
Opomba:
NP - ni podatka a- μΐ antiseruma (razredčeno petkrat s PBS) , potrebnih za 50% vezanje.
b- eksperiment razredčevanja: ena razlika razredčevanja, npr. 128 v primerjavi s 64, je znotraj obsega eksperimentalne napake.
Tabela 4 prikazuje, da je N-Bu-GBMP, kot tudi N-Pr-GBMP, dober inhibitor za vezanje slednjega na svoja lastna homologna protitelesa. Zaradi tega uporaba N-Bu-GBMP namesto N-Pr-GGBMP ne daje znatne izgube lastnosti, ki so bile dokazane s pomočjo N-Pr-GBMP.
Tabela 5 kaže, da se N-Bu-GBMP veže na protitelesa, inducirana s pomočjo N-Bu-GBMP-TT in N-Pr-GBMP-TT konjugate enako dobro kot N-Pr-GBMP-TT in daje pri tem podobne bakterijske titre. To dejstvo nakazuje na ekvivalenco N-Bu-, N-IsoBu- in N-Pen-GBMP in N-Pr-GBMP glede na sposobnost na opičji bakterijski epitop na površini meningokokov iz skupine B.

Claims (43)

  1. PATENTNI ZAHTEVKI
    1. Modificiran polisaharid skupine B Neisseria Meningitidis, značilen po tem, da ima ostanek sialinske kisline Nacetilne skupine nadomeščen s C4-C8-acilno skupino.
  2. 2. Polisaharid KI iz ovojnice E. coli, značilen po tem, da ima ostanek sialinske kisline iz N-acetilne skupine nadomeščen s C4-C8 acilno skupino.
  3. 3. Modificiran polisaharid skupine B Neisseria Meningitidis, značilen po tem, da ima ostanek sialinske kisline Nacetilnih skupin naravnega polisaharida nadomeščene s C4Cg-acilnimi skupinami v takem obsegu, da kadar je omenjeni modificirani polisaharid skupine B konjugiran na protein je stopnja substitucije acilnih skupin za acetilne skupine zadostna, da zmanjša indukcijo antiteles, ki vežejo naravni GBMP, v primerjavi z vezavo naravnega GBMP na antitelesa, katera je induciral konjugat N-Pr-GBMPproteina.
  4. 4. Polisaharid Ki iz ovojnice E. coli, značilen po tem, da ima ostanek sialinske kisline N-acetilnih skupin naravnega polisaharida nadomeščene s C4-C8-acilnimi skupinami v takem obsegu, da kadar je omenjeni modificirani polisaharid skupine B konjugiran na protein je stopnja substitucije acilnih skupin za acetilne skupine zadostna, da zmanjša indukcijo antiteles, ki vežejo naravni GBMP, v primerjavi z vezavo naravnega GBMP na antitelesa, katera je induciral konjugat N-Pr-GBMP-proteina.
  5. 5. Modificiran polisaharid po zahtevku 1 ali 3, značilen po tem, da je C4-C8 acilna skupina izbrana iz skupine, ki jo sestavljajo n-butanoil, izobutanoil, n-pentanoil, nheksanoil, n-heptanoil in n-oktanoil.
  6. 6. Modificiran polisaharid po zahtevku 5, značilen po tem, da je C4-C9 acilna skupina izbrana iz skupine, ki jo sestavljajo n-butanoil, izo-butanoil, n-pentanoil, nheksanoil.
  7. 7. Modificiran polisaharid po zahtevku 6, značilen po tem, da je C4-Cg acilna skupina n-butanoil.
  8. 8. Modificiran polisaharid po zahtevku 2 ali 4, značilen po tem, da je C4-C8 skupina izbrana iz skupine, ki jo sestavljajo n-butanoil, izo-butanoil, n-pentanoil, nheksanoil, n-heptanoil in n-oktanoil.
  9. 9. Modificiran polisaharid po zahtevku 8, značilen po tem, da je acilna skupina izbrana iz skupine, ki jo sestavljajo n-butanoil, izo-butanoil, n-pentanoil in n-heksanoil.
  10. 10. Modificiran polisaharid po zahtevku 9, značilen po tem, da je C4-C8 acilna skupina n-butanoil.
  11. 11. Modificiran polisaharid po zahtevku 1 ali 3, značilen po tem, da ima povprečno molekulsko maso v obsegu 10.000 do 50.000 Daltonov.
  12. 12. Modificiran polisaharid po zahtevku 2 ali 4, značilen po tem, da ima povprečno molekulsko maso v obsegu 10.000 do 50.000 Daltonov.
  13. 13. Modificiran polisaharid po zahtevku 1 ali 3, značilen po tem, da ima 90-100% stopnjo N-acilacije.
  14. 14. Modificiran polisharid po zahtevku 2 ali 4, značilen po tem, da ima 90-100% stopnjo N-acilacije.
  15. 15. Antigenski konjugat, značilen po tem, da vključuje modificirano skupino polisaharida B Neisseria meningitidis, ali polisaharid KI iz ovojnice E. coli, ki ima ostanek sialinske kisline N-acetilne skupine nadomeščen z N-C4-C8-acilno skupino, konjugiran na imunološko primeren protein.
  16. 16. Konjugat po zahtevku 15, značilen po tem, da je C4-C8 acilna skupina izbrana iz skupine, ki jo sestavljajo nbutanoil, izo-butanoil, pentanoil, heksanoil, heptanoil in oktanoil.
  17. 17. Konjugat po zahtevku 16, značilen po tem, da je C4-C8 acilna skupina izbrana iz skupine, ki jo sestavljajo nbutanoil, izo-butanoil, pentanoil in heksanoil.
  18. 18. Konjugat po zahtevku 17, značilen po tem, da je C4-C8 acilna skupina n-butanoil.
  19. 19. Konjugat po zahtevku 15, značilen po tem, da je protein izbran iz skupine, ki jo sestavljajo tetanusni toksoid, difteria toksoid, navzkrižno reaktivni material (CRM) in bakterijski proteinski nosilec.
  20. 20. Konjugat po zahtevku 15, značilen po tem, da sta protein in polisaharid povezana kovalentno z vezjo -CH2-NHprotein.
  21. 21. Konjugat po zahtevku 20, značilen po tem, da je C4-C8 acilna skupina n-butanoil.
  22. 22. Konjugat po zahtevku 19, značilen po tem, da je uporabljeni CRM enak CRM197.
  23. 23. Cepivo, značilno po tem, da obsega konjugat po zahtevku 15 in farmacevtsko sprejemljiv injekcijski nosilec.
  24. 24. Cepivo po zahtevku 23, značilno po tem, da nadalje obsega tudi fiziološko sprejemljiv adjuvant.
  25. 25. Cepivo po zahtevku 24, značilno po tem, da je omenjeni adjuvant izbran iz skupine, ki jo sestavljajo aluminijev hidroksid, aluminijev fosfat in aluminijev sulfat.
  26. 26. Način priprave modificiranega polisaharida, po kateremkoli zahtevku od 1 do 4, značilen po tem, da obsega zamenjavo N-acetilnih skupin naravnega polisaharida s C4-C8 acilnimi skupinami.
  27. 27. Način priprave modificiraneg polisaharida po zahtevku 26, značilen po tem, da so C4-C8 acilne skupine izbrane iz skupine, ki obsega n-butanoil, izobutanoil, n-pentanoil, n-heksanoil, n-heptanoil in n-oktanoil.
  28. 28. Način priprave modificiraneg polisaharida po zahtevku 27, značilen po tem, da so C4-C8 acilne skupine n-butanoil.
  29. 29. Način priprave konjugata polisaharid-protein, značilen po tem, da obsega korak povezovanja modificiranega polisaharida po kateremkoli zahtevku od 1 do 4 z imunološko primernim proteinom, s kovelantno vezjo.
  30. 30. Način priprave konjugata polisaharid-protein, po zahtevku 28, značilen po tem, da so C4-C8 acilne skupine izbrane iz skupine, ki obsega n-butanoil, izobutanoil, n-pentanoil, n-heksanoil, n-heptanoil in n-oktanoil.
  31. 31. Način priprave konjugata polisaharid-protein, po zahtevku 30,značilen po tem, da so C4-C8 acilne skupine n-butanoil.
  32. 32. Način, po zahtevku 29, značilen po tem, da protein pridobi protitelesa proti bakteriji.
  33. 33. Način po zahtevku 32, značilen po tem, da je protein izbran iz skupine, ki obsega tetanusni toksoid, difteria toksoid, materiale, ki reagirajo navzkrižno (CRM) in protein meningokokalne zunanje membrane.
  34. 34. Gama globulinska frakcija, značilna po tem, da obsega protitelesa, ki so usmerjena proti skupina B N. meningitidis ali E. coli Ki, omenjena globulinska frakcija pa je pridobljena z imunizacijo sesalca s antigenskim konjugatom, ki obsega modificiran polisaharid skupine B Neisseria meningitidis ali E. coli KI, ki ima ostanke Nacetilnih skupin sialinske kisline zamenjane z N-C4-C8acilnimi skupinami, konjugiran na imunološko primeren protein, kjer so N-acetilne skupine zamenjane z N-C4-C8acilnimi skupinami v takem obsegu, da kadar je omenjeni modificirani polisaharid skupine B konjugiran na omenjeni protein je stopnja substitucije acilnih skupin za acetilne skupine zadostna, da zmanjša indukcijo antiteles, ki vežejo naravni GBMP, v primerjavi z vezavo naravnega GBMP na antitelesa, katera je induciral vrinjeni konjugat N-PrGBMP-proteina.
  35. 35. Gama globulinska frakcija, značilna po tem, da je sposobna pasivno zaščititi proti meningitisu, ki ga povzroča skupina B N. meningitidis in E. coli Ki, omenjeno frakcijo pa pridobivamo z imunizacijo sesalcev s cepivom, po zahtevku 23, nakar sledi izločaje gama globulina iz omenjenega sesalca.
  36. 36. Gama globulinska frakcija po zahtevku 33, značilna po tem, da je C4-Cs acilna skupina konjugata, uporabljenega za imunizacijo sesalca, izbrana iz skupine, ki obsega n-butanoil, izobutanoil, n-pentanoil, n-heksanoil, n-heptanoil in n-oktanoil.
  37. 37. Gama globulinska frakcija po zahtevku 34, značilna po tem, da je C4-C8 acilna skupina konjugata, uporabljenega za imunizacijo sesalca, izbrana iz skupine, ki obsega n-butanoil, izobutanoil, n-pentanoil, n-heksanoil.
  38. 38. Gama globulinska frakcija po zahtevku 37, značilna po tem, da je C4-C8 acilna skupina konjugata, uporabljenega za imunizacijo sesalca n-butanoil.
  39. 39. Gama globulinska frakcija po zahtevku 38, značilna po tem, da protein konjugata pridobi protitelesa proti bakteriji.
  40. 40. Gama globulinska frakcija po zahtevku 39, značilna po tem, da je protein konjugata izbran iz skupine, ki obsega tetanusni toksoid, difteria toksoid, materiale, ki reagirajo navzkrižno (CRM) in protein meningokokalne zunanje membrane.
  41. 41. Gama globulinska frakcija po zahtevku 40, značilna po tem, da sta protein in polisaharid konjugata povezana preko kovalentne -CH2-NH- vezi, kjer N v omenjeni vezi da protein.
  42. 42. Gama globulinska frakcija po zahtevku 41, značilna po tem, da je C4-C8 acilna skupina konjugata n-butanoil.
  43. 43.Gama globulinska frakcija po zahtevku 42, značilna po tem, da je CRM enak CRM197.
SI9110243A 1989-12-14 1990-12-14 Improved meningococcal polysaccharide conjugate vaccine SI20008B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US44819589A 1989-12-14 1989-12-14
YU24391A YU24391A (sh) 1989-12-14 1990-12-14 Poboljšana meningokokna polisaharid kon-jugovana vakcina

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SI20008A true SI20008A (sl) 2000-02-29
SI20008B SI20008B (en) 2001-02-28

Family

ID=23779371

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI9110243A SI20008B (en) 1989-12-14 1990-12-14 Improved meningococcal polysaccharide conjugate vaccine

Country Status (30)

Country Link
US (3) US5576002A (sl)
EP (1) EP0504202B1 (sl)
JP (1) JP2637845B2 (sl)
KR (1) KR0158436B1 (sl)
CN (4) CN1049223C (sl)
AR (1) AR243934A1 (sl)
AT (1) ATE121947T1 (sl)
AU (1) AU641715B2 (sl)
BR (1) BR9007917A (sl)
CA (1) CA2071811C (sl)
CZ (1) CZ283530B6 (sl)
DE (1) DE69019164T2 (sl)
DK (1) DK0504202T3 (sl)
ES (1) ES2071288T3 (sl)
FI (2) FI104539B (sl)
HR (1) HRP920872A2 (sl)
HU (2) HU9201966D0 (sl)
IE (1) IE68414B1 (sl)
IL (1) IL96676A (sl)
IN (1) IN171747B (sl)
NO (2) NO305275B1 (sl)
NZ (1) NZ236471A (sl)
PH (1) PH30305A (sl)
PL (2) PL166035B1 (sl)
RO (1) RO111416B1 (sl)
RU (1) RU2105568C1 (sl)
SI (1) SI20008B (sl)
WO (1) WO1991008772A1 (sl)
YU (1) YU24391A (sl)
ZA (1) ZA9010065B (sl)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5648241A (en) 1989-09-15 1997-07-15 The General Hospital Corporation Conjugate vaccine against group B streptococcus
HU9201966D0 (en) * 1989-12-14 1992-10-28 Ca Nat Research Council An improved vaccine of meningococcus-polysaccharide conjunction
DK0667787T3 (da) * 1992-09-24 2001-10-29 Ca Nat Research Council Gruppe B-streptococcus type II- og type V-polysaccharid-protein-konjugat-vacciner
US5439808A (en) * 1993-07-23 1995-08-08 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis
US6153406A (en) * 1993-07-23 2000-11-28 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane protein P2 from Haemophilus influenzae type B
US5679654A (en) * 1994-09-02 1997-10-21 Brigham & Women's Hospital, Inc. Capsular polysaccharide immunomodulator
US5700787A (en) * 1994-09-02 1997-12-23 Brigham & Women's Hospital, Inc. Capsular polysaccharide immunomodulator
US5747287A (en) * 1995-04-28 1998-05-05 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis
US6284884B1 (en) 1995-06-07 2001-09-04 North American Vaccine, Inc. Antigenic group B streptococcus type II and type III polysaccharide fragments having a 2,5-anhydro-D-mannose terminal structure and conjugate vaccine thereof
US5811102A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 National Research Council Of Canada Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines
ATE400295T1 (de) * 1995-06-07 2008-07-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Vakzine mit einem polysaccharide antigen- trägerprotein konjugat und freiem trägerprotein
ZA97248B (en) * 1996-01-18 1997-07-18 Rohm & Haas Method for identifying and quantifying polymers utilizing immunoassay techniques
EP0939647B2 (en) † 1996-08-27 2006-07-12 Chiron Corporation Neisseria meningitidis serogroup b glycoconjugates and methods of using the same
JP4150082B2 (ja) 1996-08-27 2008-09-17 カイロン コーポレイション 独特の髄膜炎菌性ｂエピトープを規定するモノクローナル抗体およびワクチン組成物の調製におけるそれらの使用
US6426074B1 (en) * 1997-03-19 2002-07-30 The Brigham And Women's Hospital Inc. Group B Streptococcus vaccine
WO1998058670A1 (en) 1997-06-24 1998-12-30 Chiron Corporation Methods of immunizing adults using anti-meningococcal vaccine compositions
EP1007546B1 (en) * 1997-08-27 2009-01-21 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Molecular mimetics of meningococcal b epitopes
CZ302615B6 (cs) 1997-12-23 2011-08-03 Baxter Healthcare S.A. Zpusob cištení kapsulárních polysacharidu od bunecných komponent gramnegativních a grampozitivních bakterií a modifikovaný kapsulární polysacharid
PL346645A1 (en) * 1998-08-19 2002-02-25 North American Vaccine IMMUNOGENIC β-PROPIONAMIDO-LINKED POLYSACCHARIDE PROTEIN CONJUGATE USEFUL AS A VACCINE PRODUCED USING AN N-ACRYLOYLATED POLYSACCHARIDE
CN1263510C (zh) * 1998-08-19 2006-07-12 巴克斯特健康护理股份有限公司 多糖－蛋白质缀合物或寡糖－蛋白质缀合物、其制备方法及其应用
US6436653B1 (en) 1998-12-15 2002-08-20 Exiqon A/S Method for introduction of reporter groups into bacterial lipopolysaccharide-derived carbohydrates and the subsequent coupling of such derivatives onto solid surfaces
US7083777B1 (en) * 1999-04-02 2006-08-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Immunomodulating polymers
US6518037B2 (en) * 1999-11-12 2003-02-11 University Of Iowa Research Foundation Two-component system that controls bacterial membrane synthesis
GB9928196D0 (en) * 1999-11-29 2000-01-26 Chiron Spa Combinations of B, C and other antigens
GB0011108D0 (en) * 2000-05-08 2000-06-28 Microscience Ltd Virulence gene and protein and their use
SV2003000753A (es) 2000-12-05 2003-06-16 Brigham & Womens Hospital Uso de polisacaridos zwitterionicos para la especifica modulacion del progreso inmunologico
US7534444B2 (en) 2001-04-17 2009-05-19 Novattis Vaccines And Diagnostics, Inc. Molecular mimetics of meningococcal B epitopes which elicit functionally active antibodies
GB0115176D0 (en) * 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
GB0121591D0 (en) * 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
CA2480389C (en) * 2002-03-26 2012-10-09 Chiron Srl Modified saccharides having improved stability in water
EP1506007B1 (en) * 2002-05-14 2011-06-22 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Mucosal combination vaccines for bacterial meningitis
RU2317106C2 (ru) * 2002-08-02 2008-02-20 ГлаксоСмитКлайн Байолоджикалз с.а. Нейссериальные вакцинные композиции, содержащие комбинацию антигенов
GB0227346D0 (en) * 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
AU2004227852B2 (en) * 2003-03-31 2010-01-14 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Zwitterionic immunomodulators for the treatment of asthma and allergy
US7731967B2 (en) 2003-04-30 2010-06-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compositions for inducing immune responses
US7807824B2 (en) 2003-08-12 2010-10-05 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation
US8148335B2 (en) 2004-06-23 2012-04-03 Children's Hospital & Research Center Oakland De-N-acetyl sialic acid antigens, antibodies thereto, and methods of use in cancer therapy
JP2008509886A (ja) * 2004-06-23 2008-04-03 チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド 多糖誘導体および免疫応答の誘導における用途
GB0428394D0 (en) * 2004-12-24 2005-02-02 Chiron Srl Saccharide conjugate vaccines
KR20130122810A (ko) 2005-06-27 2013-11-08 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신 제조 방법
WO2007092451A2 (en) 2006-02-06 2007-08-16 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Zwitterionic polysaccharides for promotion of immune system maturation and health
GB0611914D0 (en) 2006-06-15 2006-07-26 Teti Giuseppe Peptides that mimic non-human cross-reactive protective epitopes of the group Bmeningococcal capsulsar polysaccharide
EP1872791A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-02 Institut Pasteur Use of bacterial polysaccharides for biofilm inhibition
US20100189740A1 (en) * 2007-06-20 2010-07-29 Francis Michon Modified polysaccharides for conjugate vaccines
ES2664753T3 (es) 2007-12-07 2018-04-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composiciones de inducción de respuestas inmunes
EP2387417B1 (en) 2009-01-16 2016-05-11 University of Maryland, Baltimore Broad spectrum vaccine against non-typhoidal salmonella
US9539281B2 (en) 2011-07-12 2017-01-10 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lipid-containing PSA compositions, methods of isolation and methods of use thereof
EP2752403A1 (de) * 2013-01-08 2014-07-09 Sika Technology AG Amin für emissionsarme Epoxidharz-Produkte
CA2997211A1 (en) 2015-08-19 2017-02-23 President And Fellows Of Harvard College Lipidated psa compositions and methods
WO2018014012A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 President And Fellows Of Harvard College Glycolipid compositions and methods of use
CN118021947A (zh) * 2017-01-31 2024-05-14 辉瑞大药厂 脑膜炎奈瑟菌组合物及其使用方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4057685A (en) * 1972-02-02 1977-11-08 Abbott Laboratories Chemically modified endotoxin immunizing agent
US4356170A (en) * 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
US4673574A (en) * 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4496538A (en) * 1982-07-06 1985-01-29 Connaught Laboratories, Inc. Haemophilus influenzae b polysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccine
US4644059A (en) * 1982-07-06 1987-02-17 Connaught Laboratories, Inc. Haemophilus influenzae B polysaccharide-diptheria toxoid conjugate vaccine
US4619828A (en) * 1982-07-06 1986-10-28 Connaught Laboratories, Inc. Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines
US4695624A (en) * 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4727136A (en) * 1985-10-01 1988-02-23 Canadian Patents And Development Ltd. Modified meningococcal group B polysaccharide for conjugate vaccine
HU9201966D0 (en) * 1989-12-14 1992-10-28 Ca Nat Research Council An improved vaccine of meningococcus-polysaccharide conjunction

Also Published As

Publication number Publication date
DE69019164T2 (de) 1995-09-07
CN1055541A (zh) 1991-10-23
CA2071811A1 (en) 1991-06-15
EP0504202B1 (en) 1995-05-03
NZ236471A (en) 1992-10-28
DE69019164D1 (de) 1995-06-08
IE904513A1 (en) 1991-06-19
DK0504202T3 (da) 1995-10-02
NO307835B1 (no) 2000-06-05
CN1100428A (zh) 1995-03-22
FI19991917A7 (fi) 1999-09-09
ES2071288T3 (es) 1995-06-16
PH30305A (en) 1997-02-20
CZ283530B6 (cs) 1998-04-15
FI922737A0 (fi) 1992-06-12
PL288271A1 (en) 1991-12-16
RU2105568C1 (ru) 1998-02-27
FI104539B (fi) 2000-02-29
CN1096516A (zh) 1994-12-21
KR0158436B1 (ko) 1998-12-01
FI19991917L (fi) 1999-09-09
HRP920872A2 (en) 1997-06-30
AU6898791A (en) 1991-07-18
CN1036522C (zh) 1997-11-26
ZA9010065B (en) 1992-02-26
CN1036504C (zh) 1997-11-26
EP0504202A1 (en) 1992-09-23
HUT64480A (en) 1994-01-28
NO922316D0 (no) 1992-06-12
CA2071811C (en) 2003-11-04
IL96676A (en) 1996-09-12
NO973311L (no) 1992-08-14
US5683699A (en) 1997-11-04
CN1100656A (zh) 1995-03-29
NO305275B1 (no) 1999-05-03
BR9007917A (pt) 1992-10-20
IN171747B (sl) 1992-12-26
AU641715B2 (en) 1993-09-30
CN1072506C (zh) 2001-10-10
US5902586A (en) 1999-05-11
NO973311D0 (no) 1997-07-17
SI20008B (en) 2001-02-28
IL96676A0 (en) 1991-09-16
JP2637845B2 (ja) 1997-08-06
YU24391A (sh) 1995-12-04
ATE121947T1 (de) 1995-05-15
CZ628490A3 (en) 1997-12-17
US5576002A (en) 1996-11-19
WO1991008772A1 (en) 1991-06-27
NO922316L (no) 1992-08-14
PL166659B1 (pl) 1995-06-30
CN1049223C (zh) 2000-02-09
AR243934A1 (es) 1993-09-30
PL166035B1 (pl) 1995-03-31
RO111416B1 (ro) 1996-10-31
HU218146B (hu) 2000-06-28
JPH05505392A (ja) 1993-08-12
IE68414B1 (en) 1996-06-12
HU9201966D0 (en) 1992-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SI20008A (sl) Izboljšano meningokokalno polisaharidno konjugirano cepivo
Pon et al. N-Propionylated group B meningococcal polysaccharide mimics a unique bactericidal capsular epitope in group B Neisseria meningitidis
KR100452475B1 (ko) 변형된메닝고코컬다당류접합백신
JP2004505885A (ja) Ｎ−アクリロイル化ポリサッカリドを用いて産生されたワクチンとして有用な免疫原性β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体
CA1276552C (en) Conjugate vaccine against infections by gram-negative bacteria, method for its preparation and use
BRPI0316018B1 (pt) vacina polissacarídica para infecções estafilocócicas
US20100068728A1 (en) Polysaccharide derivatives and uses in induction of an immune response
WO1998026799A1 (en) Conjugate vaccine for salmonella paratyphi a
Moreno et al. Thymic-dependence and immune memory in mice vaccinated with meningococcal polysaccharide group B complexed to outer membrane protein
CN107261129A (zh) 用作疫苗的多糖与去毒大肠杆菌(e. coli)不耐热肠毒素(lt)的偶联

Legal Events

Date Code Title Description
IF Valid on the event date
KO00 Lapse of patent

Effective date: 20090910