KR100452475B1 - 변형된메닝고코컬다당류접합백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 나이세리아 메닝기티디스의 화학적으로 변형된 B족 다당류에 관한 것이다. 본 발명은 또한 각각의 변형된 다당류가 단백질 담체에 접합되는 백신을 제공한다. 더욱 상세하게는 본 발명은 새로운 B족 메닝고코컬 불포화 N-아실기 유도체 다당류, B족 메닝고코컬 불포화 N-아실기 유도체 다당류의 새로운 접합분자 및 단백질에 공유결합하는 B족 메닝고코컬 불포화 N-아실기 유도체 다당류 절편의 접합분자를 포함하는 약학적 조성물 및 백신으로서의 상기 조성물의 용도를 제공한다.

Description

변형된 메닝고코컬 다당류 접합백신
B족 N.메닝기티디스 및 E. coli K1에 의해 야기되는 수막염은 세계적으로 주된 건강의 쟁점이 되어 왔다. B족 메닝기티디스는 풍토성 및 유행성 환경 모두에서 발생하고 기록된 모든 수막염구균성 수막염발생건의 거의 절반에 가깝게 차지하는데, K1 양성(positive) E.coli는 신생아들에게의 수막염의 대표적인 원인이다.
현재 B족 메닝기티디스균 및 E. coli K1에 의해 발생되는 질병에 대하여 상업적으로 이용 가능한 백신은 존재하지 않는다. 이것은 대개 B족 메닝기티디스구균성 다당류(GBMP)가 인체에서 면역성이 아주 빈약하다는데서 기인한 것이다. 본래의 GBMP의 빈약한 면역성 및 결과적인 면역성의 내성은 인체 및 동물의 세포조직 내에서 공통된 에피토프(epitope)가 존재하기 때문에 기인하는 것으로 여겨져 왔다. 최근들어 외부막 단백질을 가진 GBMP 복합체에서 기초한 예비 백신에 대한 몇몇 보고가 있었다. 그러나 아직까지 인체에서 이러한 백신의 효능에 대한 확실한 증거는 존재하지 않는다.
최근들어, 화학적으로 합성된 변형된(N-프로피온화된) B족 다당류-단백질(N-Pr-GBMP-Protein)에 기초한 새로운 개념의 백신이 개발되었다. 상기 백신은 마우스에서 높은 타이터의 IgG 항체를 유도하며, 상기 항체는 보호적일 뿐만 아니라 변형되지 않은 GBMP(예컨대, N-아세틸-GBMP)와 교차반응한다. 이러한 개념은 Harold J. Jennings외 다수에 의한 1988년 2월 23일자로 발행된 미합중국 특허번호 4,727,136에서 설명되고 주장되었다.
미합중국 특허번호 4,727,136에서 설명된 바와 같이 교차-반응성 항체를 유도하는 백신은 단지 면역 내성(immune tolerance)을 끊는 대가로 가능하게 된다고 추론되었다. 이러한 가설은 본래의 N-Ac-GBMP와 인체 및 동물의 세포조직에서 α-(2-8)-연결된 (적어도 10개 잔기의) 시알산 잔기 사슬을 구성하는 공통 에프토프가 존재함으로써 설득력이 있게 된다.(Jennings,Contrib.Microbiol.Immunol. Basel, Karger, 1989, Vol.10,151-165). 이러한 폴리시알로실 사슬은 발생단계 항원으로서의 기능을 하며, 배아 신경 세포 부착에 있어서의 태아 단계와 가장 많은 부분 관련되어 있다(Finne 등Biochem. Biophy. Res. Commun.,1983,112,482). 출생후 성숙과정 동안에 이러한 항원은 하향-조절되지만(Friedlander등 J.Cell Biol, 1985,101,412), 종양세포(Roth등, Proc. Natl. Acad. Sci., 1988,85,299), 내츄럴 킬러(Natural killer) 세포 및 CD3+T 세포(Husmann등 Eur. J. Immunol., 1989,19,1761)에서 병든 근육의 재발생 과정의 성숙한 인체내에서 발현된다. 이러한 치명적인 항원에 대한 내성차단의 결과는 아직 확증되지 않았지만, 인체의 에피토프에 대한 면역성을 감소시킨 백신을 개발하는 것이 바람직하다.
그러므로, 본 발명의 목적은 숙주의 본래 에피토프와의 교차-반응성을 줄인 항체를 유도하는 면역성이 존재하는 변형된 B족 메닝기티디스 다당류를 개발하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 이러한 변형된 다당류를 포함하는 다당류-단백질 접합 분자를 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 실질적으로 GBMP를 가진 감소된 교차-반응성을 나타내는 면역학적 성질을 가지는 백신을 제공하는데 있다.
본 발명은 나이세리아 메닝기티디스의 화학적으로 변형된 B족 다당류에 관한 것이다. 본 발명은 또한 각각의 변형된 다당류가 단백질 담체(carrier)에 접합되는 백신을 제공한다.
본 발명은 일반적으로 나이세리아 메닝기티디스의 화학적-변형된 B족 다당류를 제공한다. 본 발명은 또한 각각의 변형된 다당류가 단백질 담체에 접합되는 백신을 제공한다.
특별하게 본 발명은 불포화된 N. 메닝기티디스의 B족 N-아실기 유도체 다당류, 단백질과 공유결합된 불포화된 N-아실기 유도체 다당류의 접합분자, N. 메닝기티디스의 접합분자 및 불포화된 N-아실기 유도체 다당류를 포함하는 약학적 조성물 및 이러한 조성물의 백신으로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일태양에서, 불포화된 C3-4아실족에 의해 대체되는 아실산 잔기(residue) N-아세틸(C2)족을 구비하는 변형된 N 메닝기티디스의 B족 다당류가 제공된다.
다른 태양에 따라, 감소된 교차-반응적인 항체의 유도를 가진 본래 다당류와 비교하여 향상된 면역성을 구비하는, 면역적으로 적합한 단백질에 접합된 불포화된C2-4N-아실 유도체 다당류를 포함하는 항원의 접합분자가 제공된다.
추가적인 태양에 따라, 적당한 담체 또는 희석액과 결합된 불포화 N-아실 유도체 다당류-단백질 접합분자를 포함하는 백신이 제공된다. 본 발명에 따른 백신은 또한 예를 들어 알루미늄 인산염, 알루미늄 수산화물 또는 스테아릴 티로신과 같은 인체에 대한 사용에 적합한 치료적으로 효과적인 양의 보조제(adjuvant)를 포함한다.
다른 추가적인 태양에 따라, N. 메닝기티디스 및 E. coli K1 감염에 대해 포유동물에 면역성을 부여하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 감염을 당한 인체를 포함한 포유동물에 본 발명에 따른 면역적으로 효과적인 양의 백신으로 비경구적으로 투여하는 것을 포함한다. 이러한 백신은 일반적으로 체중의 단위 킬로그램당 약 1에서 50 마이크로그램의 양, 예를 들어 체중의 단위 킬로그램당 약 5에서 25 마이크로그램의 양으로 복용된다.
다른 하나의 태양에 따라, 본 발명은 B족 메닝기티디스 및 E. coli K1에 의해 발생되는 수막염에 대해 방어할 수 있는 혈청 및 감마 글로불린 분획(fraction)을 제공한다. 이러한 분획은 상기 미생물에 의해 야기되는 진행중인 감염에 대한 방어를 제공하거나 또는 치료를 위해 개개인에게 복용되어진다. 이것으로부터 본 발명에 따른 면역성 백신의 접합분자는 GBMP 교차-반응성 항체를 최소한으로 유도하는 이들의 바람직한 면역성의 관점에서 치료학적 항혈청의 소스(source)가 될 것이라는 점이 인식될 것이다. 본 발명의 접합분자는 또한 모노클로널 항체, 가능한한 앤티다이오타입 항체를 야기시키는데 유용할 것이다.
우리는 상기 언급된 Jennings 등의 미합중국 특허4,727,136에서 설명된 N-Pr-GBMP-단백질 접합분자에 의해 유도되는 대부분의 살균성 및 보호적인 항체는 GBMP 교차-반응성 항체와 결합하지 않는다는 사실을 발견하였다. 사실상 대부분의 방어 활성은 GBMP와 교차반응하지 않는 N-Pr-GBMP-특이적 항체 개체군내에 포함되어 있다. 이러한 관점에서, N-Pr-GBMP는 B족 메닝기티디스의 표면상에 존재하는 독특한 박테리아 에피토프를 모방한다고 생각된다.
본 발명은 박테리아 에피토프를 모방하는 화학적으로 변형된 GBMP를 합성하는 것이 가능하고, 그러한 접합형태에서 향상된 면역성을 나타낼 뿐만 아니라 실질적으로 GBMP와 교차반응하는 항체를 유도하지 않는다는 사실의 발견에 기초한다.
본 발명에 따라, 다른 화학적으로 변형된 GBMP가 합성되고 개별적으로 단백질에 접합된 후 상기 접합체를 마우스에 감염시키고 그 결과를 N-Pr-GBMP 단백질 접합분자에 의해 생산된 것과 비교하였다. 놀랍게도 N-아실기에서 불포화된 결합이 존재하면 특히 면역학적 접합분자를 야기시킨다는 것이 발견되었다.
본 발명의 여러 특징들은 뒤따르는 본 발명의 실시예의 상세한 설명을 연구함으로서 보다 잘 이해될 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 단지 아래에 첨부된 특허청구범위를 통하여 한정되어 진다.
본 발명은 일반적으로 새로운 B족 나이세리아 메닝기티디스(meningitidis)의 불포화 N-아실기 유도체 다당류, B족 불포화 N-아실기 유도체의 새로운 접합분자, 단백질에 공유결합된 B족 나이세리아 메닝기티디스(meningitidis)의 불포화 N-아실기 유도체 다당류 절편의 접합분자를 포함하는 약학적 조성물 및 백신으로서의 상기 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 하기 화학식( I )의 B족 N 나이세리아 불포화 N-아실기 유도체 다당류에 관한 것으로서,
상기 R1은 적어도 하나의 이중결합을 포함하는 C2-C4불포화 알킬족이다.
본 발명의 일실시예에서 화학식( I )의 R1은 세개 또는 네개의 탄소 및 두개의 비인접 이중결합을 가진다.
본 발명의 추가적인 실시예에서, 화학식(I)의 R1은 두 개, 세 개, 네개의 탄소이며, 알킬기 탄소로부터 가장 먼거리에 있는 탄소는 이중결합을 통하여 결합된다.
본 발명의 유용한 화학식(I)의 변형된 B족 메닝고코컬 다당류 N-아실기 유도체 다당류의 특별한, 그러나 제한되지 않는 예는 다음과 같다.
N-펜텐니올(CH2=CH-CH2-CH2-CONH-);
및 N-크로토놀(3-부테니올)(CH2=CH-CH2-CONH-).
B족 메닝고코컬 다당류는 당업자들에게 공지된 방법에 의해 N. 메닝기티디스로부터 분리되어 진다. 이러한 하나의 방법으로 B족 메닝고코씨(스트레인 981B)는 증류수 리터당 탈수된 토드(Todd) 헤윗(Hewitt) 브로스(Broth)(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)의 30g을 사용한 발효기에서 약 37℃까지 배양되어 진다. 발효기에서 배양하기 이전에, 냉동건조된 균주는 5%(v/v) Sheeps' Blood Agar(DifoLaboratories, Detroit, Michigan) 플레이트에서 캔들 항아리내에서 37℃의 온도에서 초기적으로 배양된다. 이때 상기 박테리아는 37℃에서 190 rpm으로 7시간동안 흔들어 섞여진 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 1.0리터의 토드 헤윗 브로스(상기와 같은)로 전달된다. 상기 종균은 이때 발효기(fermenter)로 전달된다. 발효기의 배양(16시간)후 박테리아는 포르말린을 추가하여 사멸시킨 후 0.75%의 최종농도가 되게 한다. 박테리아는 연속적인 원심분리에 의해 제거되고 B족 메닝고코컬 다당류는 상청액으로부터 분리되고, 뜨거운(50-60℃) 대신에 차가운(4℃) 90% 페놀로 조(crude) 다당류 용액을 저음으로써 단백질이 추출되는 것을 제외하고는 Bundle 등 J. Biol. Chem 249,4797-4801(1974)에 의해 개시된 방법에 따라 본질적으로 정제된다. 이러한 후자의 공정은 큰 분자량 형태의 GBMP가 생성되는 것을 확신하게 한다.
E.coli(018:K1:H7)(NRCC4283)는 탈수된 Brain Heart Infusion(BHI;37g/liter)을 포함하는 증류수로 발효기내에서 37℃의 온도로 배양되어 진다. 발효배양이전에 냉동건조된 균주는 37℃에서 200rpm으로 7시간동안 교반된 후 에를렌마이어 플라스크내에서 50밀리리터의 BHI 용액에서 배양된다. 이때 상기 배양액은 1.5리터의 BHI(상기와 같이)로 전달되고 상술한 바와 같은 동일한 조건하에서 성장된다. 종균은 상기 발효기로 전달되어 진다.
상술한 바와 같은 분리 및 정제과정은 이용될 수 있는 유일한 것이 아니며, 예를 들어 Watson 등, J. Immunol., 81,331(1958) 및 상기 언급된 미합중국 특허 4,727,136와 같은 다른 공개된 공정도 이용가능하다.
천연 다당류는 분자의 시알릭산 잔기 부분에서 반응성 아민족을 제공하기 위해 N-탈아세틸화된다. N-탈아세틸화는 예를 들어 pH 12∼13의 약 90℃ 또는 110℃의 상승된 온도에서 수용성 염기성 배지를 이용하는 어떠한 공지된 방법에 의해서도 수행될 수 있다. 수용성 염기성 배지는 예를 들어 약 2M농도의 나트륨 수산화물과 같은 수용성 알칼리 금속 수산화물 용액이 적합하다. 다른 방법으로는 수용성 용액에서 히드라진이 사용될 수 있다. N-탈아세틸화의 정도는 조건에 따라 30%에서100%까지 변화되어 진다. 약 90%에서 100%까지의 N-탈아세틸화를 달성하는 것이 바람직하다. N-탈아세틸화 부산물은 예를 들어 냉각, 중화, 바람직하다면 정제, 그리고 냉동건조에 의해 회수될 수 있다.
N-탈아세틸화의 결과로서 다당류의 절편은 약 3,000 내지 50,000돌턴(Dalton) 범위의 평균 분자량을 가지고 만들어진다. 본 발명에서의 사용을 위해, 절편 또는 전체길이 다당류가 사용될 수 있다.
이후, N-탈아세틸화 다당류 절편 또는 전체길이 다당류는 대응하는 N-아실화 부산물을 생성하기 위해 아실화된다. N-아실화는 약 pH7.5∼9.0을 가진 수용성의 완충 배지에서 N-탈아세틸화 다당류를 용해함으로서 수행되고, 선택적으로 용해도를 증가시키기 위해 알코올을 구비하여 적절한 불포화 아실 무수물(anhydride)을 추가하고, 그리고 반응이 종료될 때까지 10℃이하로 냉각시킨다. 바람직하다면, 반응 배지는 정제될 수 있다. 이용될 수 있는 정제방법의 한정되지 않은 예는 투석 및 냉동건조에 의한 N-아실화된 부산물의 회수를 포함한다. 이러한 반응은 실질적으로 10에서 20시간내에 완료된다. 일반적으로1H nmr과 같은 분석 기술에 의해 측정되는 바와 같이 N-아세틸화의 정도는 적어도 90%에서 100%에 거의 근접한 수준이다. N-아실화 반응은 절편 분자량을 상당한 정도로 감소시키지 않는다.
본 발명의 접합분자는 화학식(II)을 가지며,
상기에서 R2는 불포화 C2-4아실족이다. 그러므로 접합분자는 본 발명의 불포화 다당류를 포함하고 또한 아크릴로일(acryloyl) 유도체를 포함한다.
본 발명에 따르면 접합목적을 위해 약 10에서 200 시알릭산 잔기에 해당하는 평균 분자량을 가진 C2-4N-아실화된 물질을 선택하는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 접합분자는 N-아크릴로일(2-프로페네오) 유도체이다. 이것은 용출제로서 PBS를 사용하고 울트라젤 트래드마크 AcA 44(Bead diameter 60-140 um)를 사용하는 젤 여과법에 의해 일반적으로 달성된다. 선택적으로 적절한 크기의 막이 도입될 수 있다.
30,000에서 40,000돌턴, 예를 들면 10,000에서 15,000돌턴의 평균분자량을 가지는 불포화 N-아실화된 물질이 본 발명에 이용된다. 이것은 상기와 같은 평균 분자량 범위를 가진 N-아실화된 GBMP 물질을 포함하는 칼럼 용출액의 분획을 수집함으로서 달성된다. 본 발명에 따르면, 높은 평균 분자량 예를 들어 30,000에서 40,000돌턴 범위의 N-아실화된 물질이 또한 유용한 것으로 입증되었다.
본 발명의 접합분자에서 단백질에 대한 다당류의 그램분자비는 바람직하게는1몰 단백질과 20몰 다당류 사이이다. 더욱 바람직하게는 상기 비는 1몰 단백질과 약 2∼15몰 다당류 사이이다. 가장 바람직하게는 상기 비는 약 1몰 단백질과 4~7몰 다당류 사이이다. 단백질/다당류 비의 변화는 접합반응에서 시작성분의 비를 조절함으로써 달성될 수 있다.
단백질에 접합된 불포화 N-아실 유도체 다당류를 포함하는 접합분자를 제공하는 것에 추가하여, 본 발명은 또한 다원자가의 접합분자 및 다른 유형의 다당류가 단일 단백질에 접합된 백신에 관한 것이다.
본 발명의 백신은 불포화 N-아실화 다당류를 면역학적으로 적합한 담체 단백질에 접합시킴으로서 제조된다. 바람직하게는 담체 단백질은 그 자체가 면역원(immunogen)이다. 적합한 담체 단백질의 한정되지 않은 예로는 파상풍 독소, 디프테리아 독소, 바람직하게는 CRM197(Sclavo Ltd.,Siena,Italy)과 같은 교차-반응성 물질(CRMs) 및 메니고코컬 외막(outer membrane) 단백질과 같은 박테리아 단백질 담체를 포함하는 박테리아 단백질, 또는 폴리펩타이드가 있다.
어떠한 형태의 접합도 담체 단백질을 가진 변형된 다당류 절편을 접합하기 위해 도입될 수 있다. 하나의 바람직한 방법은 미합중국 특허 4,356,170에 설명된, 예컨대 터미널 알데히드족(cis-vicinal 하이드록실족의 산화를 통하여)을 N-아실화 다당류에 도입하고 환원 아미노화에 의해 상기 알데히드족을 단백질 아미노족에 결합하는 것이다. 그러므로 다당류와 단백질은 -CH2-NH-단백질 연결을 통하여 결합된다.
그러나 본 발명의 접합백신은 환원성 아민화를 통하여 만들어지는 상기 방법에 의해 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 백신은 Schneerson,R 등의 해모필러스 인플루엔자 타입 b 다당류-단백질 접합체의 제조, 특성 및 면역원성, J.Exp.Med., 1952,361-476,1980 및 Lance K. Gordon의 미합중국 특허 4,644,059에 기재된 것과 같이 아디핀 디하이드라지드 스페이서(adipic dihydrazide spacer)를 사용하여 N-아실화 다당류를 상기 담체 단백질에 접합시킴으로써 또한 제조될 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 접합분자는 전형적으로는 다당류 절편의 백본(backbone) 말단에서 단일 결합을 통해 적어도 하나의 본 발명의 메닝고코컬 다당류에 결합된 단백질을 포함한다. 따라서, 본 발명은 원한다면 단일 말단을 제외하고는 다당류 성분이 단백질에 의해 가려지지 않은(unobscured) 메닝고코컬 접합분자를 제조하는 능력을 제공한다. 분지(branch)의 말단 시알릭산을 통하여 단백질에 메닝고코컬 다당류를 접합하는 다른 방법은 복수의 부위에서 단백질에 다당류가 접착하는 교차결합을 야기한다. 또한, 본 발명은 상기 방법들의 조합을 사용하여 만들어질 수 있는 접합분자를 예측한다.
상당한 교차결합을 가지지 않는 N-아실화 다당류 단백질 접합분자 결과물은 수용성 용액에서 용해될 수 있다. 이것은 본 발명에 따른 상기 접합분자가 특히 백신 용도를 위한 적절한 후보자가 되도록 한다.
결과적인 불포화 N-아실화 다당류 단백질 접합분자는 마우스에서 시험관내(in vitro) 테스트에서 시험되었고, N-프로피오닐레이드-다당류와 비교할때 개선된 면역학적 성질을 가지고 있음이 밝혀졌다. 추가하여, 실질적으로 감소된 교차-반응성 항체의 형성이 관찰된다. 추가하여, 상기 불포화된 접합분자는 테스트된 다른 접합분자와 비교할 때 예상치 못한 정도의 높은 살균 타이터(titer)를 보였다. 이러한 점에서, 본 발명에 따른 백신은 B족 N. 메닝기티디스 또는 E. coli K1 미생물에 의해 야기되는 수막염에 유용할 것이다. 세균성 수막염에 가장 취약한 유아를 보호하기 위한 백신에 특별한 관심이 있다.
본 발명에 따른 백신은 백신에 적합한 당업자들에게 공지된 표준 담체, 버퍼 또는 보호제(preservative)를 포함할 수 있다. 아울러, 알룸(alum) 또는 스테아릴 티로신(stearyl tyrosine)과 같은 보조제가 면역반응을 향상시키기 위한 제제내에 또한 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 백신은 일반적으로 생리식염수 또는 다른 주사가능한 액체와 같은 어떤 적절한 치료적으로 수용가능한 담체내에서 접합분자를 분산시킴으로서 형성된다. 본 발명에 다른 백신의 투여는 제한됨이 없이 피하내, 복강내, 근육내로의 공지된 방법에 의해 효과를 나타낼 것이다. 바람직한 백신의 투여방법은 비경구 투여이다. 백신에서 예를 들어 락토스 또는 소르비톨같은 안정화제 및 알루미늄 인산염, 하이드로사이드, 또는 황산염과 같은 보조제와 같은 관례적인 첨가제가 존재한다.
본 발명에 따른 백신은 면역 반응을 불러 일으키기에 충분한 양으로 복용된다. 일반적으로 1회 약 1에서 50 μg의 다당류가 상기 반응을 발생시키는데 효과적이다. 복용량은 백신을 복용하는 크기, 무게 또는 나이에 따라 조절될 수 있다. 개개인에 있어서 항체반응은 항체 타이터 또는 세균활동에 대한 분석에 의해 감시되고 필요하다면 상기 반응을 높이기 위해 증가시킬 수도 있다.
유아가 복용하는 상기 백신의 적절한 복용량은 일반적으로 약 5에서 25마이크로그램의 범위내에 있으며, 또는 체중의 단위 킬로그래당 약 1에서 10마이크로그램의 범위에 존재한다.
아래의 실시예는 본 발명을 수행하는 여러가지 양태를 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
(예1)
N-아크릴로일레이트 GBMP의 합성은 Roy R.등 Glycoconjugate J.(1990)7:3-12에 개시되어 있다. N-탈아세틸화 GBMP(150mg)은 2.0밀리리터의 증류수에서 용해된다. 이러한 용해는 0℃까지 냉각되고 총 500ul에 대한 1회분 50ul아크릴로일 클로라이드(Aldrich Chemical Co.)로 처리된다. 상기 용액의 pH는 오토티트레이션 유닛을 사용한 4M NaOH를 가진 pH8.5에 의해 유지된다. 애시드 클로라이드의 완전한 첨가후(2hr) pH는 12까지 상승하고 이 수준에서 30분 동안 유지된다. 상기 물질은 약 4℃에서 증류수에 대한 완전 투석에 의해 정제되고, 163mg까지 냉동 건조가 뒤따른다. 상기 물질의 H-NMR은 아크릴로일 치환물에 대한 적절한 삽입(integration) 패턴을 가지는 100% N-아실레이션을 나타내었다.
(예2)
N-아크릴로일레이트 GBMP(150mg)는 증류수(1.25ml)에서 용해되고 수용액내3.75ml의 0.2M NAIO4용액(∼50 당량) 첨가가 뒤따른다. 상기 용액은 1시간동안 실내온도에서 어둠속에서 유지되고 에틸렌 글리콜(400ul, 10 당량)의 첨가가 뒤따른다.
상온에서 1시간경과후 상기 용액은 물로 평형화된 Sephadex G-10(1.6x100) 칼럼(Pharmacia Fine Chemicals)에 적용된다. 활성화된 산물은 보이드 부피 피크(void volume peak)에서 칼럼으로부터 용출되어 수집되고 냉동건조된다. 산화된 산물은 이때 PBS(pH7.6)에서 평형화된 BioGel A.5 칼럼상에서 분획화된다. 분자량 푸울은 용출된 물질의 선택된 분류의 HPLC(high performance liquid chromatography)분석(Pharmarcia-Superose, 12column)에 기초하여 만들어진다. 이미 만들어진 칼리브레이션 커브에 대한 각 분획의 상대적인 Kav 수치를 비교함으로써 산화된 아크릴로일레이트 GBMP의 구별되는 11 kD 분획이 선별되었다. 상기 분획은 상술한 바와 같은 투석에 의해 정제되었다. 분획화된 물질의 H-NMR스펙트로스코피는 산화된 N-아크릴로일레이트 GBMP와 일치하였다.
(예3)
N-아크릴로일레이트 GBMP의 파상풍 변성독소 접합분자의 제조
새롭게 정제된 파상풍 변성독소 모노머(TT-m; 3.5mg)가 피어스 리액티-바이알(Pierce reacti-vial) 내에서 10.5mg의 산화된 아크릴로일레이트 GBMP의 11KD 분획과 결합되었다. 나트륨 시아노보로하이드라이드(7.0mg)가 첨가되고 상기 혼합물은 233ul인산염 버퍼(0.1M,PH7.5)에서 용해되었다. 상기 용액은 5일 동안 37℃에서 배양되었다. 주기적으로, 접합 반응이 진행됨에 따라 높은 분자량에 대한 이동을가시화하기 위한 크기 배제 HPLC(Super-12,Pharmacia)에 의해 상기 접합이 모니터 되었다.
최종적인 접합분자는 PBS에서 평형화된 BioGel A.5 칼럼에서의 분획화 및 이후의 투석 및 냉동건조에 의해 시작 물질로부터 정제되었다. 전체 시알릭산(Svennerholm method) 및 단백질(BCA method,Pierce)에 대한 컬러리매트릭 분석(Svennerholm method)은 12∼30% 시알릭산에 포함된 접합분자를 나타낸다.
(예4)
마우스의 면역화
일반적으로, 10마리의 암컷 CF1 마우스(8-10주령)는 알럼(Alhydrogel, Superfos Biosector) 또는 RIBI's 완전한 또는 성분 보조제 시스템(RIBI Immunochem)과 같은 보조제의 첨가 또는 불첨가하에 2ug의 시알릭산에 상응하는 양의 접합분자(0.2ml)로 복강내로 면역화되었다. 상기 초기 백신화는 21일 및 25일이 소요되는 부양백신화가 뒤따르고 45일에 실혈(exsanguinaton)이 뒤따른다. 상기 혈액은 심장 천공을 통하여 수집되고 혈청은 -86℃에서 당량화되어 저장된다.
(예5)
살균 분석
살균 분석은 조직 배양 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Corning)에서 수행된다. 모든 항혈청은 사용이전에 30분동안 56℃에서 열에 의해 비활성으로 되었다. B족 메닝고코쿠스(strain 80-165 B:2b:p.1)는 5%CO2대기하에서 37℃에서 초콜렛 아가 플레이트(QueLab)상에서 밤새 배양되고, 후에 제 2플레이트를 접종하고 다섯시간동안 배양하였다. 항혈청의 적절한 희석은 단위 웰(well)당 50ul의 최종적인 부피가 되도록 희석하는 HanK's balanced salt solution(HBSS)을 사용하여 플레이트내에서 직접적으로 만들어진다.
HBSS에서 GBM의 현탁은 O.D.(λ580)=0.1 흡광도를 부여함으로서 만들어진다. 이러한 현탁은 분석을 위해 박테리아의 최종적으로 작동하는 희석을 부여하기 위하여 HBSS에서 40,000배 희석되었다. 새롭게 녹인 새끼 토끼 보체(Pel-Freeze Biologicals)가 각 웰에 추가되고(20ul), 후에 30ul의 작용성 박테리아 희석이 뒤따른다. 상기 플레이트는 1시간동안 37℃에서 교반되었다.
각 웰의 내용물은 초콜렛 아가 플레이트상에서 플레이팅(35ul) 이전에 혼합되었다. 이후, 플레이트는 37℃/5%CO2에서 밤새 배양되었고 콜로니 형성 유닛(CFU)이 계수되었다. % 사멸은 하기 식과 같이 HBSS 콘트롤 웰 또는 관련없는(irrelevant) 항형청의 평균값에 비례하여 결정되었다.
% 사멸 = (CFC대조군-CFU항혈청/CFU대조군)×100
(예6)
수동적 방어 분석
N-Acyl GBMP-TT면역화로부터 얻어지는 마우스 항혈청은 일반적으로 멸균된 생리식염수 또는 PBS(phosphate buffered saline)내에서 희석된다. (8-10)주령의 다섯마리 CF1암컷 마우스 그룹은 200μl의 희석된 항혈청으로 정맥주사되었다. 1시간 경과후, 각 마우스 그룹은 B족 나이세리아 메닝기티디스(GMB 80165 B:2b:P.1)로 복강내 주사되었다(500μl;800-1200 CFU/ml). 5시간경과 후, 혈액은 심장 천공에 의해 개개의 쥐로부터 수집되었고 10μl의 혈액은 쵸코렛 아거 플레이트에 배양되었다. 이러한 플레이트는 5%CO2하에 37℃에서 배양되었고, 15-20시간후에 콜로니 형성 유닛(CFU)의 수를 결정하였다.
수동적 방어 분석은 특정 항체의 존재하에서 박테리아가 감소 또는 제거되는 것에 기초하며, 특정 항체가 없는 대조군 그룹과 비교하여 측정된다. 상기 마우스 N-아실 GBMP 접합분자 혈청에 의해 제공되는 보호 정도는 관련없는 대조군 항혈청 또는 PBS와 비교하여 각 항혈청에 대한 CFU의 감소 백분율에 의해 표현된다.
(예7)
나이세리아 메닝기티디스 세로그룹 B에 대한 백신의 합성 및 생물학적 활성
나이세리아 메닝기티디스 세로그룹 B에 대한 새로운 접합 백신이 합성되었으며, 이것의 디자인은 본래 다당류의 독창적인 변형에 기초하고 있다. 본래 다당류(N-Ac GBMP)는 N-아크릴로닐족(NH-CO-CH=CH2)을 가진 N-아세틸족의 완전한 치환에 의해 아미노 말단에서 유도되어 졌다.1H 및13C-NMR 스펙트로스코피와 같은 물리적 방법들은 신규한 물질의 동일성과 균질성을 확실히 특성화시켰으며, 크기 배제 HPLC는 상기 공정이 탈중합을 통하여 다당류의 분자량을 변형시키지 않는다는 것을 보여주었다. 단백질에 대한 접합체는 상술된 공정과 유사한 방법으로 제조된다. 간략하게 N-아크릴로일 CBM 다당류를 준비한 후, N-아크릴로일 GBMP-파상풍 독소 접합분자가 제조되었다. 각 접합체의 컬러리매트릭 분석 결과 각 접합체에 대해 13%에서 20% 전체 시알릭산 비를 나타내었다. 상기 접합체의1H-NMR 스펙트로스코피는 변형된 다당류가 단백질상에 바뀌지 않은 채로 존재하는 것을 보여주었다.
별도의 동물실험에서, N-아크로일 GBMP-TT 접합체가 처음 경우에 생리식염수, 알루미늄 하이드로사이드 또는 RIBI의 완전한 보조제(MPL+TDM+CWS)와 함께 마우스에 주사되었고, 두 번째 경우에는 RIBI's 보조제와 함께 주사되었다.
각 항혈청의 혈청형 테스트 결과 양 접합체가 RIBI 보조제 시스템을 사용하는 N-프로피오닐 GBMP-TT 구조물(construct)에서 보여지는 것에 상응하거나 더 높은 특이 반응을 이끌어 냈다(표 1 참조). N-아크릴로일 GBMT-TT 항혈청의 교차반응성에 대한 예비적인 연구 결과 N-프로피오닐 GBMP-TT 항혈청에서 보여지는 것과 유사한 정도의 교차반응성을 보여주었다(표 2 참조). N-아크릴로일 GBMP-TT 항혈청의 두개의 로트(lot) 중 하나는 동일한 실험에서 투여된 N-프로피오닐 GBMP-TT 구조물과 비교할 대 본래 GMBP에 비해 상당히 덜 교차반응적이었다.
양쪽 로트의 N-아크릴로일 GBMP-TT가 살아있는 GBM에 대한 박테리아 활성에 대해 테스트되었으고 ,N-프로피오닐 GBMP-TT 항혈청과 비교할 때 유의한 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 표 1및 3에서 요약되어 있다. 표 1의 결과는 이중으로 수행된 살균 분석의 산물이며, 동일한 물질을 이용하여 수행된 다른 분석에서 발견되는 희석 수치와 일치한다. 표 1의 데이터는 아크릴로일 함유하는 특히 효과적인 살균 활성과 일치한다. 표 3은 두 개 로트의 N-아크릴로일 GBMT-TT 항혈청의 살균 활성을 동일한 동물 실험에서 얻어진 N-프로피오닐 GBMP-TT 항혈청과 비교한 것이다. 상기 분석은 15배 더 많은 수의 박테리아를 사용하며, 따라서 강한 활성을 보이는 항혈청만이 검출된다. 상기 N-아크릴로일 GBMP-TT 항혈청을 N-프로피오닐GBMP-TT 항혈청과 비교하면, 살균 활성이 실질적으로 동등함을 알수 있다.
수동적 방어 연구는 다양한 희석도로 수행되었고, 이들 모두는 유의한 정도의 제거를 보였으며, 따라서 마우스에 대한 방어를 나타내었다(표 1 참조). 다른 희석도에서 N-프로피오닐 GBMP-TT 항혈청과 비교하면 다시 거의 동일한 결과를 보였다. 수동적 방어 실험에서 두 개 로트의 N-아크릴로일 GBMP-TT 항혈청을 비교하면 실험적인 오차 내에서 양쪽 모두 동일하게 상기 마우스들을 방어한다는 것을 보여주었다.(표 3 참조)
[표 1]
다양한 보조제내에서 변형된 B족 메닝고코컬 다당류-파상풍 변성독소의 특성을 비교하는 실험 RPV-1-63의 요약
a. ELISA 타이터는 곡선상에 세개의 지점에 대해 평균한 O.D.×희석도로 정의된다. 생리식염수, 알룸 및 RIBI는 항혈청의 생성에 사용된 보조제를 나타낸다.
b. GBM 80-165의 50% 또는 90%사멸을 위해 요구되는 항-변형된 GBMP-TT/RIBI 혈청의 상호희석도. 수치는 +/- 1배의 희석이다.
c. HBSS 대조군에 대한 다양한 희석도의 항-변형된 GBMP-TT/RIBI 혈청의 GBM 80165 %제거
[표 2]
본래 N-아세틸 GBMP 항원 변형된 N-아실기 GBMP-TT 항혈청(RPV-1-63)의 교차반응성
a.. ELISA타이터는 곡선상에 세개의 지점에 대해 평균한 O.D.×희석도1로 정의된다. 생리식염수, 알룸 및 RIBI는 항혈청의 생성에서 사용된 보조제를 나타낸다.
b. N-아실은 코팅항원으로서 대응하는 다당류-인체의 세륨 알부민을 나타낸다.
c. N-아세틸은 코팅항원으로서 N-아세틸 GBMP-인간 혈청 알부민을 나타낸다.
[표 3]
N-프로피오닐 GBMP-TT 항혈청에 대한 두 개 로트의 N-아크릴로일 GBMP-TT 항혈청으로부터 보호적 성질의 요약
a.. 항혈청이 RIBI 보조제 시스템을 사용하여 유도되었다.
b. GBM 870165의 50%사멸에 대한 상호희석도. 상기 분석은 설명된 공정에 배하여 15배 큰 양의 GMB(2600cfu/100ul)를 사용한다.
c. 각각의 항혈청의 1:4희석도에서 PBS조절에 대한 GBM 80165의 %제거
(예8)
N-아실기 변형된 GBMP-TT 접합체를 이용한 추가 연구
일련의 N-아실기 변형된 GBM 다당류(N-프로피오닐 GBMP(NPr), N-부타노일GBMP(NBu), N-켄타노일 GBMP(NPe) 및 N-아크릴오일 GBMP(NAcryl))는 다당류의 탈중합을 제한하기 위하여 pH 조절을 사용한다는 점을 제외하고는 종래 기술된 것과 필수적으로 동일하게 합성되었다.1H 및13C-NMR 스펙트로스코피는 변형된 다당류를 완전히 동정하였고, 각 다당류는 100% 유도체화 되었다고 결정되었다.
동일한 분자량(11KD)의 일련의 산화된 다당류 절편이 표준화된 칼럼상에서 작용하는 SEC-HPLC에 기초하여 생산되었다. 모든 접합체는 정확히 동일한 조건하에서 합성된다. 접합체의 비색정량분석 결과 다음의 시알릭산 삽입(incorporation)을 만들어 내었다: NPr-28%, NBu-30%, NPe-18%, NAcryl-19%.
마우스들은 알루미늄 하이드록사이드상에 흡수되거나, RIBI의 보조제내에서 유화된 생리식염수에서 2μg의 시알릭 산/접합체로 면역화되었다. 모든 접합체는 멜레이즈(malaise)의 가시적 표시없이 마우스에서 잘 내성을 지니게 되었다.
대응하는 다당류 항원에 대한 다양한 항혈청의 ELISA 타이터는 표 1에 요약되어 있다. 가장 높은 타이터를 만들어 내는 보조제는 다른 소수성 보조제 시스템을 사용하여 이전의 발견을 실체화하면서 N-프로피오닐로부터 N-켄타노일까지 증가되는 RIBI의 시리즈에서 발견된다. 알룸과 같은 보조제 시스템에서, 적정에 일치하는 경향은 보이지 않았다. 다당류를 면역화하는 특이성은 또한 RIBI시리즈에서 가장 현저하게 아실기 사슬의 길이가 증가되면서 증가되었다(표 2 참조). 이러한 결과는 동일한 경향이 증명된 이전의 결과와 일치한다. 적정 및 특이성의 증가에도 불구하고, 살균 분석 및 수동적 생산 분석 모두에서 본래 박테리아에 대한 활성의증가는 연관되지 않았다. N-Pr 항혈청은 N-Bu 및 N-Pe 항혈청과 비교하여 50및 90%수준에서 월등하게 높은(14-25배 높은) 살균성의 적정을 나타낸다. 상기와 일치하게, 항혈청의 다른 희석도에서 수동적 방어 연구는 1:6희석도에서조차 상당한 제거를 나타내는 N-Pr항혈청과는 달리, 오직 가장 높은 농도에서만 N-Bu 및 N-Pe를 가진 박테리아의 명확한 제거를 나타낸다.

Claims (25)

  1. N-아세틸족이 화학식(I)로 표시되는 N-아실 유도체로 치환되고,
    상기 R1은 적어도 하나의 이중결합을 포함하는 C3-C4불포화 알킬족인 것을 특징으로 하는 변형된 B족 메닝고코컬 다당류.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 R1은 네개의 탄소이고 두개의 비인접 이중결합을 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 B족 메닝고코컬 다당류.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 R1은 네개의 탄소이고 하나의 이중결합을 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 B족 메닝고코컬 다당류.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 R1은 세개의 탄소인 것을 특징으로 하는 변형된 B족 메닝고코컬 다당류.
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 R1은CH2=CH-CH2-CH2인 것을 특징으로 하는 변형된 B족 메닝고코컬 다당류.
  6. 제 3항에 있어서,
    상기 R1은 CH2=CH-CH2인 것을 특징으로 하는 변형된 B족 메닝고코컬 다당류.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 아실 탄소로부터 가장 멀리 떨어진 탄소는 이중결합을 통하여 결합된 것을 특징으로 하는 변형된 B족 메닝고코컬 다당류.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 R1은 네개의 탄소인 것을 특징으로 하는 변형된 B족 메닝고코컬 다당류.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 R1은 세개의 탄소인 것을 특징으로 하는 변형된 B족 메닝고코컬 다당류.
  10. 화학식(II)과 같은 적어도 하나의 다당류 절편을 포함하는 접합분자에 있어서,
    상기 R2는 적어도 하나의 이중결합을 포함하는 불포화 아실족이고, 상기 절편은 면역학적으로 적합한 담체 단백질에 공유결합된 것을 특징으로 하는 접합분자.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 단백질은 박테리아 유래인 것을 특징으로 하는 접합분자.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 박테리아는 나이세리아 메닝기티디스인 것을 특징으로 하는 접합분자.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 단백질은 박테리아 유래로서 파상풍 변성독소, 디프테리아 변성독소,CRM197및 메닝고코컬 멤브레인 단백질(OMP)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합분자.
  14. 제 10항에 있어서,
    상기 다당류 절편은 N-아실 유도체 다당류이고, 상기 단백질은 파상풍 변성 독소 및 DMP이며, 상기 다당류 절편의 분자량은 3kDa 내지 50kDa인 것을 특징으로 하는 접합분자.
  15. 제 10항에 있어서,
    상기 다당류 절편은 N-아실 유도체 다당류이고, 상기 단백질은 파상풍 변성 독소이며, 상기 다당류 절편의 분자량은 10,000 Da인 것을 특징으로 하는 접합분자.
  16. 제 10항에 있어서,
    다당류 대 단백질의 몰 비는 20다당류 : 1단백질인 것을 특징으로 하는 접합분자.
  17. 제 16항에 있어서,
    다당류 대 단백질의 몰 비는 4 내지 7몰 다당류 : 1몰 단백질인 것을 특징으로 하는 접합분자.
  18. 제 10항에 있어서,
    N-아실 유도체 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 접합분자.
  19. 면역학적으로 적합한 담체 단백질에 공유결합된 B족 메닝고코컬 불포화 C3-5N-아실 유도체 다당류 절편을 포함하는 접합분자의 백신 조성물.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 단백질 성분은 박테리아 유래로서 파상풍 변성독소, 디프테리아 변성독소, CRM197및 메닝고코컬 외부 멤브레인 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  21. 제 19항에 있어서,
    상기 절편은 N-아실 유도체 다당류이고, 상기 다당류 절편의 분자량은 3kDa 내지 50kDa인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  22. 제 19항에 있어서,
    상기 단백질 성분은 나이세리아 메닝기티디스 유래인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  23. 제 10항에 따른 접합분자로 면역화된 포유동물에서 유도된 항체를 포함하는 면역혈청.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 접합분자의 다당류는 불포화 C3-5N-아실 유도체 다당류의 절편인 것을 특징으로 하는 면역혈청.
  25. 나이세리아 메닝기티디스 및 E. coli K1 감염에 대해 포유동물을 면역화하기 위한 약물을 제조함에 있어서의 제19항에 따른 백신 조성물의 이용 방법.
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