HU224972B1 - Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines and modified polysaccharides - Google Patents
Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines and modified polysaccharides Download PDFInfo
- Publication number
- HU224972B1 HU224972B1 HU9802664A HUP9802664A HU224972B1 HU 224972 B1 HU224972 B1 HU 224972B1 HU 9802664 A HU9802664 A HU 9802664A HU P9802664 A HUP9802664 A HU P9802664A HU 224972 B1 HU224972 B1 HU 224972B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- polysaccharide
- protein
- group
- conjugated molecule
- gbmp
- Prior art date
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims description 96
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims description 92
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims description 92
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 title description 3
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 title description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 47
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 40
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 claims description 16
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 claims description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 9
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 9
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims 17
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 claims 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims 1
- 125000004417 unsaturated alkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 17
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 15
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 241000617590 Escherichia coli K1 Species 0.000 description 6
- 230000006181 N-acylation Effects 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 6
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 5
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 5
- -1 stearyl tyrosine Chemical compound 0.000 description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 4
- 108010073443 Ribi adjuvant Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588677 Neisseria meningitidis serogroup B Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 3
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 125000003647 acryloyl group Chemical group O=C([*])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical compound CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-bromopyrazol-1-yl)ethyl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=C(Br)C=NN1CCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 206010027249 Meningitis meningococcal Diseases 0.000 description 1
- 206010058780 Meningitis neonatal Diseases 0.000 description 1
- 201000010924 Meningococcal meningitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010045362 Serum Globulins Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- HFBMWMNUJJDEQZ-UHFFFAOYSA-N acryloyl chloride Chemical compound ClC(=O)C=C HFBMWMNUJJDEQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/831—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving capsular polysaccharide of bacterium, e.g. polyribosyl ribitol phosphate
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
A találmány tárgyát a Neisseria meningitidis kémiailag módosított B poliszacharidjai képezik. A találmány tárgyához tartoznak továbbá olyan vakcinák, amelyekben a vonatkozó módosított poliszacharidok egy fehérjehordozóval vagy hasonlókkal vannak konjugálva.
A találmány háttere
Az N. meningitidis B csoport, valamint az E. coli K1 által előidézett meningitis változatlanul jelentős egészségügyi problémát jelent az egész világon. A B csoporthoz tartozó meningitis egyaránt előfordulhat helyi megbetegedés és járványok formájában, és felelős a meningococcus által előidézett meningitis nyilvántartott eseteinek megközelítően mintegy a feléért, míg az újszülötteknél fellépő meningitis eseteknél a K1-pozitív E. coli a vezető kórokozó. Jelenleg a kereskedelmi forgalomban nem található olyan vakcina, amely alkalmazható volna a meningococcus B csoport és az E. coli K1 által okozott betegségek kezelésére. Ennek főleg az az oka, hogy a meningococcus poliszacharid B csoportja (GBMP) csak kismértékben immunogén humán betegeknél. A természetben előforduló GBMP kismértékű immunogenitása, továbbá a vele szemben mutatott immuntolerancia feltételezhetően a humán és állati szövetekben egyaránt jelen lévő azonos epitópnak tulajdonítható. Újabb közleményekben beszámoltak olyan lehetséges vakcinákról, amelyekben külső membránfehérjékkel képzett GBMP komplexeket tartalmaznak, de egyelőre nem bizonyított ezen vakcinák hatásossága a humánkezelésben.
Újabban egy új típusú vakcinát dolgoztak ki, amely egy szintetikus, kémiailag módosított (N-propionilezett) B csoporthoz tartozó poliszacharid-fehérje (N-PrGBMP-fehérje) konjugátumon alapszik. Ezen vakcina egerekben nagy mennyiségű IgG-antitestek képződését indítja el, ami nemcsak védőhatást biztosít, hanem a módosítatlan GBMP-vel (azaz az N-acetil-GBMP-vel) keresztkötést is létesít. Ezen elképzeléseket ismerteti a 4 727 136 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (megadás dátuma: 1988. február 23.; Jennings Harold JH. és munkatársai).
Feltételezték, hogy olyan vakcina, amely keresztreakcióra képes antitestek képződését indítja el, mint amilyet a 4 727 136 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertettek, csak az esetben lehet eredményes, ha ez az immuntolerancia megtörésével ennek rovására megy. Ezt a hipotézist támasztja alá egy olyan közös epitóp azonosítása, amely a-(2-8)-kapcsolódó sziálsavmaradékokból álló láncot képez (legalább 10 maradék jelenléte a minimális kívánalom), amely struktúra mind a natív N-Ac-GBMP-ben, mind a humán és állati szövetekben jelen van [Jennings, Contrib. Microbiol. Immunoi., Basel, Karger, 10, 151-165 (1989)]. Ezen poliszialozilláncok úgy funkcionálnak, mint a fejlődés során képződő antigének, és többnyire ezeket az embrionális állapotban lévő embrionális idegsejt adhézióval hozzák kapcsolatba [Finné és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 112, 482 (1983)]. A születést követő fejlődési stádiumban ez az antigén háttérbe szorul [Friedlander és munkatársai: J. Cell. Bioi., 101, 412 (1985)], azonban felnőtt humán személyeknél expresszálódik a megbetegedett izmok gyógyulási folyamataiban [Cashman és munkatársai: Ann. Neuron., 21, 481 (1987)], valamint a daganatos sejtekben [Roth és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 299 (1988)] és a természetes (NK) és CD3+T killersejtekben [Husmann és munkatársai: Eur. J. Immunoi., 19, 1761 (1989)]. Noha ezen embrionális antigénekkel szemben mutatott tolerancia megtörésének konzekvenciáit még nem állapították meg, kívánatos olyan vakcinákat kifejleszteni, amelyek a humán epitópokkal szemben mérsékelt immunizáló hatást mutatnak.
Jelen találmány célja, hogy olyan módosított meningococcus B csoporthoz tartozó poliszacharidokat fejlesszen ki, amelyek képesek védettséget kiváltani, azonban olyan antitestek képződését indítják el, amelyeknek csak kismértékű keresztreakció-képessége van a kezelt gazdaszervezetben lévő természetes epitópokkal (jelzőszerkezetekkel) szemben. A találmány egy további feladatát képezi olyan poliszacharid-fehérje konjugátumok bemutatása, amelyek ezen módosított poliszacharidokat tartalmazzák. A találmány tárgyát képezi továbbá olyan vakcinák előállítása, amelyek védettséget biztosítanak, azonban a GBMP-vel szemben csak igen mérsékelt keresztaktivitással rendelkeznek.
A találmány összefoglalása
A találmány szerinti megoldás általánosságban kémiailag módosított Neisseria meningitidis B csoporthoz tartozó poliszacharidokat mutat be. A találmány tárgyát képezi továbbá olyan vakcina is, amelyben a fenti módosított poliszacharidok egy fehérjehordozóval vannak konjugálva.
Közelebbről a találmány tárgyát képezik az N. meningitidis B csoporthoz tartozó poliszacharidok telítetlen N-acil-származékai, a telítetlen N-acil-poliszacharid-származékok kovalens kötéssel fehérjéhez kötött konjugátumai; azon gyógyászati készítmények, amelyekben N. meningitidis telítetlen N-acil-poliszacharid-származékait tartalmazó konjugált molekulák vannak, valamint ezen vegyületeknek és vakcináknak az alkalmazása.
A találmány egyik aspektusa szerint az N. meningitidisből származó módosított B poliszacharidban lévő sziálsavmaradék N-acetil- (C2) csoportját egy telítetlen 3-5 szénatomos acilcsoporttal helyettesítjük.
Egy másik aspektus szerint olyan antigénhatású konjugátumot ismertetünk, amelyben poliszacharidok 3-5 szénatomos telítetlen N-acil-származékai egy immunológiailag megfelelő fehérjével vannak konjugálva, amely konjugátum fokozott immunogén- (védettséget kiváltó) hatást mutat a természetben előforduló poliszacharidokhoz viszonyítva, és ahol a konjugátum csökkent hajlamot mutat keresztreaktivitás kiváltására.
A találmány egy további aspektusa szerint olyan vakcinát ismertetünk, amely telítetlen N-acil-poliszacharid-származék-fehérje konjugátumot tartalmaz
HU 224 972 Β1 megfelelő vivőanyaggal vagy hígítószerrel együtt. A találmány szerinti vakcinák terápiásán hatásos mennyiségben humánkezeléshez alkalmas adjuvánst is tartalmazhatnak, például alumínium-foszfátot, alumíniumhidroxidot vagy sztearil-tirozint.
A találmány egy további aspektusa szerint egy emlősök immunizálására szolgáló eljárást ismertetünk N. meningitidis és E. coli K1 fertőzések ellen, amely módszer szerint emlősöknek - ideértve a humán betegeket is - parenterális úton immunológiailag hatásos mennyiségben találmány szerinti vakcinát adunk. A vakcinát általában mintegy 1-50 pg/kg testtömeg mennyiségben, így például 5-25 pg/kg testtömeg dózisban adjuk.
A találmány egy további aspektusa szerint olyan szérumot és gamma-globulinfrakciót ismertetünk, amelyek képesek védelmet nyújtani az N. meningitidis B csoportja, valamint az E. coli K1 által előidézett meningitis ellen. Ezen frakciót oly módon állíthatjuk elő, hogy egy emlőst egy találmány szerinti vakcinával immunizálunk, majd az immunszérumból előnyösen elkülönítjük a gamma-globulinfrakciót. Az így kapott frakciót ezután beadva védelmet biztosítunk a fenti mikroorganizmusok által előidézett fertőzések ellen, vagy pedig a frakcióval ezen mikroorganizmusok által okozott korai fertőzéseket kezeljük. Fentiekből kitűnik, hogy a találmány szerinti immunogén vakcinakonjugátumok terápiás antiszérumforrást képeznek, tekintetbe véve előnyös immunogénhatásukat, valamint azt, hogy ezen konjugátum minimális mennyiségben hoz létre a GBMP-vel keresztkötéseket létesítő antitesteket. A találmány szerinti konjugátumok eredményesen alkalmazhatók monoklonális antitestek és esetleg antidiotípusú antitestek képzésére.
Azt találtuk, hogy az N-Pr-GBMP-fehérje konjugátum által indukált baktericid- és védőhatású antitestek (4 727 136 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, Jennings és munkatársai) nem állnak kapcsolatban a GBMP keresztreaktív antitestekkel. Valójában a védőhatás nagy része egy olyan N-Pr-GBMP specifikus antitest populációval áll kapcsolatban, amely nem hajlamos keresztreakció létesítésére a GBMP-vel. Ezen észleletet figyelembe véve feltételezhető, hogy az N-Pr-GBMP egy olyan speciális baktericid epitópot utánoz, ami a B csoporthoz tartozó meningococcus felületén található.
Jelen találmány azon felismerésen alapszik, hogy elő lehet állítani olyan módosított GBMP-t, amely képes a baktericid epitópot utánozni, és amely konjugált alakban nemcsak hogy fokozott immunogenitást mutat, de lényegében véve nem indítja el olyan antitestek képződését, amelyek GBMP-vel keresztreakcióba lépnének.
A találmány szerinti megoldás lényege, hogy különféle kémiailag módosított GBMP-t szintetizáltunk és konjugáltunk egy adott fehérjével, majd ezen konjugátumokat egereknek adtuk be injekciós úton, majd összehasonlítottuk a kiváltott hatást az N-Pr-GBMP-fehérje konjugátum által előidézett hatással. Meglepő módon azt találtuk, hogy az N-acil-részben jelen lévő telítetlen kötés olyan konjugátumot eredményez, amely nagymértékben immunogén.
A találmány jellemző vonásait a leírásban részletesen ismertetjük. A találmány oltalmi körét azonban csak az igénypontok körvonalazzák.
A találmány részletes ismertetése
A találmány általánosságban a Neisseria meningitidis B csoporthoz tartozó poliszacharidok új telítetlen N-acil-származékait ismerteti, továbbá ezen B csoporthoz tartozó telítetlen N-acil-származékok új konjugátumait, valamint olyan gyógyászati készítményeket mutat be, amelyek a Neisseria meningitidis B csoportbeli poliszacharidfragmentum telítetlen N-acil-származékának és fehérjének kovalens kötéssel képzett konjugátumát tartalmazza; a találmány tárgyához tartozik ezen konjugátumokat tartalmazó vakcinák alkalmazása is.
A találmány tárgyát képezik közelebbről az (I) általános képletű B csoporthoz tartozó N. meningitidis poliszacharidok telítetlen N-acil-származékai, ahol a képletben
R1 jelentése 2-4 szénatomos telítetlen alkilcsoport, amelyik legalább egy telítetlen kötést tartalmaz.
A találmány egyik megoldása szerint az (I) általános képletben R4 jelentése 3 vagy 4 szénatomos alkilcsoport, amelyben két, egymással nem szomszédos kettős kötés van.
A találmány egy további megoldása szerint az (I) általános képletben R·, jelentése 2, 3 vagy 4 szénatomos alkilcsoport, amelyben az acilcsoport szénatomjától legtávolabb lévő szénatom kettős kötéssel kapcsolódik.
Az (I) általános képletű módosított B meningococcus poliszacharid N-acil-származékának előnyös, de nem korlátozó példájaként említjük meg a következőket:
N-pentenoil (CH2=CH-CH2-CH2-CONH-) [(1) képletű csoport];
az N-krotonoil-(3-butenoil)-csoport (CH2=CH-CH2-CONH-) [(2) képletű csoport],
A B csoporthoz tartozó meningococcus poliszacharidot N. meningitidisből különítettük el a technika állásából ismert módszerekkel. Az egyik módszer szerint a B csoporthoz tartozó meningococcust (981B jelzésű törzs) fermentorban 37 °C hőmérsékleten tenyésztjük, ehhez 30 g dehidratált Todd Hewitt Broth-féle (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) táptalajt használunk 1 liter desztillált vízre számítva. A fermentorban való tenyésztést megelőzően a liofilizált törzset 37 °C hőmérsékleten 5%-os (térfogat/térfogat) juhvéragarral bevont lemezen (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) lombikban (gyertyatartó edényben) tenyésztjük. A baktériumokat ezután 1,0 liter térfogatú, Todd Hewitt-féle táptalajon (fentiek szerinti) tenyésztjük Erlenmeyer-lombikban 37 °C hőmérsékleten, a táptalajt 7 óra hosszat 190 fordulat/perc sebességgel rázatjuk. Ezen inokulumot azután a fermentorhoz adjuk. A fermentorban 16 óra hosszat végezzük a baktériumok tenyésztését, majd formaiin hozzáadásával a baktériumokat elpusztítva a végső koncentrációt 0,75%-ra állítjuk be. A bak3
HU 224 972 Β1 tériumokat ezután folyamatos centrifugálással eltávolítjuk, a B csoporthoz tartozó meningococcus poliszacharidot a felülúszóból elkülönítjük és tisztítjuk; a tisztítást lényegében Bundle és munkatársai szerint végezzük [J. Bioi. Chem., 249, 4797-4801 (1974)], azzal az eltéréssel, hogy a fehérjét oly módon extraháljuk, hogy a nyers poliszacharid oldatát hideg (4 °C hőmérsékletű) 90%-os fenollal keverjük, nem pedig forró (50-60 °C hőmérsékletű) fenollal. Ezen módszer segítségével nagy móltömegű GBMP-t állíthatunk elő.
E. colit (0,18:K1 :H7) (NRCC 4283) tenyésztünk fermentorban 37 °C hőmérsékleten, táptalajként dehidratált agy/szív infúziót tartalmazó (BHI; 37 g/liter) (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) desztillált vizet használunk. A fermentorban végzett tenyésztést megelőzően a liofilizált törzset 50 ml BHI oldatban (a fentiekkel azonos) Erlenmeyer-lombikban tenyésztjük, a műveletet 37 °C hőmérsékleten végezzük, a táptalajt 7 óráig 200 fordulat/perc sebességgel rázatva. Ezen tenyészetet azután 1,5 liter BHI (fentiek szerinti) táptalajhoz adjuk, majd a fentiekben ismertetett körülmények között a tenyésztést 7 óra hosszat folytatjuk. Az így kapott inokulumot ezután a fermentorhoz adjuk.
Az E. coli K1-ből nyert kapszuláris poliszacharid elkülönítését és tisztítását oly módon végezzük, mint azt a fentiekben a B csoporthoz tartozó meningococcus poliszacharid elkülönítésénél és tisztításánál leírtuk.
Hangsúlyozni szeretnénk, hogy a fentiekben ismertetett elkülönítési és tisztítási műveletek mellett alkalmazhatók egyéb ismert módszerek is, mint például a Watson és munkatársai által közölt módszer [J. Immunoi., 81, 331 (1958)], de eljárhatunk a 4 727 136 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módszer szerint is.
A natív poliszacharidot N-dezacetilezzük, így a molekula sziálsavrészében egy reakcióképes aminocsoportot kapunk. Az N-dezacetilezést bármely ismert módon elvégezhetjük, így például lúgos vizes közegben, magasabb hőmérsékleten, így például 90-110 °C-on, ahol a pH mintegy 13-14. Lúgos vizes közegként célszerűen vizes alkálifém-hidroxid-oldatot használunk, így például mintegy 2 mol/l koncentrációjú nátrium-hidroxid-oldatot. Egy másik megoldásként használhatunk vizes hidrazinoldatot is. Az N-dezacetilezés mértéke a körülményektől függően változhat mintegy 30%-tól 100%-ig. Előnyös, ha az N-dezacetilezés mintegy 90-100%-os mértékben végbemegy. Az N-dezacetilezett terméket az elegyből például hűtéssel, semlegesítéssel, tisztítással vagy kívánt esetben liofilizálással nyerhetjük ki.
Az N-dezacetilezés következtében általában olyan poliszacharidfragmentumokat kapunk, amelyek átlagmóltömege mintegy 3000 és 50 000 dalton között van. A találmány szerinti megoldáshoz a fragmentumok és a teljes hosszúságú poliszacharidok egyaránt használhatók.
Ezután az N-dezacetilezett poliszacharidfragmentumokat és a teljes hosszúságú poliszacharidokat N-acilezésnek vetjük alá, így megkapjuk a megfelelő N-acilezett terméket. Az N-acilezést végezhetjük oly módon, hogy az N-dezacetilezett poliszacharidot puffertartalmú vizes oldatban feloldjuk (amelyben a pH mintegy 7,5 és 9,0 között van), majd az elegyhez adjuk a megfelelő telítetlen savanhidridet, adott esetben az oldékonyság fokozására alkoholt adunk az elegyhez, majd az elegy hőmérsékletét 10 °C alá hűtjük, amíg a reakció teljessé nem válik. Kívánt esetben a reakcióelegyet tisztíthatjuk. A tisztítási módszerek közül megemlítjük például nem korlátozó értelemben a dialízist, ezután az N-acilezett terméket liofilizálással nyerjük ki. A reakció lényegében 10-20 óra alatt teljessé tehető. Az N-acilezés mértékét analitikai módszerekkel állapítjuk meg, általában 1H-NMR segítségével, az N-acilezés legalább 90%-os, vagy még valószínűbb, hogy ez az érték 100%-hoz közel van. Az N-acilezési reakció nem idézi elő számottevő mértékben a fragmentumok molekulatömegének csökkenését.
A találmány szerinti konjugált molekulák legalább egy Neisseria meningitidis B csoportbeli poliszacharidot tartalmaznak, ahol az N-acetil-csoport helyén egy (I) általános képletű telítetlen N-acil-csoport áll, ahol a képletben R·, jelentése egy telítetlen 2-4 szénatomos alkilcsoport. A konjugátumok ily módon tartalmazhatják a találmány szerinti telítetlen poliszacharidokat, és tartalmazhatják az akriloilszármazékot is.
A találmány szerinti megoldásnál előnyös, ha konjugálás céljára olyan 3-5 szénatomos N-acilezett anyagot állítunk elő, amelynek átlag-molekulatömege mintegy 10-200 sziálsavmaradéknak felel meg. így előnyös konjugátumot képez az N-akriloil-(2-propenoil)-származék. Ezen származék elkülönítése történhet az N-acilezett GBMP gélszűrésével, e művelethez AcA 44 oszlopot (ahol a gyöngyök átmérője 60-140 pm) és eluálószerként PBS-t használunk. Másik lehetőségként egy megfelelő méretű membránt használhatunk.
A találmány szerinti megoldáshoz előnyösen olyan telítetlen N-acilezett anyagot használunk, amelynek átlagmóltömege 10 000-15 000 dalton. Ezen móltömegű anyaghoz oly módon jutunk, hogy kiválasztjuk az N-acilezett GBMP-anyagot tartalmazó oszlopról lejövő eluátum megfelelő frakcióját. A magasabb átlagmóltömegű N-acilezett anyag, így például amelynek móltömege 30 000 és 40 000 dalton között van, szintén eredményesen alkalmazható a találmány szerinti megoldáshoz.
A poliszacharidnak a fehérjéhez viszonyított mólaránya a találmány szerinti konjugált molekulában előnyösen 1 mól fehérje 20 mól poliszacharidhoz viszonyítva. Ez az arány még előnyösebben 1 mól fehérje/mintegy 2-15 mól poliszacharid. Legelőnyösebb, ha ezen arány mintegy 1 mól fehérje/4-7 mól poliszacharid. A fehérje/poliszacharid arányt oly módon változtathatjuk, hogy a kiindulási komponensek arányát megfelelően választjuk meg a konjugálás! reakcióban.
Amellett, hogy olyan konjugált molekulákat mutatunk be, amelyekben olyan poliszacharidok vannak a fehérjéhez konjugálva, amelyek telítetlen N-acil-láncot hordoznak, a találmány olyan konjugátumokat és eze4
HU 224 972 Β1 két tartalmazó vakcinákat is ismertet, amelyekben különféle típusú poliszacharidok vannak egy adott fehérjéhez konjugálva.
A találmány szerinti vakcinákat oly módon állítjuk elő, hogy a telítetlen savval N-acilezett poliszacharidot egy immunológiailag megfelelő fehérjehordozóval konjugáljuk. Előnyösen maga a hordozófehérje egy immunogén anyag. Nem korlátozó értelemben a megfelelő hordozófehérjékre példaként említjük meg a bakteriális eredetű fehérjéket vagy polipeptideket, így például a tetanusztoxoidot, a keresztreakció végzésére alkalmas anyagokat (CRMs), előnyösen a CRM197-et (amit a Sclavo Ltd.-től szereztünk be, Siena, Olaszország); bakteriális eredetű fehérjehordozóként megemlítjük a meningococcus külső membránjából származó fehérjéket.
A módosított poliszacharidfragmentumoknak a hordozófehérjével való konjugálása történhet bármely konjugálás! módszer segítségével. Előnyös a 4 356 175 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módszer, miszerint terminális aldehidcsoportokat (cisz-vicinális hidroxilcsoportok oxidációja révén előállítva) építenek be az N-acilezett poliszacharidba, majd az aldehidcsoportot reduktív aminezéssel a fehérje aminocsoportjához kapcsolják. A poliszacharid és a fehérje ily módon egy -CH2-NHfehérje kötés révén kapcsolódik össze.
Hangsúlyozni szeretnénk, hogy a találmány szerinti konjugált vakcinákat nem korlátozzuk a reduktív aminezéssel előállított konjugátumokra. így a vakcinákat előállíthatjuk oly módon is, hogy az N-acilezett poliszacharidot a hordozófehérjével egy adipin-dihidrazid spacer segítségével kapcsoljuk össze, mint ahogy azt Schneerson, R. és munkatársai ismertették [Haemophilus influenzáé b típus poliszacharid-fehérje konjugátumok előállítása, jellemzői és immunogenitása (Preparation, Characterization and Immunogenicity of Haemophilus influenzáé type b Polysaccharide-Protein Conjugates), J. Exp. Med., 1952. 361-476 (1980)], valamint ahogy azt a 4 644 059 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás [Láncé K. Gordon] ismerteti. Másik lehetőségként használhatjuk a Merck által kifejlesztett biner spacer technológiát, mint amit Marburg, S. és munkatársai ismertetnek [Makromolekulák biomolekuláris kémiája: Bakteriális eredetű poliszacharidkonjugátumok Neisseria meningitidis membránfehérjével történő szintézise (Biomolecular Chemistry of Macromolecules: Synthesis of Bacterial Polysaccharide Conjugates with Neisseria meningitidis), J. Am. Chem., 108, 5282-5287 (1986)], vagy használhatjuk a végcsoportok redukálásának módszerét is.
A találmány szerinti eljárással előállított konjugált molekulák jellemző módon tartalmaznak egy fehérjét, amelyhez legalább egy találmány szerinti meningococcus poliszacharid fragmentum kapcsolódik egyetlenegy kötési ponton a poliszacharidfragmentum gerincének végcsoportján. így a találmány szerinti megoldással olyan meningococcus konjugált molekulákat állíthatunk elő, ahol a poliszacharidkomponens - eltekintve egy végpontjától - nincs fehérjével elfedve. Az egyéb módszerek esetében, amelyeknél a meningococcus poliszacharidok fehérjéhez köthetők az elágazó láncok terminális sziálsavján keresztül, ez a konjugálás! eljárás keresztkötés képződéséhez vezethet, valamint ahhoz, hogy a poliszacharid több ponton kapcsolódik a fehérjéhez. A találmány tárgyához tartoznak azon konjugált molekulák is, amelyek különféle módszerek kombinációjával vannak előállítva.
Az előállított N-acilezett poliszacharid-fehérje konjugátumok, amelyek nem tartalmaznak számottevő mértékben keresztkötéseket, vizes oldatokban jól oldhatók. A találmány szerinti konjugátumoknak ezen tulajdonsága különösen alkalmassá teszi a konjugátumokat vakcinához történő felhasználásra.
A találmány szerinti telítetlen N-acilezett poliszacharid-fehérje konjugátumot egereken in vitro körülmények között vizsgáltuk, és azt találtuk, hogy ez a konjugátum az N-propionilezett poliszacharidhoz viszonyítva sokkal kedvezőbb immunogén tulajdonságokat mutat. Ezen túlmenően lényegesen csökkent a keresztreakciókra hajlamos antitestek képződése. Ezen túlmenően a telítetlen konjugátum nem várt módon magas baktericid titert mutatott a vizsgált egyéb konjugátumokhoz viszonyítva. Mindezeket figyelembe véve feltételezzük, hogy a találmány szerinti vakcinákat eredményesen lehet alkalmazni a B csoporthoz tartozó N. meningitidis vagy E. coli K1 mikroorganizmusok által előidézett meningitis ellen. Különösen nagy figyelmet érdemelnek azok a vakcinák, amelyek gyermekek védelmére használhatók, minthogy a gyermekek a bakteriális eredetű meningitisekre igen érzékenyek.
A találmány szerinti vakcinák a technika állásából ismert standard vivőanyagokat, pufferokat vagy konzerválószereket tartalmazhatják, amelyek általában a vakcinákhoz használhatók. Ezen túlmenően a vakcinák tartalmazhatnak adjuvánsokat is, mint Alumot (Alhydrogel, Superfos Biosector) vagy sztearil-tirozint a készítmény immunogénválaszt kiváltó képességének fokozására.
A találmány szerinti vakcinákat általában úgy állítjuk elő, hogy a konjugátumot valamely gyógyászatilag megfelelő vivőanyagban, így például fiziológiás sóoldatban vagy egyéb injekciós folyadékban diszpergáljuk. A találmány szerinti vakcinát adhatjuk bármely ismert módszer szerint, nem korlátozó értelemben megemlítjük a szubkután, intraperitoneális vagy intramuszkuláris beadási módot. A vakcina legelőnyösebb beadási módja a parenterális út. A vakcinákban jelen lehetnek szokásos adalék anyagok, mint például stabilizálószerek, így laktóz vagy szorbit, továbbá adjuvánsok, mint alumínium-foszfát, -hidroxid vagy -szulfát.
A találmány szerinti vakcinát hatásos mennyiségben adjuk be, amely képes immunogénválaszt kiváltani. Általában mintegy 1-50 pg poliszacharid beadása alkalmas ilyen válasz kiváltására. A dózis nagyságát változtathatjuk a kezelt személy méretét, testtömegét vagy korát figyelembe véve. A kezelt személy antitest5
HU 224 972 Β1 válaszát ellenőrizhetjük, meghatározva az antitesttitert vagy a baktericidaktivitást, és szükség esetén emlékeztető injekciót adhatunk be.
Gyermekek kezelésére megfelelő dózisként a vakcinából mintegy 5-25 mikrogramm vagy mintegy 1-10 mikrogramm/kg testtömeg mennyiséget adhatunk be.
Példák
A találmány szerinti megoldást az alábbi példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.
1. példa
N-Akriloilezett GBMP szintézise
Az N-akriloilezett GBMP szintézisét Roy R. és munkatársai ismertetik [Glycoconjugate J., 7, 3-12 (1990)]. 150 mg N-dezacetilezett GBMP-t oldunk fel 2,0 ml desztillált vízben. Az oldatot 0 °C hőmérsékletre lehűtjük, majd 50 pl (1 ekvivalens) akriloil-klorid-részletekkel kezeljük (Aldrich Chemical Co.), összesen 500 μΙ-t használunk fel. Az oldat pH-ját 8,5 értéken tartjuk 4 mol/l koncentrációjú NaOH-oldat segítségével, a pH-beállításhoz automatikus titrálóegységet használunk. A savklorid teljes mértékű beadagolása után (mintegy 2 óra) a pH-t 12-re emeljük, és ezen az értéken tartjuk 30 percig. Az így kapott anyagot kimerítő dialízis segítségével tisztítjuk 4 °C hőmérsékleten, desztillált vízzel szemben, majd ezután liofilizálást végzünk, így 163 mg anyagot kapunk. A H-NMR-vizsgálat adatai szerint az így kapott termékben az N-acilezés 100%-os volt, ahol az akriloilszubsztituens a megfelelő kapcsolódási minta szerint kötődött.
2. példa
N-Akriloilezett GBMP aktiválása
150 mg N-akriloilezett GBMP-t 1,25 ml desztillált vízben feloldunk, majd az oldathoz 3,75 ml, 0,2 mol/l koncentrációjú (»50 ekvivalens) NalO4 vizes oldatot adunk. Az oldatot 1 óra hosszat sötét helyen szobahőmérsékleten tartjuk, majd 400 μΙ (10 ekvivalens) etilénglikolt adunk hozzá. Az oldatot szobahőmérsékleten tartjuk 1 óra hosszat, majd közvetlenül ezután vízzel kiegyensúlyozott Sephadex G-10 (1,6*100) oszlopra (Pharmacia Fine Chemicals) visszük fel. Az aktivált terméket az oszlopról az üres térfogatcsúcsnál eluáljuk, a kapott anyagot elkülönítjük és liofilizáljuk. Az oxidált terméket ezután BioGel A5 oszlopon (1,6*100) (BioRad) frakcionáljuk, ahol az oszlopot előzőleg 7,6 pH-jú foszfátpuffer-tartalmú sóoldattal egyensúlyozzuk ki. HPLC analízis (nagy teljesítményű folyadékkromatográfia, Pharmacia-Superose, 12 oszlop) alapján az eluált anyagból a kiválasztott frakciókat móltömeg alapján egyesítjük. Minden egyes frakciónál a relatív Kav-értéket összehasonlítjuk egy előzetesen elkészített kalibrációs görbével, így kiválasztjuk az oxidált akriloilezett GBMP diszkrét 11 KD frakcióit. A frakciókat dialízis segítségével tisztítjuk a fentiekben leírtak szerint. A H-NMR-spektroszkópiás vizsgálat azt igazolja, hogy a frakcionált anyag oxidált N-akriloilezett GBMP.
3. példa
N-Akriloilezett GBMP-t tartalmazó tetanusztoxoid-konjugátum előállítása
Frissen tisztított tetanusztoxoid-monomert (TT-m;
3,5 mg) Pierce-féle reakciós edényben 10,5 mg oxidált akriloilezett GBMP 11 KD frakciójával elegyítünk. Az elegyhez 7,0 mg nátrium-ciano-bór-hidridet adunk, majd az elegyet 233 μΙ, 7,5 pH-jú foszfátpufferrel (0,1 mol/l) elegyítjük. Az oldatot összesen 5 napig 35 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Időnként a konjugálás előrehaladását ellenőrizzük méretkizárásos HPLC vizsgálattal (Superose-12, Pharmacia), így követjük a konjugálás előrehaladásával a magasabb móltömegű termékek képződését. A végtermékként kapott konjugátumot a kiindulási anyagtól megtisztítjuk, ebből a célból frakcionálást végzünk PBS-sel kiegyensúlyozott BioGel A.5 oszlopon, ezután dialízist, majd liofilizálást végzünk. A kolorimetriás módszerrel meghatározzuk az összes sziálsavat (Svennerholm módszer), valamint a fehérjetartalmat (BCA módszer, Pierce), a kapott eredmények szerint az előállított konjugátum 12-30% sziálsavat tartalmaz.
4. példa
Egerek immunizálása
Általában 8-10 hetes, CF1 típusú 10 nőstény egeret intraperitoneálisan (0,2 ml) immunizálunk olyan mennyiségű konjugátummal, amely ekvivalens 2 pg sziálsavval, adjuvánsok hozzáadásával vagy anélkül, ahol adjuvánsként használhatunk Alumot (Alhydrogel, Superfos Biosector), vagy RIBI komplett vagy kiegészítő adjuváns rendszert (RIBI Immunochem). Az első vakcinaoltást egy emlékeztető oltás követi a 21. és 35. napon, az állatok vérét a 45. nap eltelte után leengedjük. A vért szívpunkció segítségével vesszük le, a szérumot aliquot részekre felosztva -86 °C hőmérsékleten tároljuk.
5. példa
Baktericidvizsgálat
A szövettenyészetek baktericidvizsgálatát 96 nyílású mikrotiterlemezeken végezzük (Corning). Mindegyik antiszérumot 56 °C hőmérsékleten 30 percig inaktiváljuk felhasználás előtt. B csoporthoz tartozó meningococcust (törzsszám: 80165 B:2b:p.1) egy éjszakán át tenyésztünk csokoládés agarlemezen (QueLab), a tenyésztést 37 °C hőmérsékleten 5% CO2-tartalmú atmoszférában végezzük, ezután egy második lemezt inokulálunk, amit 5 óra hosszat inkubálunk. Az antiszérum megfelelő hígításait közvetlenül a lemezen végezzük, a hígításhoz Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatot (HBSS) használunk oldószerként, így a végső térfogatot 50 μΙ/lyuk értékre állítjuk be. GBM-szuszpenziót készítünk HBSS-sel, a szuszpenzió OD (λ580)=0,1 abszorpciót mutat. Ezen szuszpenziót 40 000-szeresére meghígítjuk HBSS-t használva oldószerként, így megkapjuk a vizsgálathoz alkalmas végső baktériumhígítást. Minden egyes nyílásba frissen felolvasztott újszülött nyúl kiegészítőt (Pel-Freeze Biologicals) adunk (20 μΙ), ezután minden egyes nyílásba 30 μΙ bakté6
HU 224 972 Β1 rium-véghígítást adagolunk. A lemezt 37 °C hőmérsékleten 1 óra hosszat rázatjuk. A nyílások tartalmát összekeverjük, majd 35 μΙ-t csokoládétartalmú agarlemezekre viszünk fel. A lemezeket egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 5% CO2-tartalmú atmoszférában, majd megszámoljuk a kolóniát képző egységeket (CFU). A baktériumpusztulás százalékát a HBSS-tartalmú kontroli-lyukakban mért átlagértékhez vagy egy irreleváns antiszérumhoz viszonyítva állapítjuk meg az alábbiak szerint:
pusztulás%-(CFUkontro|rCFUantiszérum/CFUkontron)x100
6. példa
Passzív védelem vizsgálata
N-Acil-GBMP-TT immunizálással kapott egér antiszérumokat steril sóoldattal vagy PBS-sel (foszfáttal pufferolt sóoldat) szokásos módon meghígítunk. 8-10 hetes nőstény CF1 típusú egerek 5 állatból álló csoportjainak intravénásán 200 pl hígított antiszérumot injektálunk. 1 óra eltelte után minden egyes egércsoportnak intraperitoneális injekció formájában (500 μΙ; 800-1200 CFU/ml) B csoport Neisseria meningitidis (GMB 80165, B:2b:P.1) szuszpenziót adunk be. 5 óra eltelte után az állatok vérét egyenként végzett szívpunkció segítségével levesszük, 10-10 μΙ vérmintát csokoládés agarlemezekre viszünk fel. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten 5% CO2-tartalmú atmoszférában inkubáljuk, majd 15-20 óra eltelte után a kolóniaképző egységek számát (CFU) meghatározzuk.
A passzív védelem fennállását oly módon állapítjuk meg, hogy mérjük a specifikus antitest jelenlétében a baktériumok csökkenését vagy kiválasztóképességét (clearance) olyan kontrollcsoportokhoz viszonyítva, amelyeknél a specifikus antitest hiányzik. Az egér anti-N-acil-GBMP-konjugátum által biztosított védelem mértékét a kolóniaképző egységek (CFU) számának csökkenésével fejezzük ki százalékban, ahol az antiszérum hatására mutatkozó csökkenést valamely irreleváns kontrollantiszérumhoz vagy PBS-hez viszonyítjuk.
7. példa
Neisseria meningitidis B szérumcsoportból készült vakcina előállítása és biológiai hatásának vizsgálata
Új konjugált vakcinát állítunk elő N. meningitidis B szérumcsoport ellen, amely vakcina a természetes poliszacharid egy módosítását tartalmazza. A természetes poliszacharidot (N-Ac-GBMP) az aminovégcsoporton egy más származékká alakítjuk át, az N-acetil-csoportokat teljes mértékben N-akriloil-csoportokkal (NH-CO-CH=CH2) cseréljük le. Fizikai módszerekkel, így 1H- és 13C-NMR-spektroszkópos vizsgálattal ellenőrizzük az új származékok azonosságát és homogenitását, továbbá méretkizárásos módszerrel, HPLC-vel igazoljuk, hogy az előállítás során a poliszacharidmolekula mérete nem változott, depolimerizáció nem következett be. A fehérjével kialakított konjugátumokat ismert módszerekhez hasonlóan állítottuk elő. Röviden, az N-akriloil-GBM poliszacharid előállításából kiindulva két eltérő N-akriloil-GBMP-tetanusztoxoid konjugátum tételt állítottunk elő. A kolorimetriás vizsgálat szerint a konjugátumok 13% és 20% sziálsav/konjugátum arányt mutattak. Az 1H-NMR-spektroszkópiás vizsgálat szerint a konjugátumokban kimutatható a fehérjékhez kapcsolódó módosított poliszacharid jelenléte.
Különféle állatkísérletekben N-akriloil-GBMP-TT konjugátumokat injektáltunk egereknek, ahol a beadott oldat vagy sót, alumínium-hidroxidot vagy RIBI-féle teljes adjuvánst (MPL+TDM+CWS) tartalmazott az egyik esetben, és RIBI-féle adjuvánst a másik esetben. Az egerek szemmel láthatóan jól tolerálják a vakcinákat.
Minden egyes antiszérum szerológiai vizsgálata azt igazolja, hogy mindkét konjugátum azonos vagy magasabb specifikus választ váltott ki, mint amit az N-propionil-GBMP-TT szerkezettel kapunk RIBI-féle adjuváns rendszer használatával (lásd az 1. táblázatot). Az Nakriloil-GBMP-TT antiszérumok keresztreaktivitására vonatkozó első tanulmányok azt mutatják, hogy az eredmények megegyeznek azokkal, amelyeket az Npropionil-GBMP-TT antiszérumok keresztreaktivitásának mérésénél kapunk (lásd a 2. táblázatot). Az N-akriloil-GBMP-TT-tartalmú két antiszérumtétel közül az egyik lényegesen kisebb mértékű keresztreaktivitást mutatott a natív GBMP-vel szemben, mint amit az Npropionil-GBMP-TT konjugátum beadásával azonos kísérleti körülmények között észleltünk.
Mindkét N-akriloil-GBMP-TT tétel baktericidhatását vizsgáltuk élő GBM-mel szemben, azt találtuk, hogy ezek lényegesen aktívabbnak mutatkoztak az N-propionil-GBMP-TT antiszérumokhoz viszonyítva. Ezen eredményeket az 1. és 3. táblázatban mutatjuk be. Az
1. táblázat szemlélteti a baktericidvizsgálatok eredményeit, a vizsgálatokat 2 párhuzamossal végeztük, és összhangban állnak a hasonló anyaggal kapott hígítási értékekkel. Az 1. táblázat adatai összhangban állnak a különösen hatásos akriloiltartalmú baktericidek aktivitásával. A 3. táblázat mutatja be a két N-akriloil-GBMP-TT antiszérum tétel baktericidhatását, valamint az azonos állatkísérletekben kapott N-propionil-GBMP-TT antiszérummal kapott eredményeket. A vizsgálatokhoz 15-ször nagyobb számú baktériumot használtunk, és így csak az erős hatású antiszérumokat észleltük. Az N-akriloil-GBMP-TT antiszérumot az N-propionil-GBMP-TT antiszérumhoz hasonlítva azt látjuk, hogy a baktericidhatás mindkét esetben lényegében azonos.
A passzív védelem fennállásának vizsgálatát különböző hígításokban végeztük el, mindegyik számottevő clearance-et mutatott, igazolva, hogy az egerekben védelmet alakítottunk ki (lásd az 1. táblázatot). N-Propionil-GBMP-TT antiszérummal összehasonlítást végeztünk különböző hígításokban, amikor is ismét közel azonos eredményeket kaptunk. A két N-akriloil-GBMP-TT antiszérum tételnél a passzív védelmet összehasonlító vizsgálatokban azt találtuk, hogy mindkét tételnél egerekben azonos mértékű védelmet nyújt a kísérleti hibahatáron belül (lásd a 3. táblázatot).
HU 224 972 Β1
1. táblázat
RPV-1-63-as kísérlet összefoglalása: a módosított meningococcus B csoport poliszacharid-tetanusztoxoid konjugátum tulajdonságainak összehasonlítása különböző adjuvánsokat használva
| Antiszérum | ELISA-titera | Baktericid titer*3 | Passzív védelem titer0 | |||||
| Só | Alum | RIBI | 90%-os pusztulás | 50%-os pusztulás | Clearance (%) (tisztán) | Clearance (%) (1:4) | Clearance (%) (1:6) | |
| N-Propionil-GBMP-TT | 14 387 | 38 667 | 235 456 | 210 | 690 | 100 | 81 | 73 |
| N-Butanoil-GBMP-TT | 11 253 | 38 859 | 363 264 | 9,2 | 50 | 60 | - | 0 |
| N-Pentanoil-GBMP-TT | 14019 | 53 248 | 469 920 | 12,1 | 28 | 57 | - | 0 |
| N-Akriloil-GBMP-TT | 1 698 | 7 280 | 218 304 | 1 000 | 2 120 | 96 | 78 | 46 |
3 Az ELISA-titert OD*hígítás1-ként definiáljuk a görbe három pontjának átlagaként. Só, Alum és RIBI adjuvánsként kerül felhasználásra az antiszérum előállításánál.
b Az antimódositott GBMP-TT/RIBI szérum reciprok hígítása, amely a GBMP 80165-nek 50%-os vagy 90%-os elpusztításához szükséges. Az adatok±egy hígításnyira pontosak.
c GBM 80165 clearance százalékban kifejezve az antimódositott GBMP-TT/RIBI szérum különböző hígításaiban egy HBSS-kontrollhoz viszonyítva.
2. táblázat
A módosított N-acil-GBMP-TT antiszérum (RPV-1-63) keresztreakciója a natív N-acetil-GBMP antigénnel
| Antiszérum | ELISA-titer3 | ||||||||
| Sóoldat | Alum | RIBI | |||||||
| N-Acilb titer | N-Acilc titer | N-Acil/Nacetil titer aránya | N-Acil titer | N-Acetil titer | N-Acil/Nacetil titer aránya | N-Acil titer | N-Acetil titer | N-Acil/Nacetil titer aránya | |
| N-Propionil-GBMP-TT | 2 557 | 53 | 49 | 6 217 | 795 | 8 | 51 373 | 2 910 | 18 |
| N-Butanoil-GBMP-TT | 2 628 | 45 | 59 | 10 979 | 226 | 49 | 66 267 | 406 | 163 |
| N-Pentanoil-GBMP-TT | 2 764 | 9 | 314 | 6 491 | 150 | 43 | 120 533 | 311 | 388 |
| N-Akriloil-GBMP-TT | 338 | 7 | 46 | 3 022 | 546 | 6 | 50 040 | 1 100 | 45 |
a Az ELISA-titert ODxhígítás1-ként definiáljuk a görbe három pontjának átlagaként. Só, Alum és RIBI adjuvánsként kerül felhasználásra az antiszérum előállításánál.
b Az N-acil bevonó antigénként a homológ poliszacharid-humán szérumalbumin konjugátumot jelenti.
c Az N-acetil bevonó antigénként az N-acetil-GBMP-humán szérumalbumin konjugátumot jelenti.
3. táblázat
A két N-akriloil-GBMP-TT antiszérum tétel védő tulajdonságainak összefoglalása az N-propionil-GBMP-TT antiszérumhoz viszonyítva
| Antiszérum3 | Baktericidhatásb 50%-os pusztulás | Passzív védelem0 Clearance %-ban |
| N-Propionil-GBMP-TT (RPV-1-45) | 53 | 92 |
| N-Akriloil-GBMP-TT (RPV-1-45) | 80 | 100 |
| N-Propionil-GBMP-TT (RPV-1-63) | 29 | 81 |
| N-Akriloil-GBMP-TT (RPV-1-63) | 100 | 78 |
a Az antiszérum RIBI adjuváns rendszerrel készült.
b Az antiszérum reciprok hígítása a GBMP 80165-ös törzs 50%-os pusztulásának biztosítására. Megjegyezzük, hogy a vizsgálatnál a GBM (2600 cfu/100 pl)-ből 15-szörös mennyiségeket használtunk a leírt eljáráshoz viszonyítva. Ez csak erősen baktericid antiszérum esetében eredményez mérhető baktericidaktivitást.
c A GBMP 80165 clearance %-ban a PBS-kontrollhoz viszonyítva a megfelelő antiszérum 1:4-es hígításából.
HU 224 972 Β1
8. példa
További vizsgálatok az N-acil-helyzetben módosított GBMP-TT konjugátumokkal kapcsolatban Különböző, N-acil-helyzetben módosított GBM poliszacharidokat állítunk elő [N-propionil-GBMP- (NPr), N-butanoil-GBMP- (NBu), N-pentanoil-GBMP- (NPe) és N-akriloil-GBMP-származékot (NAkril)] lényegében az előzőekben leírtak szerint, azzal az eltéréssel, hogy a pH-t szabályozzuk annak érdekében, hogy a poliszacharidok depolimerizálódását korlátozzuk. A módosított poliszacharidokat 1H- és 13C-NMR-spektroszkópiával ellenőriztük és azonosítottuk, megállapítást nyert, hogy mindegyik poliszacharidszármazék képzése 100%-osan végbement. Ugyanezen móltömegű (11 KD) oxidált poliszacharid fragmentumait is előállítottuk standard oszlopon SEC-HPLC profilú futtatással. Mindegyik konjugátumot azonos körülmények között szintetizáltuk. A konjugátumok kolorimetriás analízise szerint a sziálsav beépülése a következő mértékű volt: NPr - 28%, NBu 30%, NPe - 18%, NAkril - 19%.
Egereket immunizáltunk 2 pg sziálsav/konjugátum segítségével sóoldatban alumínium-hidroxidra abszorbeáltaivá, vagy RIBI-féle adjuvánsba emulgeálva. Az egerek jól tolerálták a konjugátumokat, káros hatás nem volt észlelhető.
A különböző antiszérumoknak a homológ poliszacharid antigénekkel szembeni ELISA titrálási eredményeit az 1. táblázat foglalja össze. Az az adjuváns, amely a legmagasabb titereket adta, a RIBI-sorozat volt; az N-propioniltól az N-pentanoilig haladva növekedés tapasztalható a korábban alkalmazott egyéb hidrofób adjuváns rendszerekhez viszonyítva. Olyan adjuváns rendszerben, mint az Alum, nem észlelhető hasonló tendencia a titerben. Az immunizáló poliszacharidokkal szembeni specifitás szintén növekszik az acillánc hosszúságától függően N-propioniltól N-pentanoil felé haladva, legkifejezettebb ez a változás a RIBI-sorozatban (lásd a 2. táblázatot). Ez szintén összhangban áll a korábbi eredményekkel, amelyek hasonlóképpen ezt a tendenciát tükrözték. A titerben és specifitásban jelentkező növekedés ellenére nem tapasztalható növekedés a természetes baktériumokkal szembeni aktivitásban sem a baktericid, sem a passzív védelem vizsgálatánál. Az N-Pr-antiszérum szignifikánsan magasabb baktericid titereket mutat (14-25-szörös növekedést) az 50 és 90%-os szintnél, amennyiben ezt az N-Bu- és N-Pe-antiszérumokkal hasonlítjuk össze. Ennek megfelelően az antiszérumok különböző hígításainál a passzív védelemre vonatkozó tanulmányok azt mutatják, hogy számottevő baktérium clearance N-Bu és N-Pe használata esetén csak a legnagyobb koncentrációknál észlelhető, ellentétben az N-Pr-antiszérumnál tapasztaltakkal, amelynél már számottevő clearance mutatkozik 1:6 arányú hígításnál is.
Claims (29)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Módosított B csoporthoz tartozó meningococcus poliszacharid, ahol az N-acetil-csoportot egy (I) általános képletű N-acil-származék helyettesíti, ahol a képletbenR1 jelentése 2-4 szénatomos telítetlen alkilcsoport, amelyben legalább egy kettős kötés van.
- 2. Az 1. igénypont szerinti poliszacharid, amelynek képletében R1 jelentése 4 szénatomos telítetlen alkilcsoport, amelyben két, nem szomszédos kettős kötés van.
- 3. Az 1. igénypont szerinti poliszacharid, amelynek képletében R3 jelentése négy szénatomos telítetlen alkilcsoport, amelyben egy kettős kötés van.
- 4. Az 1. igénypont szerinti poliszacharid, amelynek képletében R-, jelentése három szénatomos telítetlen alkilcsoport.
- 5. A 2. igénypont szerinti poliszacharid, amelynek képletében Rq jelentése CH2=CH-CH2-CH2- csoport.
- 6. A 3. igénypont szerinti poliszacharid, amelynek képletében R-, jelentése CH2=CH-CH2- csoport.
- 7. Az 1. igénypont szerinti poliszacharid, amelynek képletében az acilcsoport szénatomjától legtávolabb lévő szénatom kettős kötéssel kapcsolódik.
- 8. A 7. igénypont szerinti poliszacharid, amelynek képletében R-ι jelentése 4 szénatomos telítetlen alkilcsoport.
- 9. A 7. igénypont szerinti poliszacharid, amelynek képletében R3 jelentése 3 szénatomos telítetlen alkilcsoport.
- 10. Konjugált molekula, amely legalább egy olyan poliszacharidot tartalmaz, amely B csoporthoz tartozó Neissera meningococcus poliszacharid olyan módosított formája, amelyben a fenti poliszacharid N-acetil-csoportja helyett (I) általános képletű csoport áll, ahol a képletben R-, jelentése 2-4 szénatomos, legalább egy kettős kötést tartalmazó telítetlen alkilcsoport, és ez a poliszacharid kovalens kötéssel kapcsolódik egy fehérjéhez.
- 11. A 10. igénypont szerinti konjugált molekula, amely fehérjeként baktériumtól származó fehérjét tartalmaz.
- 12. A 11. igénypont szerinti konjugált molekula, amely Neisseria meningitidistől származó fehérjét tartalmaz.
- 13. A 10. igénypont szerinti konjugált molekula, amely a tetanusztoxoid, diftériatoxoid, CRM197 és meningococcus külső membránjából származó fehérjék körébe tartozó baktériumfehérjét tartalmaz.
- 14. A 10. igénypont szerinti konjugált molekula, amely poliszacharidként egy poliszacharid-N-acil-származékot, fehérjeként tetanusztoxoidot és OMP-t tartalmaz, ahol a poliszacharid móltömege mintegy 3 kDa és 50 kDa között van.
- 15. A 10. igénypont szerinti konjugált molekula, amely poliszacharidként egy poliszacharid-N-acil-származékot, fehérjeként tetanusztoxoidot tartalmaz, ahol a poliszacharid móltömege mintegy 10 000 és 15 000 dalton közötti.
- 16. A 10. igénypont szerinti konjugált molekula, amelyben a poliszacharidnak a fehérjéhez viszonyított mólaránya mintegy 20 mól poliszacharid/1 mól fehérje.
- 17. A 10. igénypont szerinti konjugált molekula, amelyben a poliszacharidnak a fehérjéhez viszonyított mólaránya mintegy 4-7 mól poliszacharid/mintegy 1 mól fehérje.HU 224 972 Β1
- 18. A 10. igénypont szerinti konjugált molekula, amelyben a módosított Neissera meningococcus B csoportbeli poliszacharid egy N-akriloil-származék.
- 19. Konjugált molekulát tartalmazó vakcinakészítmény, amely egy B csoporthoz tartozó meningococcus poliszacharid telítetlen 3-5 szénatomos N-acil-származék-fragmentumot tartalmaz kovalens kötéssel fehérjéhez kötve.
- 20. A 19. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amely egy baktériumtól származó fehérjekomponenst tartalmaz, ahol baktériumból származó fehérjeként tetanusztoxoid, diftériatoxoid, CRM197 vagy meningococcus külső membránjából származó fehérje szerepelhet.
- 21. A 19. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amely poliszacharidfragmentumként egy poliszacharid N-acil-származékát tartalmazza, ahol a poliszacharidfragmentum móltömege mintegy 3 és 50 kDa között van.
- 22. A 19. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amely fehérjekomponensként Neisseria meningitidisből származó fehérjét tartalmaz.
- 23. Immunszérum, amely a 10. igénypont szerinti konjugátummal immunizált emlősökben képződött antitesteket tartalmazza.
- 24. A 23. igénypont szerinti immunszérum, ahol a konjugátum poliszacharidkomponensként poliszacharidfragmentumok 3-5 szénatomos telítetlen N-acilszármazékait tartalmazza.
- 25. A 10. igénypont szerinti konjugált molekula, amelyben a poliszacharid mólaránya a proteinhez 2-15 mól poliszacharid 1 mól proteinre.
- 26. A 10. igénypont szerinti konjugált molekula, amelyben a Neissera meningococcus B csoportbeli poliszacharid N-acetil-csoportjainak mintegy 30-100%-a N-dezacetilezett.
- 27. A 10. igénypont szerinti konjugált molekula, amelyben a protein és a poliszacharid reduktív aminálás révén kovalensen kötött.
- 28. A 10. igénypont szerinti konjugált molekula, amelyben a módosított Neissera meningococcus poliszacharid molekulatömege 10 000 és 15 000 dalion közötti.
- 29. A 18. igénypont szerinti konjugált molekula, amelyben a protein egy meningococcus külső membrán protein.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/484,569 US5811102A (en) | 1995-06-07 | 1995-06-07 | Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines |
| PCT/CA1996/000379 WO1996040239A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-06-07 | Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9802664A2 HUP9802664A2 (hu) | 1999-02-01 |
| HUP9802664A3 HUP9802664A3 (en) | 1999-12-28 |
| HU224972B1 true HU224972B1 (en) | 2006-04-28 |
Family
ID=23924694
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9802664A HU224972B1 (en) | 1995-06-07 | 1996-06-07 | Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines and modified polysaccharides |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5811102A (hu) |
| EP (1) | EP0831898B1 (hu) |
| JP (2) | JP4171068B2 (hu) |
| KR (1) | KR100452475B1 (hu) |
| CN (1) | CN1163270C (hu) |
| AT (1) | ATE238064T1 (hu) |
| AU (1) | AU706053B2 (hu) |
| BR (1) | BR9609229A (hu) |
| CA (1) | CA2223567C (hu) |
| CZ (1) | CZ391497A3 (hu) |
| DE (1) | DE69627652T2 (hu) |
| ES (1) | ES2196153T3 (hu) |
| HU (1) | HU224972B1 (hu) |
| IL (3) | IL147121A (hu) |
| NO (1) | NO321705B1 (hu) |
| PL (1) | PL184125B1 (hu) |
| WO (1) | WO1996040239A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA964823B (hu) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7655699B1 (en) | 1992-04-22 | 2010-02-02 | Eisai Inc. | Compounds having selective activity for retinoid X receptors, and means for modulation of processes mediated by retinoid X receptors |
| US20030157129A1 (en) * | 1995-06-23 | 2003-08-21 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccine comprising a polysaccharide antigen - carrier protein conjugate and free carrier protein |
| US6048527A (en) | 1996-08-27 | 2000-04-11 | Chiron Corporation | Antibodies that define unique Meningococcal B epitopes and vaccine compositions |
| DK0939647T4 (da) * | 1996-08-27 | 2006-10-23 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Neisseria Meningitidis-serogruppe B-glycokonjugat og fremgangsmåde til anvendelse deraf |
| US6299881B1 (en) * | 1997-03-24 | 2001-10-09 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts |
| KR100757630B1 (ko) * | 1997-12-23 | 2007-09-10 | 박스터 헬쓰케어 에스.에이. | 신규한 추출 및 단리 방법으로 수득되는 세균성 캡슐형 다당류 |
| NZ509986A (en) * | 1998-08-19 | 2003-10-31 | Baxter Healthcare S | Immunogenic beta-propionamido-linked polysaccharide and oligosaccharide protein conjugates as vaccines |
| US6585973B1 (en) * | 1998-10-29 | 2003-07-01 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Method for preparing solid phase conjugated vaccine |
| CA2279134A1 (en) * | 1999-07-29 | 2001-01-29 | Tianmin Liu | Novel strategy for carbohydrate-based therapeutic vaccines |
| AU2001278323A1 (en) * | 2000-07-28 | 2002-02-13 | National Research Council Of Canada | Modified sialic acid vaccines |
| GB0024200D0 (en) * | 2000-10-03 | 2000-11-15 | Smithkline Beecham Sa | Component vaccine |
| AP1897A (en) | 2001-01-23 | 2008-10-10 | Aventis Pasteur | Multivalent Meningococcal polysaccharide-Protein Conjugate Vaccine. |
| RU2322451C2 (ru) * | 2001-04-17 | 2008-04-20 | Новартис Вэксинс Энд Диагностикс, Инк. | Молекулярные миметики эпитопов менингококка в, которые вызывают выработку функционально активных антител |
| GB0115176D0 (en) * | 2001-06-20 | 2001-08-15 | Chiron Spa | Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines |
| GB0130215D0 (en) * | 2001-12-18 | 2002-02-06 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| WO2004011027A1 (en) * | 2002-07-30 | 2004-02-05 | Baxter International Inc. | Chimeric multivalent polysaccharide conjugate vaccines |
| CN102302776B (zh) * | 2003-01-30 | 2014-06-18 | 诺华疫苗和诊断有限公司 | 抗多种脑膜炎球菌血清组的可注射性疫苗 |
| AU2004251734B2 (en) * | 2003-06-23 | 2010-11-04 | Baxalta GmbH | Vaccines against group Y neisseria meningitidis and meningococcal combinations thereof |
| US8148335B2 (en) | 2004-06-23 | 2012-04-03 | Children's Hospital & Research Center Oakland | De-N-acetyl sialic acid antigens, antibodies thereto, and methods of use in cancer therapy |
| MXPA06015107A (es) * | 2004-06-23 | 2007-03-26 | Childrens Hosp & Res Ct Oak | Derivados de polisacaridos y sus usos en la induccion de una respuesta inmune. |
| WO2006096970A1 (en) * | 2005-03-14 | 2006-09-21 | Governors Of The University Of Alberta | Synthetic anti-candida albicans oligosaccharide based vaccines |
| US20070184072A1 (en) * | 2005-04-08 | 2007-08-09 | Wyeth | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| US7709001B2 (en) * | 2005-04-08 | 2010-05-04 | Wyeth Llc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| ES2383209T3 (es) | 2006-03-22 | 2012-06-19 | Novartis Ag | Regímenes para la inmunización con conjugados meningococicos |
| US10828361B2 (en) * | 2006-03-22 | 2020-11-10 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Regimens for immunisation with meningococcal conjugates |
| WO2007116409A2 (en) * | 2006-04-11 | 2007-10-18 | Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science | Improved vaccines comprising multimeric hsp60 peptide carriers |
| GB0611914D0 (en) * | 2006-06-15 | 2006-07-26 | Teti Giuseppe | Peptides that mimic non-human cross-reactive protective epitopes of the group Bmeningococcal capsulsar polysaccharide |
| ATE511398T1 (de) | 2006-09-07 | 2011-06-15 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Inaktiviertes poliovirus mischimpfstoff |
| ES2621359T3 (es) * | 2007-06-20 | 2017-07-03 | Pfizer Ireland Pharmaceuticals | Polisacáridos modificados para vacunas conjugadas |
| WO2010064437A1 (ja) | 2008-12-03 | 2010-06-10 | 株式会社カネカ | ホルミル基含有多孔質担体、それを用いた吸着体、およびそれらの製造方法 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4057685A (en) * | 1972-02-02 | 1977-11-08 | Abbott Laboratories | Chemically modified endotoxin immunizing agent |
| US4356170A (en) * | 1981-05-27 | 1982-10-26 | Canadian Patents & Development Ltd. | Immunogenic polysaccharide-protein conjugates |
| US4673574A (en) * | 1981-08-31 | 1987-06-16 | Anderson Porter W | Immunogenic conjugates |
| US4902506A (en) * | 1983-07-05 | 1990-02-20 | The University Of Rochester | Immunogenic conjugates |
| US4619828A (en) * | 1982-07-06 | 1986-10-28 | Connaught Laboratories, Inc. | Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines |
| US4644059A (en) * | 1982-07-06 | 1987-02-17 | Connaught Laboratories, Inc. | Haemophilus influenzae B polysaccharide-diptheria toxoid conjugate vaccine |
| US4496538A (en) * | 1982-07-06 | 1985-01-29 | Connaught Laboratories, Inc. | Haemophilus influenzae b polysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccine |
| NZ214503A (en) * | 1984-12-20 | 1990-02-26 | Merck & Co Inc | Covalently-modified neutral bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates |
| US4601903A (en) | 1985-05-01 | 1986-07-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease |
| US4727136A (en) * | 1985-10-01 | 1988-02-23 | Canadian Patents And Development Ltd. | Modified meningococcal group B polysaccharide for conjugate vaccine |
| US5034516A (en) * | 1987-08-04 | 1991-07-23 | University Of Ottawa | Synthetic antigens of sialic acid and derivatives thereof |
| WO1990006696A2 (en) | 1988-12-19 | 1990-06-28 | Praxis Biologics, Inc. | Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine |
| KR0158436B1 (ko) * | 1989-12-14 | 1998-12-01 | 피에르 오. 페론 | 개선된 수막염균성 폴리사카라이드 결합체 백신 |
| FI903414A (fi) | 1990-07-06 | 1992-01-07 | Kansanterveyslaitos | Produktion av proteiner i grampositiva bakterier. |
| FR2682388B1 (fr) * | 1991-10-10 | 1995-06-09 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procede de preparation d'un oligoside par depolymerisation d'un polyoside issu d'un agent pathogene, oligoside ainsi obtenu et son utilisation notamment comme agent vaccinal. |
| US5425946A (en) * | 1992-08-31 | 1995-06-20 | North American Vaccine, Inc. | Vaccines against group C Neisseria meningitidis |
| US5780606A (en) * | 1995-06-07 | 1998-07-14 | Connaught Laboratories Limited | Neisseria meningitidis capsular polysaccharide conjugates |
| US6048527A (en) * | 1996-08-27 | 2000-04-11 | Chiron Corporation | Antibodies that define unique Meningococcal B epitopes and vaccine compositions |
-
1995
- 1995-06-07 US US08/484,569 patent/US5811102A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-06-07 IL IL147121A patent/IL147121A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 IL IL11860496A patent/IL118604A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 JP JP50004397A patent/JP4171068B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-07 KR KR1019970709190A patent/KR100452475B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 DE DE69627652T patent/DE69627652T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-07 CZ CZ973914A patent/CZ391497A3/cs unknown
- 1996-06-07 EP EP96917303A patent/EP0831898B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 BR BR9609229A patent/BR9609229A/pt unknown
- 1996-06-07 WO PCT/CA1996/000379 patent/WO1996040239A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-06-07 CA CA002223567A patent/CA2223567C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 ZA ZA964823A patent/ZA964823B/xx unknown
- 1996-06-07 HU HU9802664A patent/HU224972B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 AT AT96917303T patent/ATE238064T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 AU AU59937/96A patent/AU706053B2/en not_active Ceased
- 1996-06-07 PL PL96323862A patent/PL184125B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 ES ES96917303T patent/ES2196153T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 CN CNB961945826A patent/CN1163270C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-12-02 NO NO19975547A patent/NO321705B1/no not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-02-11 US US09/022,155 patent/US5969130A/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-07-20 US US09/357,491 patent/US6350449B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-07-20 US US09/910,568 patent/US6596283B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-12-16 IL IL14712101A patent/IL147121A0/xx unknown
-
2008
- 2008-05-14 JP JP2008126880A patent/JP2008285675A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU706053B2 (en) | Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines | |
| AU641715B2 (en) | Improved meningococcal polysaccharide conjugate vaccine | |
| US5773007A (en) | Vaccine compositions | |
| AU748973B2 (en) | Immunogenic conjugates comprising a group B meningococcal porin and an H. influenzae polysaccharide | |
| PL175595B1 (pl) | Antygenowy/immunogenny koniugat do wytwarzania szczepionki przeciwko infekcji N.meningitidis, sposób wytwarzania antygenowego/immunogennego koniugatu oraz szczepionka przeciwko infekcji N.meningitidis | |
| AU2005316864A1 (en) | Glycoconjugate vaccines containing peptidoglycan | |
| JP7100031B2 (ja) | 免疫原性コンジュゲート及びその使用 | |
| MXPA03010283A (es) | Conjugados inmunogenicos de acido hialuronico de peso molecular bajo con toxinas de polipeptido. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |