CONJ UGADOS INMUNOGÉNICOS DE ÁCIDO HIALURÓNICO DE PESO MOLECULAR BAJO CON TOXINAS DE POLIPÉPTIDO
CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a las moléculas conjugadas de ácido hiaiurónico/polipéptido y composiciones farmacéuticas que las incluye. En particular, la presente invención se refiere al ácido hialurónico, y más preferentemente, al ácido hialurónico de peso molecular bajo (L W-HA), y moléculas conjugadas de L W-HA/polipéptido que sacan los anticuerpos del ácido hialurónico los cuales son sometidos a reacción cruzada con ambos grupos de estreptococos A y C. Las moléculas de la invención y las composiciones farmacéuticas que las incluyen son útiles para el tratamiento y prevención de la infección y para el diagnóstico de la enfermedad causáda por los grupos de estreptococos A y C.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El ácido hialurónico (HA) es un glicosaminoglicano que se produce naturalmente. Está formado por unidades repetitivas de ??-acetilglucosamina y ácido glucurónico. Ver la Figura 1 . HA se produce en el tejido animal, por ej; fluido espinal, fluido ocular, fluido sinovial, piel, y también en algunos estreptococos, tales como en las cápsulas de los grupos estreptococos A y C. Tal mucoide o deformaciones altamente encapsuladas del grupo A de estreptococos han sido asociados con las infecciones inusualmente serias, y con la fiebre reumática aguda (Johnson et al, 1992, J Infect. Dis. 166:374-382). Las infecciones invasivas - 2 -humanas de emisión suave causadas por los Grupos A y C de estreptococos están asociadas con morbidez y mortalidad significativas. El Grupo C de estreptococos está asociado también con la laringitis y la artritis reactiva. Además, las infecciones del Grupo C de estreptococos prevalecen en los caballos. La morfología de la colonia mucoide de los grupos A y C de estreptococos es un resultado de producción abundante de polisacárido capsular compuesto por ácido hialurónico. La cápsula de ácido hialurónico del Grupo A de estreptococo ha exhibido recientemente una cantidad de papeles importantes en la patogenicidad de estos organismos. Entre otras cosas, la cápsula HA protege el Grupo A de estreptococo de la fagocitosis y tiene un papel importante en la virulencia (Wessels et. al. 1991 , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88: 8317.21 ; Dale et al. 1996, Infect. Immunol. 64: 1495-501 ; y Moses et al, 1997 Infect. Immumol. 65;64-71 ). Además, la cápsula HA modula la adherencia de la proteína-mediada M y actúa como un ligando para la unión del grupo A de estreptococo con el CD44 en los queratinocitos humanos. La cápsula HA del grupo A de estreptococo es altamente conservable y de superficie expuesta lo cual indica que el HA puede servir como un sitio de adhesión universal para la unión de otras deformaciones de bacterias a la mucosa faríngea y a la piel (Schrager et al 1998, J. Invest, 101: 1708-16). Prevenir y tratar las infecciones de patógenos gram-positivos tales como los estreptococos son particularmente importantes debido al desarrollo de las deformaciones resistentes que son difíciles de tratar y difíciles de erradicar una vez que se establecen. A pesar de que la - 3 -conjugación de los antígenos polísacáridos, o de haptenos de carbohidratos inmunológicamente inertes, con los antígenos timo dependientes (TD) tales como las proteínas aumenta su inmunogenicidad, no era evidente si tal respuesta inmunogénica, ocasionada por el HA, pudiera ofrecer protección contra el HA que contiene bacteria, tal como los grupos estreptococos A o C. Además, la presencia de HA en el tejido mamario y estreptococo complica el desarrollo de HA como un antígeno de carbohidrato para tratar o evitar la infección por estreptococos causada por un potencial para ocasionar una respuesta autoinmune dirigida al tejido huésped. Hasta hace poco tiempo, se creía que HA era una molécula no inmunológica (Meyer, 1936, J Biol Chem. 1 14:689 y Humphreys, 1943, Biochem J. 37:460). Sin embargo, los resultados más recientes indican que los anticuerpos que se producen naturalmente a HA están presentes en varias especies (Underhill, 1982, Biophys, res, Commun. 108:1488). Fillit ef al; e indujeron anticuerpos con HA en ratas con HA unido a liposomas. Informan que HA es inmunogénica e identificaron dos determinantes antigénicos en la molécula. Fillit et al, encontraron también que el modo de presentación del HA en el liposoma es importante para su inmunogenicidad. Finalmente, Fillit et al., informaron que un anticuerpo HA tenía reacción cruzada con sulfato de heparin y que tales reacciones cruzadas podrían estar comprendidas en la patogénesis de la enfermedad vascular autoinmune (Fillit eí al., 1988, J. Exp. Med. 168:971 -982). En base a los informes descritos anteriormente, resulta impredecible saber si HA o los conjugados de HA podrían causar una respuesta inmune para - 4 - in h ibir o tratar la infección de la bacteria q ue contiene el HA tal como los g ru pos estreptococos A o C .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece una composición inmunogénica que incluye HA y LMW-HA conjugados con u n polipéptido o portador de proteína. Las molécu las conjugadas de la presente inven ción son útiles para producir anticuerpos que son tienen reacciones cruzadas con bacteria conteniendo HA, tal como ambos grupos estreptococos A y C . Las molécu las conjugadas de la presente i nvención y las composiciones farmacéuticas que las incluyen son útiles en un método para el tratamiento y diagnóstico de infección y enfermedad causada por tal bacteria , incluyendo los grupos estreptococos A y C . Los solicitantes han descubiertos con sorpresa que los conjugados LMW-HA son inmunogénicos en mamíferos. Aú n más sorprendente, los solicitantes descubrieron q ue los anticuerpos causados por los conjugados de la invención tienen reacciones cruzadas con grupos estreptococos A y C pero son m ínimamente de reacción cruzada con HA nativo asociado con tejido mamífero. Los métodos para conjugar LMW-HA a los polipéptidos incluyen la aminación reductiva , el tratamiento con bromuro de cianógeno , formación de u nión de amida entre u n gru po amino libre en el portador y una porción de carboxilato en el LMW-HA, o por el uso de una molécula de en lace. La invención ofrece composiciones farmacéuticas que comprenden molécu las de conjugado de LMW-HA y el uso de estas composiciones para - 5 -ocasionar anticuerpos para el tratamiento de la infección por medio de HA conteniendo bacteria tal como los grupos estreptococos A y C, y para los diagnósticos. Cualquier polipéptido que convierta una respuesta independiente de célula T de carbohidrato en una respuesta dependiente de célula T es adecuado para usar como un portador. Los ejemplos son toxinas o toxoides tales como toxoide de tétano, toxoide de difteria, y toxinas o toxoides tosferina, neisserial porins, por ej. , PorA de gonocócico y PorB de miningonocócico. La presente invención ofrece también composiciones, vacunas y otros reactivos inmunológicos derivados de los conjugados de polipéptido L W-HA inmunogénico. La invención está dirigida además a un método de inmunizar un mamífero contra las infecciones bacteriales. El método comprende administrar una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de la invención a un mamífero para determinar la infección de un organismo que causa la enfermedad. Los métodos son útiles para evitar o tratar la infección mediante bacterias conteniendo HA, tales como los grupos estreptococos A y C. La invención ofrece también un método para causar anticuerpos en mamíferos, preferentemente humanos, con los conjugados de polipéptido LMW-HA de la invención. La invención también provee una composición de inmunoglobulina y anticuerpo aislado que se ocasionan en respuesta a la inmunización de un mamífero utilizando los conjugados de polipéptido LMW-HA de la invención. Tal inmunoglobulina y anticuerpo aislado son útiles como agentes terapéuticos y como reactivos de -6-diagnóstico. Las inmunoglobulinas y los anticuerpos producidos son específicos para L W-HA. Las moléculas conjugadas de la invención son también útiles para originar anticuerpos monocionaies y antiidiotípicos de acuerdo con los métodos bien conocidos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIG. 1: Estructura del ácido hialurónico (HA) FIG. 2: Generación del LMW-HA de peso molecular bajo mediante sonicación y/o tratamiento de ácido. FIG. 3: Estructura de epítope protector del estreptococo HA; a) tetrasacárido del HA sometido a sonicación , b) tetrasacárido generado después de la acción de la hialuronidasa. FIG. 4: Títulos ELISA de antisueros de conejo a conjugados HA-TT. FIG 5: Títulos ELISA de antisueros de conejo a conjugados de ácido LMW-HA/TT hidrolizado. FIG. 6: Titulación de antisueros de conejo al conjugado LMW-HA/TT sometido a sonicación. FIG. 7: Titulación de antisueros de conejo al conjugado de ácido LMW-HA/TT hidrolizado. FIG. 8: Inhibición del antisuero de conejo # 75295 con un ácido HA hidrolizado, HA sometido a sonicación, y conjugado HA sometido a sonicación sobre placas revestidas de LMW-HA/HSA. FIG. 9: Inhibición del antisuero de conejo # 75295 con HA - 7 -sometido a sonicacion, HA nativo, ácido glucurónico D, disacárido HA y tetrasacárido HA en placas revestidas de LMW-HA/HSA. FIG. 10: Inhibición del antisuero de conejo # 72700 con HA sometido a sonicacion, HA nativo, ácido glucurónico D, disacárido HA y tetrasacárido HA en placas revestidas de LMW-HA/HSA. FIG. 1 1 : Inhibición del antisuero de conejo # 72700 con HA sometido a sonicacion, HA nativo, disacárido HA, tetrasacárido HA, y hexa/octasacárido HA en placas revestidas de LMW-HA/HSA. FIG. 12: Títulos ELISA de antisueros de ratón BALB/c al conjugado LMW-HA/rPortB. FIG. 13: Títulos ELISA de antisueros de ratón CDI al conjugado LMW-HA/rPortB. FIG 14: Inmunización pasiva de ratones Balb/c con antisueros de conejo; desafío con el tipo GAS 6 (4,400 cfa/mL). Respectivamente, los antisueros de conejo V contra PBS/CFA; antisuero de conejo o contra LMW-HA/TT sometido a sonicacion; antisueros de conejo · contra LMW-HA/TT sometidos a sonicacion; antisueros de conejo T contra LMW-HA/TT sometido a sonicacion. FIG 15: Inmunización pasiva de los ratones BALB/c con antisueros de conejo; desafío con el tipo 3 de GAS (2,5 x 105 cfu/mL). Respectivamente, los antisueros de conejo V contra PBS/CFA; antisueros de conejo o contra LMW-HA/TT sometidos a sonicacion; antisueros de conejo · contra el ácido LMW/HA/TT hidrolizado; antisueros de conejo T contra el ácido de LMW-HA/TT hidrolizado sometido a sonicacion.
- 8 - DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se utiliza el ácido hialurónico como un inmunógeno para originar una respuesta protectora y/o terapéutica. En particular, HA es útil para originar una respuesta inmune que sea de reacción cruzada con bacterias, tales como los grupos de estreptococos A y C, que tienen HA en su superficie. Sin estar limitado por la teoría, se cree que el epítope de reacción cruzada con los grupos de estreptococos A y C es de alrededor de 3 o 4 residuos en longitud y está ubicado en la terminal no reductora. No parece ser de importancia significativa si el residuo de ácido glucorónico terminal no reductor está saturado o no saturado ya que ambos epítopes son protectores. Además, parece que el ácido glucurónico terminal está convertido a ácido glucurónico no saturado en la sangre y otros fluidos del cuerpo. El HA puede terminar en un residuo tanto glucosaminilo o glucuronilo, la respuesta inmune es aumentada cuando el porcentaje de ácido glucurónico o ácido glucurónico no saturado en la terminal no reductora del HA se aumenta sobre el porcentaje de N-acetilglucosamina. A pesar de que el HA nativo puede utilizarse para preparar los conjugados de acuerdo con esta invención, se utiliza preferentemente LMW-HA que es de alrededor de 3 o 4 sacáridos a alrededor de 2000 sacáridos o de alrededor de 600 daltones a alrededor de 400 Kd en tamaño para preparar los conjugados. Más preferentemente, el LMW-HA es de alrededor de 4 sacáridos o 2 unidades repetitivas a alrededor de 1 00 unidades repetitivas o de alrededor de 800 daltones a alrededor de 40 Kd en tamaño. Un tamaño más preferido para el LMW-HA es de alrededor de - 9 -
4 unidades repetitivas a alrededor de 1 0 o alrededor de 20 unidades repetitivas o alrededor de 800 daltones a alrededor de 4 o 8 Kd. Se puede obtener el LMW-HA del HA nativo, que tiene típicamente un peso molecular de 400 Kd a varios millones de daltones (disponibles en Sigma o por purificación de acuerdo con la Patente de Estados Unidos No. 4, 141 ,973), mediante varios métodos incluyendo la sonicación (Kubo K; ef al., Glycoconj J., 1993, 1 0(6): 435) o por métodos químicos (Blatter G, Carbohydr. Res. 1996, 288: 109-125 y Halkes K. M. Carbohydr. Res. 1998, 3009:161 -164) y/o enzimáticos (De Luca et al. , J. Am. Chem. Soc. 1995 1 7: 5869-5870). La invención ofrece también moléculas LMW-HA conteniendo residuos de ácido glucurónico en la terminal no reductora. Un método para obtener fragmentos de terminal HA de ácido glucurónico es mediante la sonicación de HA nativo de acuerdo con el método de Kubo K, et al, Glycoconj J., 1993, 1 0(6): 435. El porcentaje de moléculas con una terminal de ácido glucurónico puede aumentarse por medio del tratamiento del producto de sonicación con una glucosaminídasa exo- -/V-acetilo para remover cualquier terminal no reductor de los residuos W-acetil glucosminilo y proveer LMW-HA con un alto porcentaje de residuos de glucuronilo en la terminal no reductora de las moléculas. Un método alternativo para obtener LMW-HA incluye tratar el HA nativo bajo condiciones acídicas suaves para generar moléculas que contengan una mezcla de residuos de A/-acetil glucosaminilo y glucuronilo en sus extremos no reductores. Los grupos de glucosminilo no reductores en el LMW-HA depolimerizado de ácido puede removerse con una - 10 -glucosaminidasa exo-p-W-acetilo para proveer LMW-HA con residuos de glucuronilo en las moléculas de la terminal no reductora. Ver la Figura 2. La invención ofrece también las moléculas LMW-HA conteniendo residuos de glucuronilo 4,5-no saturados en la terminal no reductora. Ver la Figura 3. Un método para obtener los fragmentos de HA terminados de glucuronilo 4,5 no saturados es por medio del tratamiento del HA nativo con la hialuronidasa. El LMW-HA para uso con la presente invención consiste en fragmentos en donde por lo menos 90% de los fragmentos de LMW-HA tienen ácido glucurónico o ácido glucurónico no saturado en su terminal no reductora. Preferentemente, por lo menos alrededor del 95% de los fragmentos de LMW-HA para uso con la invención tienen un ácido glucurónico o un ácido glucurónico no saturado en su terminal no reductora. Cuando se utiliza la sonicación, el HA nativo puede disolverse en un solvente adecuado, tal como el fosfato salina amortiguada, y la solución sometida a sonicación hasta que se obtenga la cantidad deseada de depolimerización. Ver, por ejemplo, Kubo K et al, Glycoconj J., 1993, 10(6): 435). El LMW-HA obtenido por medio de tal tratamiento tiene preferentemente un peso molecular de alrededor de 10-20 Kd y contiene principalmente residuos glucurónicos en su extremo de terminal no reductora es decir mayor al 95 %. Además, los fragmentos del LMW-HA conteniendo una mezcla de residuos de glucuronilo y /V-acetilglucosaminilo se pueden obtener por medio del tratamiento del HA bajo condiciones acídicas suaves. Alrededor - 11 -del 50 % de los fragmentos del LMW-HA obtenidos por medio de este método tienen ácido glucurónico en su terminal no reductora. Luego del tratamiento del ácido, los grupos de glucosaminilo de la terminal no reductora pueden removerse selectivamente de los fragmentos con glucosaminidasa exo-p-A -acetilo (disponible en Sigma) para exponer los residuos de glucuronilo en el extremo terminal de las moléculas. Si se varían las condiciones de la reacción, el porcentaje de los fragmentos con los grupos de glucosaminilo de la terminal no reductora pueden ser controlados. Por ejemplo, la reacción puede ser detenida por medio de la destrucción dé la enzima con calor o pH en varios puntos de acabado para obtener el porcentaje deseado de fragmentos con ácido glucurónico en su terminal no reductora. Además, el LMW-HA ya sea con la glucosaminidasa exo-ß-?-acetilo o ácido glucurónico ß-D en el extremo de reducción puede sintetizarse químicamente por medio de los métodos conocidos en el arte. Ver Blatter G. Carbohydr. Res. 1996, 288:109-125 y Halkes K. M. Carbohydr. Res. 1998, 309: 161 -164. Por ejemplo, un disacárido de ácido giucosamina-glucurónico puede prepararse primero con los monosacáridos correspondientes. Los monosacáridos pueden acoplarse por medio de métodos conocidos en el arte, tales como el uso de un -tricloroacetamidoglucopiranosa como el donador de glicosilo. El disacárido resultante puede acoplarse repetidamente con él mismo para formar LMW-HA de tamaño variado. Por ejemplo, el grupo protectqr anomérico en la porción de ácido glucurónico del disacárido puede removerse selectivamente. Un grupo protector preferido para esta posición es el - 12 -grupo 4-metoxifenilo. Para el disacárido de extremo reductor, es decir, el aceptor de glicosilo, la posición anomérica puede convertirse en una porción de metoxi, por ejemplo, convirtiendo primero el grupo 4-metoxifenilo en hidroxilo anomérico por medio del tratamiento con nitrato de amonio cérico El grupo de hidroxilo anomérico resultante puede convertirse en una porción de a-tricloroacetimidato por medio del tratamiento con tricloroacetonitrilo y DBU. La porción de a-tricloroacetimidato puede convertirse en la porción de metoxi por medio del tratamiento con metanol anhidro seguido por el tratamiento con triflato de trimetilsililo y trietilamina. Para los disacáridos a utilizarse como domadores de glicosilo, la posición anomérica puede convertirse en la porción de a-tricloroacetimidato según se describió anteriormente. El disacárido protegido de metoxi descrito anteriormente puede utilizarse como un aceptor de glicosilo después de remover selectivamente el grupo protector en la posición 3 del residuo de glucosamina. Un grupo protector preferido para esta posición es el grupo de cloroacetilo que puede removerse por medio del tratamiento con tioúrea y piridina en etanol. El donador de disacárida puede acoplarse con el aceptor en una manera interactiva para producir LMW-HA, es decir, con cada acoplamiento sucesivo produce LMW-HA con una unidad de repetición adicional. Los grupos protectores preferidos adicionales para el residuo de glucosamina son un grupo de 4,6-O-benzilideno y un grupo de 2-/\Mricloroacetam¡da. Los grupos protectores preferidos para el residuo de ácido glucurónico son 6- y 4-O-benzoilo y un éster de metilo C6. El uso de éstos y de grupos protectores alternativos se describe en "Grupos Protectores en las Síntesis -13- Orgánicas", 2nd Ed., por T.W, Greene y P.G. . Wuts, 1991,. John Wiley & Sons, Inc., que es incorporado en la presente por referencia. Los fragmentos pueden sintetizarse también enzimáticamente utilizando azúcares de difosfato de uridina y sintetasa HA. Ver, por ej., De Luca et al., J. Am. Chem. Soc. 1995 17: 5869-5870. Estos dos últimos métodos permiten que la síntesis de LMW-HA tenga cualquier porcentaje de ácido glucurónico en su terminal. Por esto, la formación de LMW-HA por degradación enzimática, síntesis enzimática o por síntesis química permite la producción mayor del 98 %, o mayor del 99 % de los fragmentos de LMW-HA que tienen un ácido glucurónico o un ácido glucurónico no saturado en su terminal no reductora. El LMW-HA puede acoplarse a un portador por medio de métodos conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Dick and Beurret in Conjúgate Vaccines, Cruse ef al., eds., Contrib. Microbio!. Immunol, Basel, Karger, 1989, vol. 10, pp 48-114 y Jennings y Sood en Neoglycoconjugates. Preparation and Applications, Lee ef al., eds., Chapter 10, pp 325-371 1994, Academic Press, San Diego. Los métodos incluyen aminación reductiva, acoplamiento a través de la porción de carboxilato, el uso de conectores, y el uso de bromuro de cianógeno o sus derivados. Cuando se conjuga LMW-HA a un portador, es preferible evitar la alteración del epítope en el extremo no reductor del polisacárido. Un método preferido de conjugar el LMW-HA a un portador es por medio de la conjugación directa tal como por medio de la aminación reductiva en el sacárido terminal reductor. Por ejemplo, un grupo extremo de terminal reductora puede introducirse selectivamente en LMW-HA por medio de la - 14 -reducción del residuo de la terminal reductora con, por ejemplo un borohidruro, seguido por la oxidación de periodato y la aminación reductiva. Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos de Jennings No. 4,356, 170. Se pueden utilizar también los métodos que conjugan LMW-HA a un portador en varios lugares a lo largo de la columna vertebral del LMW-HA. Por ejemplo, LMW-HA puede activarse por medio del uso de periodato para generar grupos de aldehido en los residuos de la columna vertebral del polisacárido y el LMW-HA activado es luego tratado con un portador que contiene un grupo de amino libre en la presencia de un agente reductor tal como un borohidruro. Estos métodos permiten también la conjugación de más de una molécula portadora a un LMW-HA único que permite el encadenamiento cruzado El componente de polipéptido de las moléculas conjugadas de la invención puede ser cualquier proteína tolerada fisiológicamente o polipéptido que evoca una respuesta dependiente de ia célula T cuando se acopla a LMW-HA. El término polipéptido tiene por objeto ser un término genérico que incluye péptidos, polipéptidos y proteínas incluyendo proteínas nativas, modificadas o recombinadas. Los ejemplos de polipéptidos útiles como portadores incluyen, pero no están limitados, a toxinas bacteriales, toxoides, porinos, proteínas de membrana externas, y materiales de proteína de reacción cruzada. Tales polipéptidos incluyen, pero no están limitados a, toxoide de tétano, toxoide de difteria, toxoide pertusis, un polipéptido inmunogénico derivado de los estreptotpcos, un polipéptido inmunogénico derivado de la influenza, un polipéptido - 15 - ¡nmunogénico derivado de miningocócico, un polipéptido inmunogénico derivado de neumocócico y un polipéptido inmunogénico derivado de E. coíi. En particular, se prefieren toxoide de tétano, toxoide de difteria, CRM197, y los polipéptidos de porino de hemofilo, E. Coli y neisseria, tales como rPorB. Ver el ejemplo la Patente de Estados Unidos No. 5,439,808. Las rrioléculas conjugadas preparadas de acuerdo con la presente invención comprenden un polipéptido portador o proteína a la cual está unido por lo menos un fragmento de ácido hialuronico de peso molecular a través de un lugar de unión simple en el extremo de la terminal de la columna vertebral del fragmento del polisacárido. Por ello, la presente invención ofrece la habilidad, si se desea, de producir las moléculas conjugadas hialurónicas de peso molecular bajo en donde el componente polisacárido, excepto de un extremo, no es obscurecido por el portador. Estos tipos de conjugados pueden ser referidos como neoglicoproteínas. Ver, por ejemplo, Dick y Beurret, más arriba. Alternativamente, los conjugados de encadenamiento cruzado pueden estar formados de acuerdo con la presente invención. Estos tipos de conjugados pueden ser referidos como conjugados reticulados. Ver, por ejemplo, Dick y Beurret más arriba. La relación molecular de LMW-HA con el polipéptido o proteína en las moléculas conjugadas de la invención es preferentemente de alrededor de 1 a alrededor de 100 moléculas de LMW-HA por polipéptido de molécula o proteína. Más preferentemente, la relación es de alrededor de 10 y alrededor de 20 moléculas LMW-HA o epítopes por molécula de polipéptido o proteína. Alternativamente, la relación de LMW-HA con el -16- polipéptido o proteína puede determinarse por peso. Por ejemplo, las moléculas del conjugado de la invención son de alrededor de 10 % y alrededor del 500 % de peso LMW-HA con el peso del polipéptido o proteína. Preferentemente, los conjugados de la presente invención son de alrededor del 30 % a alrededor del 100 % de peso LMW-HA con el peso del polipépido o proteína. En una modalidad, se utiliza ácido hialurónico de peso molecular muy bajo, es decir, menos de alrededor de 20 unidades repetitivas, para formar los conjugados que aumentan la densidad del epítope. Las variaciones en la relación del LMW-HA/polipéptido o proteína pueden alcanzarse ajustando las condiciones de la conjugación, especialmente la relación de los componentes de partida en la reacción de conjugación. Además de ofrecer las moléculas de conjugado que incluyen ácido hialurónico de peso molecular bajo conjugadas con el polipéptido o proteína, la presente invención comprende también conjugados multivalentes y composiciones farmacéuticas y vacunas que comprenden los conjugados multivalentes en donde los diferentes polisacáridos se conjugan con un único polipéptido. Por ejemplo, el ácido hialurónico de peso molecular bajo puede estar unido al polipéptido o proteína en varias combinaciones con otros polisacáridos. Los ejemplos de tales polisacáridos sort los polisacáridos capsulares del tipo b Haemophilous influenzae; grupo B de estreptococos tipo la, y Ib, II, III, IV, V, VI y VIII; grupos de meningococos A, B y C; y grupo A de estreptococos polisacáridos. Los conjugados inmunogénicos de acuerdo con la presente - 17 -invención ofrecen composiciones farmacéuticas útiles, tales como vacunas, que son importantes para proveer protección contra la infección por HA conteniendo bacterias, tales como los grupos de estreptococos A y C, en mamíferos, particularmente humanos y caballos. Además, estas vacunas son útiles para administrar a mujeres embarazadas como un medio de protección de anticuerpos a un nonato antes del nacimiento. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden utilizarse como un medio para originar anticuerpos monoclonales, policlonales o anti-idiotípicos útiles para propósitos profilácticos, terapéuicos y de diagnóstico. Los diagnósticos son particularmente útiles en verificar y detectar varias infecciones y enfermedades causadas por HA conteniendo bacterias tales como el grupo A o el grupo C de estreptococos. Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden utilizarse como un ¡nmunó.geno para usar tanto en la protección activa y pasiva inmunogénica en aquellos individuos infectados o en riesgo de infección especialmente por el grupo A o el grupo C de estreptococos. Los anticuerpos bactericidas utilizados para la protección pasiva se producen inmunizando un mamífero con cualquiera de las composiciones inmunogénicas de la invención y luego recuperando los anticuerpos bactericidas. Los anticuerpos bactericidas para usar con la presente invención pueden estar presente en sueros, una fracción purificada parcialmente tal como una fracción de gama globulina, o anticuerpos purificados. Por ejemplo, lgG puede purificarse con las mezclas de proteína cruda, tal como suero o fluido ascítico, por medio del uso de la proteína A- o proteína G-agarosa. La proteína A se une con la - 18 -porción Fe de IgG. La proteína G se une también con la región Fe, pero también puede unirse con la región Fab, haciéndola útil para la purificación de los fragmentos F(ab)'2 de IgGs. Las muestras crudas de IgGs pueden purificarse utilizando una protéína A- o columnas de proteína G-agarosa. Las muestras de suero, fluido ascítico o sobrenadante de cultivo de tejido debería diluirse por lo menos 1 : 1 con amortiguador antes de aplicarlo a una columna. Después de aplicar la muestra, se lava la columna con un amortiguador de agua, por ej., 20 mM de fosfato de sodio, 150 mM NaCI, pH 7,4, hasta que la mayoría de las impurezas se remueven. Se eluye luego el IgG con amortiguador de elución, por ej. , 100 mM glicina, pH 3,0. Se pueden entonces concentrar el IgG mediante diafiltración o purificarse mediante intercambio iónico o cromatografía de exclusión de tamaño. Los anticuerpoé "humanizados" (incluyendo y los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos injertados-CDR), los fragmentos de anticuerpo, y especialmente los anticuerpos bi-específicos basados en los anticuerpos reivindicados como monoclonales están contemplados dentro de la presente invención, como productos relacionados con anticuerpos recombinantes producidos en las células procarióticas o eucarióticas. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos, tales como los fragmentos Fab y F(ab')2, pueden producirse en cultivo mediante células huésped tales como E. Coli, levadura, células de insectos y mamíferos con la determinación de información (secuencia) estructural para las regiones variable de los anticuerpos de la invención. Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 6,180,377. La información de secuencia para las regiones variables permiten también la preparación de anticuerpos injertados-CDR.
- 19 - Además, los anticuerpos quiméricos (por ej., anticuerpos de ratón/humano) pueden prepararse utilizando células de mieloma transformado o células de hibridoma y anticuerpos bi-específicos pueden prepararse por medio de las células de hibridoma híbrida. Las composiciones^ farmacéuticas y las vacunas de la invención están formadas típicamente al dispersar el ácido hialurónico de peso molecular bajo y/o conjugar en un portador farmacéuticamente aceptable, adecuado, tal como salina fisiológica, salina de fosfato amortiguado u otros líquidos inyectables. La composición farmacéutica o vacuna puede administrarse parentalmente, por ejemplo subcutáneamente, ¡ntraperitonealmente o ¡ntramuscularmente. Los aditivos usuales en las composiciones farmacéuticas, tales como vacunas pueden también agregarse; por ejemplo, estabilizadores, tales como lactosa o sorbitol, y adyuvantes tales como fosfato alumínico, hidróxido alumínico, sulfato alumínico, lípido de monofosforilo A, QS21 , o tirosina de estearilo. Tales composiciones farmacéuticas pueden comprender el ácido hialurónico de peso molecular bajo, su conjugado, o anticuerpos al ácidp hialurónico de peso molecular bajo y/o su conjugado. Las composiciones pueden administrarse solas o en combinación con por lo menos otro agente, tales como un adyuvante o como un compuesto estabilizador, que puede administrarse en cualquier portador farmacéutico estéril, biocompatible, incluyendo, pero no limitado a, salina, salina amortiguada, dextrosa, y agua. Las composiciones pueden administrarse solas a un paciente, o en combinación con otros agentes, drogas, hormonas, o modificadores de respuesta biológica.
- 20 - Las composiciones farmacéuticas y las vacunas se administran en cantidades suficientes para provocar una respuesta inmunogénica. Las dosis estarán normalmente dentro del margen de alrededor de 0,1 a 50 µg de molécula conjugada por kilogramo de peso corporal. Las dosis pueden ajustarse basadoá en el tamaño, peso, o edad del individuo y está bien dentro del nivel de habilidad y experiencia en el arte. Se puede dar una serie de dosis para la inmunidad óptima. La respuesta del anticuerpo en un individuo puede verificarse determinando el título del anticuerpo o actividad bactericida y el individuo puede sobrealimentarse, si es necesario, para acrecentar la respuesta. La presente invención ofrece composiciones que incluyen anticuerpos, tales como ios anticuerpos purificados, fracciones de gama globulina y suero útiles para proveer la inmunidad pasiva a los mamíferos infectados o en peligro de ser expuestos al HA conteniendo bacteria, especialmente el grupo A o grupo C de estreptococos. Entre las muchas patologías causadas por los estreptococos está la infección invasiva del tejido suave que está asociada con la morbidez y mortalidad significativas. Ver, por ejemplo, Ashbaugh et al. J. Clin. Invest., 1998, 102: 550. Los IgGs, los fragmentos de anticuerpos, los anticuerpos, lás fracciones de gama globulina y el suero provistos por esta invención son útiles para inhibir o evitar la infección del HA que contiene bacterias, tales como el grupo A y el grupo C de estreptococos y la necrosis de tejido resultante y otras patologías que resultan de tal infección. Las composiciones farmacéuticas que incluyen anticuerpos, tales como anticuerpos purificado, fracciones de gama globulina y suero son típicamente formados por medio - 21 -de la dispersión de anticuerpos en un portador adecuado farmacéuticamente aceptable, tal como salina fisiológica, salina de fosfato amortiguado u otros líquidos inyectables. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse parentalmente, por ejemplo subcutáneamente, intraperitonealmente intramuscularmente. Se pueden agregar también los aditivos usuales en las composiciones farmacéuticas. Las composiciones pueden administrarse solas o en combinación con por lo- menos otro agente, tales como un compuesto estabilizador, que puede administrarse en cualquier portador estéril, farmacéuticamente biocompatible, pero no limitado a salina, salina amortiguada, dextrosa, y agua. Las composiciones pueden administrarse solas a un paciente o en combinación con otros agentes, drogas, o modificadores de respuesta biológica. Las composiciones farmacéuticas que incluyen anticuerpos se administran en cantidades suficientes para inhibir la infección bacterial. Las dosis pueden ajustarse en base al tamaño, peso o edad del individuo y está bien dentro del nivel de la habilidad en el arte. Puede darse una serie de dosis para la inmunidad óptima. La respuesta a la dosis en un individuo puede verificarse mediante la determinación del título del anticuerpo o actividad bactericida y se puede dar al individuo dosis adicionales, si es necesario, para aumentar la respuesta. Los anticuerpos preparados de acuerdo con la presente invención son también útiles para preparar varios inmunoreactivos y para uso en los inmunoensayos. Por ejemplo, para los inmunoensayos los fragmentos de ácido hialurónico de peso molecular o sus conjugados - 22 -pueden ser inmovilizados ya sea directamente o a través de un conector, tal como un conector de polipéptido, a un soporte sólido. Pueden utilizarse los métodos similares a aquellos usados para hacer conjugados para la inmovilización. Los anticuerpos pueden usarse en varios sistemas de inmunoensayo conocidos por aquellos expertos en el arte incluyendo, radioinmunoensayos y ELISA para detectar la presencia de HA conteniendo bacteria, tales como el grupo A o grupo C de estreptococos. Tales ensayos pueden utilizarse para diagnosticar la presencia de infección en individuos ensayando por la presencia del grupo A o grupo C de anticuerpos estreptococos en suero u otros fluidos del cuerpo. Los ejemplos presentados en la presente tienen por fin ejemplificar los distintos aspectos de llevar a cabo la invención y no tienen la intención de limitar el alcance de la invención de manera alguna. Todas las publicaciones, patentes y artículos referidos dentro de está descripción están incorporadas en su totalidad en esta descripción. EJEMPLO 1 PREPARACIÓN DE L W-HA Depolimerización del Ácido Hialurónico por Hidrólisis de Ácido Se agregó ácido hialurónico (100 mg, Lifecore lote 1 -9062-5) a una solución de 1 0 mi de 0,05 N HCI. Se calentó la mezcla a 80°C durante 2 horas, y se agitó a fin de disolver el sólido entero. Se calentó luego la muestra por otras 1 ,5 horas a 100°C. La depolimerización fue verificada mediante la remoción de alícuotas de la mezcla de la reacción varias veces y se analizó en un sistema Bio-Rad (Bjologic) equipado con una columna Superose®12 HR 10/30 (Pharmacia). Se neutralizó la solución - 23 -con 0,5N NaOH, luego se dializó con una membrana de Diaflo® de corte de peso molecular (MWCO) 3,500 y liofilizó. El producto fue fraccionado a tamaño molecular a través de una columna Superdex® 200 PG (Pharmacia) para producir 65 mg de producto sólido. El análisis de H-NM de las muestras en 500 Hz confirmaron la estructura de la unidad repetitiva del ácido hialurónico del disacárido (HA). Se estimó que el peso molecular promedio del fragmento generado por medio de cromatografía de exclusión de tamaño acoplada con la fotometría de luz de dispersión láser de multiángulo (SEC MALLS) era de 12.000 daltones. Preparación de Oligosacáridos HA Conteniendo Acido D-Glucurónico en sus Extremos No Reductores Se trata el ácido hialurónico (100 mg. , Lifecor lote 1 -9062-5) con 0, 1 N HCI en 80°C durante 10 horas. Se neutralizó la solución con 0,5 N NAOH y se desaló a través de una columna Sephadex® G-20 (Pharmacia) eluída con agua. Se seca el producto desalado por congelación y se trató con glucosaminidasa -A/-acetilo (EC 3.2.1.30; Calbiochem) para generar los fragmentos de LMW-HA con alrededor de 4 a alrededor de 20 unidades repetitivas y conteniendo ácido D-glucurónico en sus extremos no reductores. Se confirma la estructura de los oligosacáridos por medio de espectroscopia NMR y análisis dé metilación. Depolimerización del Acido Hialurónico Mediante la Sonicación Se disolvió el ácido hialurónico (100 mg, Lifecore lote 1 -9062-5) en 20 mi del amortiguador de 10 mM PBS, y se agitó la suspensión hasta disolverse. Se sometió la muestra a sonicación con un aparato sónico modelo Branson 450, (valores sónicos: Control de sonido: 3;
- 24 - Régimen de trabajo: 50%; temperatura: 2°C) durante 1 8 horas. Después de la diálisis y liofilización, se recuperaron 57 mg de producto sólido. El peso molecular resultante promedio del ácido hialurónico sometido a sonicación fue determinado en 18,000 daltones por SEC-MALLS utilizando el instrumento MiniDawn (Tecnología Wyatt, Santa Barbara, CA) y una columna Superóse® 12HR 10/30 (Pharmacia). El análisis 1H-NMR de las muestras en 500 MHz confirmaron la estructura de la unidad repetitiva del disacárido de ácido hialurónico. EJE MPLO 2 PREPARACIÓN DE LOS CONJ UGADOS DE LMW-HA Reducción del Acido Hialurón ico tratado al ácido con NaB H4 Se disolvió el ácido hialurónico, depolimerizado con ácido clorhídrico (65 mg) en 6,5 mi de agua deionizada. Se ajustó el pH a 10 con 0,5 NAOH y 64,5 mg de NaBH4 agregado a la solución. Se mantuvo la mezcla de la reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. Se destruyó el exceso de NaBH4 con 1 M de ácido acético. La diálisis contra el agua desionizada con una membrana Diaflo® de MWCO 3,500 seguida por liofilización produjo 35 mg de producto sólido. Oxidación de periodato de Acido H ialurónico tratado a l ácido reduc ido Dos muestras de 18 mg de los polisacáridos reducidos y medidos se disolvieron en 1 ,3 mi de 0,87 mi de una solución acuosa de 10 mM de Nal04 para alcanzar un grado de oxidación (d.o.) de 10 y 20 por ciento, respectivamente. Se agitaron las reacciones en la oscuridad durante 2 horas a temperatura ambiente, y se enfriaron rápidamente con 20 µ? de etilenglicol. Las mezclas de la reacción fueron luego dializadas y - 25 -liofilizadas para dar 17 mg de producto sólido. Preparación del Conjugado de Acido Hialurónico tratado ai ácido -Toxoide de Tétano (LMW-HA/TT) El periodato-oxidizado (d.o. 10% y 20%) del ácido hialurónico tratado al ácido (10 mg de cada uno respectivamente) y el monómero de toxoide de tétano (5 mg para cada muestra, Staten Serum Institute, Copenhagen, Dinamarca) se disolvieron en 0,5 mL de 0,2 de fosfato de sodio, pH 7,4. El cianoborohidruro de sodio recristalizado (10 mg para cada muestra) fue agregado y la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante toda la noche. El progreso de la reacción fue verificado en distintos tiempos utilizando un sistema Bío-Rad (Biologíc) equipado con una columna Superóse® 12 HR, 10/30 (Pharmacia). La conjugación del polisacárido con la proteína fue indicado por un aumento progresivo de un pico de UV (280 nm) eluyendo en el volumen vacío de la columna. Después de completarse la conjugación se agregaron 10 mg de NABH4 en 1 mi de 0.1 N NaOH a cada muestra a fin de reducir cualquier aldehido no conjugado reátante. Se purificó el conjugado mediante el pasaje a una columna (1 ,6 x 60 cm) de Superdex® 200 PG (Pharmacia) eluyendo con 1 0 nM PBS conteniendo 0,01 por ciento de timerosal. Las fracciones correspondientes al pico del volumen-vacío se agruparon y almacenaron a 4°C. Ellos fueron conjugados designados 1 y 2 para 1 0 y 20 por ciento de oxidación en sus polisacáridos, respectivamente. Oxidación de Periodato del Acido Hialurónico Sometido a Sonicación Se disolvieron dos muestras de 26 mg y 30 mg cada una de polisacáridos en 2 y 1 ,5 mi de agua deionizada, respectivamente y tratadas - 26 -con 0,65 mi y 1 ,5 mi de 10 mM de Nal04 acuoso para alcanzar grados de oxidación (d.o.) de 1 0 y 20 por ciento, respectivamente. Se agitaron las reacciones en la oscuridad durante 2 horas a temperatura ambiente, y se enfrió rápidamente cada reacción con 20 µ? de etilenglicol. Las soluciones fueron luego dializadas y liofilizadas para proveer 24 y 25 mg del producto respectivamente. Preparación del Ácido Hialurónico Sometido a Sonicación-Conjugado de Toxoide de Tétanos (LMW-HA/TT) HA sometido a sonicación y periodato-oxidizado (7 mg de cada muestra, d.o. 10% y 20%) y monómero de toxoide de tétanos purificado (3,5 mg para cada muestra ) se disolvieron en 350 µ? de 0,2 de fosfato de sodio en pH 7,4. Se agregó el carbohidruro de sodio (7 mg para cada muestra) y las mezclas se mantuvieron a temperatura ambiente durante toda la noche. El progreso de cada reacción de conjugación fue verificada mediante la remoción de alícuotas de la mezcla de la reacción en distintos tiempos y análisis subsiguientes en un sistema de Bio-Rad (Biologic) equipado con una columna Superóse® 12 HR 10/30 (Pharmacia). La conjugación del polisacárido con el polipéptido fue indicado por un aumento progresivo de un pico de UV (280 nm) fluyendo en el volumen vacío de la columna. Después de completarse la conjugación se agregaron 10 mg de NABH en 1 mi de 0, 1 N NaOH4 a cada muestra a fin de reducir cualquier aldehido no conjugado restante. Se purificó el conjugado mediante el pasaje a una columna de Superdex® 200 PG (Pharmacia) eluída con 10 mM PBS conteniendo 0,01 por ciento de timerosal. Las - 27 -fracciones correspondientes al pico del volumen-vacio se agruparon y almacenaron a 4°C. Ellos fueron conjugados designados 3 y 4 para 10 y 20 por ciento de oxidación en sus polisacáridos, respectivamente. Acoplamiento del Ácido Hialurón ico Sometido a Sonicación con Neisserial Porin Clase 3 Recombinante (LMW-HA/rPorB) Se disolvieron el ácido hialurónico sometido a sonicación y periodato-oxidizado (20 mg, 20% d.o.) y rPorB (10 mg) en 717 µ? del amortiguador 0,25 M HEPES, pH 8,5, conteniendo 0,25 de NACI y 0,05 por ciento de Zwittergent Z 3.14 (Calbiochem, San Diego, CA). Se agregó cianoborohidruro de sodio (20 mg), y se incubó la mezcla a 37°C durante 1 día. Después de completar la conjugación, se agregó 10 mg de borohidruro de sodio en 1 mi de 0,1 N NAOH a la mezcla de la reacción para remover cualquier aldehido restante.. Se purificó el conjugado mediante el pasaje a una columna de Superdex® 200 PG (Pharmacia) eluida con 10 nM PBS conteniendo 0,01 por ciento de timerosal. Las fracciones correspondientes al pico del volumen-vacio, según se verificó por la absorción de UV en 280 nm, se agruparon y almacenaron a 4°C y etiquetaron como el conjugado 5. Preparación de Conj ugados de Alb úm ina de Suero Acido-Hu mano H ia lurón ico (L W-HA/HAS ) como Antígenos con revestimiento ELISA Ambos ácidos hialurónicos tratados al ácido y periodato-oxidizados sometidos a sonicación con un d.o. del 1 0 por ciento, y Albúmina de Suero Humano (HSA, Fluka) se disolvieron en 0,5 mi de amortiguador de fosfato de sodio, pH 7,4. Se agregó el cianoborohidruro de sodio, y se incubaron las mezclas en 37°C durante 1 día. Después de - 28 - completar la incubación se agregó hidruro de boro en 0,1 N NAOH a las mezclas de la reacción según se describió para los otros conjugados a fin de remover cualquier aldehido restante. Los conjugados fueron dializados y liofilizados. Tabla 1 : Características Fisio-Químicas de los Conjugados LMW- HA/Proteina
Se midieron los contenidos de ácido hialurónico y proteína en los conjugados mediante el carbazol (para ácidos urónicos) (Bitter, T. 962 Anal. Biochem. Respectivamente 4:330) y ensayos de coomassie (BioRad), respectivamente. EJEMPLO 3 AISLAMIENTO DE LOS INHIBIDORES OLIGOS ACÁRIDOS DE ACIDO- HIALURÓNICO Se agregó Masa hialuronato (EC 4.2-2.1 ) de Streptomyces - 29 -hyalurolyticus (Sigma Biochemicals), el contenido de 3 ampollas en 10 mM PBS, al ácido hialurónico sometido a sonicación (60 mg) e incubó a 37°C durante 1 ,5 horas. Se detuvo la reacción mediante ebullición de la mezcla de reacción a 100°C durante un minuto en un baño de agua. El progreso de ia digestión enzimática fue verificado mediante la remoción de alícuotas de la mezcla de reacción y análisis en un sistema de BIO-RAD (Biologic) equipado con una columna de péptido Superdex® (Pharmacia), con 10 mM PBS como fluyente en un flujo de velocidad de 0,75 ml/min. Se almacenó la solución en 4°C hasta su posterior purificación. El aislamiento de los oligosacáridos se realizó por medio de la cromatografía de intercambio-anión con una columna de Mono-Q HR 5/5 (Pharmacia) utilizando un sistema HPLC 1090 (Hewlett Packard 1090 Series II) equipado con un detector con red de diodo, un auto-inyector programable, un colector de fracción, y el programa de software de Hewlett Packard Chemstation para el control del sistema y los datos de adquisición/proceso. Se utilizó un gradiente-escalonado de cloruro de sodio en el amortiguador Tris-HCL para la separación. Se reunieron dos fracciones de oligosacáridos correspondiente a un dímero (DP2) y un tetrámero (DP4) eluyendo, respectivamente, entre 18 26 minutos y entre 28 a 31 minutos se liofilizaron y desalaron utilizando una columna Sephadex G-10 (Pharmacia) y se deionizó agua como fluyente. La estructura de los oligosacáridos se confirmó por medio del examen de su espectro 1H-NMR en 500 MHz. El oligosacárido DP2 correspondía a A4,5-p-GlcU-(1 ,3)-D-GleNAc, y el DP4 a A4,5-p-GlcU-(1 ,3)-p-D-GlcNAc-(1 ,4)-p-D-GlcU-(1 ,3)-ß-D-GleNac.
- 30 - EJEMPLO 4 ESTUDIOS SEROLÓGICOS: INMUNOESPECIFICIDAD DE ANTIS UEROS DE CONEJO CON ACIDOS HIALURÓtílCÓS DE PESO MOLECULAR BAJO (LMW-HAS) Estudios de (nmunogenicidad Se inmunizaron subcutáneamente conejos blancos de Nueva Zelanda, 3 veces con intervalos de 21 días (días 0, 21 , y 41 ) con 10 µ9 de polisacárido conjugado por dosis de LMW-HA/TT en adyuvante completo de Freund para la primera dosis y adyuvante incompleto de Freund para la segunda y tercera dosis. Se les sacó sangre de las orejas a los conejos en los días 21 , 31 y 4 y se realizó una prueba de punción cardiaca 10 días después de la tercera inmunización. Titulación de Antisueros de Conejo en Placas Revestidas de LMW-HA-HSA Se revistieron pasivamente placas de microtítulos (NUNC
Polysorp) tanto con LMW-HA-HSA sometido a sonicación o conjugado de ácido hidrolizado LMW-HA-HSA (aproximadamente 25 ng PS en 100 µL/cavidad) diluido en PBS (50 mM de fosfato de sodio, 150 mM NACI, pH 7,4) durante una hora a 37°C. Después de lavar las placas con PBS + 0,05% de Tween® 20 (PBS Tween, pH = 7,4), las placas fueron post-revestidas con 150 µ?/cavidad PBS + 0,1 % de Albúmina de Suero Bovino (PBS + BSA, pH 7,4) durante una hora a temperatura ambiente. Después del post-revestimiento, se lavaron las placas otra vez y se almacenaron a 2-8 C hasta su uso. Se diluyeron los antisueros de conejo serialmente en PBS - 31 - Tween en cavidades de placas de microtítulo revestidas tanto con LMW-HA/HSA sometido a sonicación como con ácido hidrolizado LMW-HA/HSA a un volumen final de 100 µ?/cavidad e incubados durante una hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas con PBS Tween y se agregó 100 µ? de un conjugado de Peroxidasa IgG-Rábano picánte anti-conejo cabra (Laboratorios Kirkegaard y Perry) diluido 1 :2,500 en PBS Tween en cada cavidad. Luego de una hora de incubación a temperatura ambiente, se lavaron otra vez las placas y se agregó 100 µL· de Solución de Substrato TMB en cada cavidad. Se incubaron las placas durante cinco a diez minutos a temperatura ambiente y se detuvo el desarrollo del color por medio de la adición de 100 µL· de una Solución de Detención de Un Componente (KPL) en cada cavidad. Se leyó la densidad óptica de cada cavidad en 450 nm, y se generaron las curvas de titulación para cada condición. Inhibición de Unión de los Sueros de Conejo con LMW-HA/TT sometido a Sonicación en las Placas Revestidas con LMW-HA/HSA Se revistieron las placas de microtítulo como lo antedicho. Los antisueros LMW-HA/TT anti-sometidos a sonicación de conejo fueron titulados en placas revestidas con el conjugado LMW-HA/HSA sometido a sonicación. Se eligió la dilución correspondiente a aproximadamente una mitad de la señal máxima como apropiada para los estudios de inhibición. Se diluyeron los antisueros de conejo en PBS Tween. Se diluyeron los inhibidores serialmente en un amortiguador conteniendo los antisueros de dilución en Titertubes® (Bio-Rad) y 100 µ? de cada muestra se toman de Titertubes® y agregan directamente a las cavidades de placas de - 32 -microtítulo revestidas. Las muestras se incuban en las placas de microtítulo durante una hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas de microtítulo con PBS Tween, luego 100 ? del conjugado de cabra anti-conejo IgG-HRP (KPL) diluido 1 :2,500 en PBS Tween se agregaron a cada cavidad. Se incubaron las placas durante una hora a temperatura ambiente, y se lavaron con PBS Tween. Se agregó a cada cavidad 100 µ? de Solución de Substrato TMB. Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante cinco a diez minutos y se detuvo el desarrollo del color por medio de la adición de 100 µL· de una Solución de Detención de Un Componente (KPL) en cada cavidad, y se leyó la absorción en 450 nm. Se determinó la inhibición como por ciento de señal máxima alcanzada con los antisueros de dilución en la ausencia de cualquier inhibidor. Respuesta Inmune a los Conejos Blancos de Nueva Zelanda Se inmunizaron ocho conejos Blancos de Nueva Zelanda con tres inyecciones subcutáneas de conjugados tanto el Toxoide de Acido-Tétanos Hialurónico (LMW-HA/TT) como el Toxoide de Acido-Tétanos Hialurónico hidrolizado (LMW-HA/TT) (cuatro animales para cada cónjugado). La Figura 4 muestra la respuesta inmune para cada conejo individual para el conjugado inmunógeno LMW-HA/TT sometido a sonicación. Los cuatro animales respondieron al ácido hialurónico con los títulos ELISA en exceso de 50,000. La Figura 5 muestra la respuesta inmune para los conejos individuales inmunizados con el conjugado LMW-HA/TT hidrolizado de respondieron al ácido. Los cuatro animales individuales respondieron al ácido hialurónico con los títulos ELISA de - 33 -aproximadamente 1 0,000 o más. Se demostró que la respuesta inmune de los conejos era especifica dependiendo de la naturaleza del conjugado utilizado para las inmunizaciones. La Figura 6 muestra que los anticuerpos de animales que fueron inmunizados con el conjugado LMW-HA/TT sometido a sonicación reaccionaron generalmente más fácilmente a las placas revestidas con LMW-HA/HSA sometidas a sonicación, que el LMW-HA/HSA de ácido hidrolizado. Hay por lo menos un orden de gran diferencia en la inmunoreactividad entre estos antígenos con diferentes revestimientos. Lo contrario ocurre para los animales inmunizados con el conjugado LMW-HA/TT de ácido hidrolizado. La Figura 7 muestra una orden de gran preferencia para estos antisueros con el conjugado de ácido hidrolizado LMW-HA/HSA por oposición con la fase sólida del LMW-HA/HSA sometido a sonicación. Especificidad de los Antisueros Generados por medio del LMW-HA/TT en los Conejos Blancos de Nueva Zelanda La especificidad de los antisueros producidos en los conejos mediante la inmunización con el conjugado LMW-HA/TT sometido a sonicación fue examinada por medio de los estudios de inhibición de placa de microtítulo. Los resultados de los estudios de inhibición utilizando antisueros de conejo #75295 inmunizado con LMW-HA/TT sometido a sonicación están representados en las Figuras 8 y 9. La Figura 8 indica varias especies de HA sometida a sonicación, así como varias especies de HA de ácido hidrolizado utilizadas como inhibidores. En este experimento, todas las formas del ácido hidrolizado HA eran inhibidores pobres de - 34 -anticuerpos uniéndose con el LMW-HA/HSA revestido sometido a sonicación. Con respecto a las especies sometidas a sonicación de los inhibidores, parece que la tendencia indica que cuanto más pequeño es el fragmento de HA producido por el sometimiento a sonicación, más eficiente es el fragmento como un inhibidor. Esto indica que las moléculas de HA más pequeñas presentan más epítopes por unidad masa que las especies más grandes. Los resultados presentados en la Figura 9 aclaran este descubrimiento. En la presente, el HA nativo de peso molecular muy alto es visto como un inhibidor muy pobre, casi tres órdenes de magnitud menor que los 20 kD HA utilizados como el inmunógeno. Las especies más pequeñas se usaron también como inhibidores en este experimento. La forma de tetrasacárido de HA era un inhibidor relativamente eficiente, mientras que el disacárido y las formas de ácido D-glucurónico no inhibía la unión del anticuerpo con la fase sólida para nada. Los resultados de los estudios de inhibición realizados utilizando antisuero de conejo #72700, que también estaba inmunizado con el conjugado LMW-HA/TT, están presentes en las Figuras 1 0 y 1 1 . Estos resultados son muy similares a los obtenidos del conejo #75295 según se describió anteriormente. La Figura 10 muestra resultados similares a los vistos en la Figura 9. Es decir, la forma de tetrasacárido del HA y la forma del inmunógeno del HA sometido a sonicación (20K) inhiben bien, mientras que el disacárido y las formas nativas del HA inhiben pobremente. La relación entre el tamaño del HA y la inmunoreactividad fue examinada además utilizando una forma de hexasacárido del HA. Estos resultados se - 35 -muestran en la Figura 1 1 . Los resultados indican que esta forma de HA es capaz de completar la inhibición del anticuerpo de unión. De estos estudios se explica que por lo menos la forma del tetrasacárido (dos subunidades repetitivas) de HA es necesario para la inhibición completa. La forma del tetrasacárido es insuficiente para la inhibición y la forma nativa de la molécula no es un inhibidor óptimo. Por lo tanto, se prefiere una reducción en el tamaño de la molécula HA nativa grande para el reconocimiento inmune. EJEMPLO 5 ESTUDIOS DE INMUNOGE NICIDAD EN RATONES Antisueros Producidos en Ratones con los Conjugados de Proteína-Acido Hialurónico Se inmunizaron ambos ratones BALB/c y CD1 con tres inyecciones de vacunas de conjugado LMW-HA/proteína. Los conjugados fueron tanto LMW-HA/TT sometido a sonicación, como con los conejos, o HA sometido a sonicación conjugado con rPorB (LMW-HA/rPorB). La vacuna del conjugado LMW-HA/TT no producía una respuesta inmune mayor que la del control negativo. Sin embargo, el conjugado LMW-HA/rPorB produjo títulos ELISA mensurables en 100% de los animales inmunizados. Estos datos se muestran en las Figuras 12 y 13 para los ratones BALB/c y ratones CD1 , respectivamente. EJEMPLO 6 EXPERIMENTOS DE PROTECCIÓN Inmunización Pasiva Se utilizaron los ántisueros de conejo con los conjugados - 36 - LMW-HA/TT para ensayo de protección en la inmunización pasiva en ratones adultos Balb/c. Los antisueros de conejo (0,5 mi) diluidos por la mitad en PBS estéril fueron inyectados ¡ntraperitonealmente (IP) dos horas antes del desafío (IP) con una dosis desafío LD90 del grupo A de estreptococos (GAS) tipo 6 o tipo 3. Se incluyeron los antisueros de un conejo inmunizado con fosfato de amortiguador salino (PBS) y el adyuvante completo de Freund (CFA) así como un antisuero de conejo originado contra el grupo A de carbohidrato de estreptococos conjugados con toxoide de tétanos en el experimento de protección como suero de control. Se siguió la supervivencia durante 10 días después del desafío. Los LD90s fueron determinados anteriormente después de la inmunización de ratones Balb/c con antisueros de conejo inmunizados con PBS/CFA seguido durante 2 horas más tarde por un desafío IP con una gama de dosis del tipo GAS o tipo 3. Se determinó que el LD90 para GAS de tipo 6 era respectivamente 5 x 103 y 2 x 105 cfu/mL.. Los resultados de los experimentos del desafío se muestran en las Figuras 14 y 15.