JP2000507274A - キャリヤーペプチドとしてのｉｇａ１プロテアーゼフラグメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、４０〜２００個のアミノ酸残基を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列の、１〜５のいずれか１つに位置するアミノ酸で始まり、４０〜１０４のいずれか１つに位置するアミノ酸で終わる、少なくとも４０個のアミノ酸を含んでなるＩgＡ１−プロテアーゼのフラグメント、または相同配列の、特に多糖類と組み合わせてのコンジュゲートに対するキャリヤーとしてのその使用、およびそのペプチドを製造する方法、さらにはまた、該ペプチドを含んでなるワクチンに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 キャリヤーペプチドとしてのＩＧＡ１プロテアーゼフラグメント 本発明は、新たなペプチド、特に多糖類と組み合わせてのコンジュゲートに対 するキャリヤーとしてのその使用、およびそのペプチドを製造する方法、さらに はまた、該ペプチドを含んでなるワクチンに関する。 多糖類は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌における莢膜として、また細菌お よび真菌の細胞壁の構成成分として存在する。Neisseria属、Streptococcus属、 Klebsiella属、Salmonella属、Shigella属、およびHaemophilus属の様々な種は 病原性であり、様々なヒト疾患(例えば、流行性髄膜炎、耳炎、肺炎、および下 痢)の原因である。これらの疾患は、重大で世界的な小児期の公衆衛生問題であ り、従って、これらの疾患に対する予防を獲得することが重要である。 多糖類巨大分子は、免疫原性を媒介することができる糖単位から成る。従って 、細菌多糖類またはその部分は、ヒトの免疫化に使用されてきた。これらのワク チンは、子供達および大人達において免疫原性であって、防御抗体を誘導するこ とができるが、それらは、Ｔ細胞非依存性免疫応答を誘引することしかできない ので、乳児を防御するのには適当ではない。そのようなわけで、莢膜多糖体との 接触は、記憶応答を誘導せず、持続性防御をもたらさない。そのうえ、乳児にお いて免疫応答を誘引することができない。 Ｔ細胞非依存性免疫応答の問題を克服するために、Ｔ−非依存性抗原としての 多糖類の、Ｔ−依存性抗原としてのタンパク質キャリヤーへの共有結合的コンジ ュゲートが使用されて、この欠陥を上手く克服することが見い出された。そのよ うなコンジュゲートを用いての免疫化は、Ｔ細胞依存性抗体応答を誘引する。し かし、ヒトに有用であるキャリヤータンパク質の選択は非常に制限され、大抵の 場合、多糖類を破傷風毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素に結合させてい る。これらの毒素の、キャリヤーとしての非限定的な使用または過度の使用は、 このタイプのキャリヤーに結合した多糖類に対するその後の応答を抑制すると考 えられる。そのキャリヤーに対する、先在抗体による免疫応答の、この抑制は、 今後問題になるものと思われる。 このタイプのコンジュゲートに関して、新たなキャリヤータンパク質の選択を 限定するさらなる問題は、そのタンパク質が無毒であるか、または解毒されてい なければならないことである。 さらにまた、既知のペプチドー多糖類コンジュゲートは、アジュバントを使用 して、免疫応答を高める必要があるという不利を招く。しかし、多くの既知のア ジュバントは、炎症応答を誘引し得るので、ヒトには適用できない。現在まで、 １つのアジュバントしかヒトには許されていない：アルミニウムゲル。 従って、本発明の目的は、非常に免疫原性であり、Ｔ細胞依存性免疫応答を誘 引し、哺乳動物において持続する記憶をもたらして、アジュバントの使用を回避 することができる可能性のある、新たなキャリヤー分子を提供することである。 この目的、そして以下の説明から明らかになるであろうさらなる目的は、少なく とも４０個のアミノ酸を有する新規ペプチドの使用により達成される。 従って、本発明の第一態様によれば、４０〜２００個のアミノ酸残基を有する ペプチドであって、配列番号１に示すアミノ酸配列の、１〜５のいずれか１つに 位置するアミノ酸で始まり、４０〜１０４のいずれか１つに位置するアミノ酸で 終わる、少なくとも４０個のアミノ酸を含んでなるペプチド、または相同配列を 提供する。 本発明のさらなる態様では、これらの新規ペプチドを、コンジュゲートに対す るキャリヤーとして使用する。 驚いたことに、Ｎeisseria由来のＩgＡ１ プロテアーゼの部分である、配列番 号１、２、３、４、もしくは５の１つの、少なくとも４０個のＮ末端アミノ酸を 含んでなるペプチド、または相同配列を抗原に対するキャリヤーとして使用して 、アジュバントを使用することさえなく、Ｔ細胞依存性免疫応答を永続して誘引 することができることが見い出された。そのような小さなペプチドが免疫原性コ ンジュゲートに対するキャリヤーとして有用であり得ることは予測できなかった 。 現在まで使用されているキャリヤーに比べて、この小さなペプチドの使用は、 多くの利点を有する。小さなペプチドにすぎないことから、それは合成的に製造 することができ、それは、多糖類のような、免疫原として使用される全てのタイ プの化合物にコンジュゲートすることができ、Ｎeisseria由来の、特にＮ．meni ngitidis、またはＨaemophilus、特にＨ．influenzae由来の多糖類と組み合わせ てとりわけ有用である。従って、それは、乳児のための、さらにはまた、若年の 子供達および大人達のためのワクチンを製造するのに有用である。 本発明のペプチドは、Ｎeisseria属の病原性細菌により産生されるＩgＡ１プ ロテアーゼの部分である。ＩgＡ１プロテアーゼは、細菌に対する防御として宿 主により産生されるＩgＡ１抗体を崩壊させる酵素である。ＩgＡ１プロテアーゼ が免疫応答を誘引することができることは知られているが、そのようなプロテア ーゼの、キャリヤーとしての使用は、一方では、それが大きな分子であり、他方 では、それが免疫すべきヒトの免疫系にマイナスの影響を与えるので、考えられ ていなかった。それとは対照的に、そのペプチドは、この酵素的な効果を有して いない。 本発明のペプチドは、配列番号１、２、３、４、もしくは５の配列の１つの少 なくとも４０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸、さらに好 ましくは少なくとも７０個のアミノ酸、そして最も好ましくは１０４個のアミノ 酸全て、またはそれらの相同配列を含んでなる。最も好ましくは、そのペプチド は、１０４merの配列番号１である。 そのペプチドはまた、１０４個を超えるアミノ酸も有し得る。配列番号１、２ 、３、４、および５で説明する配列は、他のアミノ酸を妨害したり、Ｔ−エピト ープに影響を及ぼしたり、またはペプチドの最初の４０個のＮ末端アミノ酸の構 造を変えたりしない、さらなるアミノ酸により伸張することができる。その配列 は、Ｎ末端で、さらにはまた、カルボキシ末端で伸張することができる。そのペ プチドは、少なくとも４０個の、かつ約２００個以下のアミノ酸を有していなけ ればならない。そのペプチドが４０個未満のアミノ酸を有するならば、それはキ ャリャーとして適当ではなく、それをキャリヤーとして用いたとしても、持続性 免疫化が起こる見込みはない。一方、２００個を超えるアミノ酸を有するペプチ ドは、合成するのが難しい。７０個を超えるアミノ酸を有するペプチドが改良さ れた抗原性を有し、配列番号１の配列についての１０４個のアミノ酸を有するペ プチドが最も好ましいことが見い出された。該配列は、Ｎeisseria meningitidi s、セ ログループＡ、サブグループIII、Ｚ３９０６株由来のＩgＡ１プロテアーゼの部 分であって、Ｇenbank取得Ｘ８２４７４がもつ配列と同一である。 本発明のペプチドは、配列番号１、２、３、４、または５の１つのアミノ酸配 列を有するペプチドと同一または相同であるのが好ましい。好ましくは、そのペ プチドは、上述のアミノ酸配列の１つと少なくとも８５％が同一であり、さらに 好ましくは上述のアミノ酸配列と９０％が同一であり、特に好ましくは９５％が 同一である。最も好ましい態様では、そのペプチドは、上述のアミノ酸配列と、 特に配列番号１と１００％同一である。 配列番号１、２、３、４、または５に示す配列の１つと相同な配列を有するペ プチドもまた、本発明の範囲内である。配列番号２は、Ｎ．meningitidis、セロ グループＣ、ＥＴ−３７複合体、Ｚ４４００株由来の配列である。配列番号３は 、Ｎ．meningitidis、セログループＡ、サブグループIII、Ｚ３５２４株由来の 配列である。配列番号４は、ＳwissProtからの配列 Ｓ０９３８６より得られる 。配列番号５は、欧州特許公開第２５４０９０号で公表された、Ｎ．gonorrhoea e、ＭＳ１１株由来の配列であって、Ｇenbank取得番号Ａ０２７９６と同一であ る。 「相同の」という用語は、本発明の説明および請求の範囲で使用する場合、各 々の配列と少なくとも８０％が同一である配列を示す。ペプチドの相同性は、典 型的には、配列分析ソフトウェア(例えば、Ｇenetics Ｃomputer Ｇroup、Ｕniv ersity of Ｗisconsin Ｂiotechnology Ｃenter、１７１０ Ｕniversity Ａvenu e、Ｍadison、ＷＩ、５３７０５の配列分析ソフトウェアパッケージ)を使用して 測定される。類似のアミノ酸配列を並べて、最大の相同性度を得る。この目的の ために、その配列にギャップを人為的に導入する必要があり得る。最適な整列が 設定されたら、位置の全体数に対して、両方の配列のアミノ酸が同一である位置 を全て記録することにより、相同性度を確立する。 従って、本発明のペプチドのアナログもまた、本発明の範囲内である。「アナ ログ」ペプチドは、そのポリペプチドの生物学的機能を変えない、１個またはそ れ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するものとして特徴付けられる 、別の形のペプチドである。本発明のペプチドの生物学的機能は、キャリヤーと し て抗原と一緒に使用する場合に、Ｔ−依存性免疫応答を誘引することである。 好ましい態様では、本発明のペプチドは、さらにシステイン残基を含む。その システイン残基は、配列におけるアミノ酸の１個をシステイン残基で置換するこ とにより、カルボキシ末端に、Ｎ末端に、またはアミノ酸鎖内のいずれかに位置 し得る。この置換は、Ｔ−依存性エピトープを破壊しない、またはＴ−依存性エ ピトープに影響を及ぼさないという条件で、全ての個所でなされ得る。好ましく は、システインを一方の末端に付加する。配列番号１、２、３、４、または５の １つによる配列を有するペプチドはシステインを全く含んでいないことから、シ ステインの導入が特に有用であり、これは、それがペプチドの構造を破壊または 妨害しないからである。システインは、リンカー分子との安定なカップリングの ために導入する。そのペプチドをまた、他の官能基、例えば、リジン残基のアミ ノ基、またはグルタミン酸基もしくはアスパラギン酸基のカルボキシル基によっ て結合することもできる。 本発明のペプチドは、微生物学的方法により、さらにはまた、有機合成により 製造することができる。好ましい態様では、そのペプチドを、組換え技術を使用 するか、または合成により製造する。そのペプチドの組換え製造のために、配列 番号１、２、３、４、または５の１つに記すアミノ酸配列に基づいて、ポリヌク レオチドを与えて、そのペプチドを周知の遺伝子工学技術により製造する。 本発明のペプチドを製造する他の好ましい方法は、有機合成によるものである 。そのペプチドは、当業者によく知られている方法により合成することができる 。例えば、幾つかのより小さなフラグメントを、適当なアミノ酸を結合させるこ とにより製造することができる。次いで、これらのフラグメントを結合させるこ とにより、完全なペプチドを得る。 従って、本発明のさらなる態様は、有機合成を使用して、ペプチドを製造する 方法である。好ましい態様では、好ましくはＦmocまたはＢoc化学を使用して、 完全なペプチドを固相合成により製造する。その合成を自動化ペプチド合成装置 で行って、ＦastＭoc化学を使用するのがとりわけ好ましい。 特に好ましい態様では、自動化ペプチド合成装置、および固相がＴentaＧelＳ ＲＡＭ ＳpezialであるＦastＭoc化学を使用して、先に概略を述べた配列で ある１０４merの配列番号１を合成するが、ここでは、アミノ酸をＦＭocで保護 し、そして側基を、好ましくは、以下のように保護する：アスパラギン酸、グル タミン酸、セリン、トレオニン、およびチロシンのカルボキシル基またはヒドロ キシル基は各々、Ｏ−ｔ−ブチルで保護し；ヒスチジン、アスパラギン、および グルタミンのアミノ基またはイミノ基は各々、トリチルで保護し；リジンのアミ ノ基は、ｔ−ブチルオキシカルボニルで保護し；そしてアルギニンのイミノ基は 、ＰＭＣで保護する。１−２、４、１０−１３、１７、２７、３２、４９、５９ 、６６、７５−７８、８４−８５、８８、９６−９７、および１０４−１０５サ イクルでは、二重カップリングを行うべきであり、遊離アミノ基を無水酢酸での アセチル化によりブロックする。その活性化およびカップリングは、ＨＢＴＵ／ ジイソプロピルエチルアミンの存在下に行うのが好ましい。ピペリジン脱保護の 後、無水酢酸を使用して、最終生成物のＮ末端をアセチル化する。 先に概略を述べた方法はまた、勿論、本発明のペプチドがたとえ１０４個未満 のアミノ酸または１０４個を超えるアミノ酸を有するとしても、使用することが できる。前者の場合には、最初のサイクルを幾つか省くことにより、その方法を 変更するが、後者の場合には、さらなるサイクルを幾つか加えて、さらなるアミ ノ酸を導入することにより、その方法を変更する。そのペプチドが相同なペプチ ドであるか、または配列番号１、２、３、４、もしくは５の１つで同定された配 列を有するか、またはこれらの配列の１つと相同であり、異なったアミノ酸を幾 つか有するならば、適当なアミノ酸を保護された形で各々のサイクルに使用する ことにより、その方法を適宜に改変することができる。 本発明のペプチドは、多糖類のような免疫反応性分子に対する有用なキャリヤ ーである。そのペプチドは、免疫学的「記憶」を起こすのに必要であるＴ細胞エ ピトープを与え、従って、一般的には、全ての既知の免疫反応性分子に対するキ ャリヤーとして使用して、有効なワクチンとして使用することができるコンジュ ゲートを製造することができる。 本発明の好ましい態様では、そのペプチドを多糖類に対するキャリヤーとして 使用して、免疫応答を誘引する。その多糖類は、哺乳動物、とりわけヒトにおい て免疫原性であることが知られている、いずれの多糖類でもあり得る。「多糖 類」という用語はまた、免疫原性であって、時にオリゴ糖と呼ばれる、より小さ な多糖類も包含する。コンジュゲートの部分として使用することができる多糖類 は、莢膜多糖体、リポ多糖、Ｏ−抗原、細菌もしくは真菌の膜多糖類、またはそ れらの解重合化された部分、例えば、Ｎeisseria meningitidisの多糖類 Ｃであ る。その多糖類は、１０,０００〜５００,０００の範囲内の分子量を有し得る。 天然に存在する多糖類は、普通、１００,０００〜５００,０００の範囲内の分子 量を有するが、その解重合化された形は、１０,０００程度の低分子量を有し得 る。 本発明のさらなる目的は、先に記載したようなペプチドおよび免疫反応性分子 を含んでなるコンジュゲートである。好ましい態様では、免疫反応性分子をリン カーを介してペプチドに結合させる。そのリンカーは、ペプチドおよび抗原分子 への結合に各々寄与する官能基を両端に与える。両方の官能基をブリッジに結合 させるが、その長さは、両方の部分が最適な方法で免疫系に示されるよう選択す る。そのブリッジは、別の立体障害が起こり得るほど短すぎるべきではない。一 方、両方の部分の構造を妨害しないように、長すぎるべきではない。両方の官能 基の間のブリッジの長さは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される２〜２０原子 であるのが好ましい。さらに好ましくは、そのブリッジは、Ｃ₂−Ｃ₈−アルキレ ン、フェニレン、Ｃ₇−Ｃ₁₂−アルアルキレン、Ｃ₂−Ｃ₆−アルカノイルオキシ 、およびベンジルカルボニルオキシから選択される。 そのペプチドおよび多糖類へのカップリングに使用する官能基は、この分野で 一般に使用される官能基である。カップリング法についての総説は、Ｗ.Ｅ．Ｄi ckおよびＭ.ＢeurretのＣonjugates Ｖaccines、Ｊ.Ｍ．Ｃruse、Ｒ.Ｅ. Lewis Jr編、Ｃontrib．Ｍicrobiol．Ｉmmunol．Ｂasel、Ｋarger（１９８９）１０： ４８に見い出される。そのペプチドを、アミノ酸の１つにより与えられる官能基 、例えば、アミノ基、カルボキシ基、またはヒドロキシ基によってリンカーに結 合させる。好ましい態様では、そのペプチドを、システイン残基により与えられ るチオール基によってリンカーに結合させる。その免疫反応性分子は、利用でき る官能基によってスペーサーに結合させることができる。好ましい態様では、多 糖類を免疫反応性分子として使用する場合、存在する、または糖単位に導入し たヒドロキシ基、アミノ基、もしくはカルボキシ基をカップリングに使用する。 好ましくは、そのリンカーを、エーテル、エステル、アミド、またはカルバメー ト結合によって多糖類のヒドロキシ基に、Ｎ−ＯＨ−スクシンイミジル結合によ ってアミノ基に、および／またはエステル結合によってカルボキシル基に結合さ せる。当業者に知られている方法を使用して、本発明のコンジュゲートを製造す ることができる。 本発明のコンジュゲートにより誘引される免疫応答は、Ｔ細胞依存性エピトー プおよびＢ細胞依存性エピトープの数およびアベイラビリティ、並びにそれらの 比率に依存する。本発明のコンジュゲートでは、Ｔ細胞依存性エピトープはペプ チドにより与えられるが、Ｂ細胞依存性エピトープは多糖類により与えられる。 従って、コンジュゲートの両方の部分の比率は、不可欠な特徴である。そのよう なわけで、両成分の比率は、どちらかの種類の分子がほとんど存在しないことの ないように調節すべきである。本発明の発明者により、１〜５０モル、好ましく は３〜３０モル、そして最も好ましくは５〜２０モルの多糖類の反復単位あたり 約１モルのペプチドが存在するならば、良好な結果を得ることができることが見 い出された。５０モルの反復単位あたり１モル未満のペプチドが存在するならば 、持続的な免疫応答を誘導するだけの十分なペプチド分子がないので、免疫応答 を検出することはできない。一方、１モルの反復単位あたり１モルを超えるペプ チドが存在するならば、多すぎる多糖類が免疫応答を誘引するのを立体的に妨げ るので、その結果もまた満足のゆくものではない。「反復単位」という用語は、 １〜７つの異なる糖類から成り、糖類の性質、結合位置、および糖類のアノマー 立体配置に関して異なる、多糖類内の単位を示す。 本発明のさらなる態様は、従来の担体、賦形剤、および希釈剤と一緒に、本発 明によるコンジュゲートを含んでなるワクチンである。そのコンジュゲートは、 この分野で知られているように、有効量を従来の担体、賦形剤、もしくは希釈剤 と混合するか、またはそれらで希釈するか、またはそれらに溶解する。このワク チンを使用して、乳児達、子供達、および大人達を免疫することができる。Ｎei sseria meningitidis、または莢膜多糖体を有する他の細菌により引き起こされ る、流行的に起こる疾患の制御にとりわけ有用である。本発明のワクチンの使用 は、高い抗体価をもたらす。 実施例 １ 以下の配列(配列番号１＋Ｎ末端システイン)： Cys Leu Tyr Tyr Lys Asn Tyr Arq Tyr Tyr Ala Leu Lys Ser Gly Gly Ser Val Asn Ala Pro Met Pro Glu Asn Gly Gln Thr Glu Asn ASn AsP Trp Ile Leu Met Gly Ser Thr Gln Glu Glu Ala Lys Lys Asn Ala Met Asn His Lys Asn Asn Gln Arq Ile Ser Gly Phe Ser Gly Phe Phe Gly Glu Glu Asn Gly Lys Gly His Asn Gly Ala Leu Asn Leu Asn Phe ASn Gly Lys ser Ala Gln Asn Arq Phe Leu Leu Thr Gly Gly Thr ASn Leu Asn Gly Lys Ile Ser Val Thr Gln Gly を有する１０５merの合成ペプチドの製造。 自動化ペプチド合成装置(４３１Ａ型、Ａpplied Ｂiosystems)を用いてのＦ astＭoc化学を使用して、そのペプチドを合成した。固相は、Ｃ末端アミドキャ ップのペプチドを産するＲink樹脂(０.１３ｍＭ ＴentaＧel ＳＲＡＭ Ｓpezial 、 に使用するアミノ酸のアミノ基を９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆm oc)基で保護して、側基を以下の基で保護した： アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、およびチロシンのカ ルボキシル基またはヒドロキシル基に関しては各々：Ｏ−ｔ−ブチル基； ヒスチジン、アスパラギン、およびグルタミンのアミノ基またはイミノ基に 関しては各々：トリチル基； リジンのアミノ基に関しては：ｔ−ブチルオキシカルボニル基；そして アルギニンのイミノ基に関しては：ＰＭＣ基。 その活性化およびカップリングは、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イ ル）−１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(ＨＢ ＴＵ)／ジイソプロピルエチルアミンの存在下に行った。１−２、４、１０−１ ３、１７、２７、３２、４９、５９、６６、７５−７８、８４−８５、８８、９ ６−９７、および１０４−１０５サイクルでは、二重カップリングを行って、遊 離アミノ基を無水酢酸でのアセチル化によりブロックした。最終サイクルの後、 そのペ プチドをピペリジンで脱保護し、無水酢酸を使用して、最終生成物のＮ末端をア セチル化した。 側鎖の脱保護および樹脂支持体からの切断は、２.１％(ｖ／ｖ) １,２−エタ ンジチオール、４.２％(ｖ／ｖ) チオアニソール、４.２％(ｖ／ｖ) 水、６.２ ％(ｖ／ｖ) フェノール、および８３％(ｖ／ｖ) トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)を用 いて室温で３時間行った。樹脂を濾過により除去して、その溶液が無色となるま で、トリエチルシランを滴下して加えた。次いで、その溶液を室温でさらに３時 問インキュベートした。ｔ−ブチルメチルエーテルで沈殿させ、続いて、遠心分 離して、凍結乾燥させた後、粗製のペプチド３６０mgが回収された。その粗製の ペプチド１３０mgを、５０ｍＭジチオトレイトールを含む５０ｍＭエチルモルホ リン、ｐＨ８.３ ４０mlに溶解して、室温で一晩インキュベートした。そのｐＨ を１０％ ＴＦＡで３.５に調節して、そのペプチドを、アセトニトリルのグラジ ェント(２５〜４５％(ｖ／ｖ))、０.１％ＴＦＡ(１０ml分^-1、０．３３％分^-1の グラジエント)を使用して、逆相ＨＰＬＣ(Ｐep−Ｓ、Ｃ２／Ｃ１８、細孔径１０ ０Å、１２μm２２.５mm×２５cm、Ｐharmacia)により精製した。そのペプチド を約２５％のアセトニトリルで１本のピークとして溶出して、そのピークを凍結 乾燥させた(７３mg)後、さらに使用した。ＨＰＬＣおよび質量分析法による分析 は、最終生成物の６５％以上が所望の配列に対応することを示した。Ｎ末端をア セチル化する前に除去した試料のＥdmanのＮ末端配列決定により、そのＮ末端配 列を確認した。 実施例 ２ 多糖類ペプチドコンジュゲートの製造 Ｅ．ＧotschlichらによりＪ．Ｅxp．Ｍed.、Ｎｏ １２９（１９６９）、１３ ４９−１３６５頁に記載されているような抽出法により、以下、多糖類 Ｃと呼 ぶ、Ｎeisseria meningitidisセログループ Ｃ由来の莢膜多糖類の乾燥粉末を得 た。多糖類 Ｃ １００mgを最終濃度が１１.１mg／mlとなるまで０.２Ｍ ＮaＣｌ に溶解した(溶液Ａ)。平行して、０.２Ｍ ＮaＣ１中の０.２Ｍ アジピン酸ジヒ ドラジド(ＡＤＨ)の溶液を調製した(溶液Ｂ)。０.２ＭＮaＣｌ中のエチル ジメ チル アミノプロピルカルボジイミド(ＥＤＡＣ)の０.５Ｍ溶液もまた調製した(溶液 Ｃ)。溶液Ａ ９ml、溶液Ｂ １０ml、および溶液 Ｃ １mlを一緒に混合して、５ mg／ml 多糖類 Ｃ、０.１２５Ｍ ＡＤＨ、および０.０２５Ｍ ＥＤＡＣを含む調 製物を得る。０.１Ｍ ＨＣlを加えて、そのpＨを６.５に調節した：４５分の全 反応時間の間ずっと、このpＨを保った。温度は約２０℃であった。 そのpＨを０.１Ｎ ＮaＯＨ ４０μlで７.１まで上げることにより、反応を停 止させた。その反応混合物を０.５Ｍ ＮaＣｌ、１０ｍＭホスフェート、次いで 、水に対して透析して、その後、凍結乾燥させた。 誘導体化した多糖類 Ｃの大きさをＨＰＬＣ 排除カラム ＴＳＫ ４０００(製 造業者 Ｔosohaas)で制御した。その結果は、誘導体化の間に解重合が起こらな かったことを実証した。 誘導体化の間に、反復単位の約３.４％をＮＨ₂基で誘導体化した。 凍結乾燥させた生成物を濃度が６.２５mg／mlとなるまで０.０２Ｍ リン酸塩 緩衝液、pＨ ７に溶解して、脱ガスした。スクシンイミジルマレイイミド(malei imido)ブチレート(ＧＭＢＳ)を、窒素下、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に２ ５mg／mlの濃度で溶解した後、誘導体化した多糖類 Ｃに等量を加えた。その反 応混合物を窒素下に室温で９０分間攪拌した。活性化した多糖類 Ｃをセファデ ックスＧ５０排除カラムクロマトグラフィーにより精製した。排除した画分を回 収して、限外濾過(３０Ｋ Ａmicon膜)により約７.５mg／mlとなるまで濃縮した 。 実施例 １で得られたペプチド２０mgを、窒素下、水に１０mg／mlの濃度で溶 解した。活性化した多糖類 Ｃを含む調製物１.２mlに、そのペプチド溶液１.５m lを加えると、(マレイイミド残基)／(チオール残基)の比率が２となった。その 反応混合物を攪拌しながら室温で一晩保った。次いで、メルカプトエタノール０ .０１０mlを加えることにより、未反応のマレイイミド残基を不活性化した。 コンジュゲートした生成物を４ＢＣＬセファロースカラムで精製した。溶出し た画分を糖類(シアル酸)およびペプチドの存在に関してアッセイした。両方のア ッセイで確実に応答する画分をプールした。 Ｓvennerholm Ｌ.、Ｂiochim．Ｂiophys．Ａcta（１９５７）２４：６０４に 記載されている用量法により、シアル酸残基の量を測定し、またＬowryら、Ｊ． Ｂiol．Ｃhem．(１９５１) １９３：２６５の方法により、ペプチドの量を測定 した。それは、(ペプチド)／(多糖類 Ｃの反復単位)の比率モル／モルが１：１ ８(１.８：１の重量／重量比に対応する)であることを示した。 実施例 ３ ぶ、Ｓtreptococcus pneuwniae ４型由来の莢膜多糖類の乾燥粉末を得る。多糖 類 Pneumo ４ １００mgを最終濃度が１１.１mg／mlとなるまで０.２Ｍ ＮａＣl に溶解した(溶液 Ａ)。平行して、０.２Ｍ ＮaＣl中のアジピン酸ジヒドラジド( ＡＤＨ)の溶液を０.２５Ｍの濃度に調製した(溶液 Ｂ)。０.２Ｍ ＮaＣl中のエ チル ジメチル アミノプロピル カルボジイミド(ＥＤＡＣ)の溶液もまた０.５Ｍ の濃度に調製した(溶液 Ｃ)。溶液Ａ ９ml、溶液Ｂ １０ml、および溶液 Ｃ１ml を一緒に混合して、５mg／ml多糖類 Pneumo ４、０.１２５Ｍ ＡＤＨ、および０ .０２５Ｍ ＥＤＡＣを含む調製物を得る。１Ｎ ＨＣlをpＨが４.９となるまで加 えた；３０分の全反応時間の間ずっと、このpＨを保った。温度は約２５℃であ った。 反応をＮ ＮaＯＨ ０.２８mlで停止させた。そのpＨを７.５まで上げた。その 反応混合物を０.５Ｍ ＮaＣl、次いで、水に対して透析して、その後、凍結乾燥 させた。 誘導体化した多糖類 Pneumo ４の大きさをＨＬＰＣ 排除カラム ＴＳＫ ４０ ００(製造業者 Ｔosohaas)で制御した。誘導体化の間に解重合は起こらなかった 。 誘導体化の間に、多糖類 Pneumo ４の反復単位の約８.２％を−ＮＨ₂基で誘導 体化した。 凍結乾燥させた生成物を０.０５Ｍ ＮaＣlに２.７6mg／mlの濃度で溶解して、 脱ガスした。スクシンイミジル マレイイミド ブチレート(ＧＭＢＳ)を、窒素下 、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に２５mg／mlの濃度で溶解した。窒素下、そ の 多糖類溶液１６mlに、ＧＭＢＳ溶液１.７５mlを加えた。その反応混合物を窒素 下に攪拌したまま室温で５時間放置した。活性化した多糖類 Ｐneumo ４を排除 カラム セファデックス Ｇ５０で精製した。排除した画分を回収して、３０Ｋ膜 (Ａmicon)で約７mg／mlとなるまで濃縮した。その濃縮した溶液を脱ガスした。 実施例 １で得られたペプチド２０mgを、窒素下、０.１Ｍ ＮaＣ1、０.０１Ｍ リン酸塩緩衝液 pＨ ７.５に４.６mg／mlの濃度で溶解した。一方、活性化した 多糖類 Ｐneumo 4を含む調製物１.２５mlに、そのペプチド溶液２.２mlを加える と、(マレイイミジル残基)／(チオール基)の比率が１(Ｐneumo ４−ペプチド− １ コンジュゲート)となった。反応混合物を窒素下に攪拌しながら室温で６時間 、次いで、＋４℃で一晩保った。次いで、各々の反応混合物にメルカプトエタノ ール０.００５mlを加えることにより、未反応のマレイイミジル残基を不活性化 した。 そのコンジュゲートをセファロース ４ＢＣＬカラムで精製した。溶出した画 分を糖およびペプチドの存在に関してアッセイした。両方のアッセイで確実に応 答する画分をプールした。 Ｄuboisら、Ａnal．Ｃhem．(１９５６) ３：３５０に記載されている用量法に より、糖の量を測定し、またＬowryら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．(１９５１) １９３ ：２６５の方法により、ペプチドの量を測定した。ペプチド／多糖類 モル／モ ルの反復単位の比率は、Ｐn ４−ペプチド−１ コンジュゲートに関して、１： ３０(０.４：１のｗ／ｗ比に対応する)である。 実施例 ４ Ｅ．ＧotschlichらによりＪ．Ｅxp．Ｍed.、Ｎo １２９（１９６９）、１３４ ９−１３６５頁に記載されているような抽出法により、以下、多糖類 Ａと呼ぶ 、Ｎeisseria mengitidis セログループ Ａ由来の莢膜多糖類の乾燥粉末を得る 。多糖類 Ａ １００mgを最終濃度が５mg／mlとなるまで水に溶解した(溶液 Ａ) 。平行して、水中の臭化シアン(ＣＮＢr)の溶液を６７ｍｇ／mlの濃度に調製し た(溶液Ｂ)。０.５Ｍ ＮaＨＣＯ₃中のアジピン酸ジヒドラジド(ＡＤＨ)の溶液も また１５０mg／mlの濃度に調製した(溶液 Ｃ)。溶液Ａ ２０ml、および溶液 Ｃ ０.７５mlを一緒に混合して、多糖類／ＣＮＢrの重量／重量比が１である調製物 を得た。０.１Ｎ ＮaＯＨをpＨが１０.８となるまで加えた；６０分の全反応時 間の問ずっと、このｐＨを保った。温度は約２０℃であった。 次いで、０.１Ｎ ＨＣ１０.１５mlを加えることにより、そのｐＨを８.５まで 下げた。溶液 Ｃ１.１７mlをＡＤＨ／多糖類の重量／重量比が３.５となるよう に加えた。１５分間ずっと、そのpＨを保った。次いで、その反応混合物を攪拌 したまま＋４℃で一晩放置した。１Ｎ ＨＣ１０.１mlを加えて、そのｐＨを７ま で下げた。その反応混合物を０.５Ｍ ＮaＣl、次いで、水に対して透析して、そ の後、凍結乾燥させた。 誘導体化した多糖類 Ａの大きさをＨＬＰＣ 排除カラム ＴＳＫ ４０００(製 造業者Ｔosohaas)で制御した。誘導体化の間に解重合は起こらなかった。 誘導体化の間に、多糖類 Ａの反復単位の約２.５％を−ＮＨ₂基で誘導体化し た。 次いで、実施例 ２と同じ方法を使用して、誘導体化した多糖類 Ａを活性化し て、活性化した多糖類 Ａを実施例 １で得られたペプチドにコンジュゲートした 。 実施例 ５ 実施例 ２で得られたコンジュゲートと他の生成物との比較 実施例 １のペプチドの、多糖類コンジュゲートにおけるキャリヤーとしての 有用性を以下のように実証する： ６週齢のＮＭＲＩマウスに、以下の組成物の１つを、０.５ml体積で皮下経路 によって(各々、注射)、またアジュバントを使用する場合には、腹腔内経路によ って投与した： （ａ）アジュバントの不存在下、１日目、１５日目、および２９日目に、多糖 類 Ｃ(ペプチドを含んでいない)５μg； （ｂ）１日目には、フロイント完全アジュバントと一緒に、そして１５日目お よび２９日目には、フロイント不完全アジュバントと一緒に、多糖類 Ｃ(ペプチ ドを含んでいない)５μg； （ｃ）１日目には、フロイント完全アジュバントと一緒に、そして１５日目お よび２９日目には、フロイント不完全アジュバントと一緒に、多糖類 Ｃ ５μg およびペプチド９μg； （ｄ）アジュバントの不存在下、１日目、１５日目、および２９日目に、多糖 類 Ｃ １μgおよびペプチド１.８μgを含む、実施例２で得られたコンジュゲー ト； （ｅ）アジュバントの不存在下、１日目、１５日目、および２９日目に、多糖 類 Ｃ ５μgおよびペプチド９μgを含む、実施例２で得られたコンジュゲート、 ； （ｆ）１日目には、フロイント完全アジュバントと一緒に、多糖類５μgおよ びペプチド９μgを含む、実施例 ２で得られたコンジュゲート、そして１５日目 および２９日目には、フロイント不完全アジュバントと一緒に、実施例 ２で得 られたコンジュゲート；そして （ｇ）ジフテリアアナトキシンと一緒に、多糖類 Ｃ ５μgのコンジュゲート 。 (最初に免疫化した日から計算して)１５日目、２９日目、および４３日目に、 血液試料を採取して、抗多糖類 Ｃ抗体をＥＬＩＳＡにより滴定する。 その結果を以下の表に要約する。 各々の場合において、コンジュゲートしていない多糖類 Ｃに対する抗体応答 は非常に弱いが、ＤＴまたはペプチドのいずれかにコンジュゲートした多糖類 Ｃに対する応答は満足のゆくものである。本発明のコンジュゲートを用いて、２ 回目に注射した後、免疫応答に必要であるブースター効果を得る。コンジュゲー トである多糖類 Ｃ − ペプチドの応答は、多糖類 Ｃ − ＤＴのコンジュゲート で得られる応答と同等である。 実施例 ６ 実施例 ５と同じプロトコルを使用して、ペプチド：多糖類の比率(ｗ／ｗ)が ０.４：１(１：３０の、反復単位(モル)あたりのペプチド(モル)の比率に対応す る)である、実施例３で製造したコンジュゲートをマウスにおいて試験した。そ れは、アジュバントの存在下、マウスにおいて免疫原性であり、２回目に注射し た後、ブースター効果をもたらした。その結果は、以下の表２から理解すること ができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アハトマン，マルク ドイツ連邦共和国デー―10696ベルリン、 ノイエンブルガー・シュトラーセ16番 (72)発明者 モロー，モニク フランス、エフ―69007リヨン、リュ・ガ リバルディ324番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．４０〜２００個のアミノ酸残基を有するペプチドであって、配列番号１に 示すアミノ酸配列の、１〜５のいずれか１つに位置するアミノ酸残基で始まり、 ４０〜１０４のいずれか１つに位置するアミノ酸残基で終わる、少なくとも４０ 個のアミノ酸を含んでなるペプチド、または相同配列。 ２．１〜５のいずれか１つに位置するアミノ酸残基で始まり、４０〜１０４の いずれか１つに位置するアミノ酸残基で終わる、配列番号２のアミノ酸配列； １〜５のいずれか１つに位置するアミノ酸残基で始まり、４０〜１０４のいず れか１つに位置するアミノ酸残基で終わる、配列番号３のアミノ酸配列； １〜５のいずれか１つに位置するアミノ酸残基で始まり、４０〜１０４のいず れか１つに位置するアミノ酸残基で終わる、配列番号４のアミノ酸配列；および １〜５のいずれか１つに位置するアミノ酸残基で始まり、４０〜１０４のいず れか１つに位置するアミノ酸残基で終わる、配列番号５のアミノ酸配列； よりなる群から選択されるアミノ酸配列と同一または相同であるアミノ酸配列を 含んでなる、請求項１に記載のペプチド。 ３．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５の アミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％が同一であるアミノ酸配列を有 する、少なくとも４０個のアミノ酸を含んでなる、請求項１または請求項２に記 載のペプチド。 ４．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の アミノ酸配列の、１〜５のいずれか１つに位置するアミノ酸残基で始まり、７０ 〜１０４のいずれか１つに位置するアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列と同一ま たは相同であるアミノ酸配列を有する、少なくとも７０個のアミノ酸残基を含ん でなる、前述の請求項のいずれかに記載のペプチド。 ５．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の アミノ酸配列の、１〜５のいずれか１つに位置するアミノ酸残基で始まり、１０ ０〜１０４のいずれか１つに位置するアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列と同一 または相同であるアミノ酸配列を有する、少なくとも１００個のアミノ酸残基を 含んでなる、前述の請求項のいずれかに記載のペプチド。 ６．配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。 ７．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％が同一であるアミノ酸配列 を含んでなる、請求項１に記載のペプチド。 ８．さらにシステイン残基を含む、前述の請求項のいずれかに記載のペプチド 。 ９．システイン残基がペプチド配列の一方の末端に位置する、請求項８に記載 のペプチド。 １０．有機合成を使用する、請求項１に記載のペプチドを製造する方法。 １１．ＦmocまたはＢoc化学、および自動化ペプチド合成装置を使用して、そ の合成を行う、請求項１０に記載の方法。 １２．ＦastＭoc化学を使用する、請求項１１に記載の方法。 １３．アミノ酸のアミノ基を９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆmoc )基で保護し、そして側基を以下の基で保護し：アスパラギン酸、グルタミン酸 、セリン、トレオニン、およびチロシンのカルボキシル基またはヒドロキシル基 を各々、Ｏ−ｔ−ブチルで保護し；ヒスチジン、アスパラギン、およびグルタミ ンのアミノ基またはイミノ基を各々、トリチルで保護し；リジンのアミノ基を、 ｔ−ブチルオキシカルボニルで保護し；そしてアルギニンのイミノ基を、ＰＭＣ で保護し； その活性化およびカップリングをＨＢＴＵ／ジイソプロピルエチルアミンの存 在下に行い；そして そのペプチドをピペリジンで脱保護し、無水酢酸を使用して、最終生成物のＮ 末端をアセチル化する； 請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。 １４．二重カップリングおよび無水酢酸でのアセチル化を、１−２、４、１０ −１３、１７、２７、３２、４９、５９、６６、７５−７８、８４−８５、８８ 、９６−９７、および１０４−１０５サイクルで使用する、請求項１０または１ ３のいずれかに記載の方法。 １５．固相がＴentaＧel Ｓ ＲＡＭ Ｓpezialである、請求項１０〜１４のい ずれかに記載の方法。 １６．システイン単位をペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に加える、請 求項１０〜１５のいずれかに記載の方法。 １７．コンジュゲートに対するキャリヤーとしての、請求項１〜９のいずれか に記載のペプチドの使用。 １８．リポ多糖、Ｏ−抗原、または細菌、莢膜、もしくは真菌の膜多糖類から 選択される多糖類に対するキャリヤーとしての、請求項１〜９のいずれかに記載 のペプチドの使用。 １９．Ｎeisseria meningitidisの多糖類 Ｃに対するキャリヤーとしての、請 求項１〜９のいずれかに記載のペプチドの使用。 ２０．請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド、および免疫反応性分子を含 んでなるコンジュゲート。 ２１．免疫反応性分子が多糖類である、請求項２０に記載のコンジュゲート。 ２２．追加のシステイン残基、二官能性リンカー、および多糖類と共に、請求 項１〜９のいずれかに記載のペプチドを含んでなり、そのペプチドがシステイン のチオール基によってリンカーに結合し、またその多糖類がヒドロキシ基、カル ボキシ基、またはアミノ基によってリンカーの他の官能基に結合する、請求項２ ０または２１に記載のコンジュゲート。 ２３．多糖類がＮeisseria meningitidisの多糖類 Ｃである、請求項２０〜２ ２のいずれかに記載のコンジュゲート。 ２４．多糖類の反復単位の５０〜１モルあたり１モルのペプチドが存在する、 請求項２０〜２３のいずれかに記載のコンジュゲート。 ２５．従来の担体、賦形剤、および／または希釈剤と一緒に、請求項２０〜２ ４のいずれかに記載のコンジュゲートを含んでなるワクチン。