KR20000064740A - 담체 펩티드로서의 아이쥐에이1 프로테아제 단편 - Google Patents

담체 펩티드로서의 아이쥐에이1 프로테아제 단편 Download PDF

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마르크 아히트만
모니끄 모로
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막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우.
파스뙤르 므리외 세롬 에 박셍 소시에떼 아노뉨
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Abstract

본 발명은 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열에서 위치 1 내지 5중 어느 하나의 아미노산 잔기에서 시작되고, 위치 40 내지 104중의 어느 하나의 아미노산 잔기에서 끝나는 40개 이상의 아미노산의 서열 또는 그 상동성 서열을 포함하는 40개 내지 200개의 아미노산 잔기를 가진 IgA1-프로테아제 단편, 이 단편을 접합체, 특히 다당류와의 조합체 형태인 접합체에 대한 담체로서 사용하는 용도, 이 펩티드를 제조하는 방법 및 이 펩티드를 함유하는 백신에 관한 것이다.

Description

담체 펩티드로서의 아이쥐에이1 프로테아제 단편
다당류는 그람-양성 박테리아 및 그람-음성 박테리아에 협막(capsule)으로서, 그리고 박테리아 및 진균류의 세포벽의 구성 성분으로서 존재한다. 나이제리아(Neisseria), 스트렙토코커스(Streptococcus), 클렙시엘라(Klebsiella), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella) 및 헤모필러스(Haemophilus) 속의 다양한 종들이 병원성이 있으며, 다양한 인간 질병, 예를 들면, 유행성 수막염, 이염(耳炎), 폐렴 및 설사의 원인이 된다. 이러한 질병들은 심각한 세계적인 아동 공중 보건 문제를 나타내며, 그러므로, 이들 질병에 대한 예방책을 가지는 것이 중요하다.
다당류 거대분자는 면역원성을 조절할 수 있는 당류의 단위 분자로 구성된다. 그러므로, 박테리아의 다당류 또는 그것의 부분은 인간의 면역화에 사용되어 왔다. 이들 백신은 아동 및 성인에서 면역원성이 있고 보호성 항체를 유발할 수 있지만, 이들이 T-세포와 무관한 면역 반응을 단지 유도만 할 수 있기 때문에, 이들 백신은 유아의 보호에는 적합하지 못하다. 따라서, 협막의 다당류와의 접촉은 기억 반응을 유도하지 않으며, 지속적인 보호를 초래하지도 않는다. 더욱이, 유아에서는 면역 반응을 유도할 수 없다.
T-세포와 무관한 면역 반응의 문제를 극복하기 위해, T-무관성 항원으로서의 다당류를 T-의존성 항원으로서의 단백질 담체에 공유적으로 접합시키는 방법을 사용하여 왔고, 이는 이 결함의 극복에 성공적인 것으로 확인되었다. 그러한 접합체를 사용한 면역화에 의해 T-세포 의존성 항체 반응이 유도된다. 그러나, 인간에게 유용한 담체 단백질의 선택은 매우 제한적이고, 대부분의 경우에, 다당류는 파상풍 톡소이드, 콜레라 톡소이드 또는 디프테리아 톡소이드에 연결되었다. 상기 톡소이드를 담체로서 무제한적으로 또는 과도하게 사용하면 이 유형의 담체에 연결된 다당류에 대한 후속 반응을 억제하는 것으로 생각된다. 담체에 대한 기존 항체에 의한 면역 반응의 그러한 억제는 장래에는 문제가 될 것으로 예상된다.
이러한 유형의 접합체와 관련하여 신규의 담체 단백질의 선택을 제한하는 또 다른 문제는 그 단백질이 비독성으로 되거나 또는 해독되어야 한다는 점이다.
또한, 공지의 펩티드-다당류 접합체는 면역 반응을 증강시키는 보조제를 사용할 필요가 있다는 결점을 안고 있다. 그러나, 다수의 공지된 보조제는 인간에게는 적용할 수 없는데, 그 이유는 이들 보조제가 염증 반응을 유발할 수 있기 때문이다. 지금까지, 단 하나의 보조제, 즉 알루미늄 겔만이 인간에게 허용되고 있다.
본 발명은 신규의 펩티드, 접합체(conjugate), 특히 다당류와의 조합체 형태의 접합체에 대한 담체(carrier)로서의 그 펩티드의 용도, 그 펩티드의 제조 방법 및 그 펩티드를 함유하는 백신에 관한 것이다.
그러므로, 본 발명의 목적은 면역원성이 매우 크고, T-세포 의존성 면역 반응을 유발할 수 있고, 포유동물에서 장기간 지속되는 기억을 야기하며, 보조제의 사용을 피할 수도 있는 신규의 담체 분자를 제공하는 것이었다. 이러한 목적 및 추가의 목적은 하기의 상세한 설명에 의해 명백해질 것이며, 그것은 40개 이상의 아미노산을 가진 신규의 펩티드를 사용함으로서 달성될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 제1 양태로 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열 중에서 위치 1 내지 5중 어느 하나의 아미노산에서 시작되고, 위치 40 내지 104중의 어느 하나의 아미노산에서 끝나는 40개 이상의 아미노산의 서열 또는 그 상동성 서열을 포함하는 40개 내지 200개의 아미노산 잔기를 가진 펩티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 상기 신규의 펩티드를 접합체에 대한 담체로서 사용한다.
놀랍게도, 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5중 하나의 N-말단 아미노산을 40개 이상 포함하는 펩티드가 발견되었는데, 이 펩티드는 나이제리아에서 유래한 IgA1 프로테아제의 일부 또는 그 상동 서열이며, 보조제를 사용하지 않을 때조차 장기간 지속되는 T-세포 의존성 면역 반응을 유도하는 항원에 대한 담체로서 사용할 수 있다. 그러한 소형 펩티드가 면역원성 접합체에 대한 담체로서 유용할 수 있다는 것은 예견할 수 없었다.
이러한 소형 펩티드의 사용은 지금까지 사용된 담체들과 관련하여 다수의 장점을 가진다. 단지 소형의 펩티드이기 때문에, 그 펩티드는 합성법으로 제조할 수 있고, 다당류와 같은 면역원으로서 사용되는 모든 유형의 화합물에 접합될 수 있으며, 특히 나이제리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)와 같은 나이제리아, 또는 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)와 같은 헤모필러스에서 유래한 다당류와 조합체 형태로 유용하다. 그러므로, 그 펩티드는 아동 및 성인 뿐만 아니라, 유아용 백신의 제조에 유용하다.
본 발명의 펩티드는 나이제리아 속의 병원성 박테리아에 의해 생성된 IgA1 프로테아제의 일부이다. IgA1 프로테아제는 박테리아에 대한 보호 수단으로서 숙주에 의해 생성된 IgA1 항체를 분해하는 효소이다. IgA1 프로테아제가 면역 반응을 유발할 수 있다는 것이 알려져 있지만, 그러한 프로테아제의 담체로서의 사용은 고려되지 않았는데, 그 이유는 한편으로는 그 프로테아제가 큰 분자이기 때문이고, 다른 한편으로는 그 프로테아제는 면역화하고자 하는 인간의 면역계에 부정적인 영향을 끼치기 때문이다. 이와 대조적으로, 상기 펩티드는 그러한 효소적 효과를 갖지 않는다.
본 발명의 펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 서열중의 하나의 서열에서 40개 이상의 아미노산, 바람직하게는 50개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 70개 이상의 아미노산, 그리고 가장 바람직하게는 104개 아미노산 모두 또는 이들의 상동성 서열을 포함한다. 펩티드는 서열번호 1의 104량체인 것이 가장 바람직하다.
상기 펩티드는 또한 104개 이상의 아미노산을 가질 수도 있다. 서열번호 1, 2, 3, 4 및 5에 예시한 서열은 기타의 아미노산을 간섭하거나, T-에피토프에 영향을 끼치거나 또는 펩티드의 처음 40개의 N-말단 아미노산의 구조를 변형시키지 않는 추가의 아미노산에 의해 연장될 수 있다. 그 서열은 카르복시 말단 뿐만 아니라 N-말단상에서 연잘될 수 있다. 상기 펩티드는 약 40개 이상 약 200개 이하의 아미노산을 가져야 한다. 펩티드가 40개 아미노산보다 적으면, 그것은 담체로서 적합하지 않으며, 담체로서 그 펩티드를 사용한 경우 지속적인 면역화는 일어나지 않을 것이다. 한편, 200개보다 많은 아미노산을 가진 펩티드는 합성하기가 어렵다. 70개보다 많은 아미노산을 가진 펩티드는 향상된 항원성을 가진 것으로 확인되었으며, 가장 바람직한 펩티드는 서열번호 1의 104개 아미노산을 가진 펩티드이다. 이 서열은 나이제리아 메닌지티디스의 혈청군 A, 아군 III인 균주 Z3906에서 유래한 IgA1 프로테아제의 일부이며, 그것은 젠뱅크 승인번호 X82474의 서열과 동일하다.
본 발명의 펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5중 하나의 아미노산 서열을 가진 펩티드와 동일하거나 상동성인 것이 바람직하다. 이 펩티드가 전술한 아미노산 서열중의 하나와 85% 이상 동일한 것이 바람직하고, 90% 동일한 것이 보다 바람직하며, 95% 동일한 것이 특히 바람직하다. 가장 바람직한 양태에서, 펩티드는 전술한 아미노산 서열, 특히 서열번호 1과 100% 동일하다.
서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5에 나타낸 서열중 하나와 상동성인 서열을 가진 펩티드 역시 본 발명의 범위내에 속한다. 서열번호 2는 나이제리아 메닌지티디스의 혈청군 C, ET-37 복합체인 균주 Z4400에서 유래한 서열이다. 서열번호 3은 나이제리아 메닌지티디스의 혈청군 A, 아군 III인 균주 Z3524에서 유래한 서열이다. 서열번호 4는 스위스프로트에서 입수한 서열 S09386에서 유래한 서열이다. 서열번호 5는 EP-A 254090호에 공개된 나이제리아 고너리아(N. gonorrhoeae) 균주 MS11에서 유래한 서열이며, 이것은 젠뱅크 승인번호 A02796의 서열과 동일하다.
본 명세서 및 특허 청구 범위에서 사용하고 있는 "상동성"이란 용어는 당해 서열과 80% 이상 동일한 서열을 말한다. 펩티드의 상동성은 통상 서열 분석 소프트웨어(예; 위스콘신주 53705 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710 소재의 유니버시티 오브 위스콘신 바이오테크놀로지 센터의 제네틱스 컴퓨터 그룹의 서열 분석 소프트웨어 패키지)를 사용하여 측정한다. 최대의 상동성도를 얻기 위하여 유사한 아미노산 서열을 배열한다. 이 목적으로, 갭을 서열내로 임의로 도입할 필요가 있다. 최적 배열이 이루어지면, 상동성도는 양 서열의 아미노산들이 위치들의 총 갯수에 상대적으로 동일한 위치를 모두 기록함으로써 확립된다.
따라서 본 발명의 펩티드의 유사물 역시 본 발명의 범위내에 속한다. "유사물" 펩티드는 폴리펩티드의 생물학적 기능을 변화시키지 않는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드의 또 다른 형태이다. 본 발명의 펩티드의 생물학적 기능은 항원과 함께 담체로서 사용할 경우 T-의존성 면역 반응을 유발하는 것이다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 펩티드는 부가로 시스테인 잔기를 포함한다. 시스테인 잔기는 시스테인 잔기에 의해 서열내 아미노산중의 하나를 치환함으로써, 카르복시 말단에, N-말단에 또는 아미노산 쇄내에 위치할 수 있다. 이 치환은 T-의존성 에피토프가 파괴되거나 형향을 받지 않을 것을 조건으로 모든 위치에서 행해질 수 있다. 시스테인을 말단중의 하나에 첨가하는 것이 바람직하다. 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5중의 하나에 따른 서열을 가진 펩티드가 어떠한 시스테인도 함유하지 않을 때, 시스테인의 도입이 특히 유용한데, 그 이유는 시스테인이 펩티드의 구조를 파괴하거나 또는 방해하지 않기 때문이다. 시스테인은 링커 분자와의 안정한 연결(couplinf)을 위해 도입된다. 펩티드를 기타 작용기, 예를 들면, 라이신 잔기의 아미노기 또는 글루타민산 또는 아스파라긴산의 카르복실기를 통해 연결할 수도 있다.
본 발명의 펩티드는 유기 합성 뿐만 아니라, 미생물학적 방법으로 제조할 수 있다. 바람직한 양태에서, 펩티드는 재조합 기술 또는 합성법으로 제조한다. 재조합에 의한 펩티드의 제조의 경우에는, 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5중의 하나에 제시된 아미노산 서열에 근거하여 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 유전공학의 널리 공지된 기술에 따라 펩티드를 제조한다.
본 발명의 펩티드를 제조하는 기타 바람직한 방법은 유기 합성법을 이용하는 방법이다. 펩티드는 당해 분야의 숙련자에게는 널리 공지된 방법으로 합성할 수 있다. 예를 들면, 일부의 보다 작은 단편들은 적합한 아미노산을 연결함으로써 제조할 수 있다. 완전한 펩티드는 이들 단편들을 연결함으로써 수득할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 또 다른 양태는 유기 합성법을 사용하여 펩티드를 제조하는 방법이다. 바람직한 양태에서, 완전 펩티드는 Fmoc 또는 Boc 화학을 사용하는 것이 바람직한 고체상 합성법으로 제조한다. 자동화된 펩티드 합성기를 사용하여 합성을 수행하고 FastMoc 화학을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
특히 바람직한 양태에서, 상기에 그 서열의 개요를 설명한 서열번호 1의 104량체는 자동화된 펩티드 합성기 및 FastMoc 화학을 사용하여 합성되는데, FastMoc 화학에서는 고체상이 텐타겔(TentaGel) S RAM 스페지얼(Spezial)이고, 아미노산은 FMoc 보호되며, 측쇄는 다음과 같이 보호되는 것이 바람직하다: 아스파라긴산, 글루타민산, 세린, 트레오닌 및 티로신의 카르복실 및 히드록실기를 O-t-부틸로; 히스티딘, 아스파라긴 및 글루타민의 아미노기 또는 이미노기를 트리틸로; 라이신의 아미노기를 t-부틸옥시카르보닐로; 및 아르기닌의 이미노기를 PMC로 보호한다. 사이클 1, 2, 4, 10-13, 17, 27, 32, 49, 59, 66, 75-78, 84, 85, 88, 96, 97 및 104-105에서, 이중 연결(double coupling)을 실행해야 하고, 유리 아미노기는 아세트산 무수물로 아세틸화하여 차단한다. 활성화 및 연결은 HBTU/디이소프로필에틸아민의 존재하에 수행하는 것이 바람직하다. 피페리딘 탈보호후, 최종 생성물은 아세트산 무수물을 사용하여 N-말단을 아세틸화한다.
물론, 본 발명의 펩티드가 104개 아미노산보다 적거나 또는 그보다 많은 경우에는 상기에서 요약한 방법을 이용할 수 있다. 전자의 경우, 공정은 제1 사이클의 일부를 생략함으로써 변화시키는 반면에, 후자의 경우에는, 공정은 일부 추가 사이클을 첨가함으로써 변화시켜 추가의 아미노산을 도입시킨다. 펩티드가 상동성 펩티드이거나, 서열번호 2, 3, 4 또는 5중의 하나에서 확인되는 서열을 가지거나, 또는 상기 서열중의 하나와 상동성이면서 일부 상이한 아미노산을 가지는 경우, 공정은 각각의 사이클에 대해 보호되는 형태로 적합한 아미노산을 사용하여 상응하rp 변형시킬 수 있다.
본 발명의 펩티드는 다당류와 같은 면역 반응성 분자에 대한 유용한 담체이다. 그 펩티드는 면역학적 "기억"을 생성시키는 데에 필요한 T-세포 에피토프를 제공하며, 그러므로, 일반적으로 모든 공지된 면역 반응성 분자에 대한 담체로서 사용하여, 효율적인 백신으로 사용될 수 있는 접합체를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 펩티드는 다당류에 대한 담체로서 사용하여 면역 반응을 유도한다. 상기 다당류는 포유동물, 특히 인간에서 면역원성인 것으로 공지된 임의의 다당류일 수 있다. "다당류"란 용어는 올리고당으로 종종 지칭되고 면역원성이 있는 보다 작은 다당류를 포함하는 개념이다. 접합체의 일부로서 사용될 수 있는 다당류는 협막 다당류, 지다당류, O-항원, 박테리아 또는 진균류의 막 다당류 또는 그 해중합된(depolymerized) 부분, 예를 들면, 나이제리아 메닌지티디스의 다당류 C이다. 다당류는 그 분자량 범위가 10,000 내지 500,000일 수 있다. 자연 발생적 다당류는 정상적으로는 그 분자량 범위가 100,000 내지 500,000인 반면에, 그 해중합된 형태는 10,000처럼 보다 낮은 분자량을 가질 수도 있다.
본 발명의 추가의 목적은 상기한 펩티드 및 면역 반응성 분자를 포함하는 접합체이다. 바람직한 양태에서, 면역 반응성 분자는 링커를 통해 펩티드에 연결된다. 그 링커는 각각 펩티드 및 항원성 분자에의 결합을 제공하는 두 단부에 작용기를 제공한다. 두 작용기는 브리지에 연결되는데, 브리지의 길이는 두 부분이 최적의 방법으로 면역계에 제공되도록 선택된다. 브리지는 입체적 간섭 작용이 일어날 수 있을 만큼 너무 짧아서는 안 된다. 한편, 브리지는 두 부분의 구조를 간섭하지 않을 만큼 너무 길어서도 안 된다. 두 작용기 사이에 브리지의 길이는 C, N, O 및 S중에서 선택되는 2개 내지 20개 원자인 것이 바람직하다. 브리지는 C2-C8-알킬렌, 페닐렌, C7-C12-아르알킬렌, C2-C6-알카노일옥시 및 벤질카르보닐옥시중에서 선택되는 것이 보다 더 바람직하다.
펩티드 및 다당류에 연결시키기 위해 사용되는 작용기는 당해 분야에서 통상 사용되는 그러한 작용기들이다. 연결 방법에 대한 검토는 문헌[W.E. Dick 및 M. Beurret, Conjugates Vaccins, J.M. Cruse, R.E. Lewis Jr 편집, Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger (1989) 10:48]에서 확인된다. 펩티드는 하미노산들중 하나에 의해 제공되는 작용기, 예를 들면, 아미노기, 카르복시기 또는 히드록시기를 통해 링커에 결합된다. 바람직한 양태에서, 펩티드는 시스테인 잔기에 의해 제공되는 티올기를 통해 링커에 결합된다. 면역 반응성 분자는 이용 가능한 작용기를 통해 스페이서에 결합시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, 면역 반응성 분자로서 다당류를 사용할 경우, 당 단위에 존재하거나 또는 당 단위에 도입된 히드록시기, 아미노기 또는 카르복시기를 연결에 사용한다. 링커는 에테르, 에스테르, 아미드 또는 카르바메이트 연결체를 통해 다당류의 히드록시기에, N-OH-숙신이미딜 연결체를 통해 아미노기에, 및/또는 에스테르 연결체를 통해 카르복실기에 결합된다. 본 발명의 접합체는 당해 분야의 숙련자에게 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 접합체에 의해 유도된 면역 반응은 T-세포 의존성 및 B-세포 의존성 에피토프의 수 및 이용 가능성 및 그 비율에 의해 좌우된다. 본 발명의 접합체에서, T-세포 의존성 에피토프는 펩티드에 의해 제공되는 반면, B-세포 의존성 에피토프는 다당류에 의해 부여된다. 그러므로, 접합체의 두 부분의 비가 본질적인 특징이다. 따라서, 두 성분의 비는 어느 한 종류의 분자가 너무 적게 존재하지 않도록 조정되어야 한다. 본 발명의 발명자들에 의해 다당류의 반복 단위 1몰 내지 50몰, 바람직하게는 3몰 내지 30몰, 가장 바람직하게는 5몰 내지 20몰당 상기 펩티드가 약 1몰 존재하는 경우에 양호한 결과를 수득할 수 있음이 밝혀졌다. 반복 단위 50몰당 펩티드가 1몰 미만으로 존재하면, 면역 반응은 검출되지 않았는데, 그 이유는 펩티드 분자가 지속적인 면역 반응을 유도하기에는 충분하지 않기 때문이다. 한편, 반복 단위의 1몰당 펩티드 1몰이 존재하는 경우에도 역시 결과는 만족스럽지 않았는데, 그 이유는 너무 많은 다당류가 입체적으로 간섭되어 면역 반응을 유발할 수 없기 때문이다. "반복 단위"란 용어는 1개 내지 7개의 상이한 당으로 구성되고, 당의 성질, 연결체의 위치 및 당의 아노머 입체 형태와 관련하여 상이한 다당류내의 단위를 의미한다.
본 발명의 또 하나의 양태는 백신인데, 이것은 통상의 담체, 부형제 및 희석제와 함께 본 발명에 따른 접합체를 함유하는 백신이다. 접합체는 당해 분야에서 유효량으로 공지되어 있는 대로 통상의 담체, 부형제 또는 희석제와 혼합되거나 또는 그들내에 희석 또는 용해된다. 이 백신은 유아, 아동 및 성인을 면역화하는 데에 사용할 수 있다. 나이제리아 메닌지티디스 또는 협막 다당류를 보유하는 기타 박테리아에 의해 야기된 전염성 질병의 구제에 특히 유용하다. 본 발명의 백신을 사용함으로써 높은 항체 역가를 수득한다.
실시예 1
하기의 서열(서열번호 1 + N-말단 시스테인)을 가진 합성 105량체 펩티드의 제조:
상기 펩티드는 자동화된 펩티드 합성기(모델 431A, 어플라이드 바이오시스템스)과 함께 FastMoc 화학을 사용하여 합성하였다. 고체상은 C-말단 아미드 캐핑된 펩티드를 산출하는 링크(Rink) 수지(텐타겔 S RAM 스페지얼 0.13 mM, 랩 폴리머레(Rapp Polymere) 0.15 mM/g, 독일 튀빙겐)였다. 합성에 사용된 아미노산의 아미노기는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)기로 보호하고, 측쇄는 다음 기들로 보호하였다: 아스파라긴산, 글루타민산, 세린, 트레오닌 및 티로신의 카르복실기 또는 히드록실기에 대해서는 O-t-부틸기로; 히스티딘, 아스파라긴 및 글루타민의 아미노기 또는 이미노기에 대해서는 트리틸기로; 라이신의 아미노기에 대해서는 t-부틸옥시카르보닐기로; 그리고 아르기닌의 이미노기에 대해서는 PMC기로 보호한다.
활성화 및 연결은 2-(1-H-벤조트리아졸-1-일)-1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU)/디이소프로필에틸아민의 존재하에 수행하였다. 사이클 1, 2, 4, 10-13, 17, 27, 32, 49, 59, 66, 75-78, 84, 85, 88, 96, 97 및 104-105에서, 이중 연결을 실행하고, 유리 아미노기는 아세트산 무수물로 아세틸화하여 차단하였다. 마지막 사이클에서, 펩티드는 피페리딘으로 탈보호하고, 최종 생성물은 아세트산 무수물을 사용하여 N-말단 아세틸화한다.
수지 지지체로부터 측쇄 탈보호 및 절단은 실온에서 3 시간 동안 2.1%(v/v)의 1,2-에탄디티올, 4.2%(v/v)의 티오아니솔, 4.2%(v/v)의 물, 6.2%(v/v)의 페놀 및 83%(v/v)의 트리플루오로아세트산(TFA)를 사용하여 수행하였다. 수지는 여과에 의해 제거하고, 용액이 무색이 될 때까지 트리에틸실란을 적하 방식으로 첨가하였다. 그 다음, 용액을 실온에서 3시간 더 항온처리하였다. t-부틸메틸에테르로 침전시키고, 원심분리하고 동결건조시켜 미정제 펩티드 360 ㎎을 회수하였다. 미정제 펩티드 130 ㎎을, 50mM 디티오트레이톨을 함유하는 50 mM 에틸모폴린(pH 8.3) 40 ㎖에 용해시키고, 실온에서 하루밤 동안 항온처리하였다. pH를 10% TFA를 사용하여 3.5로 조정하고, 아세토니트릴 구배(25%(v/v) 내지 45%(v/v)), 0.1% TFA(10 ㎖/min, 0.33%/min의 구배)를 사용하여 펩티드를 역상 HPLC(Pep-S, C2/C18, 100Å의 소공 크기, 12 ㎛의 22.5 ㎜ × 25 ㎝, 파마시아)에 의해 정제하였다. 펩티드는 약 25%의 아세토니트릴에서 하나의 피크로서 용출되었고, 그 피크는 추후의 사용전에동결건조시켰다(73 ㎎). HPLC 및 질량 분광분석에 의한 분석으로부터 최종 생성물의 65% 이상이 목적하는 서열에 상응하였음을 알 수 있었다. N-말단 서열은 N-말단 아세틸화 전에 제거된 샘플의 N-말단 에드먼 서열분석에 의해 확인하였다.
실시예 2
다당류 펩티드 접합체의 제조
문헌[E. Gotschlich 등, J. Exp. Med., No 129(1969), 1349-1365면]에 기재된 추출 방법에 의해, 하기에서 다당류 C로서 지칭되는 나이제리아 메닌지디티스 혈청군 C로부터 협막 다당류의 건조 분말을 수득하였다. 다당류 C 100 ㎎을 0.2M NaCl에 용해시켜 최종 농도를 11.1 ㎎/㎖(용액 A)로 만들었다. 병행하여, 0.2M NaCl중의 0.2M 아디프산 디히드라지드(ADH)의 용액을 제조하였다(용액 B). 0.2 M NaCl중의 에틸 디메틸 아미노프로필 카르보디이미드(EDAC)의 0.5 M 용액도 제조하였다(용액 C). 용액A 9 ㎖, 용액B 10 ㎖ 및 용액C 1 ㎖를 함께 혼합하여 다당류 C 5 ㎎/㎖, 0.025M ADH 및 0.025M EDAC를 함유하는 제제를 수득하였다. 0.1M HCl을 첨가하여 pH를 6.5로 조정하고; 이 pH를 45분의 전체 반응 시간 동안 유지하였다. 온도는 약 20℃였다.
pH를 7.1로 상승시킨 0.1N NaOH 40㎕에 의해 반응을 중지시켰다. 반응 혼합물은 0.5M NaCl, 10 mM 포스페이트에 대해 투석한 다음, 물로 투석하고 이어서 동결건조시켰다.
유도된 다당류 C의 크기는 HPLC 배타 칼럼 TSK 4000(제조자 토소하아스)상에서 조절하였다. 그 결과는 유도 과정중에 해중합이 일어나지 않았음을 증명하였다.
유도 과정중에, 반복 단위 약 3.4%는 NH2기로 유도하였다.
동결건조된 생성물은 0.02M 포스페이트 완충액(pH 7)에 용해시켜 농도를 6.25 ㎎/㎖로 만들고, 기체를 제거하였다. 숙신이미딜 말레이미도 부티레이트(GMBS)를 질소하에서 25 ㎎/㎖의 농도로 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시킨 다음, 동일한 양으로 유도된 다당류 C에 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소하에 실온에서 90분 동안 교반하였다. 활성화된 다당류 C는 세파덱스 G50 배타 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 배제된 분획을 회수하고, 한외여과(30K 아미콘 막)에 의해 약 7.5 ㎎/㎖로 농축시켰다. 농축 용액으로부터 기체를 제거하였다.
실시예 1에서 수득한 펩티드 20g을 질소하에서 10 ㎎/㎖의 농도로 물에 용해시켰다. 펩티드 용액 1.5 ㎖를, 활성화된 다당류 C를 함유하는 제제 1.2 ㎖에 첨가한 결과, (말레이미도 잔기)/(티올 잔기)의 비는 2가 되었다. 반응 혼합물은 실온에서 교반하에 하루밤 동안 유지하였다. 그 다음, 비반응된 말레이미도 잔기는 메르캅토에탄올 0.010 ㎖를 첨가하여 불활성화시켰다.
4BCL 세파로즈 칼럼상에서 접합된 생성물을 정제하였다. 용출된 분획을 당(시알산) 및 펩티드의 존재에 대해 분석하였다. 양 분석에서 양성적으로 반응하는 분획을 수집하였다.
사이알산 잔기의 양은 문헌[Svennerholm L., Biochim. Biophys. Acta (1957) 24 : 604]에 기재된 투여 방법에 따라 측정하였으며, 펩티드의 양은 문헌[Lowry등, J. Biol. Chem. (1951) 193:265]의 방법에 따라 측정하였다. (펩티드)/(다당류 C의 반복 단위)의 몰비는 1:18(중량비 1.8:1에 해당함)인 것으로 나타났다.
실시예 3
특허 공개 WO-A 82/01 995호(발명의 명칭: Procede de purification de polyosides de Streptococcus pneumoniae et vaccins a base de polyosides ainsi purifies)에 기재된 추출 방법에 의해, 하기에서 다당류 뉴모(Pneumo) 4로 지칭되는 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 유형 4로부터 협막 다당류의 건조 분말을 수득하였다. 다당류 뉴모4 100 ㎎을 0.2M NaCl에 용해시켜 최종 농도를 11.1 ㎎/㎖(용액 A)로 만들었다. 병행하여, 0.2M NaCl중의 아디프산 디히드라지드(ADH)의 용액을 0.25M의 농도로 제조하였다(용액 B). 0.2M NaCl중의 에틸 디메틸 아미노프로필 카르보디이미드(EDAC)의 0.5 M 용액도 제조하였다(용액 C). 용액A 9 ㎖, 용액B 10 ㎖ 및 용액C 1 ㎖를 함께 혼합하여 다당류 뉴모4 5 ㎎/㎖, 0.025M ADH 및 0.025 M EDAC를 함유하는 제제를 수득하였다. 1N HCl을 첨가하여 pH를 4.9로 만들고; 이 pH를 30분의 전체 반응 시간 동안 유지하였다. 온도는 약 25℃였다.
1N NaOH 0.28 ㎖에 의해 반응을 중지시켰다. pH는 7.5로 상승하였다. 반응 혼합물은 0.5M NaCl에 대해 투석한 다음, 물로 투석하고 이어서 동결건조시켰다.
유도된 다당류 뉴모4의 크기는 HPLC 배타 칼럼 TSK 4000(제조자 토소하아스)상에서 조절하였다. 유도 과정중에는 해중합이 일어나지 않았다.
유도 과정중에, 다당류 뉴모4의 반복 단위 약 8.2%는 NH2기로 유도하였다.
동결건조된 생성물은 0.05M NaCl에 용해시켜 농도를 2.76 ㎎/㎖로 만들고, 기체를 제거하였다. 숙신이미딜 말레이미도 부티레이트(GMBS)를 질소하에서 25 ㎎/㎖의 농도로 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켰다. GMBS 용액 1.75㎖를 질소하에서 다당류 용액 16 ㎖에 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 질소하의 실온에서 5 시간 동안 교반하면서 방치하였다. 활성화된 다당류 뉴모4는 배타 칼럼 세파덱스 G50 상에서 정제하였다. 배제된 분획을 회수하여 30K 막(아미콘)상에 약 7 ㎎/㎖로 농축시켰다. 농축 용액으로부터 기체를 제거하였다.
실시예 1에서 수득한 펩티드 20g을 질소하에서 4.6 ㎎/㎖의 농도로 0.1M NaCl, 0.01M 포스페이트 완충액(pH 7.5)에 용해시켰다. 한편, 펩티드 용액 2.2 ㎖를, 활성화된 다당류 뉴모4를 함유하는 제제 1.25 ㎖에 첨가한 결과, (말레이미딜 잔기)/(티올 기)의 비는 1이 되었다(뉴모4-펩티드-1 접합체). 반응 혼합물은 실온에서 질소하에 교반하면서 6 시간 동안 유지한 다음, +4℃에서 하루밤 동안 교반하였다. 그 다음, 비반응된 말레이미딜 잔기는 메르캅토에탄올 0.005 ㎖를 각각의 반응 혼합물에 첨가하여 불활성화시켰다.
4BCL 세파로즈 칼럼상에서 접합체를 정제하였다. 용출된 분획을 당 및 펩티드의 존재에 대해 분석하였다. 양 분석에서 양성적으로 반응하는 분획을 수집하였다.
당의 양은 문헌[Dubois 등, Anal. Chem. (1956) 3: 350]에 기재된 투여 방법에 따라 측정하였으며, 펩티드의 양은 문헌[Lowry등, J. Biol. Chem. (1951) 193:265]의 방법에 따라 측정하였다. (펩티드의 반복 단위)/(다당류)의 몰비는 Pn 4-펩티드-1 접합체의 경우 1:30(중량비 0.4:1에 해당함)이었다.
실시예 4
문헌[E. Gotschlich 등, J. Exp. Med., No 129 (1969), 1349-1365면]에 기재된 추출 방법에 의해, 하기에서 다당류 A로 지칭되는 나이제리아 메닌지티디스 혈청군 A로부터 협막 다당류의 건조 분말을 수득하였다. 다당류 A 100 ㎎을 물에 용해시켜 최종 농도를 5 ㎎/㎖로 만들었다(용액 A). 병행하여, 시아노겐 브로마이드(CNBr) 수용액을 67 ㎎/㎖의 농도로 제조하였다(용액 B). 0.5M NaHCO3중의 아디프산 디히드라지드(ADH) 용액도 150 ㎎/㎖의 농도로 제조하였다(용액 C). 용액A 20 ㎖ 및 용액C 0.75 ㎖를 함께 혼합하여 다당류/CNBr 중량비가 1인 제제를 수득하였다. 0.1N NaOH를 첨가하여 pH를 10.8로 만들고; 이 pH를 60분의 전체 반응 시간 동안 유지하였다. 온도는 약 20℃였다.
그 다음, 0.1N HCl 0.15 ㎖를 첨가하여 pH를 8.5로 감소시켰다. 용액 C 1.17 ㎖를 첨가하여 ADH/다당류의 중량비가 3.5가 되도록 하였다. 그 pH를 15분 동안 유지하였다. 그 다음, 반응 혼합물은 +4℃에서 교반하면서 하루밤 동안 방치하였다. 1N HCl 0.1 ㎖를 첨가하여 pH를 7로 감소시켰다. 반응 혼합물은 0.5M NaCl에 대해 투석한 다음, 물로 투석하고 이어서 동결건조시켰다.
유도된 다당류 A의 크기는 HPLC 배타 칼럼 TSK 4000(제조자 토소하아스)상에서 조절하였다. 유도 과정중에는 해중합이 일어나지 않았다.
유도 과정중에, 다당류 A의 반복 단위 약 2.5%는 NH2기로 유도하였다.
그 다음, 실시예2에서와 동일한 절차를 사용하여 유도된 다당류 A를 활성화시키고, 활성화된 다당류 A를 실시예 1에서 수득한 펩티드에 접합시켰다.
실시예 5
실시예 2에서 수득한 접합체와 기타 생성물의 비교
다당류 접합체에서 담체로서의 실시예 1의 펩티드의 용도는 다음과 같이 입증된다:
6주령의 NMRI 마우스에게 피하 경로를 통해 0.5 ㎖의 부피(각각의 주사마다)로 하기 조성물중 하나를 투여하였으며, 경우에 따라 보조제를 사용하였다:
(a) 1일, 15일 및 29일째에 보조제의 부재하에 다당류 C 5 ㎍(펩티드 없음);
(b) 1일째에는 완전 프로인트(Freund) 보조제와 함께, 15일 및 29일째에는 불완전 프로인트 보조제와 함께 다당류 C 5 ㎍(펩티드 없음);
(c) 1일째에는 완전 프로인트(Freund) 보조제와 함께, 15일 및 29일째에는 불완전 프로인트 보조제와 함께 다당류 C 5 ㎍ 및 펩티드 9 ㎍;
(d) 1일, 15일 및 29일째에 보조제의 부재하에 다당류 C 1 ㎍ 및 펩티드 1.8 ㎍을 함유하는 실시예 2에서 수득한 접합체;
(e) 1일, 15일 및 29일째에 보조제의 부재하에 다당류 C 5 ㎍ 및 펩티드 9 ㎍을 함유하는 실시예 2에서 수득한 접합체;
(f) 1일째에 완전 프로인트 보조제와 함께 다당류 5 ㎍ 및 펩티드 9 ㎍을 함유하는 실시예 2에서 수득한 접합체 및 15일째 및 29일째에 불완전 프로인트 보조제와 함게 실시예 2에서 수득한 접합체; 및
(g) 디프테리아 아나톡신과 함께 다당류 C 5 ㎍의 접합체.
15일, 29일 및 43일째에(최초 면역화일로부터 계산하여), 혈액 샘플을 채혈하고, 항다당류 C 항체를 ELISA로 적정하였다.
그 결과는 하기 표 1A 및 표 1B에 요약한다.
주사된 화합물 주사된 다당류의 용량(㎍) 주사된 펩티드의 용량(㎍) 면역화후 일수 각 일수에 채혈된 혈액 샘플 항다당류의 항체 역가(ELISA 단위)
(a) 5 11529 152943 1032115
(b) 5 11529 152943 223974
(c) 5 9 11529 152943 243447
주사된 화합물 주사된 다당류의 용량(㎍) 주사된 펩티드의 용량(㎍) 면역화후 일수 각 일수에 채혈된 혈액 샘플 항다당류의 항체 역가(ELISA 단위)
(d) 1 1.8 11529 152943 321052630
(e) 5 9 11529 152943 56321516
(f) 5 9 11529 152943 100628542492
(g) 5 11529 152943 1311971531
비접합된 다당류 C에 대한 항체 반응은 각각의 경우에 매우 약한 반면에, DT 또는 펩티드에 접합된 다당류 C에 대한 반응은 충분한 것이었다. 본 발명의 접합체의 경우, 두 번째의 주사후에 추가 자극(booster) 효과를 얻었는데, 이것은 면역 반응의 증거이다. 다당류 C-펩티드 접합체의 반응은 다당류 C-DT의 접합체를 사용하여 수득한 반응과 동등한 것이다.
실시예 6
펩티드 대 다당류의 중량비(w/w)가 0.4:1(펩티드/반복단위의 몰비 1:30에 해당함)인 실시예 3에서 제조된 접합체는 실시예 5에서와 동일한 원리를 사용하여 마우스에서 시험하였다. 그 접합체는 보조제의 존재하에서는 마우스에서 면역원성이 있었으며, 두 번째의 주사후에 추가 자극 효과를 야기하였다. 그 결과는 하기 표 2로부터 알 수 있다.
주사된 화합물 주사된 다당류의 용량(㎍) 주사된 펩티드의 용량(㎍) 면역화후 일수 각 일수에 채혈된 혈액 샘플 항다당류 Pn4(ELISA 단위)
뉴모 유형 4 PS + 보조제 5 11529 152943 <10<10<10
뉴모 유형 4 PS + 펩티드 + 보조제 5 1.9 11529 152943 ~18~24<10
접합체 Pn4-펩티드-1 + 보조제 5 1.9 11529 152943 ~614582601
염수 11529 152943 <10<10<10
(1) 일반 정보:
(i) 출원인:
(A) 명칭: 막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우. 베를린
(B) 거리명: 호프가르텐슈트라쎄 2
(C) 도시명: 뮌헨
(E) 국가명: 독일
(F) 우편번호: 데-80539
(A) 명칭: 파스뙤르 므리외 세롬 에 박셍 소시에떼 아노뉨
(B) 거리명: 아브뉘 르끌레르 58
(C) 도시명: 리용
(E) 국가명: 프랑스
(F) 우편번호: 에프-69007
(ii) 발명의 명칭: 담체 펩티드
(iii) 서열수: 5
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC-호환 가능
(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 페이턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.30(EPO)
(2) 서열번호 1에 관한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 104개 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 불명
(ii) 분자 형태: 펩티드
(vi) 출처:
(A) 미생물: 나이제리아 메닌지티디스
(B) 균주: 혈청군 A, 아군 III의 균주 Z3906
(xi) 서열: 서열번호 1:
(2) 서열번호 2에 관한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 104개 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 불명
(ii) 분자 형태: 펩티드
(vi) 출처:
(A) 미생물: 나이제리아 메닌지티디스
(B) 균주: 혈청군 C, ET-37 복합체의 균주 Z4400
(xi) 서열: 서열번호 2:
(2) 서열번호 3에 관한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 104개 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 불명
(ii) 분자 형태: 펩티드
(vi) 출처:
(A) 미생물: 나이제리아 메닌지티디스
(B) 균주: 혈청군 A, 아군 III의 균주 Z3524
(xi) 서열: 서열번호 3:
(2) 서열번호 4에 관한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 104개 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 불명
(ii) 분자 형태: 펩티드
(vi) 출처:
(A) 미생물: 나이제리아 고너리아
(xi) 서열: 서열번호 4:
(2) 서열번호 5에 관한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 104개 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 불명
(ii) 분자 형태: 펩티드
(vi) 출처:
(A) 미생물: 나이제리아 고너리아
(B) 균주: 균주 MS11
(xi) 서열: 서열번호 5:

Claims (25)

  1. 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열에서 위치 1 내지 5중 어느 하나의 아미노산 잔기에서 시작되고, 위치 40 내지 104중의 어느 하나의 아미노산 잔기에서 끝나는 40개 이상의 아미노산의 서열 또는 그 상동성 서열을 포함하는 40개 내지 200개의 아미노산 잔기를 가진 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열 중에서 위치 1 내지 5중 어느 하나의 아미노산 잔기에서 시작되고, 위치 40 내지 104중의 어느 하나의 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열; 서열번호 3의 아미노산 서열 중에서 위치 1 내지 5중 어느 하나의 아미노산 잔기에서 시작되고, 위치 40 내지 104중의 어느 하나의 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열; 서열번호 4의 아미노산 서열 중에서 위치 1 내지 5중 어느 하나의 아미노산 잔기에서 시작되고, 위치 40 내지 104중의 어느 하나의 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열; 및 서열번호 5의 아미노산 서열 중에서 위치 1 내지 5중 어느 하나의 아미노산 잔기에서 시작되고, 위치 40 내지 104중의 어느 하나의 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 동일하거나 또는 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 아미노산 서열중 어느 하나의 서열과 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 40개 이상의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 아미노산 서열중 어느 하나의 서열과 동일하거나 또는 상동성이고, 이들 서열번호의 아미노산 서열에서 위치 1 내지 5중 어느 하나의 아미노산 잔기에서 시작되고, 위치 70 내지 104중의 어느 하나의 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열을 가진 70개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 상동성이고, 이들 서열번호의 아미노산 서열에서 위치 1 내지 5중 어느 하나의 아미노산 잔기에서 시작되고, 위치 100 내지 104중의 어느 하나의 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열을 가진 100개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 것을 특징으로 하는 펩티드.
  7. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열과 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, 시스테인 잔기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 시스테인 잔기가 펩티드 서열의 하나의 말단에 위치하는 잔기인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  10. 유기 합성법을 사용하여 제1항에 따른 펩티드를 제조하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, Fmoc 또는 Boc 화학 및 자동화된 펩티드 합성기를 사용하여 합성을 수행하는 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 펩티드를 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, FastMoc 화학을 사용하는 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 펩티드를 제조하는 방법.
  13. 제10항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서, 아미노산의 아미노기를 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)기로 보호하고, 측기들은 다음 기들로 보호하는데, 즉 아스파라긴산, 글루타민산, 세린, 트레오닌 및 티로신의 카르복실기 또는 히드록실기는 O-t-부틸기로, 히스티딘, 아스파라긴 및 글루타민의 아미노기 또는 이미노기는 트리틸기로, 라이신의 아미노기는 t-부틸옥시카르보닐기로, 그리고 아르기닌의 이미노기는 PMC로 보호하며, 활성화 및 연결은 HBTU/디이소프로필에틸아민의 존재하에 수행하며, 펩티드는 피페리딘으로 탈보호시키고, 최종 생성물은 아세트산 무수물을 사용하여 N-말단 아세틸화시키는 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 펩티드를 제조하는 방법.
  14. 제10항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서, 이중 연결 및 아세트산 무수물에 의한 아세틸화는 사이클 1, 2, 4, 10-13, 17, 27, 32, 49, 59, 66, 75-78, 84, 85, 88, 96, 97 및 104-105에서 사용하는 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 펩티드를 제조하는 방법.
  15. 제10항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서, 고체상이 텐타겔(TentaGel) S RAM 스페지얼(Spezial)인 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 펩티드를 제조하는 방법.
  16. 제10항 내지 제15항중 어느 한 항에 있어서, 시스테인 단위를 펩티드의 N-말단, C-말단 또는 그 둘다에 첨가하는 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 펩티드를 제조하는 방법.
  17. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 펩티드를 접합체에 대한 담체로서 사용하는 방법.
  18. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 펩티드를 지다당류, O-항원 또는 박테리아성, 협막성 또는 진균성 막 다당류 중에서 선택되는 다당류에 대한 담체로서 사용하는 방법.
  19. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 펩티드를 나이제리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)의 다당류 C에 대한 담체로서 사용하는 방법.
  20. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 펩티드와 면역 반응성 분자를 포함하는 접합체(conjugate).
  21. 제20항에 있어서, 면역 반응성 분자가 다당류인 것을 특징으로 하는 접합체.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 부가의 시스테인 잔기, 2작용성 링커 및 다당류를 가진 제1항 내지 제9항중 어느 한 항의 펩티드를 포함하고, 이 펩티드는 시스테인의 티올기를 통해 링커에 결합되며 다당류는 히드록시기, 카르복시기 또는 아미노기를 통해 링커의 기타 작용기에 결합되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  23. 제20항 내지 제22항중 어느 한 항에 있어서, 다당류가 나이제리아 메닌지티디스의 다당류 C인 것을 특징으로 하는 접합체.
  24. 제20항 내지 제23항중 어느 한 항에 있어서, 다당류의 반복 단위 50몰 내지 1몰당 펩티드 1몰이 존재하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  25. 제20항 내지 제24항중 어느 한 항에 따른 접합체를 통상의 담체, 부형제, 희석제 또는 이들의 조합과 함께 함유하는 백신.
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