ES2234095T3

ES2234095T3 - Fragmento de proteasa iga1 como peptido de soporte.

Info

Publication number: ES2234095T3
Application number: ES98904105T
Authority: ES
Inventors: Mark Achtman; Monique Moreau
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Aventis Pasteur SA
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Sanofi Pasteur SA
Priority date: 1997-01-21
Filing date: 1998-01-20
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2018-01-20
Also published as: NO984365L; US20040203108A1; ATE283914T1; JP2000507274A; US7235242B2; NO322265B1; KR20000064740A; AU6211698A; EP0895537B1; DE69827880D1; CA2249409A1; NO984365D0; WO1998031791A1; PT895537E; CA2249409C; NZ331968A; DE69827880T2; DK0895537T3; EP0895537A1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN FRAGMENTO DE PROTEASA IGA1, CON 40 A 200 RESTOS DE AMINOACIDOS, Y QUE COMPRENDE AL MENOS 40 AMINOACIDOS DE UNA SECUENCIA DE LOS MISMOS SIMILAR A LA QUE SE MUESTRA EN SEQ ID NO 1, COMENZANDO CON UN AMINOACIDO EN CUALQUIERA DE LAS POSICIONES 1 A 5 Y FINALIZANDO CON UN AMINOACIDO EN CUALQUIERA DE LAS POSICIONES 40 A 104, O UNA SECUENCIA HOMOLOGA; SU USO COMO VEHICULO DE UN CONJUGADO, PARTICULARMENTE EN COMBINACION CON UN POLISACARIDO; Y UN PROCESO PARA PRODUCIR EL PEPTIDO, ASI COMO LAS VACUNAS QUE CONTIENEN DICHO PEPTIDO.

Description

Fragmento de proteasa IgA1 como péptido de soporte

La presente invención se refiere a un nuevo péptido, a su uso como soporte para un conjugado, particularmente en combinación con un polisacárido, y a un proceso para producir el péptido, así como a vacunas que comprenden dicho péptido.

Los polisacáridos están presentes como cápsulas en bacterias gram-positivas y gram-negativas y como un constituyente de la pared celular de bacterias y hongos. Diversas especies de los géneros Neisseria, Streptococcus, Klebsiella, Salmonella, Shigella y Haemophilus son patógenas y son responsables de diversas enfermedades humanas, por ejemplo meningitis epidémica, otitis, neumonía y diarrea. Estas enfermedades representan un problema global grave para la salud pública infantil y, por lo tanto, es importante disponer de una profilaxis contra estas enfermeda-
des.

Las macromoléculas de polisacárido comprenden unidades de sacárido que pueden mediar una inmunogenicidad. Por lo tanto, se han usado polisacáridos bacterianos o partes de los mismos para la inmunización de seres humanos. Sin embargo, aunque estas vacunas son inmunogénicas en niños y adultos y pueden inducir anticuerpos protectores, no son adecuadas para proteger a los bebés porque sólo inducen una respuesta inmune independiente de células T. De esta manera, el contacto con polisacáridos capsulares no induce una respuesta de memoria y no produce una protección persistente. Además, no es posible inducir una respuesta inmune en bebés.

Para solucionar el problema de una respuesta inmune independiente de células T, se ha usado una conjugación covalente de polisacáridos como antígenos independientes de células T a soportes de proteína como antígenos dependientes de células T y se ha considerado satisfactoria para solucionar esta deficiencia. La inmunización con tales conjugados induce una respuesta de anticuerpos dependiente de células T. Sin embargo, la elección de las proteínas de soporte que son útiles para seres humanos está muy restringida, y en la mayoría de los casos se han acoplado polisacáridos a toxoide tetánico, toxoide colérico o toxoide diftérico. Se cree que el uso ilimitado o excesivo de estos toxoides como soportes reprime las respuestas posteriores a un polisacárido acoplado a este tipo de soporte. Es de esperar que esta supresión de la respuesta inmune al soporte por anticuerpos pre-existentes se convierta en un problema en el futuro.

Otro problema que limitaba la elección de una nueva proteína de soporte en relación con este tipo de conjugado es que la proteína tiene que ser no tóxica o destoxificarse.

Además, los conjugados de péptido-polisacárido conocidos tienen el inconveniente de que es necesario usar un adyuvante para potenciar la respuesta inmune. Sin embargo, muchos adyuvantes conocidos no se pueden aplicar a seres humanos porque pueden inducir una respuesta inflamatoria. Hasta la fecha, sólo se permite un adyuvante para seres humanos: gel de aluminio.

El documento WO 90 11367 A1 describe la clonación del gen que codifica la proteasa IgA1 de Haemophilus influenzae y enseña el uso de la proteasa IgA1 en una vacuna contra la meningitis.

Por lo tanto, el objeto de la presente invención fue proporcionar nuevas moléculas de soporte que fueran muy inmunogénicas, pudieran inducir una respuesta inmune dependiente de células T, produjeran memoria persistente durante un largo periodo de tiempo en mamíferos y posiblemente evitaran el uso de adyuvantes. Este objeto y otros objetos adicionales que serán evidentes tras la siguiente descripción se consiguen por medio del uso de un nuevo péptido que tiene al menos 40 aminoácidos.

Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona un péptido que tiene de 40 a 200 restos aminoacídicos que comprende al menos 40 aminoácidos de una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEC ID Nº 1, que empieza con el aminoácido en una cualquiera de las posiciones 1 a 5 y termina con un aminoácido en una cualquiera de la posiciones 40 a 104, o una secuencia homóloga.

En otro aspecto de la presente invención, estos nuevos péptidos se usan como soporte para un conjugado.

Sorprendentemente, se ha descubierto que un péptido que comprende al menos 40 aminoácidos N-terminales de una de las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4 o 5, que forman parte de una proteasa IgA1 de Neisseria o una secuencia homóloga, podría usarse como soporte para un antígeno para inducir una respuesta inmune dependiente de células T con larga persistencia incluso sin el uso de un adyuvante. No era previsible que tal pequeño péptido pudiera ser útil como soporte para un conjugado inmunogénico.

El uso de este pequeño péptido tiene muchas ventajas con respecto a los soportes usados hasta la fecha. Al ser sólo un pequeño péptido, puede producirse de manera sintética, puede conjugarse con todos los tipos de compuestos que se usan como inmunógenos, tales como polisacáridos, y es especialmente útil en combinación con un polisacárido de Neisseria, particularmente de N. meningitidis o Haemophilus, particularmente H. influenzae. Por lo tanto, es útil para producir vacunas para bebes así como para niños pequeños y para adultos.

El péptido de la presente invención forma parte de una proteasa IgA1 producida por bacterias patógenas del género Neisseria. La proteasa IgA1 es un enzima que degrada anticuerpos contra IgA1 producidos por el hospedador como protección contra las bacterias. Aunque se sabía que las proteasas IgA1 podían inducir una respuesta inmune, no se ha contemplado el uso de tal proteasa como soporte porque, por una parte, es una molécula grande y, por otra parte, tiene una influenza negativa sobre el sistema inmune del ser humano a inmunizar. Por el contrario, el péptido no tiene este efecto enzimático.

El péptido de la presente invención comprende al menos 40 aminoácidos, preferiblemente al menos 50 aminoácidos, más preferiblemente al menos 70 aminoácidos y aún más preferiblemente los 104 aminoácidos de una de las secuencias de las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4 o 5 o una secuencia homóloga de las mismas. Aún más preferiblemente, el péptido es el 104mero de la SEC ID Nº 1.

El péptido también puede tener más de 104 aminoácidos. Las secuencias ilustradas en las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4 y 5 pueden extenderse con aminoácidos adicionales que no interfieran con otros aminoácidos, afecten al epítopo T o alteren la estructura de los primeros 40 aminoácidos N-terminales del péptido. La secuencia puede extenderse por el extremo N así como por el extremo carboxi. El péptido debe tener al menos 40 aminoácidos y no más de aproximadamente 200 aminoácidos. Si el péptido tiene menos de 40 aminoácidos, no es adecuado como soporte y es poco probable que se produzca una inmunización persistente cuando se use como soporte. Por otra parte, es difícil sintetizar un péptido que tenga más de 200 aminoácidos. Se ha descubierto que un péptido que tiene más de 70 aminoácidos tiene mejor antigenicidad, y el más preferido es un péptido que tiene 104 aminoácidos con la secuencia de la SEC ID Nº 1. Dicha secuencia es parte de una proteasa IgA1 de Neisseria meningitidis, serogrupo A, subgrupo III, cepa Z3906 y es idéntica a una secuencia con el número de acceso del Genbank X82474.

El péptido de la presente invención preferiblemente es idéntico u homólogo a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una de las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4 o 5. Preferiblemente, el péptido tiene una identidad de al menos un 85% con una de las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente, más preferiblemente tiene una identidad del 90% y de una forma particularmente preferida tiene una identidad del 95% con las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente. En la realización más preferida, el péptido tiene una identidad del 100% con las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente, particularmente con la SEC ID Nº 1.

También está dentro del alcance de la presente invención un péptido que tiene una secuencia homóloga a una de las secuencias mostradas en la SEC ID Nº 1, 2, 3, 4 o 5. La SEC ID Nº 2 es una secuencia de N. meningitidis, serogrupo C, complejo ET-37, cepa Z4400. La SEC ID Nº 3 es una secuencia de N. meningitidis, serogrupo A, subgrupo III, cepa Z3524. La SEC ID Nº 4 deriva de la secuencia S09386 de SwissProt. La SEC ID Nº 5 es una secuencia de N. gonorrhoeae, cepa MS11, publicada en el documento EP-A 254090 e idéntica al número de acceso del GenBank A02796.

El término "homólogo", como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones, se refiere a una secuencia que tiene una identidad de al menos un 80% con la secuencia respectiva. La homología de un péptido se mide típicamente usando un software de análisis de secuencia (por ejemplo, el paquete de software de análisis de secuencia del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI, 53705). Se alinean secuencias de aminoácidos similares para obtener el grado máximo de homología. Para este fin, puede ser necesario introducir artificialmente huecos en la secuencia. Una vez que se ha establecido una alineación óptima, se establece el grado de homología registrando todas las posiciones en las que los aminoácidos de las dos secuencias son idénticos, con respecto al número total de posiciones.

Por consiguiente, también están dentro del alcance de la presente invención análogos del péptido de la presente invención. Un péptido "análogo" es una forma alternativa de un péptido que se caracteriza por tener una sustitución, deleción o adición de uno o más aminoácidos que no altera la función biológica del polipéptido. La función biológica del péptido de la presente invención es inducir una respuesta inmune dependiente de células T cuando se usa como soporte junto con un antígeno.

En una realización preferida, el péptido de la presente invención comprende adicionalmente un resto de cisteína. El resto de cisteína puede localizarse en el extremo carboxi, en el extremo N o dentro de la cadena de aminoácidos sustituyendo uno de los aminoácidos de la secuencia por un resto de cisteína. Esta sustitución puede realizarse en todos los sitios con la condición de que el epítopo dependiente de células T no se destruya o se vea afectado. Preferiblemente, se añade la cisteína a uno de los extremos. Como el péptido que tiene una secuencia de acuerdo con una de las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4 o 5 no contiene ninguna cisteína, la introducción de una cisteína es particularmente útil, porque no destruye ni interfiere con la estructura del péptido. La cisteína se introduce para un acoplamiento estable con una molécula enlazadora. También es posible acoplar el péptido con otros grupos funcionales, por ejemplo, el grupo amino de un resto de lisina o el grupo carboxílico de un grupo de ácido glutámico o aspártico.

El péptido de la presente invención puede producirse por métodos microbiológicos así como por síntesis orgánica. En una realización preferida, el péptido se produce usando técnicas recombinantes o por síntesis. Para la producción recombinante del péptido, se proporciona un polinucleótido basándose en la secuencia de aminoácidos proporcionada en una de las SEC ID Nº 1, 2, 3, 4 o 5 y el péptido se produce de acuerdo con técnicas bien conocidas de ingeniería genética.

El otro método preferido para producir el péptido de la presente invención es través de una síntesis orgánica. El péptido puede sintetizarse por métodos bien conocidos para el especialista en la técnica. Por ejemplo, pueden producirse algunos fragmentos más pequeños acoplando los aminoácidos apropiados. Entonces se obtiene el péptido completo por acoplamiento de esos fragmentos.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención es un proceso para producir el péptido usando una síntesis orgánica. En una realización preferida, el péptido completo se produce por una síntesis en fase sólida, preferiblemente usando la química Fmoc o Boc. Se prefiere especialmente realizar la síntesis con un sintetizador de péptidos automático y usar la química FastMoc.

En una realización particularmente preferida, se sintetiza el 104mero de la SEC ID Nº: 1, cuya secuencia se ha indicado anteriormente, usando un sintetizador de péptidos automático y la química FastMoc, donde la fase sólida es TentaGel S RAM Spezial, donde los aminoácidos están protegidos con Fmoc y los grupos laterales preferiblemente se protegen como se indica a continuación: el grupo carboxilo o hidroxilo, respectivamente, del ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina y tirosina con O-t-butilo; el grupo amino o imino, respectivamente, de la histidina, asparagina y glutamina con tritilo; el grupo amino de la lisina con t-butiloxicarbonilo; y el grupo imino de la arginina con PMC. En los ciclos 1-2, 4, 10-13, 17, 27, 32, 49, 59, 66, 75-78, 84-85, 88, 96-97 y 104-105 deben realizarse dobles acoplamientos y los grupos amino libres se bloquean por acetilación con anhídrido acético. La activación y acoplamiento preferiblemente se realizan en presencia de HBTU/diisopropiletilamina. Después de la desprotección con piperidina, el producto final se acetila en el extremo N-terminal usando anhídrido
acético.

El proceso indicado anteriormente, por supuesto, también puede emplearse si el péptido de la presente invención tiene menos de 104 aminoácidos o más de 104 aminoácidos. En el primer caso el proceso varía omitiendo parte de los primeros ciclos, mientras que en el último caso el proceso varía añadiendo algunos ciclos adicionales para introducir más aminoácidos. Si el péptido es un péptido homólogo o tiene una secuencia como la identificada en una de las SEC ID Nº 2, 3, 4 o 5 o es homólogo a una de estas secuencias, teniendo algunos aminoácidos diferentes, el proceso puede adaptarse de acuerdo con esto usando el aminoácido apropiado en forma protegida para el ciclo respectivo.

El péptido de la presente invención es un soporte útil para moléculas inmunorreactivas tales como polisacáridos. El péptido proporciona epítopos de células T que son necesarias para generar una "memoria" inmunológica y, por lo tanto, generalmente puede usarse como soporte para todas las moléculas inmunorreactivas conocidas para producir conjugados que pueden usarse como vacunas eficaces.

En una realización preferida de la presente invención, el péptido se usa como soporte para un polisacárido para inducir una respuesta inmune. El polisacárido puede ser cualquier polisacárido que se sabe que es inmunogénico en mamíferos, especialmente en seres humanos. El término "polisacárido" también incluye polisacáridos más pequeños que son inmunogénicos y que algunas veces se denominan oligosacáridos. Son polisacáridos que pueden usarse como parte del conjugado polisacáridos capsulares, lipopolisacáridos, O-antígenos, polisacáridos de membrana bacterianos o fúngicos o partes despolimerizadas de los mismos, por ejemplo, polisacárido C de Neisseria meningitidis. El polisacárido puede tener un peso molecular en el intervalo de 10.000 a 500.000. Los polisacáridos naturales normalmente tienen un peso molecular en el intervalo de 100.000 a 500.000, mientras que sus formas despolimerizadas pueden tener un peso molecular inferior, tan sólo de 10.000.

Otro objeto de la presente invención es un conjugado que comprende un péptido como se ha descrito anteriormente y una molécula inmunorreactiva. En una realización preferida, la molécula inmunorreactiva se acopla al péptido a través de un enlazador. El enlazador proporciona grupos funcionales en los dos extremos que proporcionan la unión al péptido y a la molécula antigénica, respectivamente. Los dos grupos funcionales se conectan a un puente, cuya longitud se elige de manera que las dos partes se presenten al sistema inmune de una manera óptima. El puente no debe ser demasiado corto, ya que de lo contrario podría producirse impedimento estérico. Por otra parte, no debe ser demasiado largo para que no interfiera con la estructura de las dos partes. Se prefiere que la longitud del puente entre los dos grupos funcionales sea de 2 a 20 átomos seleccionados entre C, N, O y S. Más preferiblemente, el puente se selecciona entre alquileno con 2 a 8 átomos de carbono, fenileno, aralquileno con 7 a 12 átomos de carbono, alcanoiloxi con 2 a 6 átomos de carbono y bencilcarboniloxi.

Los grupos funcionales usados para el acoplamiento al péptido y al polisacárido son los grupos funcionales que se usan comúnmente en este campo. Se encuentra una revisión de métodos de acoplamiento en W.E. Dick y M. Beurret en Conjugates Vaccines, J.M. Cruse, R.E. Lewis Jr Eds. Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger (1989) 10:48. El péptido se une al enlazador a través de un grupo funcional proporcionado por uno de los aminoácidos, por ejemplo, un grupo amino, carboxi o hidroxi. En una realización preferida, el péptido se une al enlazador a través del grupo tiol proporcionado por un resto de cisteína. La molécula inmunorreactiva puede unirse al espaciador a través de grupos funcionales que están disponibles. En una realización preferida, cuando se usa un polisacárido como molécula inmunorreactiva, se usan grupos hidroxi, amino o carboxi que están presentes o se han introducido en las unidades de sacárido para el acoplamiento. Preferiblemente, el enlazador se une a los grupos hidroxi del polisacárido a través de un enlace éter, éster, amida o carbamato, a los grupos amino a través de un enlace N-OH-succinimidilo y/o a los grupos carboxilo a través de un enlace éster. El conjugado de la presente invención puede producirse usando métodos conocidos para el especialista en la técnica.

La respuesta inmune que se induce por el conjugado de la presente invención depende del número y disponibilidad de epítopos dependientes de células T y dependientes de células B y su relación. En el conjugado de la presente invención, los epítopos dependientes de células T se proporcionan por el péptido, mientras que los epítopos dependientes de células B se aportan por el polisacárido. Por lo tanto, la relación de las dos partes del conjugado es una característica esencial. De esta manera, la relación de los dos componentes debe ajustarse de manera que no esté presente una cantidad demasiado pequeña de cualquier tipo de molécula. Los inventores de la presente invención han descubierto que pueden obtenerse buenos resultados si está presente aproximadamente 1 mol de péptido por 1 a 50 moles, preferiblemente 3 a 30 moles y aún más preferiblemente por 5 a 20 moles de unidades repetidas del polisacárido. Si está presente menos de un mol de péptido por 50 moles de unidades repetidas, no puede detectarse ninguna respuesta inmune porque no hay suficientes moléculas de péptido para inducir una respuesta inmune persistente. Por otra parte, si está presente más de 1 mol de péptido por mol de unidades repetidas, los resultados no son satisfactorios porque una proporción demasiado grande del polisacárido tendrá impedimento estérico para inducir una respuesta inmune. La expresión "unidades repetidas" se refiere a unidades dentro de los polisacáridos que están compuestas por 1 a 7 sacáridos diferentes y difieren con respecto a la naturaleza del sacárido, posición del enlace y configuración anomérica del sacárido.

Otro aspecto de la presente invención es una vacuna que comprende un conjugado de acuerdo con la presente invención junto con vehículos, excipientes y diluyentes convencionales. El conjugado se mezcla, diluye o disuelve en un vehículo, excipiente o diluyente convencional como se conoce en este campo en una cantidad eficaz. Esta vacuna puede usarse para inmunizar bebés, niños y adultos. Es especialmente útil para el control de enfermedades epidémicas que se producen por Neisseria meningitidis u otras bacterias que llevan polisacáridos capsulares. El uso de la vacuna de la presente invención tiene como resultado altas titulaciones de anticuerpo.

Ejemplo 1 Producción de un péptido 105mero sintético que tiene la siguiente secuencia (SEC ID Nº: 1 + cisteína N-terminal)

1

El péptido se sintetizó usando química FastMoc con un sintetizador de péptidos automático (modelo 431A, Applied Biosystems). La fase sólida era una resina Rink (TentaGel S RAM Spezial 0,13 mM, 0,15 mM g^{-1}, Rapp Polymere, Tübingen, Alemania) que produce un péptido protegido con una amida C-terminal. Los grupos amino de los aminoácidos usados para la síntesis se protegieron con grupos 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) y los grupos laterales se protegieron con los siguientes grupos:

para el grupo carboxilo o hidroxilo, respectivamente, del ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina y tirosina: el grupo O-t-butilo;

para el grupo amino o imino, respectivamente, de la histidina, asparagina y glutamina: el grupo tritilo;

para el grupo amino de la lisina: el grupo t-butiloxicarbonilo;

y para el grupo imino de la arginina: el grupo PMC.

La activación y acoplamiento se realizaron en presencia de hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,3,3-tetrametiluronio (HBTU)/diisopropiletilamina. En los ciclos 1-2, 4, 10-13, 17, 27, 32, 49, 59, 66, 75-78, 84-85, 88, 96-97 y 104-105 se realizó un acoplamiento doble y los grupos amino libres se bloquearon por acetilación con anhídrido acético. Después del último ciclo, el péptido se desprotegió con piperidina y el producto final se acetiló N-terminalmente usando anhídrido acético.

La desprotección y escisión de la cadena lateral del soporte de resina se realizó con 1,2-etanoditiol al 2,1% (v/v), tioanisol al 4,2% (v/v), agua al 4,2% (v/v), fenol al 6,2% (v/v) y ácido trifluoroacético (TFA) al 83% (v/v) durante 3 horas a temperatura ambiente. La resina se retiró por filtración y se añadió trietilsilano gota a gota hasta que la solución fue incolora. La solución después se incubó durante 3 horas más a temperatura ambiente. Se recuperaron 360 mg de péptido bruto después de la precipitación con t-butilmetiléter seguido de centrifugación y liofilización. Se disolvieron 130 mg del péptido bruto en 40 ml de etilmorfolina a 50 mM, pH 8,3 que contenía ditiotreitol 50 mM y la disolución se incubó durante una noche a temperatura ambiente. El pH se ajustó a 3,5 con TFA al 10% y el péptido se purificó por HPLC de fase inversa (Pep-S, C2/C18, tamaño de poros 100 \ring{A}, 12 \mum 22,5 mm x 25 cm, Pharmacia) usando un gradiente (del 25 al 45% (v/v)) de acetonitrilo, TFA al 0,1% (100 ml min^{-1}, gradiente del 0,33% min^{-1}). El péptido eluyó como un pico en acetonitrilo a aproximadamente el 25% y el pico se liofilizó (73 mg) antes de usarse adicionalmente. Un análisis por HPLC y espectrometría de masas demostró que más del 65% del producto final correspondía a la secuencia deseada. La secuencia N-terminal se confirmó por secuenciación de Edman N-terminal de la muestra extraída antes de la acetilación N-terminal.

Ejemplo 2 Preparación de un conjugado de polisacárido-péptido

Se obtuvo un polvo seco de polisacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C, denominado polisacárido C en lo sucesivo, por un proceso de extracción como el descrito por E. Gotschlich et al., en J. Exp. Med., Nº 129 (1969), p 1349 - 1365. Se disolvieron 100 mg de polisacárido C en NaCl 0,2 M hasta una concentración final de 11,1 mg/ml (solución A). En paralelo, se preparó una solución de dihidrazida de ácido adípico (ADH) 0,2 M en NaCl 0,2 M (solución B). También se preparó una solución 0,5 M de etil dimetil aminopropil carbodiimida (EDAC) en NaCl 0,2 M (solución C). Se mezclaron 9 ml de solución A, 10 ml de solución B y 1 ml de solución C para dar una preparación que contenía 5 mg/ml de polisacárido C, ADH 0,125 M y EDAC 0,025 M. Se añadió HCl 0,1 M para ajustar el pH a 6,5; este pH se mantuvo durante todo el periodo de reacción de 45 minutos. La temperatura fue de aproximadamente 20ºC.

La reacción se detuvo por 40 \mul de NaOH 0,1 N que elevaron el pH a 7,1. La mezcla de reacción se dializó frente NaCl 0,5 M, fosfato 10 mM y después agua, y posteriormente se liofilizó.

El tamaño del polisacárido C derivatizado se controló en una columna de exclusión de HPLC TSK 4000 (fabricante Tosohaas). Los resultados demostraron que no se había producido despolimerización en el transcurso de la derivatización.

Durante la derivatización, aproximadamente un 3,4% de las unidades repetidas se derivatizaron con un grupo NH_{2}.

El producto liofilizado se disolvió en tampón fosfato 0,02 M, pH 7, hasta una concentración de 6,25 mg/ml y se desgasificó. Se disolvió butirato de succinimidil maleimido (GMBS) en dimetilsulfóxido (DMSO) en una atmósfera de nitrógeno a una concentración de 25 mg/ml y después se añadió al polisacárido C derivatizado en una cantidad igual. La mezcla de reacción se agitó durante 90 minutos a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno. El polisacárido C activado se purificó por cromatografía en columna de exclusión de sephadex G5C. La fracción excluida se recuperó y se concentró a aproximadamente 7,5 mg/ml por ultrafiltración (membrana Amicon 30K). La solución concentrada se desgasificó.

Veinte mg del péptido obtenido en el ejemplo 1 se disolvieron en agua a una concentración de 10 mg/ml en una atmósfera de nitrógeno. Se añadieron 1,5 ml de la solución de péptido a 1,2 ml de la preparación que contenía el polisacárido C activado, de forma que la relación (restos de maleimido)/(restos de tiol) fue igual a 0. Las mezclas de reacción se mantuvieron durante una noche con agitación a temperatura ambiente. Después, los restos maleimido que no habían reaccionado se inactivaron añadiendo 0,010 ml de mercaptoetanol.

El producto conjugado se purificó en una columna de Sepharose 4BCL. En las fracciones eluidas se ensayó la presencia de sacáridos (ácido siálico) y péptidos. Se reunieron fracciones que respondían positivamente en los dos ensayos.

La cantidad de restos de ácido siálico se determinó de acuerdo con el método de dosificación descrito en Svennerholm L., Biochim. Biophys. Acta (1957) 24: 604, y la cantidad de péptido se determinó de acuerdo con el método de Lowry et al., J. Biol. Chem. (1951) 193: 265. Se demostró que la relación (péptido)/(unidades repetidas de polisacárido C) mol/mol era de 1:18 (correspondiente a una relación peso/peso de 1,8:1).

Ejemplo 3

Se obtiene un polvo seco de polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae tipo 4, denominado polisacárido Pneumo 4 en lo sucesivo, por un proceso de extracción como el descrito en la patente WO-A 82/01 995 "Procede de purification de polyosides de Streptococcus pneumoniae et vaccins à base de polyosides ainsi purifiés". Se disolvieron 100 mg de polisacárido Pneumo 4 en NaCl 0,2 M hasta una concentración final de 11,1 mg/ml (solución A). En paralelo, se preparó una solución de dihidrazida de ácido adípico (ADH) en NaCl 0,2 M en una concentración de 0,25 M (solución B). También se preparó una solución de etil dimetil aminopropil carbodiimida (EDAC) en NaCl 0,2 M a una concentración de 0,5 M (solución C). Se mezclaron 9 ml de solución A, 10 ml de solución B y 1 ml de solución C para dar una preparación que contenía 5 mg/ml de polisacárido Pneumo 4, ADH 0,125 M y EDAC 0,025 M. Se añadió HCl 1 N a un pH de 4,9; este pH se mantuvo durante todo el periodo de reacción de 30 minutos. La temperatura fue de aproximadamente 25ºC.

La reacción se detuvo por 0,28 ml de NaOH N. El pH aumentó a 7,5. La mezcla de reacción se dializó frente a NaCl 0,5 M y después agua, y posteriormente se liofilizó.

El tamaño del polisacárido derivatizado Pneumo 4 se controló en una columna de exclusión de HPLC TSK 4000 (fabricante Tosohaas). No se produjo despolimerización en el transcurso de la derivatización.

Durante la derivatización, aproximadamente un 8,2% de las unidades repetidas del polisacárido Pneumo 4 se derivatizaron con un grupo -NH_{2}.

El producto liofilizado se disolvió en NaCl 0,05 M a una concentración de 2,76 mg/ml y se desgasificó. Se disolvió butirato de succinimidil maleimido (GMBS) en dimetilsulfóxido (DMSO) en una atmósfera de nitrógeno a una concentración de 25 mg/ml. Se añadieron 1,75 ml de la solución de GMBS a 16 ml de la solución de polisacárido en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se dejó con agitación durante 5 horas a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno. El polisacárido activado Pneumo 4 se purificó en una columna de exclusión Sephadex G50. La fracción excluida se recuperó y se concentró hasta aproximadamente 7 mg/ml en una membrana 30K (Amicon). La solución concentrada se desgasificó.

Veinte mg del péptido obtenido en el ejemplo 1 se disolvieron en NaCl 0,1 M, tampón fosfato 0,01 M pH 7,5, a una concentración de 4,6 mg/ml en una atmósfera de nitrógeno. Por una parte, 2,2 ml de la solución de péptido se añadieron a 1,25 ml de la preparación que contenía el polisacárido activado Pneumo 4, de forma que la relación (restos de maleimidilo)/(grupos tiol) era igual 1 (conjugado Pneumo 4-péptido-1). Las mezclas de reacción se mantuvieron durante 6 horas con agitación a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno, y después durante una noche a +4ºC. Después, los restos de maleimidilo sin reaccionar se inactivaron por medio de la adición de 0,005 ml de mercaptoetanol a cada mezcla de reacción.

Los conjugados se purificaron en una columna de Sepharose 4BCL. En las fracciones eluidas se ensayó la presencia de azúcares y péptidos. Se reunieron las fracciones que respondían positivamente en los dos ensayos.

La cantidad de azúcar se determinó de acuerdo con el método de dosificación descrito en Dubois et al. Anal. Chem. (1956) 3: 350, y la cantidad de péptido se determinó de acuerdo con el método de Lowry et al, J. Biol. Chem. (1951), 193: 265. La relación de unidades repetidas de péptido/polisacárido mol/mol es de 1:30 para el conjugado de Pn 4-péptido-1 (correspondiente a una relación p/p de 0,4:1).

Ejemplo 4

Se obtiene un polvo seco de polisacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A, denominado polisacárido A en lo sucesivo, por un proceso de extracción como el descrito por E. Gotschlich et al. en J. Exp. Med., Nº 129 (1969), p 1349 - 1365. Cien mg de polisacárido A se disolvieron en agua hasta una concentración final de 5 mg/ml (solución A). En paralelo, se preparó una solución de bromuro de cianógeno (CNBr) en agua en una concentración de 67 mg/ml (solución B). También se preparó una solución de dihidrazida de ácido adípico (ADH) en NaHCO_{3} 0,5 M a una concentración de 150 mg/ml (solución C). Se mezclaron 20 ml de solución A y 0,75 ml de solución C para dar una preparación con una relación de polisacárido/CNBr peso/peso igual a 1. Se añadió NaOH 0,1 N a un pH de 10,8; este pH se mantuvo durante todo el periodo de reacción de 60 minutos. La temperatura fue de aproximadamente 20ºC.

Después, el pH se redujo a 8,5 añadiendo 0,15 ml de HCl 0,1 N. Se añadieron 1,17 ml de solución C de forma que la relación de ADH/polisacárido peso/peso era igual a 3,5. El pH se mantuvo durante 15 minutos. Después, la mezcla de reacción se dejó durante una noche con agitación a +4ºC. Se añadieron 0,1 ml de HCl 1 N para reducir el pH a 7. La mezcla de reacción de dializó frente a NaCl 0,5 M y después agua, y posteriormente se liofilizó.

El tamaño del polisacárido A derivatizado se controló en una columna de exclusión de HPLC TSK 4000 (fabricante Tosohaas). No se produjo despolimerización en el transcurso de la derivatización.

Durante la derivatización, se modificaron aproximadamente un 2,5% de unidades repetidas de polisacárido A con un grupo -NH_{2}.

Después se usaron los mismos procesos que en el ejemplo 2 para activar el polisacárido A derivatizado y para conjugar el polisacárido A activado al péptido obtenido en el ejemplo 1.

Ejemplo 5 Comparación del conjugado obtenido en el ejemplo 2 con otros productos

La utilidad del péptido del ejemplo 1 como soporte en un conjugado de polisacárido se demuestra como se indica a continuación:

Ratones NMRI de seis semanas recibieron por vía subcutánea una de las siguientes composiciones en un volumen de 0,5 ml (cada inyección), y por vía intraperitoneal cuando se usó un adyuvante:

(a) 5 \mug de polisacárido C (sin péptido) en los días 1, 15 y 29, en ausencia de adyuvante;

(b) 5 \mug de polisacárido C (sin péptido) junto con adyuvante completo de Freund en el día 1, y en los días 15 y 29 junto con adyuvante incompleto de Freund;

(c) 5 \mug de polisacárido C y 9 \mug de péptido junto con adyuvante completo de Freund en el día 1, y en los días 15 y 29 junto con adyuvante incompleto de Freund;

(d) el conjugado obtenido en el ejemplo 2 que contenía 1 \mug de polisacárido C y 1,8 \mug de péptido en los días 1, 15 y 29 en ausencia de adyuvante;

(e) el conjugado obtenido en el ejemplo 2 que contenía 5 \mug de polisacárido C y 9 \mug de péptido en los días 1, 15 y 29 en ausencia de adyuvante;

(f) el conjugado obtenido en el ejemplo 2 que contenía 5 \mug de polisacárido y 9 \mug de péptido junto con adyuvante completo de Freund en el día 1, y en los días 15 y 29 el conjugado obtenido en el ejemplo 2 junto con adyuvante incompleto de Freund; y

(g) un conjugado de 5 \mug de polisacárido C junto con anatoxina diftérica.

En los días 15, 29 y 43 (calculados desde el día de la primera inmunización), se recoge una muestra de sangre y se titulan los anticuerpos anti-polisacárido C por ELISA.

Los resultados se resumen en la siguiente tabla.

TABLA 1

2

En todos los casos, la respuesta de anticuerpos al polisacárido C no conjugado es extremadamente débil, mientras que la respuesta al polisacárido C conjugado con DT o con el péptido es satisfactoria. Con el conjugado de la presente invención se obtiene un efecto de refuerzo después de la segunda inyección, que es una indicación de una respuesta inmune. La respuesta del conjugado de polisacárido C - péptido es equivalente a la respuesta obtenida con el conjugado de polisacárido C - DT.

Ejemplo 6

El conjugado preparado en el ejemplo 3 con una relación (p/p) entre péptido y polisacárido de 0,4: 1 (correspondiente a una relación de mol de péptido por moles de unidad repetidas de 1:30) se ensayó en ratones usando el mismo protocolo que en el ejemplo 5. Fue inmunogénico en ratones en presencia de adyuvante y tuvo como resultado un efecto de refuerzo después de la segunda inyección. Los resultados pueden observarse en la siguiente tabla 2.

TABLA 2

3

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften e.V. Berlín

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(B): CALLE: Hofgartenstrasse 2

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(C): CIUDAD: Muencheu

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(E): PAÍS: República Federal de Alemania

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): D-80539

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\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Pasteur Merieux Serums er Vaccines S.A.

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(B): CALLE: 58, Avenue Leclerc

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(C): CIUDAD: Lyon

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(E): PAÍS: Francia

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): F-69007

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(ii): TITULO DE LA INVENCIÓN: Péptido de soporte

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

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(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco Floppy

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Versión # 1.30 (EPO)

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 104 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA; desconocida

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(ii): TIPO MOLECULAR: péptido

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(vi): FUENTE ORIGINAL

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(A): ORGANISMO: Neisseria meningitidis

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(B): CEPA: Serogrupo A, subgrupo III, cepa Z3906

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

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4

5

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD; 104 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(ii): TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Neisseria meningitidis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Serogrupo C, complejo ET-37, cepa Z4400

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

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6

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

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(i): CARACTERÍST1CAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 104 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Neisseria meningitidis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Serogrupo A, subgrupo III, cepa Z3524

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

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7

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 104 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(ii): TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Neisseria gonorrhoeae

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4

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8

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 104 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(ii): TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL

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(A): ORGANISMO: Neisseria gonorrhoeae

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(B): CEPA: Cepa MS1 l

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

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9

Claims

1. Un soporte de antígeno que consta de un péptido que tiene de 40 a 200 restos aminoacídicos y que comprende al menos 40 aminoácidos de una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEC ID Nº 1, que empieza con el resto aminoacídico de una cualquiera de las posiciones 1 a 5 y termina con un resto aminoacídico de una cualquiera de las posiciones 40 a 104, o una secuencia que tiene una identidad de al menos un 80% con la misma.

2. Un soporte de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 80% con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por las secuencias de aminoácidos:

de la SEC ID Nº 2, que empieza con el resto aminoacídico de una cualquiera de las posiciones 1 a 5 y termina con el resto aminoacídico de una cualquiera de las posiciones 40 a 104;

de la SEC ID Nº 3, que empieza con el resto aminoacídico de una cualquiera de las posiciones 1 a 5 y termina con el resto aminoacídico de una cualquiera de las posiciones 40 a 104;

de la SEC ID Nº 4, que empieza con el resto aminoacídico de una cualquiera de las posiciones 1 a 5 y termina con el resto aminoacídico de una cualquiera de las posiciones 40 a 104; y

de la SEC ID Nº 5 que empieza con el resto aminoacídico de una cualquiera de las posiciones 1 a 5 y termina con el resto aminoacídico de una cualquiera de las posiciones 40 a 104.

3. Un soporte de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende al menos 40 aminoácidos que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85% con una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 5.

4. Un soporte de antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende al menos 70 restos aminoacídicos que tienen una secuencia de aminoácidos que es idéntica o presenta una identidad de al menos un 80% con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 5 que empieza con el resto aminoacídico en una cualquiera de las posiciones 1 a 5 y termina con el resto aminoacídico en una cualquiera de las posiciones 70 a 104.

5. Un soporte de antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende al menos 100 restos aminoacídicos que tienen una secuencia de aminoácidos que es idéntica o presenta una identidad de al menos un 80% con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 5 que empieza con el resto aminoacídico en una cualquiera de las posiciones 1 a 5 y termina con el resto aminoacídico en una cualquiera de las posiciones 70 a 104.

6. Un soporte de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1.

7. Un soporte de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1.

8. Un soporte de antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un resto de cisteína.

9. Un soporte de antígeno de acuerdo con la reivindicación 8, donde el resto de cisteína está localizado en un extremo de la secuencia del péptido.

10. Proceso para producir un soporte de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, donde se usa una síntesis orgánica.

11. Proceso de acuerdo con la reivindicación 10, donde la síntesis se realiza usando química de Fmoc o Boc y un sintetizador de péptidos automático.

12. Proceso de acuerdo con la reivindicación 11, donde se usa la química FastMoc.

13. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde los grupos amino de los aminoácidos están protegidos con grupos 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) y los grupos laterales están protegidos con los siguientes grupos: el grupo carboxilo o hidroxilo, respectivamente, del ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina y tirosina con O-t-butilo; el grupo amino o imino, respectivamente, de la histidina, asparagina y glutamina con tritilo; el grupo amino de la lisina con t-butiloxicarbonilo; y el grupo imino de la arginina con PMC, y donde la activación y el acoplamiento se realizan en presencia de HBTU/diisopropiletilamina, y donde el péptido se desprotege con piperidina y el producto final se acetila N-terminalmente usando anhídrido acético.

14. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 o 13, donde se usan acoplamientos dobles y acetilación con anhídrido acético en los ciclos 1-2, 4, 10-13, 17, 27, 32, 49, 59, 66, 75-78, 84-85, 88, 96-97 y 104-015.

15. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, donde la fase sólida es TentaGel S RAM Spezial.

16. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, donde se añade una unidad de cisteína al péptido en el extremo N y/o el extremo C.

17. Uso de un soporte de antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, como soporte para un conjugado.

18. Uso de un soporte de antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, como soporte para un polisacárido seleccionado entre lipopolisacáridos, O-antígenos, o polisacáridos de membrana bacterianos, capsulares o fúngicos.

19. Uso de un soporte de antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 como soporte para el polisacárido C de Neisseria meningitidis.

20. Conjugado que comprende un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y una molécula inmunorreactiva.

21. Conjugado de acuerdo con la reivindicación 20, donde la molécula inmunorreactiva es un polisacárido.

22. Conjugado de acuerdo con la reivindicación 20 o 21, que comprende el péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 con un resto de cisteína adicional, un enlazador bifuncional y un polisacárido, donde el péptido se une al enlazador a través del grupo tiol de la cisteína y el polisacárido se une al otro grupo funcional del enlazador a través de un grupo hidroxi, carboxi o amino.

23. Conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, donde el polisacárido es el polisacárido C de Neisseria meningitidis.

24. Conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, donde está presente un mol de péptido por 50 a 1 mol de unidades repetidas del polisacárido.

25. Vacuna que comprende el conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24 junto con vehículos, excipientes y/o diluyentes convencionales.