NO179164B

NO179164B - Fremgangsmåte for fremstilling av et immunogenkonjugat

Info

Publication number: NO179164B
Application number: NO902909A
Authority: NO
Inventors: Garvin Bixler; Subramonia Pillai; Richard Insel
Original assignee: American Cyanamid Co; Praxis Biolog Inc
Priority date: 1988-02-01
Filing date: 1990-06-29
Publication date: 1996-05-13
Also published as: JPH03502691A; DE68917126D1; ATE109008T1; WO1989006974A2; JP2921574B2; WO1989006974A3; EP0399001A1; CA1340958C; NO902909D0; DE68917126T2; NO179164C; DK174416B1; CA1340956C; DK182990A; AU3065489A; FI104374B; AU634153B2; NO902909L; FI903292A0; DK182990D0

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte

for fremstilling av et immunogenkonjugat. De foreliggende forbindelsene er i stand til å frembringe på en effektiv måte produksjonen av beskyttende antistoffer mot immunogenene som er benyttet, mens på samme tid unngå bruken av større proteinbaerermolekyler.

Frembringelse av en beskyttelsesimmunrespons mot enhver gitt infeksiøs forbindelse i vertebrater avhenger først av presentasjonen av det passende stimulus til vertens immunsystem. Den infeksiøse organismen selv representerer tallrike immunstimulatoriske forbindelser, eller antigener,

ved dens cellemembransammensetninger, eller ved de metabolske produkter den frigjør i vertens kropp. Disse forbindelsene, vanligvis større molekyler, slik som proteiner, lipopoly-sakkarider eller glykoprotein, blir gjenkjent av immunsystemet som fremmed, og forårsaker én eller flere forskjellige typer reaksjoner fra verten i et forsøk på å fjerne eller nøytralisere den invaderende organismen. Antigenet kan stimulere sensibiliserte lymfocytter (T-celler) som formidler celleutløst immunitet. Alternativt kan et antigen også stimulere B-lymfocytter til å starte syntesen og utskillelsen av frie antistoffer i blodet og andre kroppsvæsker (humoral immunitet) og kan samarbeide med B-lymfocytter. Utviklingen av kroppens immunbeskyttelsessvar avhenger av å oppnå et terskelnivå i stimulering av ett eller begge systemer, dvs. aktivering av B-celler med samarbeid fra aktiverte T-celler (se infra). Midlertidig immunitet mot infeksjon kan ofte oppnåes ved å gi et individ forhåndslagde antistoffer fra et annet individ av samme eller forskjellig art; dette er kjent som passiv immunitet. Et eksempel på slik immunitet er beskyttelsen som et foster eller nyfødt får ved overføring via livmoren av maternale antistoffer så vel som overføring gjennom melk. Et annet eksempel er samlet humant gammagloblin som kan bli benyttet for å forhindre eller modifisere effektene av eksponering for meslinger, vannkopper, hepatitt, kopper og tetanus. Disse lagde antistoffer blir eventuelt benyttet ved interaksjon med antigenene eller nedbrutt av

kroppen, og således tapes beskyttelsen til slutt. En mer permanent form for beskyttelse blir gitt ved aktiv immunisering ved vaksinasjon, som stimulerer vertens eget immunsystem til å lage beskyttelsesantistoffer ved aktivering av B- og T-lymfocytter. Kort sagt gir vaksinasjon en aktiv immunitetbeskyttelse ved å benytte en uskadelig eller ikke sykdomsutløsende form av antigen f.eks., en drept eller genetisk forandret bakterie, eller et isolert polysakkarid eller glykoprotein fra celleveggen eller kapselen av mikroorganismen, som et primærstimulus til immunsystemet. Dette utløser et heller langsomt svar i antistoffproduksjon som har en topp og faller av. Imidlertid har kroppen blitt vekket med hensyn til eksistensen av antigenet, og neste gang eksposisjonen opptrer, sannsynligvis med den levende, sykdomsfremkallende organisme, blir et sekundærsvar, med meget hurtigere og omfattende produksjon av antistoffene observert. Dette sekundærsvar vil typisk være tilstrekkelig for å hindre mikroorganismen fra å etablere seg selv i en slik grad at det er i stand til å forårsake en fullt utviklet infeksjon.

MEKANISME FOR B- CELLEAKTIVERING

Når et antigen kommer inn i kroppen, vil minst en del av det blit tatt opp og fordøyet av fagocytterende makrofager; imidlertid, vil andre dentrittiske makrofager (antigenpresenterende celler eller APCer) inkorporere antigenet i deres overflatemembran med det formål å presentere og aktivere lymfocyttene. Tidlig i B-celleutviklingen utvikler hver celle en gjenkjennelse av en spesielt antigenbindende spesifisitet og produserer antistoffer med spesifisitet for antigenet på den celleoverflate. Den første presentasjonen av et antigen for en antigenspesifikk B-celle resulterer i en langsom økende syntese av antistoffet, vanligvis dominert av IgM. Dette er den primære respons som er den type respons som er typisk stimulert ved vaksinasjon; den forårsaker modning av B-lymfocytten til en plasmacelle som er høyt spesialisert for antistoffproduksjon. Ved et annet møte med det samme antigenet, vanligvis i form av en utfordring av en levende mikroorgansime som bærer antigenet, har systemet allerede lært å gjenkjenne antigenet, og et meget raskere og større svar (sekundærrespons), dominert ved IgG, opptrer. Denne "læring" er basert på hukommelsesceller med lang levetid som fortsetter å sirkulere etter den første eksponering for antigenet; disse hukommelse-B-celler bærer på sine overflater immunoglobuliner som binder sterkt til det på ny invaderende antigen, produserer raskt nye antistoffer og i beste fall, hindrer det infeksiøse middel i å forårsake sykdom.

B- OG T- CELLEKOOPERASJON

Den forangående diskusjon beskriver på en meget generell måte mekanismen for B-cellestimulering og antistoffproduksjon. I virkeligheten fungerer imidlertid B-cellene ikke fullstendig uavhengig i utøvelsen av et beskyttelsessvar. Skjønt T-cellene selv ikke utskiller antistoff, er en type T-celler, hjelper T-cellene, ofte nødvendig for å assistere stimuler-ingen av B-cellen fordi samspillet mellom visse antigener med overflatebundede antistoffer alene er ofte utilstrekkelig til å stimulere B-cellevekst og sekresjon av løselige antistoff. Hjelper T-cellene reagerer også med og gjenkjenner antigener på overflaten til antigenpresenterende makrofager, og utvikler antigengjenkjennelse. T-cellene gjenkjenner så antigen på overflaten til makrofager og formidler aktivering og differensiering av hvilende B-celler. Gjennom sekresjon av løselige faktorer, øker B-cellevekstfaktorer antallet aktiverte B-celler ved å reagere med deres overflatereseptorer og en modningsfaktor stopper celledelingen og stimulerer differensieringen til antistoffutskillende plasmaceller.

Visse spesifikke typer antigener må engasjere T-celle-assistanse for å utløse det riktige svar fra T-celler. Generelt er de antigenene der en determinant forekommer bare én gang pr. molekyl, slik som et assymetrisk protein, i høy grad avhengig av T-cellesamspill og må stole på dens andre determinanter eller T-celleepitoper på molekylet for å bli gjenkjent av T-celler. T-cellen sender så antageligvis et tilleggssignal til B-cellen som hjelper den antigene stimulering av B-cellene til å bli mer effektiv.

BÆREREFFEKT

Visse typer molekyler, slik som små peptider eller haptener, har iboende dårlige immunogene eller svake immunogene egenskaper, og greier ikke å produsere et antistoffsvar under noen omstendigheter. Andre molekyler, slik som visse bakterielle kapselformede polysakkarider (CP'er) kan være sterkt immunogene hos voksne, men i dårlig utviklet immunsystem hos barn greier de ikke å produsere et adekvat beskyttelsessvar.

For å unngå problemene som man møter med hensyn til å forårsake et immunsvar med svake immunogene molekyler, slik som små peptider, haptener, CP'er o.l., har forsøk blitt utført for å øke deres immunogenisitet ved å binde dem til "bærer"-molekyler. Disse bærerne er vanligvis store immunogene proteiner; den ønskede effekt av disse konjugater må etterligne den T-cellekooperative effekt som opptrer med naturlig immunogene molekyler. Med andre ord, polysakkaridet som er kovalent bundet til en bærer, vil utløse T-celle-deltagelse i antistoffproduksjon av T-cellens svar på nærværet av determinantene på bæreren. Samspillet mellom T- og B-celler vil så gå videre på det vanlige observerte vis, som beskrevet ovenfor med hensyn til store immunogene proteiner. Ved å utfordre T-cellene med bærerdeterminanter, vil B-cellene begynne antistoffproduksjon, ikke bare mot bæreren selv, men også mot det bundne polysakkaridmolekylet. Denne fremgangsmåten for å øke immunogenisiteten til små eller dårlig immunogene molekyler er blitt benyttet med. hell i flere tiår (se f.eks. Goebel, et al., J. Exp. Med. 69: 53, 193 9) og mange vaksinesammensetninger som er blitt beskrevet der rensede kapself ormede polymerer er blitt konjugert, til bærerproteiner for å lage mer effektive vaksineforbindelser ved å utnytte denne "bærereffekt".

F.eks. Schneerson, et al. ( J. Exp. Med. 152: 361-376, 1980) beskriver Haemophilus influenzae b polymer proteinkonjugater som overfører immunitet mot invaderende sykdommer forårsaket av denne mikroorganismen. Formålet med konjugeringen var å avhjelpe den aldersavhengige immunologiske opptreden mot kapselpolymerer hos barn. Polymerene ble konjugert til et antall av forskjellige proteiner, inklusive serumalbumin, Limulus olyphemus hemocynin, og difteritoksin ved hjelp av en sammenbindende substans slik som adipin-dihydrazid.

Konjugater av PRP (polyribosyl ribitolfosfat, en kapsel-polymer av IL influenzae b) er vist å være mer effektiv enn vaksiner basert på polysakkaridet alene (Chu et al., Infect. Immun. 40.: 245, 1983; Schneerson et al. , Inf ect. Immun. 45.: 582-591, 1984) . Konjugeringen er også blitt vist å overvinne det dårlige antistoffsvar som vanligvis observeres hos barn når de immuniseres med et fritt polysakkarid (Anderson et al., J. Pediatr. 107: 346, 1985; Insel et al.. J. Exp. Med. 158: 294, 1986).

Geyer et al. ( Med. Microbiol. Immunol. 165: 171-288, 1979) laget konjugater av visse Klebsiella pneumoniae kapselformede polysakkaridfragmenter koblet til en nitro-fenyletylaminbinder ved reduserende aminering, og det derivatiserte sukker ble så bundet til proteinene ved å bruke en azokobling.

BÆRERPROTEINER

At bruken av bærerprinsippet utgjør en effektiv metode for å forbedre vaksiner som inneholder kapselformete polymerer er vidt akseptert. Videre er dise polymere proteinkonjugater ikke uten sine ulemper, særlig for menneskebruk. F.eks. er antallet proteiner som er etisk akseptert for å benyttes som potensielle bærerproteiner for mennesketilførsel relativt begrenset. De to primære proteinene vanligvis tilgjengelig for menneskebruk er tetanustoksoid og difteritoksoid. Et annet verdifullt bærerprotein er CRM197, et protein som har en enkel aminosyreforandring fra naturlig difteritoksin, men som i seg selv ikke er giftig og beholder i det vesentligste en immunogenitet som er identisk med det naturlige proteins. Mange hensyn påvirker også rutinebruk av disse kjente bærerproteiner. F.eks., det begrensede antall av tilgjengelige proteiner betyr at et stort antall av vaksineforbindelser vil bli basert på ett av disse proteinene; multiple vaksinasjoner med forbindelser konjugert med dette begrensede antall av bærere øker sannsynligheten for at uønskede reaksjoner mot disse proteiner kan opptre etter gjentatt immunisering. Tilstedeværelsen av på forhånd eksisterende antistoffer kan også gi uønskede lokale eller systemiske immunologiske sensitivitetsreaksjoner. Videre eksisterer muligheten at også et protein i konjugatet kan kryssreagere med normal vertvev og derved øke muligheten for autoimmuntypefenomener. Det er også sannsynlig at fenomenet med epitop undertrykkelse kan opptre ved bruk av konjugatvaksine. I korthet er dette fenomenet, som først ble beskrevet for keyhole limpet hemocyanin-konjugater av Herzenberg et al. ( J. Ex<p.> Med. 155: 1741, 1982), og resultater referert for tetanus toksoidkonjugater av Joliet et al. ( Biochem. Biophys. Res.. Comm., 117: 359, 1983) og Schulte et al. ( J. Immunol. 135: 2319, 1985), observert når immunitet mot et protein i konjugatet allerede eksisterer i vaksinen, og interfererer med dannelsen av et svar til det kovalent koblede polysakkaridet. Skjønt ikke ennå dokumentert i mennesker, kan denne undertrykkelse (hvis den opptrer) muligens ha alvorlige følger i utviklingen av konjugatvaksiner.

Endelig, siden proteinene er produkter av en biologisk prosess, er det flere iboende vanskeligheter. Først, som et produkt av et biologisk system, vil en uunngåelig produksjons-varisjon være tilstede; denne variasjon kan muligens forandre T-celle-avhengige egenskaper hos proteinet eller dets totale antigenisitet. Således kreves en mer stringent overvåkning av produksjonen og en medfølgende økning i omkostningene. For det annet, er det tydeligvis økede omkostninger involvert i tillagingen og rensningen av et biologiske produkt.

Det er klart at det er et nødvendig behov for et alternativ til de vanlige tilgjengelige konjugatvaksiner som vil hindre de immunologiske vanskelighetene forbundet med bruk av disse vaksinene og også beholde i vesentlig grad den samme immunogenitet som de kjente effektive vaksinene. Vi har nå vist at det er mulig å oppnå en slik vaksine ved konjugeringen av et antigen, antigendeterminant eller hapten med en T-

celleepitop fra et bakterielt produkt.

T- CELLEDETERMINANTER

For tiden er det ikke ennå klart hvordan T-celler gjenkjenner proteiner, eller hva T-cellen gjenkjenner som en immunogen determinant.

I mange år har det vært generell enighet om at antigene antistoffbindende determinanter i proteiner viser to tydelige egenskaper. Determinanter i et protein kan eksistere som korte segmenter av den primære sekvensen som inneholder aminosyrer direkte bundet ved peptidbindinger. Slike determinanter har blitt betegnet "sekvensielle" eller "kontinuerlige" determinanter. Alternativt kan en determinant være sammensatt av aminosyrer som er forskjellige i primær-sekvens, men som er rommessig i tett nærhet p.g.a. sekundær folding. Determinanter som viser denne egenskap har blitt kalt "topografiske" eller mindre flertydig, "diskontinuerlige" determinanter. I tillegg er det generell enighet om at antistoffer gjenkjenner tilgjengelige overflateregioner i et protein som er strukturelt bestemt og har en minimumslengde på 5-7 aminosyrerester.

T-cellegjenkjennelse av proteiner er en mer kompleks prosess enn antistoffbinding og er følgelig mindre klart forstått. T-celler har generelt blitt ansett å gjenkjenne kontinuerlige determinanter. For mange år siden ble det vist at T-celler kunne gjenkjenne både naturlige og denaturerte former av et protein, mens antistoffet kunne ikke (Maizels et al. , Eur. J. Immunol. 10.: 509, 1980) . Dette funn ble tolket slik at det viste en eksklusiv gjenkjennelse av sekvensielle determinanter av T-celler og demonstrerte et skille mellom T-og B-cellegjenkjennelse av proteiner (Maizels et al., supra). Skjønt ennå ikke avgjort, eksisterer fortsatt det syn at T- og B-celler imidlertid gjenkjenner fundamentalt forskjellige strukturer (Benjamin et al., Ann. Rev Immunol. 2: 67, 1984).

Uenigheten om hva som blir gjenkjent som en determinant av en T-celle går også videre på hvordan en T-celle oppfatter et protein. Det er vanlig oppfatning at immunsystemet gjenkjenner et protein på en genetisk begrenset måte, og at T-celler oppfatter proteiner i sammenhengen av et Ia-molekyl på overflaten til en antigenpresenterende celle. Det er blitt antydet at APC møter proteinet først, opptar det og fordøyer proteinet til mindre fragmenter. De mindre fragmentene av det opprinnelige proteinet blir så uttrykt i sammenheng med Ia på overflaten til en APC, hvor det kan gjenkjennes av T-celler. T-cellen ville derfor bare se et "prosessert" peptidfragment.

Skjønt det fremdeles ikke er klart hva en T-celle oppfatter, er det enighet blant flere grupper som har brukt en rekke modeller at en region på 7-17 aminosyrerester kreves for gjenkjennelse. Så tidlig som 1972 ble det vist at et 7 rests poly-L-lysinpolymer produserer forsinket type hypersensitivitet i marsvin (Schlossman, Transplant. Rev. 10: 97, 1972). Nyere studier med en rekke naturlige proteiner inklusive fibrinopeptid, influensa hemagglutinin, cytokrom, lysozym, ovalbumin og myoglobin, har indikert en minimum peptid-størrelse for T-cellestimulering på 7-17 aminosyrerester. Ved bruk av T-cellekloner av kjent spesifisitet, ble en størrelse på 10-14 rester funnet å være nødvendig for et T-cellesvar (Atassi, et al., Biochem. J. 246: 307-312, 1987). Den større peptidstørrelse krevet for T-cellegjenkjennelse, til sammenligning med 5-7 rester krevet for antistoffbinding, kan reflektere tilleggsrestene som kreves for å uttrykke determinanten i forbindelse med et Ia-molekyl.

I virkeligheten har samspillet Ia og syntetiske peptider blitt demonstrert i flere modeller. En region som er innblandet i Ia-binding, en agretop, ble foreslått (Katz, et al., J. Mol. Cell Immunol. 1: 3, 1983). Følgelig har plane membraner med Ia innebygget blitt benyttet for å presentere syntetiske peptider for T-celler (Watts et al., PNAS 81: 7564, 1984). Nyere studier, har vist at den direkte binding av syntetiske peptider for Ia-molekyler (Babbett et al., Nature 317: 359, 1985; Buss PNAS 83: 3968, 1986) som ble presentert på en genetisk begrenset måte avhengig av opprinnelsen til Ia-molekylene (Groillet et al., Science 235: 865, 1987). Hoved-sakelig p.g.a. av disse studier er det blitt postulert at en T-celleepitop vil bestå av en hydrofil region som kan reagere med T-cellereseptorer og en hydrofob agretop som binder til Ia-molekyler. I tillegg, ble det antatt at disse fragmenter som representerer kontinuerlige determinanter, ville bli dannet ved proteolytisk prosessering av det naturlige proteinet.

I et forsøk på å forutsi lokaliseringen av antistoffbinding eller T-celledeterminanter, har flere forskjellige veier blitt benyttet. For flere år siden, ga Hopp og Woods ( PNAS 78: 3824; 1981; europeisk søkn. nr. 0056249; Sør-Afrika patent nr. 823 952) en numerisk hydrofob/hydrofil indeks til hver av aminosyrene og undersøkte den primære sekvensen til flere proteiner i forbindelse med denne indeks. Ifølge deres analyse korrelerte de kjente antistoff-bindingsseter i proteinene som ble undersøkt med de hydrofile regioner. En lignende analyse ble brukt av Kyte og Doolittle ( J. Mol. Biol. 157: 105-132, 1982) ved bruk av en numerisk indeks som representerte en litt forskjellig variant.

Senere har forsøk blitt gjort på å korrelere regioner i et protein som har høy grad av fleksibilitet eller segmental bevegelsesfrihet med regioner for antistoffbinding (Tainer et al., Nature 315:327, 1985; Ann. Rev. Immunol. 2:501, 1985, Westhoff et al., Nature 311:123, 1984). Med denne fremgangsmåte gir data fra røntgen eller nøytronsprednings-mønstre en vurdering av den relative konformasjonsvariasjon for en rest som blir uttrykt som en atomær temperaturfaktor. En kurve for den atomære temperaturfaktor mot resttallet indikerer den relative bevegelsesgrad langs polypeptidkjeden til et gitt protein. Regioner med høy bevegelse ble tenkt å korrelere med kjente antistoffbindingsseter (Tainer et al., supra.).

T-celledeterminanter er blitt ansett av visse grupper å vise en amfipatisk struktur, dvs., en determinant er antatt å være sammensatt av en hydrofil region som binder til T-celle-reseptoren og videre en hydrofob region som binder til Ia-molekyler. En 16-rests T-celledeterminant av lysozym ble funnet å bestå av en kort, sammenhengende serie av hydrofile rester (Allen et al., PNAS 81:2489, 1984) . Andre har imidlertid antydet at T-celledeterminanter har en tendens til å danne stabile heliksstrukturer, der de hydrofile rester finnes på én overflate av heliksen mens de hydrofobe rester finnes på den motsatte overflate (DeLisi and Berzofsky, PNAS 82:2489, 1985; Watts et al.. PNAS 82:704 8, 1985). En algoritme er blitt utviklet for å lete i en gitt protein-sekvens etter regioner som har en tendens til å danne heliksamfipatiske strukturer (DeLisi og Berzofsky, supra.) og anvendt på flere proteinmodeller. I motsetning til dette hevder stadig noen forskere at T-celledeterminanter er forbundet med betasvinger innen proteinet (Katz, et al., J. Immunol. 135:1386, 1985). Et klart bilde av hvilke faktorer som er viktige for å forutsi en T-celledeterminant mangler ennå.

Flere grupper har anerkjent viktigheten av å inkludere en T-celledeterminant som del av en syntetisk vaksine. Milch et al. (US patent nr. 4,599,230 og 4,599,231) har syntetisert en peptidvaksine som består av T-celle- og B-celledeterminanter fra hepatitt B virusoverflateantigen. På samme måte ble en malariavaksine laget av en T-hjelperepitop fra det circumsporozoite protein som var kovalent bundet til hoved-B-celledeterminanten for dette protein (Good et al., Science 235:1059, 1987). Det er interessant at T-hjelperdeterminanten ble forutsagt av algoritmen til DeLisi og Berzofsky, supra. Begge disse rapporter benyttet T-celle- og B-celledeterminanter innenfor det samme proteinet for å konstruere vaksinen. Derimot konstruerte Leclerc et al., ( Eur. J. Immunol. 17:269, 1987) en vaksine ved å kopolymerisere et streptokokkpeptid, S-34, som innen sin sekvens inneholdt både T- og B-celle-determinanter med et viruspeptid som representerte en B-celledeterminant fra hepatitt B-virus. T-celledeterminanten, som i dette tilfellet korresponderte i vesentlig grad med et naturlig peptid, overførte immunogenitet til viruspeptidet og fungerte derved som et bærermolekyl.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse anvender nye isolerte eller syntetiske T-celleepitoper fra bakterielle produkter ved tillagning av vaksinesammensetninger. Disse er analoge i bruksområde med tidligere kjente vaksiner som benyttet bærerproteiner for å øke antistoffproduksjon. Blant disse epitoper er de som er isolert fra bakterielle toksiner, spesifikk difteritoksin eller kryssreagerende materiale (CRM), og tetanustoksin. Som benyttet heri, og i patentkravene, refererer T-celleepitopene i oppfinnelsen til T-celleepitoper per se.

T-celleepitopene kan bli benyttet i kombinasjon med en ikke-beslektet B-celledeterminant for å oppnå betydelige mengder antistoffproduksjon mot B-celledeterminanten uten å produsere antistoffer til T-celleepitopen. Det er nå blitt overraskende oppdaget at en slik kombinasjon kan gi i det vesentligste et likeså effektivt nivå med antistoffproduksjon som B-celledeterminantbærerproteinkombinasjonen til nå vanligvis har gjort. Tilgjengeligheten og utvist anvendbarhet av en slik kombinasjon gjør det mulig å unngå de mulige ikke-ønskede immunologiske konsekvensene som kan være forbundet med bruken av bærer-protein-baserte vaksiner. Videre gir bruken av T-celleepitopen per se, i motsetning til et større peptid som inneholder epitopen, en økonomisk fordel i at det kan bli lett syntetisert så vel som å være en sikkerhetsfordel i å unngå bruken av hele proteinet.

Den innledningsvis nevnte fremgangsmåte omfatter ifølge oppfinnelsen kovalent kopling av et polysakkaraid-antigen til et oligopeptid svarende til minst én T-celleepitop av et bakterielt toksin, CRM eller toksoid, hvori antigenet og oligopeptidet er heterologe med hverandre.

Konjugeringen av de to elementene i en vaksinesammensetning tillater et mer effektivt nivå med hensyn til antistoffsvar på antigenet. Disse vaksiner som inneholder de fremstilte immunogenkonjugater er egnet for produksjon av antistoffer mot enhver type antigen, inklusive ikke bare antigener av patogene organismer (bakterier, virus, parasitter), men også til allergener, og cancer-forbundne antigener, o.l.. Imidlertid er konjugatene spesielt egnet for formulering av vaksinesammensetninger, hvilke benytter antigener som er bare svakt immunogene, det betyr de antigener som tradisjonelt måtte konjugeres til bærerproteiner for å oppnå en tilfredsstillende grad av antistoffproduksjon.

Tilgjengeligheten av disse konjugater gir også en metode for å stimulere et immunsvar i varmblo'dige dyr når dyret tilføres en immunogen effektiv mengde av et interessant antigen konjugert til en T-celleepitop fra et bakterielt produkt. Metoden omfatter beskyttende immunisering på tradi-sjonell måte, det betyr inokulering mot en spesiell mikro-biologisk sykdomsforbindelse; men vil også omfatte enhver annen type behandling hvori øket antistoffproduksjon ville være ønskelig, f.eks. å stimulere antistoffer mot tumor-spesifikke eller tumorassosierte antigener, eller i produksjonen av antistoffer mot felles allergen. Metoden er også spesielt anvendbar i immuniseringen av barn hvis immunsystem ikke er fullt utviklet. Den foreliggende metode kan benyttes i både terapeutisk og profylaktisk sammenheng.

BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 viser primærsekvensen til CRM i standard én-bokstavkode. De regioner som har en tendens til å danne amfipatiske heliksstrukturer er vist ved tallet 1, og de sekvenser som har en potensiell T-celleepitopaktivitet er streket under. Figur 2 viser HPLC-analyse av peptid 6. A. Kromatogram av urenset peptid 6. Stolpen indikerer samlede regioner. B. Rekromatografi av peptid 6 (samlede fraksjoner oppnådd fra det tidligere beskrevne). Det syntetiske peptidet ble eluert som beskrevet i teksten. Figur 3 viser utvalgte kromatogrammer av PTH-derivater fra syntetisk peptid 6. Peptidet ble sekvensert som beskrevet i teksten. Tallene indikerer Edman-cykler. Topper a og b, som tjener som interne markører, representerer hhv. N'N-dimetyl-N'-fenyltiourea og N'N-difenyltiourea. Syklus 2 indikerer nærværet av tyrosin; syklus 5, valin; syklus 9, isoleucin; syklus 17, asparagin; syklus 22, prolin og syklus 28, glysin. Figur 4 viser Western blot analyse av utvalgte peptidkonjugater som ble oppdaget med monoklonalt antistoff til PRP.

Fra venstre til høyre inneholder sporene molekylvektstandard (LMW), PRP (peptid 357-380), PRP (peptid 306-334), PRP-CRM, PRP og PRP kort (peptid 366-383). Figur 5 viser et diagram av effektene av en forhåndseks-posisjon mot bærer, DT, på immunsvaret til PRP-(306-334) . Figur 6 viser et diagram av antistoffsvaret til respiratorisk syncytiale virus-(RSV)-F-proteinkonjugater.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

BAKTERIELLE T- CELLEEPITOPER

De forskjellige utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse vedrører oppdagelsen at isolerte eller syntetiske T-celleepitoper fra bakterielle produkter kan tjene likeså effektivt som bærerproteiner for antigener med hensyn til immuniseringsformål. Det er ikke tidligere demonstrert at T-celledeterminanten fra et bakterielt produkt bundet til et antigen, kan fungere på samme måte som det fullstendige naturlige protein konjugert til det samme antigenet. Kunnskapen at en T-celleepitop fra et bakterielt produkt kan fungere likeså effektivt som et bærerprotein i å fremme et antistoffsvar, har åpnet døren til en fullstendig ny klasse vaksiner basert på bruken av de isolerte T-celleepitopene i kombinasjon med en B-celledeterminant eller helt antigen. Den følgende diskusjon vedrører en detaljert beskrivelse av fremgangsmåter for å identifisere og isolere de rette T-celleepitoper for bruk i den foreliggende oppfinnelse. I tillegg til å ha lignende immunogene egenskaper, kan bruken av epitopene (i motsetning til bruken av et intakt naturlig protein) hindre de mulige problemene med hypersensitivitet, auto-immunitet, og utstrakt rensing, uten å ofre effektivitet.

TEKNIKKER FOR Å IDENTIFISERE T- CELLEEPITOPER

Skjønt T-celleepitopene fra bakterielle produkter ikke er blitt tidligere identifisert, er det mange fremgangsmåter beskrevet i litteraturen som kan benyttes for å identifisere en T-celleepitop eller epitoper i et interessant bakterielt produkt. F.eks. DeLisi et al. ( PNAS 82:7048, 1985; se også Margalite et al. J. Immunol. 138:2213, 1987) har antydet at potensielle epitope regioner kan lokaliseres ved å identifisere potensielle amfipatiske alfaheliksregioner i molekylet. Rothbard et al. (Modern Trends in Huiman Leukemia VII, 1986) beskriver også en empirisk fremgangsmåte for å identfisere T-celleepitoper ved å undersøke proteinenes primære sekvens med hensyn til hydrofobi, ladning, polaritet og nærvær av glycin-eller prolinrester. En sekvens i hvilken en ladet rest eller glycinrest var etterfulgt av to hydrofobe rester, ble antatt å være en potensiell T-celleepitop. Bixler et al. ( Immunol. Comm. 12:593, 1983); J. Immunoaenet. 11:245, 1984; J. Immuno<g>enet. 11:339, 1984) beskriver en strategi for å synte-tisere overlappende syntetiske peptider som omfatter et helt proteinmolekyl for å undersøke T-celleepitoper. En ny syntetisk metode beskrevet av Gysen ( Ciba Foundation S<y>mposium 119:130, 1986) tillater syntese av en lang rekke peptider i små mengder som tillater etterligningen av en rekke mulige bindingsseter, og det tillater rask undersøkelse av et molekyl. Mer tradisjonelle metoder, slik som enzymatisk eller kjemisk fordøyelse av proteiner, gir peptidfragmenter som lett kan testes på T-celleaktivitet. F.eks. gir enzymer slik som chymotrypsin, elastase, ficin, papain, pepsin, eller trypsin begrensede og forutsigbare fragmenter ved kløving av spesifikke aminosyrebindinger. På samme måte gir kjemiske forbindelser slik som N-klorsuccinimid BPNS-skatol, cyanogen-bromid, maursyre, eller hydroksylamin også definerbare fragmenter ved deres virkning på proteiner. Tilstedeværelsen av den ønskede T-cellestimulerende aktivitet i ethvert gitt fragment kan lett bestemmes ved å tilsette rensede fragmenter til en standard T-celle celledelingsmetode eller ved å analysere ikke-rensede fragmenter med en T-celle Western-metode (Young et al. , Immunol. 59.: 167, 1986) .

KILDER FOR T- CELLEEPITOPER

Det er et antall bakterielle produkter som utgjør passende kilder for potensielt anvendbare T-cellepitoper i kraft av å benytte det naturlige opprinnelige molekyl som bærerprotein. F.eks. kan ytre membranproteiner fra forskjellige gram-negative bakterier benyttes, slik som OMP fra Haemophilus influenzae. Hårene (pili, fimbriae), de filamentøse, ikke-flagellære strukturene på mange gram-negative bakterier, så vel som flagellin, proteinkomponenten i bakterielle flageller, representerer en mulig kilde for T-celle-determinanter. Filamentøse hemagglutininer (FHA) fra visse bakterier, f.eks. pertussis, er også vurdert som T-celledeterminantkilder.

Blant de mest verdifulle bakterielle proteiner for de foreliggende formål er de velkjente bakterielle toksiner som er blitt benyttet på en vellykket måte som bærerproteiner i vanlige vaksinesammensetninger. Skjønt de bakterielle toksiner og toksoider beskrevet ovenfor er blitt benyttet i en rekke år for å immunisere mennesker, er meget lite kjent om deres gjenkjennelse av immunsystemet. Det lille som er blitt beskrevet i litteraturen har ikke vært definitivt (inconclusive) . Triebel et al. ( Eur. J. Immunol 16.:.47, 1986) undersøkte humane perifere leukocytter for T-cellereaktivitet mot fragmenter fra difteritoksin som ble laget ved cyanogen-bromidkløving. Bare et begrenset sett store fragmenter ble vurdert, men en presis avklaring av T-celle-determinanter var ikke mulig. Derfor har en presis T-celle-determinant fra et bakterielt toksin ikke ennå blitt identifisert.

Det foreliggende preparat fra bakterielle toksin T-celle-determinantkonjugater kan baseres på enhver av de kjente toksiner som er generelt anvendbare i sine naturlige form som bærere for antigene forbindelser, hvilke er bare svakt immunogene. Blant de kjente bakterielle toksiner, CRMs eller toksoider er de fra Pseudomonas. Staphylococcus, Streptococcus, Pertussis og enterotoksigene bakterier, inklusive E^ coli. De videst aksepterte bærerproteiner, er imidlertid tetanus og difteritoksoid, som har en etablert helsemessig sikker forhistorie. En særlig foretrukket T-celleepitop er isolert fra CRM197, en ikke-giftig mutant av difteritoksin.

CRM1Q-, EPITOPER

"Kryss-reagerende materialer" eller CRMS er genetisk forandrede proteiner som er antigent likt det naturlige proteintoksin og allikevel ikke giftig. CRM fra difteri-

toksinet har allerede blitt vist å være effektivt i å øke antistoffsvaret mot bakterielle kapselformede polymerer (Anderson et al., J. Pediatr. 107:346, 1985) . Den kryss-reagerende substans kjent som CRM197 er bemerkelsesverdig ved at det har en enkel aminosyreforandring og er immunologisk lik det naturlige difteritoksin. En kultur av Corynebacterium diphtheriae - stamme C7 (15 197) , som produserer CRM197-protein, er blitt deponert hos the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland og har fått registreringsnr. ATCC 53281.

For å lokalisere potensielle T-celledeterminanter i CRM ble oppmerksomheten rettet mot heliksamifpatiske regioner i proteinet ifølge teorien til DeLisi og Berzofsky ( PNAS 82.:2489, 1985). Lokaliseringen ble bestemt ved algoritme ved bruk av en personlig datamaskin og vurdert ved sammenligning med resultatene oppnådd for analysen av spermhvalmyoglobin som beskrevet i DeLisi & Berzofsky, supra. Programmet ble så benyttet overfor den kjente sekvensen til CRM197 (Collier, Bacteriol. Rev. 3.9:54, 1975; Drazin et al. , J. Biol. Chem. 254 -.5832, 1979). Seks regioner i CRM ble valgt for en detaljert studie. Disse regioner ble syntetisert ved hjelp av standard trinnvis fastfase Merrifieldsyntese.

Når en gitt region i CRM ble bestemt eksperimentelt å inneholde en T-celledeterminant eller en del av denne, kunne de presise grenser for determinanten kartlegges. Dette ble utført ved bruk av flere forskjellige sett syntetiske peptider som systematisk dissekerte den interessante regionen. I de første sett peptider, ble den N-terminale del av peptidet variert ved etterfølgende tilsetninger av 3-5 naturlige sekvensrester mens den C-terminale del ble holdt uforandret. Dette tillater en grov tilnærming av den N-terminale grensen. For å forfine videre lokalisering av grensen, ble en annen serie peptider som dissekerte denne regionen syntetisert ved enkelttrinntilsetninger av naturlige sekvensrester til N-terminalen. I det tredje sett peptider, ble de C-terminale restene gradvis fjernet i 1-3-resttrinn, mens den N-terminale delen ble holdt uforandret. Siden dette resulterer i stadig kortere peptider som kunne ha motsatt effekt på deres gjenkjennelse, var det nødvendig å kompensere for den avtagende størrelsen ved å addere til den N-terminale del tilleggsrester, som ikke var relatert til den naturlige sekvensen i proteinet. Når både N- og C-terminale ender i determinanten var kartlagt, ble et peptid som korresponderte med den bestemte regionen syntetisert og bekreftet som en T-celledeterminant.

Av regionene som ble kartlagt i figur 1 som mulige T-celleepitoper, viste peptidet i region 357-383, et vesentlig svar ved å stimulere difteri-(DT)-behandlede lymfeknuteceller. Videre studier lokaliserte epitopen til 369-383 i CRM197. Sekvensen representerer en T-celleepitop i CRM197 og difteritoksin. Peptidet ble, når det ble kovalent koblet til kapselpolymer PRP, vist å være effektivt ved å utløse den ønskede antistoffrespons mot PRP in vivo, og også indusere ikke-antistoffer som kryssreagerer med hele CRM eller DT-toksinet. Således har dette peptid har de karakteristika som er ønskelige i et bakterielt toksinkonjugat. En annen T-celleepitop er blitt lokalisert til 306-334 i CRM.

FREMSTILLING AV CRM T- CELLEEPITOPEN

Det vil bli bemerket ved referanse til eksemplene infra, at et antall variasjoner med hensyn til lengden av peptidet kan utføres uten å affisere aktiviteten overfor T-cellesvaret, og det vil være klart at den foreliggende oppfinnelse anvender ethvert av fragmentene til peptidet som beholder stimulerende aktivitet, men som ikke forårsaker uønskede immunologiske reaksjoner som kan utløses av de naturlige proteinene. Den foreliggende oppfinnelse kan også anvende variasjoner i det aktive peptidet der aminosyresubstitusjoner gjøres i den primære sekvens, uten å affisere aktiviteten til peptidet. Slike substitusjoner er vel kjent for den erfarne fagperson. F.eks. kan substitusjoner gjøres på basis av likhet i polaritet, ladning, løselighet, hydrofobi, hydrofili og/eller den amfipatiske natur til restene det vedgår. Negativt ladede aminosyrer inkluderer asparaginsyre og glutaminsyre; positivt ladede aminosyrer inkluderer lysin og arginin; aminosyrer med ikke-ladede polare endégrupper eller ikke-polare endegrupper som har lignende hydrofilisitetsverdier inkluderer følgende: leucin, isoleucin, glutamin, serin, threonin, fenylalanin, tyrosin.

Fremgangsmåten kan velges fra enhver av de som er kjent innenfor feltet peptidsyntese. Blant de mer vanlig benyttede teknikker er kobling via den solide fasen Merrifieldsyntese

( J. Am. Chem. Soc. 96.: 2986-2983, 1964) der en beskyttet aminosyre er bundet til en resinpartikkel. Aminosyrer som har funksjonelle grupper, f.eks. tyrosin, blir generelt beskyttet med en lett fjernbar blokkerende gruppe. Hver av disse teknikker er like velegnet for dette formålet.

TETANUSTOKSINEPITOPER

I tillegg til identifiseringen av CRM197 T-celleepitoper, ble tetanustoksinmolekylet også undersøkt for tilstedeværelse av T-celleepitoper. For å lokalisere slike epitoper ble tetanustoksinmolekylet kløvet i passende fragmenter ved bruk av en rekke proteaser. Fragmentene som ble dannet på denne måte, ble først testet for deres evne til å stimulere T-celledeling i gnagere. Et sett overlappende peptider som omfattet de aktive fragmentene ble syntetisert og undersøkt med hensyn til T-celle-aktivitet. Foretrukne epitoper er peptidene 961-980 og 1021-1040 av tetanustoksin.

ANTIGEN- T- CELLEEPITOPKONJUGATER

T-celleepitopene kan i den foreliggende oppfinnelse på nyttig måte kombineres med omtrent ethvert antigen, antigendeterminant, eller hapten av medisinsk eller veterinær-medisinsk interesse, der en øking i immunogenisiteten er ønskelig. F.eks. disse antigener kan bli forbundet med infeksiøse forbindelser av bakteriell, viral, parasitt, eller soppopprinnelse; eksemplene inkluderer pneumokokkpolysakkarider, gonokokk ytre membranproteiner, adhesjonsproteiner fra Mvcoplasma pneumoniae, eller overflatesakkarider forbudnet med lipopolysakkarid fra gram-negative bakterier. Flere antigener av denne type kan lett erkjennes av den erfarne fagmann.

En annen gruppe antigene forbindelser som kan bli benyttet som B-celledelen i de immunogene konjugater, er ethvert av de kjente allergener. Eksempler på denne type allergener som kan være anvendbare i den foreliggende oppfinnelse, er B-celledeterminanter fra planter (genus Ambrosia) (Atassi et al., FEBS Letters 188:96, 1985), havregress (Standring et al., Int. Arch. Aller<q>y Appl. Immunol. 83:96, 1987); middproteiner Der pl og Der f (Chapman et al., J. Immunol. 139:1479, 1987); karbohydratepitop fra honningbigif tf osf olysase A2 (Weber et al. , Aller<q>y 42.: 464, 1987); penicillindeterminanter (Ahlstedt et al., Int. Arch. Aller<q>y App. Immunol. 61:91, 1980); karbohydratepitoper fra "sjøspruter" (Oka et al. , J. Aller<q>y Clin. Immunol. 80:57, 1987); og Ascaris-antigener (Darden et al., Immunol. Comm. 7:393, 1978).

Innenfor rammen av denne oppfinnelsen ligger også tumor-forbundne antigener. Blant de bedre karakteriserte antigener er carcinoembryonalt antigen (Kuroki et al., Cancer Res. 4_6:300, 1986; Laferti & Krantz, Mol. Immunol.. 20:421, 1983), adenocarcinomaforbundet antigen DU-DAN-2 (Lan et al., Cancer Res. 45:305, 1985) , og gastrointestinal/pankreatisk forbundet antigen (Magnani, et al. , Cancer Res. 43.: 5489, 1983) .

Av potensiell interesse er også forskjellige antigener som er forbundet med autoimmunsykdommer, slik som reumatoid artritt og lupus erythematoses.

Det vil være klart fra diskusjonen ovenfor at bruken av betegnelsen antigen er ment å omfatte enten hele antigenet eller én av dets determinanter, og det er også ment å omfatte haptenmolekyler som kunne ha nytte av dette ved en øking i immunresponsen som opptrer gjennom konjugering til en bakteriell T-celleepitop. Den foreliggende liste med antigener er kun gitt som eksempler, og andre anvendbare antigener vil lett erkjennes av en som er erfaren i faget.

KAPSULÆRE POLYMERER

Som tidligere vist er bakterielle kapsel-polymerer blant gruppene av antigener som har potensiale til å bli effektivt benyttet i en vaksine, men som bare er svake immunogene i unge mennesker. Benyttet i denne søknaden refererer betegenslen "kapsel-polymerer" til sukker-holdige polymerer, slik som polymerer av sukker, sukkersyrer, aminosukker, polyhydriske alkoholer og sukkerfosfater, og refererer ikke til aminosyre-inneholdende polymerer. Disse "kapsel-polymerer" er ofte referert til i den medisinske litteraturen som "kapsel-polysakkarider" skjønt de kan inneholde bindinger forskjellig fra glykosidbindinger og andre bestanddeler enn sukker slik som de oppført ovenfor.

Kapsel-polymerene (CP) kan oppnås fra mange forskjellige typer bakterier. Disse typene inkluderer Haemophilus influenzae, Streptococcus-arter inklusive pneumoniae (delvis serotyper 1, 4, 5, 6A, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, og 23F) pyo<g>enes og aglactiae, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeru<g>inosa og Staphvlococcus aureus.

CP fra forskjellige bakterier varierer sterkt i immunogenitet i de første år av mennskeliv. Noen er moderat aktive, slik som Streptococcus pneumoniae serotype 3 og Neisseria menin<g>itidis serogruppe A. Følsomheten for systeminfeksjon av innkapslede bakterier er større i det første leveår. Den immunogene respons mot mange bakterielle kapsel-polymerer hos barn er aldersavhengig; det betyr immunokompetanse mot CP øker til voksent nivå ved omtrent 6-års alderen.

Blant de inaktive CP'er er de fra Haemophilus influenzae type b, Sretoccoccus pneumoniae serotype 6 og 12, og Neisseria menin<g>itidis serogruppe C. Eksempler på CP'er som stimulerer en mellomrespons i barn er Stretococcus pneumoniae serotype 19 og 51. Der er også funnet polysakkarider i organismer, slik som Neisseria meningitidis serotye B, som ikke er immunogene i noen aldersgruppe.

Ikke-bakterielle polymerer kan oppnås fra gjær og sopp, f.eks., Crvtococcus neoformans, eller sakkaridenheter funnet utelukkende på kreftceller, eller de er funnet forbundet med allergener.

ANDRE ANTIGENER

Andre antigener som er brukbare i tillaging av en immunogen konstruksjon, inkluderer antigener valgt fra gruppen som består av mikrobiologiske antigener, virale antigener, tumorantigener, allergener, og auto-immunitetsrelaterte antigener. Eksempler på mikrobiologiske antigener omfatter ytre membranproteiner (f.eks. fra Haemophilus influenzae eller Branhamella catarrhalis) og overflateproteiner (f.eks. M-proteinet fra Streptococcus pyogenes). Eksempler på virale proteiner inkluderer F- og G-proteinene til respiratorisk syncytialt virus (RSV).

PRODUKSJON AV ANTIGEN- EPITOPKONJUGATER

Antigen-epitopkonjugatene i den foreliggende oppfinnelse kan bli laget ved enhver av de biologisk aksepterbare metoder kjent i feltet når det gjelder kobling av antigener til bærere. For å sikre den mest effektive utnyttelse av de foreliggende konjugatene, er koblingsmetoden hyppigst kovalent kobling. Mange slike fremgangsmåter er i dag tilgjengelig for kobling av poly- og oligo-sakkarider, proteiner, og peptider til peptidbærere. De fleste fremgangsmåter lager enten amin-eller amid-bånd, eller i noen tilfeller tio-estere.

Koblingskjemier kan bli forandret, til en viss ut-strekning, gjennom syntesen av modifiserte analoger av en T-celleepitop. Slike modifikasjoner kan omfatte, f.eks., tillegging av lysin eller cystein til N-enden i peptidet med eller uten et innskutt element. Slike analogers evne til å stimulere T-celler er blitt sammenlignet med den til det ikke-modifiserte peptidet. (a) Polysakkarider eller oligosakkarider til peptider En brukbar fremgangsmåte for sakkaridkobling er reduserende aminering. Poly- og oligosakkarider har frie reduserende endegrupper som kan bli reduktivt aminert til nitrogenet av den N-terminale aminosyre eller e-aminogruppene til lysin i peptidet. Båndet som dannes er et sekundært amin. Alternativt kan poly- eller oligosakkaridet bli oksydert, f.eks., ved perjodering og gi interne og/eller terminale aldehydgrupper. Aldehydgruppene kan også reduktivt amineres til den N-terminale aminosyre eller til e-aminogruppene i lysin i peptidene.

Korte bifunksjonelle innskutte grupper som har en aminogruppe i én ende og en aktiv gruppe slik som amino, blokkert aldehyd, karboksylsyre eller aktiv ester eller tio-gruppe i den andre ende, kan reduktivt amineres til sakkaridet, og så kobles til peptidet gjennom den andre endegruppe av den innskutte del. a-aminokapronsyre, 4-aminobutyldimetylacetal er eksempel på en slik innskutt gruppe.

Reaksjon av det terminale reduserende sukker med 0-fenylendiamin og nitrofenylhydrazin gir substituerte 1-fenyl-flavazoler. Kobling av de reaktive sakkarider til peptider går gjennom overføring av nitrogruppen til en diazofunksjon.

Aktivering av sakkaridhydroksylgrupper er en alternativ fremgangsmåte. Hydroksylgrupper i sakkarider kan bli aktivert ved bruk av enten cyanogenhalogenid (normalt bromcyano) eller karbonyldiimidazol og gir en derivatisert hydroksyl som kan koble til de N-terminale amino- eller e-aminogrupper i peptidet. Bindingen som dannes er enten en isourea eller karbamat.

Som en tilleggsfremgangsmåte kan sakkarider som har karboksylsyrefunksjonelle grupper, slik som uronsyregrupper eller aldonsyrefunksjoner bli koblet til N-terminale amino- og e-aminogrupper i lysin i peptidene ved aktivering av karboksylgruppene ved dannelse av aktive estere ved bruk av karbodiimider eller isobutylklorkarbonater. Den resulterende bindingen er en amidbinding.

Polysakkarider eller oligosakkarider som har frie aminogrupper kan også bli koblet til peptider enten gjennom karboksylterminalen eller N-terminalaminosyren. Kobling til karboksylterminalenden eller til aminosyrer slik som glutaminsyre er ved aktivering av karboksylsyrefunkjsonen med karbodiimider som beskrevet ovenfor. Kobling til den N-terminale nitrogen eller lysiner er utført ved bruk av en bifuksjonell innskutt gruppe slik som disuccinimidylsubstrat, som reagerer med hver ende som har aminofunksjoner. (b) Proteiner eller peptider til peptider Karboksylsyrefunksjoner kan bli aktivert ved karbodiimider eller klorkarbonater til å gi aktive estere som kan bli reagert med aminogrupper på peptidet. Den resulterende binding er et amid.

Den mer generelle fremgangsmåte for å koble proteiner eller peptider til peptider er bruken av bifunksjonelle kryssbindings-forbindelser. Dette er små innskutte molekyler som har aktive grupper i hver ende. De innskutte molekylene kan ha identiske eller forskjellige aktive grupper i hver ende. De mest vanlige aktive funksjonelle egenskaper, koblingsgrupper og bindinger som dannes:

1. Aldehyd - amino - sekundært amin

2. Maleimido - sulfhydryl - tioeter

3. Succinimido - amino - amid

4. Imidatestere - amino - amid

5. Fenylazider - amino - fenylamin

6. Acylhalid - sulfhydryl - tioeter

7. Pyridyldisulfider - sulfhydryl - disulfid

8. Isotiocyanat - amino - isotiourea.

FORMULERING OG ADMINISTRERING AV VAKSINER

De foreliggende konjugatene kan anvendes ved tillaging av vaksinesammensetninger for behandling av enhver type av mikro-biologisk infeksjon. Konjugatene kan kombineres med enhver av de vanlige brukte farmasøytisk aksepterbare bærere, slik som vann, fysiologisk saltvann, etanolpolyoler (slik som glyserol eller propylenglykol), eller planteoljer, så vel som enhver av vaksinetilsetningene kjent i feltet. De kan også bli opptatt i liposomer. Her omfatter "farmasøytisk aksepterbare bærere" ethvert og alle løsningsmidler, dispersjonsløsninger, anti-, bakterielle og antisoppforbindelser, isotone og absorpsjons-utsettende forbindelser o.l.. Supplementære aktive tilsetninger kan også bli benyttet.

Tilførselsveien er typisk parenteral, dvs. intravenøs, intramuskulær, intraperitoneal eller subkutan. Oral tilførsel er også mulig. Mengden av konjugat benyttet i slik vaksine vil variere avhengig av antigenet som benyttes. Tilpasning og håndtering av etablerte doseområder benyttet med tradisjonelle bærerkonjugater for tilpasning til de foreliggende konjugat-vaksinene er kjent for den erfarne fagmann. F.eks. er den typiske dosen av de kjente bærerkonjugatene som vedrører PRP og CRM omtrent 1-25 fig peptid. Vaksinene og fremgangsmåtene er også spesielt nyttige fordi de fleste barn er allerede blitt "utfordret" ("primed") ved tilførsel av difteri- og tetanusvaksiner kort etter fødselen. Konjugatene fremstilt i den foreliggende oppfinnelse er ment for bruk i behandling av både umodne og voksne varmblodige dyr, og spesielt mennesker. De sykdommene for hvilke effektiv beskyttelse kan oppnåes med den forliggende fremgangsmåte vil være klare for fagmannen ved å lese denne fremstillingen. Heller ikke bruken av de foreliggende fremgangsmåter og konjugater er begrenset til preventiv bruk (beskyttelsesbruk); behandlingsmessig bruk er også innbefattet.

I en foretrukket utførelsesform, er konjugatet et bakterielt kapselantigen, eller et antigent fragment av dette konjugert til T-celleepitopen fra et difteritoksin. Denne kombinasjonen er gunstig i behandlingen av meningitt. Denne tilstanden som oftest er forårsaket av H^ influenzae b, opptrer i barn som er mindre enn 6 år, med omtrent 60% av tilfellene tilstede i barn under 2 år. Beskyttelse mot denne sykdommen har vært vanskelig å oppnå i barn under 18 måneder med vanlige vaksinesammensetninger. De foreliggende sammen-setninger gir imidlertid en betydelig antistoffproduksjon p.g.a. T-cellerekruttering.

De følgende ikke-begrensende eksempler demonstrerer utviklingen og effektiviteten til de foreliggende T-celle-epitopkonj ugatene.

EKSEMPLER

FREMGANGSMÅTE FOR FASTFASE- PEPTIDSYNTESE

Syntetiske peptider ble konstruert ved bruk av den trinnvise fastfase-fremgangmsåten til Merrifield (1963) på en Applied Biosystems Model 430A Peptide Synthesizer. Alle syntetiske peptider ble satt sammen på en uløselig kopolymer-harpiks fremstilt av styren og divinylbenzen. Alle aminosyrer benyttet i sammensetningen av disse peptider ble tilført med a-aminogruppen beskyttet av en t-BOC(t-butylOoksykarbonyl)-del. Peptidkjedene er bundet til harpiksen gjennom en "PAM"

(fenylacetamido)bindedel.

Prinsippet for fastfase-syntese er kort beskrevet som følger. En ekvivalent av t-BOC-beskyttet aminosyre lagret som et tørt pulver i et enkeltstående glass oppløses i diklormetan (DCM) og overføres til aktivatorkaret, hvor det blir aktivert med en halv ekvivalent av dicykloheksylkarbodiimid (DCC) og gir (a-aminobeskyttet, t-BOC) aminosyresymmetriske anhydrid som benyttes som acylerende forbindelse. Det symmetriske anhydridderivatet blir overført til konsentratorkaret, mens det uløselige biprodukt, dicykloheksylurea, blir løst opp i metanol-DCM og vasket vekk fra aktivatorkaret. I konsen-treringskaret blir DCM fjernet og erstattet med N,N-dimetyl-formamid (DMF), som er løsningsmidlet benyttet for å øke effektiviteten av koblingsreaksjonen mellom det symmetriske anhydridet og peptidene som blir samlet på opplastede PAM-harpikser. Etter skifte av løsningsmiddel, blir det symmetriske anhydrid tilsatt reaksjonskaret. Før tilsetningen av det symmetriske anhydrid i DMF, har peptidresinet i reaksjonskaret blitt N-(alfa)Tavbeskyttet med TFA/DM C blanding, vasket med DCM, og nøytralisert med N,N-diisopropyl-etylamin/DMF-løsning. Etter tilsetningen av symmetrisk anhydrid til reakjsonskaret, blir koblings-reaksjonen utført, og den resulterer i kovalent kobling av den aktiverte karboksyl i t-BOC-aminosyre til den avbeskyttede a-aminogruppe i det harpiksbundede peptidet. Når syntesen er komplett, blir reaksjonskaret tømt etterfulgt av vasking med DMC, og på den måte forberedes peptidharpiksen for neste syntesesyklus.

De symmetriske anhydridderivatene ble benyttet som acyleringsforbindelsene for mesteparten av aminosyrene bortsett fra asparagin, glutamin og arginin. Disse tre aminosyrer ble koblet som 1-hydroksybenzotriazolestere. De reaktive sidekjedene til aminosyrene ble beskyttet under syntesen av peptidkjedene. Beskyttelsesgruppene som ble benyttet var 0-benzyl for Asp, Glu; benzyl for Ser, Thr; 4-metyl-benzyl for Cys; tosyl for Arg, His; 2-Cl-karbo-benzoylkarbonyl for Lys; 0-(p-brombenzyoksykarbonyl) for Tyr; formyl for Trp. Fullstendigheten i koblingen på hvert trinn ble overvåket av en kvantitativ ninhydrinmetode (V.K. Sarin et al.. 1981) som måler gjenværende frie a-aminogrupper på peptidharpiksen. Typisk ble koblingseffektiviteter større enn 99,5% oppnådd. Hvis koblingseffektiviteten er ikke-aksepter-bar, ble syntesen gjentatt med en 'dobbeltkobling' syklus av den vanskelige rest.

Etter syntesen ble hvert peptid spaltet enkeltvis fra harpiksen med 10 ml vannfri flytende HF, hvortil tilsattes

1 ml dimetylsulfid, og 1 ml av 1:0,2 molar blanding av anisol og p-tiokresol. Disse spaltningsreaksjonene ble utført ved -8°C i 50 min.. Straks etter spalting ble harpiksen vasket med 3-25 ml deler vannfri dietyleter for å fjerne enhver organisk urenhet som kunne være igjen. Endelig ble det urene peptidmaterialet ekstrahert fra harpiksen med 3-10 ml vasker av fortynnet (3 0% v/v) løsning av iseddik i vann. Ekstraktene ble kombinert i en 100 ml pæreformet kolbe og eddiksyre/vann-løsningen fjernet ved rotasjonsfordampning. Den tørkede rest som ble igjen, ble tatt opp i et minimum volum på 0,1% TFA/H20, overført til en 150 ml frysetørkingskolbe, og frosset raskt i flytende nitrogen og frysetørket over natten.

KJEMISK KARAKTERISERING AV SYNTETISKE PEPTIDER

Renheten til det syntetiske peptidet ble bedømt først ved reversfase-HPLC, fortrinnsvis ved bruk av to forskjellige gradientbetingelser. Et peptid som eluerte som en enkel homogen topp med større enn 95% av totalområdet i HPLC-kromatogrammet, ble underkastet direkte aminosyresekvensering for videre analyse.

A. HPLC-analyse. Det spaltede, urene peptidet ble analysert ved HPLC på en Vydac C4-analytisk søyle (4,6 mm x 250 mm) ved bruk av en gradient på 0-60% acetonitril i 30 min.. Hvis gradienten var utilstrekkelig, ble den følgelig forandret for å optimalisere toppoppløsningen i den urene blandingen. Også andre kromatografiske faktorer ble vurdert slik som kolonnestørrelser, pakke-effektivitet, partikkel-størrelser, bindingskjemi av pakkematerialer, og løselighets-karakteristika til peptidblandingene under HPLC-rensings-prosessen. Med en gang en passende separeringsprotokoll hadde blitt oppnådd for hvert peptid, ble disse rensebetingelser overført til en semi-preparativ versjon ved bruk av Vydac C4-kolonne (10 mm x 250 mm) for å oppnå milligram til grammengder av renset produkt. Renset materiale ble deretter rekromatografert under analytiske betingelser for å bestemme den endelige renhet av produktet; et akseptabelt nivå var større enn 95%.

B. Aminosyresekvensanalyse. Før sekvensering, ble det lyofiliserte peptidet løst opp i 0,1% TFA/vann. Omtrent 500 pikomol ble satt på et polypren-dekket glassfiberpapir før starten på den automatiserte, repetitive Edman-degradering med en Applied Biosystems 477A pulset væske-protein/peptid-sekvensator utstyrt med en direkte linje modell 12OA PTH-analysator. Etter hver Edman-degradering, ble fenyltia-zolinonderivatet som var dannet fra hver aminosyre overført til det mer stabile fenyltiohydantoin (PTH) derivatet ved behandling med 25% TFA ved 64°C i 20 min..

PTH-derivatene ble separert ved revers-fase HPLC over en Brownlee C-18 kolonne (220 mm x 2,1 mm) ved bruk av et to-løsningsmiddelgradientsystem som bestod av løsning A (per liter): 5% tetrahydrofuran som inneholder 3M natriumacetat-buffer (27,0 ml pH 3,8 og 6,2 ml pH 4,6) og løsning B (per liter): acetonitril som inneholder 50 0 nanomol oksydant fanger ("scavenger"), N,N-dimetyl-N-fenyltiourea (DMPTU). For å forbedre formen på de kromatografiske toppene og oppløselig-heten av PTH-histidin og PTH-arginin, ble 0,5 ml 12,5% tri-metylamin tilsatt løsning A. Nominelle HPLC parametere var som følger: strømhastighet på 200 jiL/min. ; detektor-bølgelengde 254 nm, og kolonnetemperatur 55°C. Optimal separasjon av PTH-derivatene ble oppnådd med den følgende lineære gradinet: 12% B ved tid 0 min., 38% B ved tid 18 min., 38% B ved tid 25 min., 90% B ved tid 25,1 min., 90% B ved tid 29 min.. Hver PTH syklus ble identifisert ved sammenligning med et standardkrornatogram av en blanding av PTH-aminosyrer (Applied Biosystems).

T- CELLEAKTIVERING

A. T- celledeling hos gnagere. Lymfeknuter fra lysken og rundt livpulsåren ble tatt ut sterilt fra mus som tidligere hadde vært immunisert med en optimal dose av antigen emulgert (1:1 vol:vol) i komplett Freund's adjuvans. En enkeltcelle-suspensjon ble laget i RPMI som inneholdt 10% fetalt bovin-serum. Etter en enkel vasking ble cellene resuspendert i RPMI uten serum og telt ved trypanblått-eksklusjon med et fasekontrastmikroskop. Celletallet ble justert til en konsentrasjon på 3 x IO<6> celler/ml i RPMI som inneholdt 2% normal museserum. Forskjellige konsentrasjoner av antigener, mitogener eller annet kontrollmateriale ble laget i RPMI uten serum og fordelt (0,1 ml) i triplikate prøver i 96 brønner, flatbunnete vevskulturbehandlede plater. Et stort dose-område ble benyttet vanligvis for alle antigenene. Til disse platene ble 0,1 ml cellesuspensjon tilsatt. Således var den endelige cellekonsentrasjon 3 x IO<5> celler/brønn i medium som inneholdt 1% museserum. Etter tilsetning av cellene ble kulturene plassert i en fuktig, 5% C02 inkubator ved 37°C. Etter 3 dager inkubasjon, ble kulturene tilsatt i 18 timer 1 /zCi/brønn med [3H] -thymidin og høstet for telling ved hjelp av væskescintillasjon. Thymidinopptak er uttrykt som gjennomsnittet av flere eksperimentelle verdier minus gjennomsnittet av flere ikke-stimulerte (bakgrunn) verdier.

B. Celledeling av humane T- celler. Blod ble samlet fra frivillige i hepariniserte rør og så fortynnet (1:1) med varm (3 7°C) RPMI uten serum. De perifere blodleukocytter ble isolert ved å legge det fortynnede blod (25 ml) over 15 ml Ficoll histopaque (Sigma). Etter sentrifugering (1500 opm, 5 min.) ved romtemperatur ble cellene på Ficoll-blodovergangen tatt ut og vasket (3X) med RPMI som inneholdt 10% fetalt bovinsersum. Etter sluttvasken ble cellene oppslemmet i RPMI uten serum og telt ved trypanblått-eksklusjon ved bruk av fasekontrastmikroskopi. Celletallet ble justert til 0,75 x IO<6 >celler/ml i RPMI inneholdende 20% samlede humane sera. Forskjellige konsentrasjoner av antigener, mitogener eller annet kontrollmateriale ble laget i RPMI uten serum og fordelt (0,1 ml) i tre like prøver i 96 brønner, rundbunnet vevskulturbehandlede skåler. En lang rekke doser ble vanligvis benyttet for alle antigener. Til disse platene, ble 0,1 ml cellesuspensjon tilsatt. Således var den endelige cellekonsentrasjon 0,75 x IO<5> celler/brønn i medium som inneholdt 10% humant serum. Etter tilsetning av cellene ble kulturene plassert i en fuktig, 5% C02 inkubator ved 37°C. Etter 6 dager inkubasjon, ble kulturene pulsmerket i 6-8 timer med 1 ^tCi/brønn av [3H] -thymidin og høstet for telling ved hjelp av væskescintillasjon. Thymidinopptak er uttrykt som gjennomsnittene av flere like eksperimentelle verdier minus gjennomsnittet av like ikke-stimulerte (bakgrunn) verdier.

UTVIKLING AV HbO- PEPTIDKONJUGATER

A. Utvikling av Haemophilus influenzae type b oligosakkarid ( HbO). Polysakkaridet av Hib (PRP) oppløses i vann og en tilstrekkelig mengde natriumfosfatbuffer (2M, pH 7,0) tilsettes for å bringe den endelige løsningen til 0,2M fosfat. Natriummetaperjodat (0,2X mol av PRP) tilsettes i én porsjon under rask omrøring. Løsningen får stå i mørket ved 4°C over natten. Det urene oligosakkaridet ultrafiltreres først på en 30.000 MW ekskluderende membran for å fjerne de større oligosakkaridene, og filtratet ultrafiltreres på en 10.000 MW ekskluderende membran for å fjerne de lavere-molekylvektoligosakkaridene og beholde det som ikke går igjennom (retentatet). Retentatet kromatograferes på en Biogel P-100-søyle i saltvann, og fraksjonene analyseres på ribose og reduserende grupper ved hhv. Orcinol og Park-Johnson-metoder. Typisk har oligosakkaridene en gjennom-snittlig Dp på 20. Det rensede oligosakkarid blir så frysetørket og lagret ved -20°C.

B. Syntese av HbO- peptidkoniugater. Peptidet løses opp i ikke-vandig DMSO i en konsentrasjon på 5 mg/ml. Løsningen blir så tilsatt til 2X molmengden av frystørket HbO. Mengden av HbO benyttet i reaksjonen kan varieres fra IX til 2X avhengig av type peptidkonjugat som skal syntetiseres; dobbelt- eller enkel-endet. Reaksjonsblandingen blir inkubert ved 37°C i 24 timer, og så blir 10X mol (basert på HbO) natriumborhydrid oppløst i et lite volum DMSO tilsatt. Løsningen blir inkubert i nye 24 timer, og så blir vann tilsatt i samme volum som DMSO. Overskuddet natriumborhydrid blir reagert med en liten mengde eddiksyre, og produktet løses opp i vann eller saltvann. Ikke-reagert peptid kan fjernes ved størrelseseksklusjonskromatografi eller dialyse ved bruk av 6-8.000 MW ekskluderende membran. Konjugering av HbO til peptidet ble bekreftet ved Western blot-analyse.

POLYAKRYLAMIDGELELEKTROFORESE ( PAGE)

PRP-peptidkonjugatene ble løst opp i 100 /zl av prøve-buffer (0,2M Tris buffer som inneholdt 5% SDS, 0,025% bromfenolblått, 10_<1>M 2-ME og 20% glyserol) og varmet i 5 min. ved 100°C. De fleste rutineanalyser ble utført ved bruk av Bio-Rad Mini Proteingelsystem (Redmond, CA). Gelene var 1,5 mm tykke og separeringsgelen inneholdt 15% akrylamid med akrylamid-til-bisforhold på 30:0,8, 0,375M Tris-HCl pH 8,8 og 0,1% SDS. Konsentreringsgelen inneholdt 4,8% akrylamid med det samme forhold av akrylamid til bis, 125 mM Tris-HCl pH 7,0 og 0,1% SDS.

10-15 fil som inneholdt 1-10 /xg prøver ble satt til hvert spor. Etter elektroforese ble gelene farget i minst 1 time med 0,125% Coomassieblått i etanol:eddiksyre:vann (5:1:5), så avfarget i samme løsningssystem uten fargen. På forhånd fargede molekylvektstandarder (fosforylase b, 92.500; bovin-serumalbumin, 69.000; ovalbumin, 43.000; og kullsyreanhydrase 30.000) ble benyttet for å hjelpe bestemmelsen av de relative molekylvektproteinene. Duplikat gel uten farging ble benyttet for Western-analyse.

WESTERN BLOTANALYSE

Prøver separert på PAGE ble overført elektroforetisk til nitrocellulosemembraner i et Hoeffer Transphor-apparat ved 0,45 mamps i 90 min. i 25 mM Tris-383 mM glycin pH 8,8 ved romtemperatur. Med en gang proteinoverføringen var komplett, ble nitrocellulosemembranene senket i BLOTTO (5% ikke-fett tørrmelk i fosfatbufret saltvann) ved 37°C i 1 time. Membranene ble prøvet med en forhåndsbestemt konsentrasjon av antistoff mot PRP eller CRM197 i 1 time ved 37°C og vasket med BLOTTO i 20 min. ved 37°C. Bundne antistoffer ble oppdaget med pepperrotperoksydasekonjugert geit-anti-mus (Kirkegaard og Perry, M.D.) i 1:250 fortynning i BLOTTO i 1 time ved 37°C. Blottene ble vasket 3 ganger med PBS og utviklet med PBS som inneholdt 0,01% hydrogenperoksyd; 0,06% 4-klor-l-naftol (Sigma Chemical Co., MO) i metanol i 20 min. ved romtemperatur. Reaksjonen ble stoppet ved å overføre filtrene til destillert vann og filtrene tørket ved blotting.

IMMUNISERING

For første immunisering av murine T-celler ble difteritoksoid, CRM eller CRM-peptider løst i fosfatbufret saltvann og emulgert i et likt volum Freund's komplett adjuvans. Mus fikk 0,1 ml av emulsjonen som inneholdt en optimal konsentrasjon av antigen subkutant i haleroten. Maksimal T-celle reaksjon ble vanligvis observert 1 uke senere.

For å immunisere for antistoffsvar, fikk musene vanligvis 2,5 fig av PRP-CRM konjugat eller 5 fig av PRP-peptidkonjugater suspendert i fosfatbufret saltvann. Konjugatene ble tilsatt i et volum på 0,1 ml intramuskulært uten bruk av adjuvans. Enhver etterfølgende immunisering ble gjort med 2 ukers intervaller ved bruk av samme dose og injeksjonsvei.

FARR- METODE

Antistoff mot PRP ble bestemt ved standardisert Farr-radioimmunoforsøk. Forskjellige fortynninger av sera, sera-standard og prøvekontroller ble laget i fetalt bovinsera og 25 fil prøver overført, i duplikat, til 1,5 ml Eppendorf-rør.

[<3>H]-PRP (50 fil) med [<3S>C1]-isotop ble tilsatt til alle rørene. Prøvene ble omrørt og inkubert over natten ved 4°C. Mettet ammoniumsulfat (75 fil) ble tilsatt til alle prøver og deretter ble prøvene rysterørt og inkubert ved 4°C i 4 0 min.. Supernatanten ble omhyggelig samlet og 400 fil av destillert vann tilsatt alle bunnfallene. Etter rysterøring ble alle innholdene av rørene og røret selv plassert i et scintilla-sjonsrør som inneholdt 10 ml av scintillasjonsvæske. Etter kraftig omrøring ble rørene telt på en væskescintillasjons-teller. Konsentrasjonen av antistoff bundet til PRP ble beregnet i sammenligning med en kjent standard, fra den lineære delen av en kurve mellom CPM og serumfortynning.

ELISA- METODE

Antistoff mot CRM ble bestemt ved en standardisert ELISA-metode. For å utføre metoden ble 96 brønns polystyrenplater dekket natten over ved 37°C i en inkubator med fuktig atmosfære med 100 /il/brønn CRM197 (1 fig/ ml i 0,1M karbonatbuf f er, pH 9,6). Brønnene ble vasket (3X) med fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholder 0,05% Tween-20 og blokkert med 200 /xl/brønn PBS som inneholder 0,1% gelatin i 45 min. ved romtemperatur. Etter vasking (2X) med PBS-Tween ble 100 /xl/brønn av sera fortynnet med fortynningsmiddel (PBS som inneholdt 0,05% Tween-20 og 0,1% gelatin) tilsatt. Platene ble inkubert i 90 min. ved romtemperatur og så vasket (3X) med PBS-Tween. Et sekundært antistoff (100 /il/brønn av 1:1000 fortynning av geit-mus alkalisk fosfatasekonjugat) i fortynningsmiddel ble tilsatt og inkubert i 6 0 min. ved romtemperatur og vasket (3X) med PBS-Tween. Substrat (100 til/brønn av p-nitrofenylosfat 1 mg/ml i dietanolamin som inneholdt MgCl2 x 6H20 ved pH 9,8) ble tilsatt og inkubert i 60 min. ved romtemperatur, hvoretter reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 150 /il/brønn 2M natriumhydroksyd. Optisk tetthet ved 410 og 690 nm ble avlest ved bruk av BioTek 310 Autoleser.

BESTEMMELSE AV IMMUNOGLOBULINKLASSE OG SUBKLASSE

Klassen og subklassen av antistoffer spesifikke for PRP ble utført i en ELISA-metode. En polystyren 96-brønners plate ble dekket med en 1/2000 fortynning av PRP-tyramin i PBS. Antigenet (100 jul/brønn) ble inkubert i 90 min. ved 37°C, og så ble platene vasket (2X) med PBS og blokkert ved inkubasjon i 60 min. ved romtemperatur med 200 /il/brønn PBS som inneholdt 0,1% gelatin. Etter vask (2X) med PBS, ble 50 /il testsera fortynnet i fortynningsmiddel (PBS som inneholder 0,05% Tween-20 og 0,1% gelatin) tilsatt, og platene ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur og så vasket automatisk med PBS som inneholdt 0,1% Tween-20. Til brønnene ble 100 /xl/brønn av den rette fortynning av geit eller kanin-anti-mus-immunoglobulin (klasse eller subklasse spesifikke) alkalisk fosfatasekonjugat tilsatt i 2 timer ved romtemperatur. Platene ble automatisk vasket som ovenfor. Til brønnene ble 200 /il substrat (p-nitrofenylfosfat, 1 mg/ml i dietanolamin som inneholdt MgCl2 x 6H20 ved pH 9,8) tilsatt og inkubert i 60 min. ved romtemperatur. (Avhengig av tilgjengeligheten på anti-sera-enzymkonjugater kan imidlertid andre enzymsubstrat-kombinasjoner benyttes). Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 50 til/brønn med 2M natriumhydroksyd. Optisk tetthet ved 410 og 690 nm ble lest ved bruk av en Bio-Tec 310 Autoleser.

PRODUKSJON AV TETANUS TOKSINFRAGMENTER

Tetanuseksotoksin ble løst opp ved oppvarming ved 100°C i 5 min. i prøvebuffer som inneholder 0,1 M DTT og 2% SDS og så gjenstand for SDS-PAGE. To fremstående proteinbånd, som representerer H- og L-kjedene i tetanustoksinet, ble kuttet ut fra SDS-gelen og ekstrahert ved elektro-eluering i 3 timer ved 25v i 50 mm NH4C03, 0,2% SDS og lmm DTT ved pH 8,2. Etter elektro-eluering, ble materialet lyofilisert og så løst opp umiddelbart før T-cellecelledelingsmetoden. C-fragment ble kjøpt fra Calbiochem, CA.

Proteinfragmenter som ble funnet å være spesielt aktive ved å aktivere murine T-celler, ble gjenstand for proteolytisk fordøyelse i et forsøk på å definere videre T-celleepitoper. Ved bruk av et fordøyelsessystem komponert av 0,125M Tris-HCl, 0,05 M DTT, 0,5% SDS og 10% glyserol ved pH 7,0, ble protein-fragmentene inkubert ved 37°C i 3 0 min. med enten 67 /xg/ml chymotrypsin, 5/xg/ml pronase, 3 /xg/ml ficin, 0,4 /xg/ml subtilisin eller 62,5 /xg/ml v8 protease. Peptidene som ble dannet på denne måten kan adskilles ved revers-fase-HPLC ved bruk av en Vydac C4-kolonne. De isolerte fragmentene kan så undersøkes m.h.t. evne til å stimulere T-celler.

RESULTATER

ANTATTE T- CELLEEPITOPER I CRM

DeLisi og Berzofsky-algoritme ( PNAS 82:7848, 1985) for projeksjon av mulige amfipatiske regioner ble benyttet på den primære sekvens mot CRM som et første valg. Computeranalyse av molekylet avslørte 6 regioner innen proteinet, som vist i figur 1, som tilfredsstillet kriteriet for en mulig T-celleepitop. Disse regionene ble identifisert som restene 1-17, 112-135, 229-256, 306-334, 357-380 og 386-408. Hver av disse regioner er satt sammen av minimum 7 sammenhengende rester som undersøkt i sammenheng med den primære sekvensen av proteinet har en tendens til å danne en alfa-heliksstruktur. I tillegg ble region 158-173 også vilkårlig valgt til å tjene som et negativt kontrollmateriale siden det fra computer-analysen ikke er ventet å dannes en alfa heliksstruktur. Disse peptidene, ble derfor sentrum for de første studiene for å finne frem til T-celleepitopene i CRM.

ANALYSE AV SYNTETISKE PEPTIDER

De syntetiske CRM-peptidene med deres aminosyresekvens er vist i tabell 1. Som beskrevet ovenfor ble forskjellige grupper av overlappende peptider dannet ved å addere til de N-terminale ender ekstra aminosyrerester ved hjelp av en fast-fasemetode.

Tabell 1 gir også den gjennomsnittlige trinnvise koblingseffektivitet for hvert syntetisk peptid. I alle tilfeller overskred den gjennomsnittlige effektivitet 99%. Basert på den trinnvise koblingseffektivitet ble det kumulative teoretiske utbyttet av syntesen også kalkulert; denne teoretiske verdi indikerer prosent utbytte av peptidene som har den korrekte aminosyresekvens ved avslutning av syntesen. Den endelige kolonnen i tabell 1 viser renheten til den urene peptidblandingen som bestemt ved revers-fase HPLC-analyse. En typisk HPLC-analyse av et urent syntesemateriale (peptid 6) er vist i figur 2A. Peptidet eluerte som en hovedtopp ved 25,8 mins og utgjorde 66% av det totale areal. Fraksjonene i dette peptidmaterialet ble samlet, konsentrert og rekromatografert som avbildet på figur 2B. Det resulterende kromatogram indikerte en renhet på 95% eller større.

I alle tilfeller der det urene peptidmaterialet hadde mindre enn 95% renhet (tabell 1), ble det utført én eller flere tilleggs HPLC kjøringer for ,å oppnå et endelig homogent produkt.

Den korrekte sekvensen av de syntetiske peptidene ble som vist i tabell 1 bestemt ved direkte aminosyresekvensering.

Som et illustrerende eksempel, viser figur 3 selekterte kromatogrammer av PTH-derivatene i enkel bokstavforkortelse fra 0,5 nanomol HPLC-renset peptid 6 satt på TFA-behandlet glassfiberstykker. Tallene korresponderer med Edman-syklus; toppene a og b er hhv. N'N-dimetyl-N'-fenyltiourea og N'N-difenyltiourea, som er biprodukter fra Edman-reaksjonen. Hver av PTH-kromatogrammene ble oppskalert til den største identi-fiserbare aminosyretopp. Som ventet økte nivået av bakgrunns "støy" ved de høyere syklustall; ikke desto mindre var det god overensstemmelse mellom aminosyretoppen for de indikerte cykler med den kjente sekvensen (tabell 1). Undersøkelse av "forhåndsundersøkte" rester (Kent et al., 1982) for hver syklus antydet også fraværet av delesjonspeptider; slik at det videre støttet homogeniteten av det endelige produktet.

WESTERN BLOT ANALYSE AV PRP- PEPTIDKONJUGATER

Den kovalente kobling av PRP til de forskjellige peptidene ble bekreftet kvalitativt ved Western blot-analyse med monoklonale antistoffer spesifikke for PRP. Som vist i figur 4 ble alle peptidkonjugatene undersøkt (PRP, peptid 357-380; PRP, peptid 306-334; og PRP kort, peptid 366-383) funnet å bestå av et bredt, kontinuerlig område med tilsynelatende molekylvekt. Noe materiale ble værende igjen i konsentreringsgelen. Mønsteret til peptidkonjugatene var meget likt det av PRP-CRM. Derimot var PRP, som ikke ville være ventet å binde seg til nitrocellulose ved overføring, alene ikke mulig å oppdage. Derfor antyder dette at båndene som ble oppdaget, representerer PRP kovalent koblet til proteiner eller peptider bundet til nitrocellulosen. Det brede båndet av disse konjugatene kan skyldes glykosylering av peptider med ulike oligosakkaridarter.

IMMUKNOGENITETPEPTIDPROFIL FOR MURIN T- CELLE

For å bekrefte eksperimentelt hvorvidt eller ikke de antatte regioner av CRM faktisk var i stand til å utløse et T-cellecelledelingssvar, ble svaret av DT-forhåndsbehandlede lymfeknyteceller til disse peptider undersøkt. Som vist i tabell 2, svarte lymfeknuteceller oppnådd fra DT-immunmus, som ventet', spesifikt på DT og CRM, men ikke på TT. I tillegg, ga disse cellene også en vesentlig reaksjon på in vitro utfordring med én av de sannsynlige T-celleepitopene, spesifikt region 357-380. Marginale reaksjoner på regionene 306-334 og 386-408 ble også observert. Intet svar ble observert mot region 158-173, det negative kontrollpeptidet, eller et ikke-beslektet RSV-peptid. I tillegg reagerte cellene riktig på både T-celle-mitogenet, Con A og B-celle-mitogenet, lipopolysakkarid (LPS). Derfor var av seks potensielle T-celleepitoper identifisert ved computeranalyse, bare region 357-380 i stand til å stimulere et T-cellesvar i den gnagermodellen som ble benyttet.

a Mus ble immunisert med en optimal konsentrasjon av 50 /xg DT emulgert i Freund's komplette adjuvans.

b Kulturer ble behandlet med et bredt spektrum (0,05 - 100 /xg/ml) av proteiner eller peptider. Bare det maksimale observerte svar er vist.

PEPTIDANALOG IMMUNOGENISITETPROFIL

FOR MURINE T- CELLER

For å undersøke muligheten av alternative koblingskjemier ble modifiserte analoger av CRM T-celleepitop 366-383 laget. Modifikasjonene inkluderte påsettingen av lysin eller cystein til den N-terminale ende av peptidet med eller uten et innskutt element. Kapasiteten av analogene til å stimulere murine T-celler ble så sammenlignet med den for det ikke-modifiserte peptidet.

Resultatene av T-cellestimuleringsmetoder er vist i tabell 3. Studiet viste at analogene fra CRM-peptid 366-383 beholdt i sammenligning med 366-383 selv mesteparten av egenskapen til å stimulere DT eller CRM197 forhåndsbehandlede T-celler. Således kan betydelige forandringer bli gjort i denne T-celleepitopen uten å hindre dets effektivitet når det gjelder å stimulere T-celleaktivitet. Som vist kan disse modifikasjoner være med tanke på forbedret kobling (eksemplet vist gir e-aminogrupen for mer efffektiv kobling), med det formål å gi tilgang på forskjellige koblingsteknologier (eksemplet vist gir et cysteinresidu), eller for å bedre T-celle-reaktivitet (ikke vist). Disse modifikasjoner utvider nytten av peptidbærere ved å tillate kobling til et stort antall B-celleepitoper.

IMMUNOGENITETPEPTIDPROFIL FOR HUMAN T- CELLE

I tillegg til å undersøke gnager T-celle-responsen til de sannsynlige T-celleepitopene, ble peptidresponsprofilen eller perifere blodleukocytter fra flere frivillige mennesker undersøkt. Individene ble valgt tilfeldig og ble ikke med hensikt immunisert med DT før undersøkelse. Derfor, var svaret til DT ventet å variere som et resultat av individuelle historier og ut fra deres spesielle genetiske komposisjon. To av de fire individene ga meget lave svar til DT eller CRM og var også uten reaksjon til noen peptid (data ikke vist), og viste derved at peptidene manglet enhver mitogen, ikke-antigen spesifikk aktivitet. Som vist i tabell 4, reagerte de gjenværende individer skikkelig til DT, CRM og TT og ga forskjellige grader svar på in vitro behandling med hver av CRM-peptidene. Vedvarende og positive svar i begge individer ble observert med peptidene 306-334, 357-383 og 386-408. Et positivt svar på fytohemagglutinin (PHA), et menneske T-cellemitogen, ble også observert.

a Kulturer ble behandlet med et vidt spektrum (0,05 -

100 itg/ml) av proteiner eller peptider. Bare det maksimale observerte svar er vist.

ANTI- PEPTID T- CELLESVAR

Etter demonstrasjon av at region 357-380 av CRM ble gjenkjent av DT-forhåndsbehandlede T-celler som en T-celleepitop, var det nødvendig å bestemme hvorvidt eller ikke peptidet selv var et effektivt immunogen. SJL-mus, ble derfor immunisert med 100 /ig av CRM (357-380) eller 50 fig av DT eller CRM. En tilleggsgruppe mus mottok 100 /xg CRM (306-334) som et alternativt peptid for å vise spesifisiteten i svaret. Som vist i tabell 5, svarte T-celler fra mus immunisert med DT som ventet til DT, CRM og peptid CRM (357-380). Et lignende reaksjonsmønster ble observert med celler fra mus immunisert med CRM skjønt svarene på CRM og peptidet var vesentlig høyere. Det er interessant at CRM (357-380) forhåndsbehandlede celler svarte spesifikt på utfordringen med CRM (357-380) så vel som kryssreagerte med CRM-proteinet. Derimot ga ikke CRM (306-334) forhåndsbehandlede celler et nevneverdig svar på in vitro behandling med noen av proteinene som var undersøkt og reagerte bare svakt på behandling med det immuniserende peptid 306-334 selv. Alle cellene, svarte imidlertid godt på både Con A og LPS. Det er klart, at region 357-380 ikke er bare en T-celledeterminant i CRM, siden det gjenkjennes av celler forhåndsbehandlet med det naturlige proteinet, men det er også i stand til å aktivere antipeptid T-celler som kan gjenkjenne det naturlige proteinet.

a Mus ble immunisert med 50 fxg protein, enten DT eller CRM, eller 100 fig peptid, enten CRM(306-337) eller CRM(357-380) emulgert i Freund's komplette adjuvans.

b Kulturer ble behandlet med en lang rekke (0,05 - 100 iig/ml) proteiner eller peptider. Bare de maksimale observerte svar er vist.

DEFINISJON AV T- CELLEGRENSER

For å definere den minste sekvensen innen region 3 57-3 80 som var nødvendig for å utløse et T-cellesvar, ble et sett peptider syntetisert som varierte i N-enden. For i tillegg å sikre at den fulle T-celleepitopen ville være innenfor dette sett peptider, ble C-enden etablert på rest 384 som var fire rester utenfor grensen av det aktive peptidet, 357-380. De følgende peptidene, ble derfor laget og undersøkt for T-cellereaktivitet: 357-383, 362-383, 366-383, 372-383 og 373-3 83. Som vist i tabell 6, reagerte mus som var forbehandlet med enten DT eller CRM likt på enten peptid 357-380 eller til peptid 357-383, skjønt svaret på 357-383 var litt høyere. Det korte peptidet 362-383 var likt med 357-383 i å stimulere DT-forbehandlede T-celler, men var mer effektive enn det lengre peptidet i stimulering av CRM-forbehandlede T-celler. Det er interessant at fjerning av fire tilleggsrester, peptid 3 66-3 83, hadde en dramatisk effekt på T-cellegjenkjennelse. Med både DT og CRM forbehandlete T-celler ble et sterkt øket svar observert på in vitro-behandling med dette peptidet. Fjerning av tilleggsrester, som vist med peptidene 372-383 og 373-383, resulterte i reduserte T-cellesvar i både DT- og CRM-forbehandlede celler. I tillegg reagerte begge grupper celler på riktig måte på DT, CRM og mitogenene.

For å definere videre epitopen innenfor denne region, ble to sett peptider syntetisert. Et sett av peptider bestod av en serie av peptider med en C-ende bestemt ved rest 383 mens den N-terminale ble variert trinnvis fra rest 357 til rest 373. Det andre sett peptider beholdt N-enden ved rest 366 mens den C-terminale varierte trinnvis fra rest 375 til 383. Begge sett peptider ble undersøkt ved T-celledeling.

a Mus ble immunisert, med en optimal konsentrasjon på 50 fig DT eller CRM emulgert i Freund's adjuvans.

b Kulturer ble behandlet med en lang rekke (0,1 - 200 /xg/ml) proteiner eller peptider. Bare den maksimale observerte respons er vist.

Tre individuelle eksperimenter ble utført med lignende resultater. Et representativt eksperiment er vist i tabell 7. I kartlegging av N-terminalen, ble sammenlignbar T-celle-aktivitet observert med inklusive peptidsubsettet 357-383 til 3 70-383 i både de DT- og CRM-forbehandlede gruppene. Fjernelse av N-terminale rester 371, 372 eller 373 resulterte i sterke fall i T-celle-aktivitet. Denne observasjon taler sterkt for at den N-terminale grensen i T-celleepitopen er rest 369 eller 370. For å forsøke å bestemme C-enden, viste resultatene at maksimal T-celleaktivitet ble oppnådd med peptid 366-383. Enhver fjerning av de C-terminale restene resulterte i nedsatt T-celleaktivitet. Dette funn antyder at den C-terminale del av epitopen er ved rest 383 eller forbi. Som kartlagt ved hjelp av disse studier ville T-celleepitopen bli lokalisert til 369 (370) - 383 i CRM197.

TABELL 7

Kartlegging av N- og C-terminale grenser for T-celle-determinant i region 357-383 i CRM ved bruk av lymfeknuteceller fra difteritoksoid eller CRM-forbehandlede SJL-mus.

ANTI-PRP OG ANTI-CRM RESPONS

UTLØST AV PEPTIDKONJUGATER

Etter en preliminær lokalisering av en determinant i T-cellegjenkjennelse i CRM var det nødvendig å bestemme hvorvidt eller ikke den bestemte regionen kunne fungere som et effektivt bærermolekyl for PRP. I tillegg, var det også av interesse å bestemme hvorvidt forhåndseksponering mot bærerproteinet, DT, forandret gjenkjennelsen av PRP-konjugatene. Følgelig ble mus immunisert med DT, TT eller saltvann emulgert i Freund's komplett adjuvans. En uke senere ble gruppene av dyr immunisert med en PRP-konjugat. En annen konjugatimmunisering ble utført etter et to ukers intervall. Antistoffresponsen til PRP utløst i disse dyrene er vist i tabell 8 . Primære (vist ved dag 21) antistoffsvar på PRP ble oppdaget etter både PRP-CRM og, av betydning, PRP-(357-380), immuniseringer av de dyrene som på forhånd har blitt behandlet med DT eller saltvann. Siden antistoff mot PRP ble oppnådd i begge disse grupper, viste forbehandling mot DT ikke nevneverdig innflytelse på dannelsen av et antistoffsvar. Derimot var PRP-(357-380) tilstrekkelig på egenhånd til å utløse en primærrespons mot PRP som var meget lik i omfang til svaret utløst av PRP-CRM. Sekundærsvar på PRP ble også oppdaget etter PRP-CRM- og PRP-(357-380)- immuniseringer. Disse resultatene viser klart at en konjugatvaksine som omfatter PRP og syntetisk peptid er i stand til å danne antistoffer mot PRP.

TABELL 8

Antistoffsvar på PRP-CRM-konjugatvaksine eller på PRP-CRM-peptidkonjugater i difteritoksoidforbehandlede mus

a Mus ble immunisert med en optimal konsentrasjon av 50 \ ig DT emulgert i Freund's komplette adjuvans og deretter utfordret med peptid (5 fig) eller protein (2,5 itg) konjugatvaksine i saltvann på uke 1 og uke 3.

b Sera ble samlet fra individuelle mus på dag 7, 21, 32, 42 og 49 dager etter immunisering med DT. Serumprøver innen en gitt gruppe ble så slått sammen for radioimmunoassay.

En sekundærrepsons mot PRP ble også observert etter immunisering med PRP-(3 06-334). Denne region ble projestert ved computeranalyse til å inneholde en T-celleepitop, men viste allikevel minimal evne til å stimulere T-celler oppnådd fra voksne dyr forbehandlet med dif teritoksoid eller CRM197. I tillegg, var dette peptidet ikke effektivt ved forbehandling for et anti-peptidsvar. Det er interessant som vist i figur 5, at svaret etter immunisering med PRP-(306-334) ble utløst hos de dyr som var forbehandlet med toksoidet, DT. Samlet har CRM-peptid 306-334 blitt vist å være nyttig som bærermolekyl for PRP. Skjønt standard celledelingsmetoder ikke overbevisende har vist at denne regionen er en T-celleepitop, viser disse eksperimentene den positive innflytelse av en forhåndseksponering mot det intakte proteinet og støtter konklusjonen at denne region virkelig er en T-celleepitop.

Det er også av viktighet å bestemme om peptidkonjugatene utløser antistoffer som kryssreagerer med hele CRM-proteinet. Disse sera ble derfor også undersøkt ved ELISA for anti-CRM-antistoffer. Som vist i tabell 9 ble bindingsaktivitet i CRM bare oppdaget i de dyr som var immunisert med PRP-CRM eller forbehandlet med DT. Ingen av peptidkonjugatene laget, når de ble injisert i de TT eller saltvannsbehandlede grupper, antistoffer mot CRM.

Etter fremgangsmåtene beskrevet ovenfor for PRP-CRM-tilførsel, ble musene også immunisert med konjugater av forskjellig type spesifikke pneumokokkpolysakkarider og CRM. Resultater fra disse tilførsler er vist i tabell 10. Disse data viser igjen at en B-celle determinant som inneholder antigen konjugert til et bakterielt T-celleepitop effektivt kan utløse et immunsvar hos det innpodede individ.

TABELL 10

Antistoffsvar på typespesifikke pneumokokkpolysakkarider tilført på et syntetisk peptidbærermolekyl

Mus ble immunisert med type-spesifikt pneumokokk-oligosakkarid koblet til CRM197 eller til CRM-peptidet 357-380. Konjugat ble tilført uke 0 og 2 med eller uten 100 txg aluminium som adjuvans. Antistoffverdier ble bestemt ved standard Farr-metode.

Uavhengig bekreftelse av nytten av PRP-peptidkonjugatet som en vaksine ble oppnådd ved funksjonell analyse av antistoffet som var dannet. PRP ble koblet ved reduktiv aminering til CRM-peptidet 369-383 som er ventet å passe nøye med den minimumsekvensen som er nødvendig for å stimulere T-celler. PRP-peptid eller PRP-CRM ble benyttet uten adjuvans til å immunisere SJL-mus på uke 0 og 2. Sera ble samlet som vist i tabell 11 og undersøkt for bakteriedrepende aktivitet in vitro mot enten én av to H_;_ inf luenzae-arter. Eagan eller det kliniske isolat Hst54. En fire ganger økning i titer blir betraktet som immunologisk signifikant.

Som vist i tabell 11, hadde antistoffet produsert etter immunisering med enten PRP-CRM eller PRP-peptid signifikant bakteriedrepende aktivtet mot begge typer, som vist fra fire-ganger økning i titer mellom uke 0 og 2. Videre var forskjellen i topp som ble oppnådd mellom PRP-peptidet og PRP-CRM- immuniserte dyr ikke signifikant forskjellige. Antistoffet utløst av peptidkonjugatet er funksjonelt likt det som ble oppnådd etter immunisering med det naturlige proteinet.

Bakteriedrepende aktivitet på uker Immunogen etter immunisering

0 2 4

Aktivitet mot Eagan

PRP-CRM <l/5 1/20 1/20

PRP-CRM(369-383) <1,5 1/10 1/20

Aktivitet mot Hst54

PRP-CRM 1/5 1/80 1/10

PRP-CRM(369-383) <l/5 1/40 1/10

ANTI- PRP- OG ANTI- CRM- SVAR UTLØST AV KONJUGATER

INKLUSIVE EN MODIFISERT PEPTIDANALOG

Etter å ha bestemt at en modifisert analog av CRM T-celleepitop 366-383 har evnen til å stimulere T-celle-celledeling i gnagere, var det nødvendig å bestemme hvorvidt en slik analog kan fungere som et effektivt bærermolekyl. PRP ble koblet ved reduktiv aminering til lysinanalogen av CRM-peptidet 366-383 via e-aminogruppen. Etter konjugering ble forskjellige doser av PRP-[Lys]-CRM(366-383) benyttet for å immunisere SJL-mus uten adjuvans. Dyr ble igjen injisert på ukene 0 og 4. Sera ble samlet på de tidspunkter som er vist i tabell 12 og undersøkt etter antistoff spesifikke for PRP.

Som vist i tabell 12 utløste flere doser av peptidkonjugatet PRP-[Lys]-CRM(366-383) antistoff spesifikt for PRP som oversteg 1 ttg/ml konsentrasjon. Studiet viser derfor at lysinanalogen av CRM-peptidet 366-383 er brukbar som et bærermolekyl.

TABELL 12

Første antistoffstudium som undersøker tilførelsen av et N-terminalt lysin til CRM-bærerpeptid 366-383 i SJL-mus

TETANUSTOKSINEPITOPER

Tetanustoksin H-, L- og C-fragmenter ble undersøkt for deres evne til å stimulere T-celle-celledeling i gnagere. Alle tre fragmenter utløste sterkt T-celleaktivitet. Imidlertid var, som vist i tabell 13, C-fragment klart best. Stimulerende aktivitet ble også observert i den menneske-perifere blodmononukleære cellemetode. Som vist i tabell 14 ble hoved T-celleaktiviteten forbundet med tetanustoksinets tunge kjede i dette individet.

Fragment C som ble funnet å være meget aktivt i å stimulere celledelingen av gnager-T-celler, ble gjort gjenstand for proteolytisk fordøyelse ved pronase, ficin, substilisin eller V8. SDS-PAGE av det urene enzymatiske preparat av tetanustoksinfragment C viste intet målbart intakt fragment C etter fordøyelsen med de fire enzymene nevnt ovenfor. Fordøyelsesproduktene ble så testet på sin evne til å stimulere gnager-T-celler. Tre av proteasespaltnings-blandingene (pronase, subtilisin og V8) beholdt vesentlig T-celleaktivitet som vist i tabell 15. Resultatet vist i tabell 15 antyder at enten pronase eller V8 proteasespaltning vil gi peptidframgenter som er spesielt nyttige til å kartlegge T-celleepitoper.

For å definere videre potensielle T-celleepitoper innen fragmenter som er dannet av V8-spaltning, ble disse fragmenter separert ved revers-'f ase-HPLC. Fem fraksjoner ble samlet og analysert ved SDS-PAGE. Fire av de fem fraksjonene ble funnet å inneholde hovedpeptider, og alle ble testet i T-cellecelledelingsmetoden i gnagere.

TABELL 13

T-cellesvar på tetanustoksoidforbehandlede SJL-mus på tetanustoksinfragmenter.

TABELL 14

Menneskelig celledelingssvar på tetanustoksoid og tetanustoksinfragmenter.

TABELL 15

Enzymatisk spaltning av tetanustoksin C-fragment -

T-cellecelledelingsstudier<*.>

Kontrollsvar som ACPM (dose ved maksimalt svar): TT 102,73 0 (5); C-fragment 120,126 (100); DT 397 (0,5); Con A 31,343 (1) og LPS 39,750 (50) .

Bakgrunnssvar var 1,334 cpm.

<9> Dose av fragment C i enzymspaltning. 'Ingen' refererer seg til svaret på fragment C alene i dosen der en maksimal respons ble oppnådd i spaltningen.

Som vist i tabell 16 ga fraksjonene 3, 4 og 5 et betydelig T-cellesvar. Fraksjon 3 inneholder et hovedbånd som har en molekylvekt på 10K og fraksjonene 4 og 5 inneholder hovedbånd på hhv. 22K og 17K.

For å analysere videre V8 fordøyelsesfragmentene, ble fraksjonene 1-5 separert ved SDS-PAGE, overført til immobilon-papir (Millipore) og sekvensert direkte. Delvise sekvenser av to fragmenter, 22K fra fraksjon 4 og 17K båndet fra fraksjon 5, er blitt bestemt og sammenlignet med den kjente sekvensen av tetanustoksin (Eisel et al., EMBO J. 5:2495-2502, 1986). Basert på molekylvektestimatene fra SDS-PAGE og sekvenserings-resultater, ble det konkludert at 22K-fragmentet korresponderte med tetanustoksinrestene 1128-1309 og 17K-fragmentet til restene 974-1116.

For å lokalisere nærmere T-celleepitopene innen C-fragmentet, ble strategien med hensyn til å benytte overlappende syntetiske peptider brukt. Denne strategi krever syntesen av 37 peptider med 19 - 20 rester i lengde og med en syv rest overlapp for å undersøke hele den primære sekvensen til C-fragmentet. Siden proteasefordøyelsesstudier antydet at T-celleaktivitet ble potensielt forbundet med 17K- og 22K-fragmentene, ble det første studiet konsentrert på den sterkeste av disse to regioner. Som vist i tabell 17 ble overlappende syntetiske peptider som begynte ved rest 97 og omspente en del av regionen 974-1116, undersøkt for T-celleaktivtet. Av de undersøkte falt tetanustoksinpeptid 961-980 og 1021-1040 innenfor C-fragmentet som ga betydelige T-celle-celledelingssvar ved tetanustoksoid-forbehandlede lymfocytter fra gnagere. Således ble to potensielle T-celleepitoper i tetanustoksinfragment C lokalisert ved bruk av disse teknikkene.

TABELL 16

Celledelingssvar av tetanustoksoidforbedhandlede T-celler på fragment C og peptider av fragment C. Tabell 17. T-cellesvar på tetanustoksoid-forbehandlede lymfeknuteceller på overlappende syntetiske peptider karkaterisert ved en utvalgt region av tetanus-fragment C.

66

ANTISTOFFSVAR TIL IKKE- KARBOHYDRATHAPTENKONJUGATER

B-celleepitopen til den respiratoriske syncytiale virus (RSV) protein F ble koblet til CRM T-celleepitop 369-383 eller til det intakte naturlige proteinet. SJL-mus ble immunisert i ukene 0 og 2 med 5 jig vektekvivalenter av peptidene 369-383 blandet med alum.. Sera ble samlet. Som vist i figur 6, ble antistoff mot RSV F-proteinet utløst etter immunisering med B-celleepitopen av RSV (283-315) koblet til enten hele CRM eller til CRM-peptidet 369-383. Dette eksperimentet viser nytten av CRM-peptidet 369-383 ved å tjene som bærermolekyl for andre materialer enn karbohydrater. I dette tilfellet er det spesifikke eksempel et peptid som representerer en B-celleepitop av et viralt protein.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et immunogenkonjugat, karakterisert ved kovalent kopling av et polysakkarid-antigen til et oligopeptid svarende til minst én T-celleepitop av et bakerielt toksin, CRM eller toksoid, hvori antigenet og oligopeptidet er heterologe med hverandre.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som bakterielt toksin, CRM eller toksoid anvendes difteritoksin, tetanustoksin, pertussistoksin, CRM197, toksoid eller tetanustoksoid.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det anvendes en epitop med en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av peptid 357-383 av CRM197, peptid 366-383 av CRM197, peptid 369-383 av CRM197, peptid 306-334 av CRM197, tetanustoksinpeptid 961-980, tetanustoksinpeptid 1021-1040 og antigenfragment, homolog eller analog av disse.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et polysakkarid-antigen valgt fra gruppen bestående av mikrobielantigener, virusantigener, parasittantigener, tumorantigener, allergener og autoimmunitetsbeslektede antigener.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det anvendes et polysakkaarid-antigen som er en bakteriell kapselpolymer, -oligomer eller fragmenter derav.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det anvendes en kapsel-polymer eller oligomer som stammer fra Haemohilus influenzae. Streptococcus pneumoniae, Neisseria menin<g>itidis eller Salmonella typhi.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det som kapselpolymer anvendes polyribosylribotolfosfat fra Haemohilus influenzae.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det som kapselpolymer anvendes serotype 1, 4, 5, 6A, 6B, 9V, 14, 18C, 19F eller 23F fra Streptococcus pneumoniae.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det som virusantigen anvendes F eller G protein fra åndedretts-syncytialt virus.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som antigen bundet til oligopeptidet anvendes et med aminosyresekvens valgt fra gruppene bestående av QWHNSYNRPAYSPG, NLFQWHNSYNRPAYSPG, AYNFVE (eller G) - SIINLFQWHNSYNRPAYSPG, ILPGIGSVMGIADGAVHHTEEIVAQSIA, VSASHLEQYGTNEYSIISSM og DKFNAYLANKWVFITITNDR.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som antigen anvendes et bakterielt ytre membranprotein, et bakterieoverflateprotein, et bakterieoverflatesakkarid eller et bakteriecelleveggsakkarid.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at det som antigen anvendes et bakterielt ytre membranprotein fra Haemohilus influenzae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Neisseria gonorrheae eller Escherichia coli.