JP2002541808A - ポリサッカリド結合体ワクチンのための組換えトキシンａタンパク質キャリア - Google Patents
ポリサッカリド結合体ワクチンのための組換えトキシンａタンパク質キャリアInfo
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Abstract
(57)【要約】
本発明は、免疫原性組成物およびワクチンとしてのその使用方法、ならびにそれらを調製する方法を提供する。これらの免疫原性組成物は、微生物病原体のポリサッカリドに結合された、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡの組換えタンパク質を含む。この免疫原性組成物は、トキシンＡの短縮化された部分、特に、繰り返し単位（ｒＡＲＵ）のみを含み得、この部分が、微生物病原体のポリサッカリドに結合される。このような組成物は、Ｔ細胞依存性抗体応答を誘発するのに有効である。従って、これらの組成物は、１以上の微生物病原体に対する防御の付与における、ヒト、特に幼児、および動物のためのワクチンとして効果的である。
Description
【０００１】 （連邦政府が後援する研究のもとでなされる発明に対する権利の陳述） 本明細書中に開示される実験的研究は、一部において、米国保健社会福祉省の
資金契約番号ＳＢＩＲ Ｒ４３ ＡＩ４２４５７で援助されていた。
資金契約番号ＳＢＩＲ Ｒ４３ ＡＩ４２４５７で援助されていた。
【０００２】 （発明の技術分野） 本発明は、医療免疫学の分野に関し、さらに薬学的組成物、ワクチンの作製方
法、およびワクチンの使用方法に関する。より詳細には、本発明は、ポリサッカ
リド抗原の免疫原性を高めるためにキャリアタンパク質として、Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡまたは密接に関連するトキシンＢを
コードする遺伝子から誘導される組換えタンパク質に関する。
法、およびワクチンの使用方法に関する。より詳細には、本発明は、ポリサッカ
リド抗原の免疫原性を高めるためにキャリアタンパク質として、Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡまたは密接に関連するトキシンＢを
コードする遺伝子から誘導される組換えタンパク質に関する。
【０００３】 （発明の背景） 効果的なワクチンの開発は、多くの感染性疾患の予防に対する大きな進歩をも
たらしている。例えば、天然痘は除去され、ポリオ（これはほとんど完全に除去
されている）についての言及は、若い世代の心に、数十年前におけるような四肢
不自由の麻痺の想像をもたらさない。多くの工業国におけるジフテリア、破傷風
、麻疹、および百日咳の発生率は、顕著に減少している。これらの進歩にも関わ
らず、感染性疾患は、依然として世界中の人々の大多数における罹患率および死
亡率の主要な原因のままである。
たらしている。例えば、天然痘は除去され、ポリオ（これはほとんど完全に除去
されている）についての言及は、若い世代の心に、数十年前におけるような四肢
不自由の麻痺の想像をもたらさない。多くの工業国におけるジフテリア、破傷風
、麻疹、および百日咳の発生率は、顕著に減少している。これらの進歩にも関わ
らず、感染性疾患は、依然として世界中の人々の大多数における罹患率および死
亡率の主要な原因のままである。
【０００４】 効果的で、製造および投与に安価で、最小の有害な副作用を示すワクチンを開
発するために医学的研究を続けることが重要である。病原体に対するワクチン接
種は、我々の最初の防御線であり、多くの感染性疾患と戦う有益で対費用効果の
高い手段を表す。従って、本願のような協同研究が、ワクチンに対する新規なア
プローチを開発すること続け、そして我々が現在使用するワクチンを改良するこ
とが不可避である。
発するために医学的研究を続けることが重要である。病原体に対するワクチン接
種は、我々の最初の防御線であり、多くの感染性疾患と戦う有益で対費用効果の
高い手段を表す。従って、本願のような協同研究が、ワクチンに対する新規なア
プローチを開発すること続け、そして我々が現在使用するワクチンを改良するこ
とが不可避である。
【０００５】 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（グラム陽性嫌気性胞子形成バ
チルス）は、細菌誘導性下痢のいくつかの形態についての病因因子であることが
示された。ヒト腸管の複合微生物叢の一部として、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、
抗生物質療法に続く腸内微生物誘導性下痢の原因の１つとして現れることが示さ
れ、これは、正常な競合する腸内の微生物叢の多くを弱めるかまたは破壊する。
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの菌株は、２５％のみの抗生物質関連性下痢を引き起こ
すことが観測されているが、偽膜性腸炎（「ＰＭＣ」）のほとんど全ての原因の
原因因子であることが見出され、これらのうちのいくつかの場合は致死性である
（Ｌｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｍ．およびＴ．Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ、第５８章
、８６７〜８９１頁、（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｔｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
１９９５））。さらに、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、院内感染性下痢（特に、老
年または免疫無防備状態の患者において）原因因子としてしばしば同定される（
米国特許第４，８６３，８５２号（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８９））。
チルス）は、細菌誘導性下痢のいくつかの形態についての病因因子であることが
示された。ヒト腸管の複合微生物叢の一部として、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、
抗生物質療法に続く腸内微生物誘導性下痢の原因の１つとして現れることが示さ
れ、これは、正常な競合する腸内の微生物叢の多くを弱めるかまたは破壊する。
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの菌株は、２５％のみの抗生物質関連性下痢を引き起こ
すことが観測されているが、偽膜性腸炎（「ＰＭＣ」）のほとんど全ての原因の
原因因子であることが見出され、これらのうちのいくつかの場合は致死性である
（Ｌｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｍ．およびＴ．Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ、第５８章
、８６７〜８９１頁、（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｔｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
１９９５））。さらに、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、院内感染性下痢（特に、老
年または免疫無防備状態の患者において）原因因子としてしばしば同定される（
米国特許第４，８６３，８５２号（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８９））。
【０００６】 Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの病原性のレパートリーの有意な成分は、大部分の菌
株によって産生される２つの腸内トキシンＡおよびＢにおいて見出される（米国
特許第５，０９８，８２６号（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９９２））。トキシンＡ
は、第一に最小の細胞障害性活性を有するエンテロトキシンである。トキシンＢ
は、強力な細胞毒であるが、腸管粘膜に対する広範囲の損傷は、トキシンＡの作
用に起因するが、トキシンＡおよびＢが腸内において相乗的に作用し得るという
報告がある。
株によって産生される２つの腸内トキシンＡおよびＢにおいて見出される（米国
特許第５，０９８，８２６号（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９９２））。トキシンＡ
は、第一に最小の細胞障害性活性を有するエンテロトキシンである。トキシンＢ
は、強力な細胞毒であるが、腸管粘膜に対する広範囲の損傷は、トキシンＡの作
用に起因するが、トキシンＡおよびＢが腸内において相乗的に作用し得るという
報告がある。
【０００７】 トキシン産生性タンパク質ＡとＢ（それぞれ３０８，０００および２６９，０
００の分子量を有する最大の公知の細菌トキシン）の両方をコードする遺伝子配
列が、解明された（Ｍｏｎｃｒｉｅｆら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：１
１０５〜１１０８（１９９７）；Ｂａｒｒｏｓｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１８：４００４（１９９０）；Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
５８：４８０〜４８８（１９９０））。保存性置換が考慮される場合、類似性の
程度のために、これらのトキシンは、遺伝子重複から生じると考えられる。タン
パク質は、多数の類似的特徴を互いに共有する。例えば、両方のタンパク質は、
推定のヌクレオチド結合部位、中心疎水性領域、４つの保存性システインおよび
それらのカルボキシル末端における長い一連の繰り返し単位を有する。特に、ト
キシンＡの繰り返し単位は、免疫優性であり、腸管上皮の表面上の２型コア炭水
化物抗原に対する結合の原因である（Ｋｒｉｖａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．５３：５７３〜５８１（１９８６）；Ｔｕｃｋｅｒ，Ｋ．およびＴ．Ｄ．Ｗ
ｉｌｋｉｎｓ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：７３〜７８（１９９１））。
００の分子量を有する最大の公知の細菌トキシン）の両方をコードする遺伝子配
列が、解明された（Ｍｏｎｃｒｉｅｆら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：１
１０５〜１１０８（１９９７）；Ｂａｒｒｏｓｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１８：４００４（１９９０）；Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
５８：４８０〜４８８（１９９０））。保存性置換が考慮される場合、類似性の
程度のために、これらのトキシンは、遺伝子重複から生じると考えられる。タン
パク質は、多数の類似的特徴を互いに共有する。例えば、両方のタンパク質は、
推定のヌクレオチド結合部位、中心疎水性領域、４つの保存性システインおよび
それらのカルボキシル末端における長い一連の繰り返し単位を有する。特に、ト
キシンＡの繰り返し単位は、免疫優性であり、腸管上皮の表面上の２型コア炭水
化物抗原に対する結合の原因である（Ｋｒｉｖａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．５３：５７３〜５８１（１９８６）；Ｔｕｃｋｅｒ，Ｋ．およびＴ．Ｄ．Ｗ
ｉｌｋｉｎｓ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：７３〜７８（１９９１））。
【０００８】 トキシンは、Ｒｈｏタンパク質の共有結合修飾を含む作用の類似の分子機構を
共有する。Ｒｈｏタンパク質は、細胞骨格の組織化の維持を含む多くの細胞機能
を有する小分子量のエフェクタータンパク質である。Ｒｈｏタンパク質の共有結
合修飾は、トキシンのグルコシルトランスフェラーゼ活性に起因する。グルコー
ス部分は、補基質としてＵＤＰ−グルコースを使用してＲＨＯに加えられる（Ｊ
ｕｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３７５：５００〜５０３（１９９５）；Ｊｕｓｔら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７０：１３９３２〜１３９３９（１９９５））。グ
ルコシルトランスフェラーゼ活性は、これらのトキシンのそれぞれのアミノ酸配
列の最初のおよそ２５％に局所化され（Ｈｏｆｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７２：１１０７４〜１１０７８（１９９７）；ＦａｕｓｔおよびＳｏｎ
ｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．２５１：１００
〜１０５（１９９８））、細胞障害性の原因の酵素活性に関与しないトキシンの
大部分（繰り返し単位を含む）を残す。
共有する。Ｒｈｏタンパク質は、細胞骨格の組織化の維持を含む多くの細胞機能
を有する小分子量のエフェクタータンパク質である。Ｒｈｏタンパク質の共有結
合修飾は、トキシンのグルコシルトランスフェラーゼ活性に起因する。グルコー
ス部分は、補基質としてＵＤＰ−グルコースを使用してＲＨＯに加えられる（Ｊ
ｕｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３７５：５００〜５０３（１９９５）；Ｊｕｓｔら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７０：１３９３２〜１３９３９（１９９５））。グ
ルコシルトランスフェラーゼ活性は、これらのトキシンのそれぞれのアミノ酸配
列の最初のおよそ２５％に局所化され（Ｈｏｆｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７２：１１０７４〜１１０７８（１９９７）；ＦａｕｓｔおよびＳｏｎ
ｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．２５１：１００
〜１０５（１９９８））、細胞障害性の原因の酵素活性に関与しないトキシンの
大部分（繰り返し単位を含む）を残す。
【０００９】 細菌性病原体の表面ポリサッカリドの免疫原性は、これらの抗原がキャリアタ
ンパク質（結合体）に共有結合される場合に改善される。ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉ
ｌｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する結合体ワクチンは、慣用的に子供をワ
クチン接種する先進国においてこの疾患を実質的に除去している（Ｒｏｂｂｉｎ
ｓ，Ｊ．Ｂ．およびＲ．Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１
６１：８２１〜８３２（１９９０）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、ＪＡＭＡ ２７６：１
１８１〜１１８５（１９９６））。ポリサッカリド抗原の免疫原性を改善するた
めのこのアプローチは、ハプテン（小分子）またはそれ自身による乏しい免疫原
性の抗原をキャリアタンパク質に付着する効果を規定する実験に基づく（Ａｖｅ
ｒｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．５０：５２１〜５３３（１９２９）；Ｇｏｅｂｅ
ｌ，Ｗ．Ｆ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６９：３５３〜３６４（１９３９）；Ｂｕ
ｃｈａｎａｎ−Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８３：５４３〜５５
５（１９５９）；Ｆｕｃｈｓら、Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４０；３５５８〜
３５６７（１９６５）。多数の異なる被包性の病原体微生物由来のポリサッカリ
ドを含む結合体が、動物およびヒトにおいて試験され、ポリサッカリド抗体を誘
発することが示された（Ｃｈｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：４４５０
〜４４５８（１９９１）；Ｄｅｖｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：７３
２〜７３６（１９９１）；Ｄｅｖｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｍ．５９：３７
００〜３７０７（１９９０）；Ｆａｔｔｏｍら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６
０：５８４〜５８９（１９９２）；Ｆａｔｔｏｍら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ
．６１：１０２３−１−３２（１９９３）；Ｋｏｎａｄｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉ
ｍｍｕｍ．６２：５０４８〜５０５４（１９９４）；Ｋａｙｈｔｙら、Ｊ．Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：１２７３〜１２７８（１９９５）；Ｓｚｕら、Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５４：４４８〜４５３（１９８６）；Ｓｚｕら、Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：４５５５〜４５６１（１９９１）；Ｓｚｕら、Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：３８２３〜３８２７（１９８９））。結合体を用
いるワクチン接種によって誘導される表面ポリサッカリドに対する抗体は、接種
材料（ｉｎｎｏｃｕｌｕｍ）を不活性化することによって被包性の微生物に対す
る保護を与え得る（Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７１：１
３８７〜１３９８（１９９５））。
ンパク質（結合体）に共有結合される場合に改善される。ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉ
ｌｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する結合体ワクチンは、慣用的に子供をワ
クチン接種する先進国においてこの疾患を実質的に除去している（Ｒｏｂｂｉｎ
ｓ，Ｊ．Ｂ．およびＲ．Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１
６１：８２１〜８３２（１９９０）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、ＪＡＭＡ ２７６：１
１８１〜１１８５（１９９６））。ポリサッカリド抗原の免疫原性を改善するた
めのこのアプローチは、ハプテン（小分子）またはそれ自身による乏しい免疫原
性の抗原をキャリアタンパク質に付着する効果を規定する実験に基づく（Ａｖｅ
ｒｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．５０：５２１〜５３３（１９２９）；Ｇｏｅｂｅ
ｌ，Ｗ．Ｆ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６９：３５３〜３６４（１９３９）；Ｂｕ
ｃｈａｎａｎ−Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８３：５４３〜５５
５（１９５９）；Ｆｕｃｈｓら、Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４０；３５５８〜
３５６７（１９６５）。多数の異なる被包性の病原体微生物由来のポリサッカリ
ドを含む結合体が、動物およびヒトにおいて試験され、ポリサッカリド抗体を誘
発することが示された（Ｃｈｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：４４５０
〜４４５８（１９９１）；Ｄｅｖｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：７３
２〜７３６（１９９１）；Ｄｅｖｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｍ．５９：３７
００〜３７０７（１９９０）；Ｆａｔｔｏｍら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６
０：５８４〜５８９（１９９２）；Ｆａｔｔｏｍら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ
．６１：１０２３−１−３２（１９９３）；Ｋｏｎａｄｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉ
ｍｍｕｍ．６２：５０４８〜５０５４（１９９４）；Ｋａｙｈｔｙら、Ｊ．Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：１２７３〜１２７８（１９９５）；Ｓｚｕら、Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５４：４４８〜４５３（１９８６）；Ｓｚｕら、Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：４５５５〜４５６１（１９９１）；Ｓｚｕら、Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：３８２３〜３８２７（１９８９））。結合体を用
いるワクチン接種によって誘導される表面ポリサッカリドに対する抗体は、接種
材料（ｉｎｎｏｃｕｌｕｍ）を不活性化することによって被包性の微生物に対す
る保護を与え得る（Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７１：１
３８７〜１３９８（１９９５））。
【００１０】 結合体ワクチンに対する大部分のキャリアは、医学的に有用なタンパク質、す
なわち、破傷風、ジフテリア、百日咳およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕ
ｇｉｎｏｓａの不活性化トキシンであった（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：５２〜５９（１９８５）；Ｃｏｈｅｎら、Ｌａｎｃｅｔ
３４９：１５５〜１５９；Ｄａｇａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：
２０９３〜２０９８（１９９８）；Ｄｅｖｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：７１７５〜７１７９（１９９１）；Ｐａｖｌｉａｋｏ
ｖａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５５２６〜５５２９（１９９９）；
Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：３５２８〜３５３
２（１９９２））。従って、結合体ワクチンは、その保護的な抗原がキャリアタ
ンパク質（これは、トキシン媒介疾患を引き起こすものを含む）である病原体に
対する保護を与え得る。破傷風トキシンが使用される場合において、トキシン中
和抗体応答が観測された（Ｃｌａｅｓｓｏｎら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１１２：
６９５〜７０２（１９８８）；Ｌａｇｅｒｇａｒｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．５８：６８７〜６９４（１９９０）；Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５１９〜５２８（１９８６））。さらに、破傷風トキシ
ン（分子量１５０，０００）は、ジフテリアトキシンまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の外毒素Ａの２倍のサイズであり、そしてポリ
サッカリド抗原成分に対して産生される高いレベルの抗体を生じる（Ｒｏｂｂｉ
ｎｓ，Ｊ．Ｂ．およびＲ．Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．
、１６１：８２１〜８３２（１９９０））。
なわち、破傷風、ジフテリア、百日咳およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕ
ｇｉｎｏｓａの不活性化トキシンであった（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：５２〜５９（１９８５）；Ｃｏｈｅｎら、Ｌａｎｃｅｔ
３４９：１５５〜１５９；Ｄａｇａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：
２０９３〜２０９８（１９９８）；Ｄｅｖｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：７１７５〜７１７９（１９９１）；Ｐａｖｌｉａｋｏ
ｖａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５５２６〜５５２９（１９９９）；
Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：３５２８〜３５３
２（１９９２））。従って、結合体ワクチンは、その保護的な抗原がキャリアタ
ンパク質（これは、トキシン媒介疾患を引き起こすものを含む）である病原体に
対する保護を与え得る。破傷風トキシンが使用される場合において、トキシン中
和抗体応答が観測された（Ｃｌａｅｓｓｏｎら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１１２：
６９５〜７０２（１９８８）；Ｌａｇｅｒｇａｒｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．５８：６８７〜６９４（１９９０）；Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５１９〜５２８（１９８６））。さらに、破傷風トキシ
ン（分子量１５０，０００）は、ジフテリアトキシンまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の外毒素Ａの２倍のサイズであり、そしてポリ
サッカリド抗原成分に対して産生される高いレベルの抗体を生じる（Ｒｏｂｂｉ
ｎｓ，Ｊ．Ｂ．およびＲ．Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．
、１６１：８２１〜８３２（１９９０））。
【００１１】 Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡおよびＢから誘導されるタンパク質は、
ポリサッカリドに対する効果的なキャリアとして役立つことによって、院内感染
に対する結合体ワクチンに有用であり得るキャリアタンパク質の候補であり得る
。ｒＡＲＵ結合体ワクチンによって保護され得そうな被包性の院内病原体の例と
しては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；凝固酵素陰性Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒ種；Ｃａｎｄｉｄａ種；Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ；およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種が挙げられる。
ポリサッカリドに対する効果的なキャリアとして役立つことによって、院内感染
に対する結合体ワクチンに有用であり得るキャリアタンパク質の候補であり得る
。ｒＡＲＵ結合体ワクチンによって保護され得そうな被包性の院内病原体の例と
しては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；凝固酵素陰性Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒ種；Ｃａｎｄｉｄａ種；Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ；およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種が挙げられる。
【００１２】 Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに起因する院内感染は、米国
において主要な健康保健問題を提示する。これは、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅ
ｕｓ（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ（ＶＲＥ）
（Ｔｈｏｒｎｓｂｅｒｒｙ Ｃ．Ｗｅｓｔ Ｊ．Ｍｅｄ．１６４：２８〜３２（
１９９６）（耐性をＭＲＳＡに移し得る）のような抗生物質耐性病原体によって
引き起こされる新たな脅威を考慮する特に真実ある。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染の発
生率が上昇し続け、これは現在院内感染由来の最も一般的な死亡原因である（Ｗ
ｅｉｎｓｔｅｉｎ，ＲＡ Ｅｍｅ１９９８）。その罹患率は、一部において、そ
れが引き起こす幅広い範囲の感染およびその病原性因子の広範なレパートリーに
起因する（Ａｒｃｈｅｒ，ＧＬ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２６：１１
７９〜１１８１（１９９８））。さらに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの菌株は、鼻の通路
中および皮膚上に一般的に保持され、これは、この生物体の拡散の制御を非常に
困難にする。病院獲得感染を引き起こすことに加えて、Ｓ．ａｕｅｒｕｓは、地
域（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）獲得感染としてより一般的に認識されている（Ｋａｙ
ａｂａら、Ｓｕｒｇ Ｔｏｄａｙ ２７：２１７〜２１９（１９９７）；Ｍｏｒ
ｅｎｏら、Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２１２：１３０８〜１３１２（１
９９５））。病原性および抗生物質療法に対する耐性を増加しているＳ．ａｕｒ
ｅｕｓの菌株が出現し続けている。最近、バンコマイシンに対して中程度の耐性
を有する菌株が米国および他の先進国において同定された（Ｔｅｎｏｖｅｒら、
Ｊ．Ｈｏｓｐ Ｉｎｆｅｃｔ ４３ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ３−７（１９９９）；Ｗｏ
ｏｄｆｏｒｄら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：２５８〜
２５９（２０００））。Ｓ．ａｕｒｅｕｓのバンコマイシン耐性菌株（これはま
た他の抗生物質に対する耐性を増している）は、新規な治療法の開発なしに処置
するのは非常に難しいので、これは、驚くべく発達である。
において主要な健康保健問題を提示する。これは、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅ
ｕｓ（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ（ＶＲＥ）
（Ｔｈｏｒｎｓｂｅｒｒｙ Ｃ．Ｗｅｓｔ Ｊ．Ｍｅｄ．１６４：２８〜３２（
１９９６）（耐性をＭＲＳＡに移し得る）のような抗生物質耐性病原体によって
引き起こされる新たな脅威を考慮する特に真実ある。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染の発
生率が上昇し続け、これは現在院内感染由来の最も一般的な死亡原因である（Ｗ
ｅｉｎｓｔｅｉｎ，ＲＡ Ｅｍｅ１９９８）。その罹患率は、一部において、そ
れが引き起こす幅広い範囲の感染およびその病原性因子の広範なレパートリーに
起因する（Ａｒｃｈｅｒ，ＧＬ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２６：１１
７９〜１１８１（１９９８））。さらに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの菌株は、鼻の通路
中および皮膚上に一般的に保持され、これは、この生物体の拡散の制御を非常に
困難にする。病院獲得感染を引き起こすことに加えて、Ｓ．ａｕｅｒｕｓは、地
域（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）獲得感染としてより一般的に認識されている（Ｋａｙ
ａｂａら、Ｓｕｒｇ Ｔｏｄａｙ ２７：２１７〜２１９（１９９７）；Ｍｏｒ
ｅｎｏら、Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２１２：１３０８〜１３１２（１
９９５））。病原性および抗生物質療法に対する耐性を増加しているＳ．ａｕｒ
ｅｕｓの菌株が出現し続けている。最近、バンコマイシンに対して中程度の耐性
を有する菌株が米国および他の先進国において同定された（Ｔｅｎｏｖｅｒら、
Ｊ．Ｈｏｓｐ Ｉｎｆｅｃｔ ４３ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ３−７（１９９９）；Ｗｏ
ｏｄｆｏｒｄら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：２５８〜
２５９（２０００））。Ｓ．ａｕｒｅｕｓのバンコマイシン耐性菌株（これはま
た他の抗生物質に対する耐性を増している）は、新規な治療法の開発なしに処置
するのは非常に難しいので、これは、驚くべく発達である。
【００１３】 血清型５および８は、約８５％のＳ．ａｕｒｅｕｓ感染を引き起こし、実験的
証拠は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの莢膜ポリサッカリドに対する抗体が疾患に対して保
護し得ることを示唆する（Ｆａｔｔｏｍら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：
２３６７〜２３７４（１９９０）；Ｆａｔｔｏｍら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ
．６１：１０２３〜１０２４（１９９３））。従って、血清型５および８に対す
る結合体ワクチンは、広く保護性であり得る。さらに、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ｅ型ｂ（Ｈｉｂ）結合体ワクチンの場合、ワクチン接種は、鼻の通路におけるＨ
．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの輸送を減少した。これは、集団免疫によるＨｉｂ結合
体ワクチンの成功に寄与していると考えられる（Ｒｏｂｂｉｎｓら、ＪＡＭＡ
２７６：１１８１〜１１８５（１９９６））。類似の効果は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ
に対する効果的な結合体ワクチンを用いて観察され得、これは、保健医療作業者
ならびに患者をワクチン接種することによって、病因獲得感染を除去するために
特に重要であり得る。
証拠は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの莢膜ポリサッカリドに対する抗体が疾患に対して保
護し得ることを示唆する（Ｆａｔｔｏｍら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：
２３６７〜２３７４（１９９０）；Ｆａｔｔｏｍら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ
．６１：１０２３〜１０２４（１９９３））。従って、血清型５および８に対す
る結合体ワクチンは、広く保護性であり得る。さらに、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ｅ型ｂ（Ｈｉｂ）結合体ワクチンの場合、ワクチン接種は、鼻の通路におけるＨ
．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの輸送を減少した。これは、集団免疫によるＨｉｂ結合
体ワクチンの成功に寄与していると考えられる（Ｒｏｂｂｉｎｓら、ＪＡＭＡ
２７６：１１８１〜１１８５（１９９６））。類似の効果は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ
に対する効果的な結合体ワクチンを用いて観察され得、これは、保健医療作業者
ならびに患者をワクチン接種することによって、病因獲得感染を除去するために
特に重要であり得る。
【００１４】 結合体ワクチンはまた、Ｔヘルパー細胞によって認識され得るポリサッカリド
抗原に対するエピトープを提供することが考慮される（Ａｖｅｒｙ Ｏ．Ｔ．お
よびＷ．Ｆ．Ｇｏｅｂｅｌ Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄ．５０：５
３３〜５５０（１９２９））。強力な抗体応答は、抗原特異的Ｂ細胞とＴヘルパ
ー細胞との相互作用を必要とするようである。この事象は、大量の高いアビディ
ティ抗体の産生および免疫学的記憶の形成に導く体液性免疫応答に必須であると
考えられる。この事象において、Ｂ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として作用
する。しかし、他のＡＰＣとは異なり、Ｂ細胞は、抗原と細胞表面上の抗体との
結合によって、特定の方法で抗原を取り込む。これらのＢ細胞は、抗原に対する
抗体を分泌する血漿細胞に分化し得る。また、活性化Ｂ細胞の下位集団（ｓｕｂ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）は、抗原を認識するために準備され、後の曝露時に活性
化される記憶細胞に分化する。両方の場合において、分化は、Ｔヘルパー細胞と
の直接の相互作用を必要とする。抗原の取り込み時に、Ｂ細胞は、抗原（タンパ
ク質）をプロセスし、クラスＩＩ ＭＨＣという文脈で、表面上のＴ細胞を提示
する。次いで、抗原特異的Ｔヘルパー細胞は、Ｔヘルパーエピトープ／クラスＩ
Ｉ ＭＨＣ複合体を結合し、そしてＢ細胞の血漿細胞を分泌する抗体または記憶
細胞への分化に導くヘルパーサイトカインを放出する。この事象はまた、特定の
Ｔヘルパー細胞を記憶細胞への分化に導く。従って、免疫系は、後の抗原に対す
る曝露時に、既往性応答（ブースター効果）のために準備される。
抗原に対するエピトープを提供することが考慮される（Ａｖｅｒｙ Ｏ．Ｔ．お
よびＷ．Ｆ．Ｇｏｅｂｅｌ Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄ．５０：５
３３〜５５０（１９２９））。強力な抗体応答は、抗原特異的Ｂ細胞とＴヘルパ
ー細胞との相互作用を必要とするようである。この事象は、大量の高いアビディ
ティ抗体の産生および免疫学的記憶の形成に導く体液性免疫応答に必須であると
考えられる。この事象において、Ｂ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として作用
する。しかし、他のＡＰＣとは異なり、Ｂ細胞は、抗原と細胞表面上の抗体との
結合によって、特定の方法で抗原を取り込む。これらのＢ細胞は、抗原に対する
抗体を分泌する血漿細胞に分化し得る。また、活性化Ｂ細胞の下位集団（ｓｕｂ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）は、抗原を認識するために準備され、後の曝露時に活性
化される記憶細胞に分化する。両方の場合において、分化は、Ｔヘルパー細胞と
の直接の相互作用を必要とする。抗原の取り込み時に、Ｂ細胞は、抗原（タンパ
ク質）をプロセスし、クラスＩＩ ＭＨＣという文脈で、表面上のＴ細胞を提示
する。次いで、抗原特異的Ｔヘルパー細胞は、Ｔヘルパーエピトープ／クラスＩ
Ｉ ＭＨＣ複合体を結合し、そしてＢ細胞の血漿細胞を分泌する抗体または記憶
細胞への分化に導くヘルパーサイトカインを放出する。この事象はまた、特定の
Ｔヘルパー細胞を記憶細胞への分化に導く。従って、免疫系は、後の抗原に対す
る曝露時に、既往性応答（ブースター効果）のために準備される。
【００１５】 ポリサッカリド抗原は、Ｔ細胞エピトープを含まない。従って、ポリサッカリ
ドは、付着のタンパク質なしで提示される場合、Ｔ細胞非依存性応答を誘導する
。Ｔ細胞非依存性応答は、ＩｇＭによって優性にされる低いアフィニティ抗体に
よって特徴付けられる短命抗体応答を生じる。ポリサッカリドに対するタンパク
質の結合体は、ポリサッカリドに対してＴ細胞エピトープを提供する。これは、
Ｔ細胞非依存性応答をＴ細胞依存性応答に変換する。ポリサッカリドに対して特
異的なＢ細胞による結合体の取り込み時に、結合体のタンパク質部分がプロセス
され、Ｔ細胞エピトープが、Ｔヘルパー細胞との相互作用に対してクラスＩＩ
ＭＨＣの文脈でＢ細胞の表面上に示される。従って、抗体をポリサッカリドに分
泌するＢ細胞は、Ｔ細胞依存性様式で増殖される。
ドは、付着のタンパク質なしで提示される場合、Ｔ細胞非依存性応答を誘導する
。Ｔ細胞非依存性応答は、ＩｇＭによって優性にされる低いアフィニティ抗体に
よって特徴付けられる短命抗体応答を生じる。ポリサッカリドに対するタンパク
質の結合体は、ポリサッカリドに対してＴ細胞エピトープを提供する。これは、
Ｔ細胞非依存性応答をＴ細胞依存性応答に変換する。ポリサッカリドに対して特
異的なＢ細胞による結合体の取り込み時に、結合体のタンパク質部分がプロセス
され、Ｔ細胞エピトープが、Ｔヘルパー細胞との相互作用に対してクラスＩＩ
ＭＨＣの文脈でＢ細胞の表面上に示される。従って、抗体をポリサッカリドに分
泌するＢ細胞は、Ｔ細胞依存性様式で増殖される。
【００１６】 ｒＡＲＵは、３１の連続する繰り返し単位から構成され、複数のＴ細胞エピト
ープを含み得る（Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０〜４８
８（１９９０）。繰り返し単位は、クラスＩ繰り返しおよびクラスＩＩ繰り返し
として定義される。ｒＡＲＵは、Ｔ細胞依存性応答をポリサッカリドに誘導する
際の使用に独特に適し得る。それぞれの単位の配列は、類似しているが、同一で
はない。
ープを含み得る（Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０〜４８
８（１９９０）。繰り返し単位は、クラスＩ繰り返しおよびクラスＩＩ繰り返し
として定義される。ｒＡＲＵは、Ｔ細胞依存性応答をポリサッカリドに誘導する
際の使用に独特に適し得る。それぞれの単位の配列は、類似しているが、同一で
はない。
【００１７】 トキシンＢの繰り返し単位は、ｒＡＲＵの特徴と類似の特徴を有する。ｒＡＲ
Ｕと同様に、組換えトキシンＢの繰り返し単位（ｒＢＲＵ）は、比較的大きく（
約７０ｋＤａ）、そして類似のアミノ酸配列の連続した繰り返しから構成される
（Ｂａｒｒｏｓｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４００４（
１９９０）；Ｅｉｃｈｅｌ−Ｓｔｒｅｉｂｅｒら、Ｇｅｎｅ ９６：１０７−１
１３（１９９２））。トキシンＢのこの部分については、トキシンＡの結合ドメ
インほど知られていない。Ｔｈｏｍａｓら（米国特許第５，９１９，４６３号（
１９９９））は、抗原（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉウレ
アーゼ、オボアルブミン（ＯＶＡ），またはキーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ））に対する免疫応答を刺激するために鼻内投与される粘膜アジュバン
トとして、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｌｅのトキシンＡまたはトキシンＢ、あるいはそれ
らの特定のフラグメントを開示する。
Ｕと同様に、組換えトキシンＢの繰り返し単位（ｒＢＲＵ）は、比較的大きく（
約７０ｋＤａ）、そして類似のアミノ酸配列の連続した繰り返しから構成される
（Ｂａｒｒｏｓｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４００４（
１９９０）；Ｅｉｃｈｅｌ−Ｓｔｒｅｉｂｅｒら、Ｇｅｎｅ ９６：１０７−１
１３（１９９２））。トキシンＢのこの部分については、トキシンＡの結合ドメ
インほど知られていない。Ｔｈｏｍａｓら（米国特許第５，９１９，４６３号（
１９９９））は、抗原（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉウレ
アーゼ、オボアルブミン（ＯＶＡ），またはキーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ））に対する免疫応答を刺激するために鼻内投与される粘膜アジュバン
トとして、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｌｅのトキシンＡまたはトキシンＢ、あるいはそれ
らの特定のフラグメントを開示する。
【００１８】 ｒＡＲＵおよびｒＢＲＵは、結合体ワクチンのための候補キャリアタンパク質
として考えられていたが、このようなタンパク質の産生は、いくらか問題を提示
する。トキシンＡ、およびそれに対して惹起される抗体の産生のための方法が存
在する（米国特許第４，５３０，８３３号（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８５）；
米国特許第４，５３３，６３０号（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８５）；および米
国特許第４，８７９，２１８号（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８９））。十分量の
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡタンパク質およびトキシンＢタンパク質の
産生において、有意な困難性が存在する。これらの方法は、一般的に、煩わしく
、かつ高費用性である。しかし、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉ株における、Ｃ．ｄｉ
ｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡおよびトキシンＢの非毒性の短縮化された部分また
はフラグメントの構築および組換え発現を提供する。このような方法は、ポリサ
ッカリド抗原に対する体液性免疫原性を惹起するために有効な十分量のキャリア
分子の産生に、より効果的であり、そして商業的に実施可能である。
として考えられていたが、このようなタンパク質の産生は、いくらか問題を提示
する。トキシンＡ、およびそれに対して惹起される抗体の産生のための方法が存
在する（米国特許第４，５３０，８３３号（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８５）；
米国特許第４，５３３，６３０号（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８５）；および米
国特許第４，８７９，２１８号（Ｗｉｌｋｉｎｓら）（１９８９））。十分量の
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡタンパク質およびトキシンＢタンパク質の
産生において、有意な困難性が存在する。これらの方法は、一般的に、煩わしく
、かつ高費用性である。しかし、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉ株における、Ｃ．ｄｉ
ｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡおよびトキシンＢの非毒性の短縮化された部分また
はフラグメントの構築および組換え発現を提供する。このような方法は、ポリサ
ッカリド抗原に対する体液性免疫原性を惹起するために有効な十分量のキャリア
分子の産生に、より効果的であり、そして商業的に実施可能である。
【００１９】 本発明が克服する困難性の部分は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて大きいタンパク質を
高レベルで発現させることが困難であるという事実に関連する。さらに、これら
のクロストリジウム属の遺伝子配列における異常に高いＡＴ含量（すなわち、Ａ
Ｔリッチ）が、これらの遺伝子を高レベルで発現させることを特に困難なものに
する（Ｍａｋｏｆｆら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１０４３−１０４
６（１９８９））。大きい（すなわち、１００ｋｄより大きい）フラグメントを
Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させる場合、発現の困難性にしばしば遭遇することが報告
されている。トキシンＡ遺伝子のより小さいフラグメントを含む多くの発現構築
物が構築され、この遺伝子の小さい領域が、広範なタンパク質分解を伴わずに高
レベルに発現され得るかどうかが決定されてきた。多くの場合、大きい組換えフ
ラグメントよりむしろ、インタクトな全長融合タンパク質が、より高いレベルで
観察されることが報告された（Ｋｉｎｋら、米国特許第５，７３６，１３９号；
実施例１１（ｃ）を参照のこと）。ＡＴリッチなクロストリジウム属の遺伝子が
、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるそれらの高レベルの発現に干渉すると考えられる希少な
コドンを含むことが、さらに報告されている（Ｍａｋｏｆｆら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：１０１９１−１０２０２）。本発明は
、大きく、かつＡＴリッチである遺伝子を産生するための方法を提供する。例え
ば、トキシンＡの繰り返し単位は、約９８ｋＤａであり、そしてこの遺伝子配列
は、約７０％のＡＴ含量を有し、これは、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの約５０％のＡＴ
含量よりはるかに高い。本発明は、その希少なコドンを変化することも、希少な
ｔＲＮＡを供給することも伴わずに、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＡＴリッチな遺伝子
（非常に大きい遺伝子を含む）を高レベルで発現させる方法を提供する。
高レベルで発現させることが困難であるという事実に関連する。さらに、これら
のクロストリジウム属の遺伝子配列における異常に高いＡＴ含量（すなわち、Ａ
Ｔリッチ）が、これらの遺伝子を高レベルで発現させることを特に困難なものに
する（Ｍａｋｏｆｆら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１０４３−１０４
６（１９８９））。大きい（すなわち、１００ｋｄより大きい）フラグメントを
Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させる場合、発現の困難性にしばしば遭遇することが報告
されている。トキシンＡ遺伝子のより小さいフラグメントを含む多くの発現構築
物が構築され、この遺伝子の小さい領域が、広範なタンパク質分解を伴わずに高
レベルに発現され得るかどうかが決定されてきた。多くの場合、大きい組換えフ
ラグメントよりむしろ、インタクトな全長融合タンパク質が、より高いレベルで
観察されることが報告された（Ｋｉｎｋら、米国特許第５，７３６，１３９号；
実施例１１（ｃ）を参照のこと）。ＡＴリッチなクロストリジウム属の遺伝子が
、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるそれらの高レベルの発現に干渉すると考えられる希少な
コドンを含むことが、さらに報告されている（Ｍａｋｏｆｆら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：１０１９１−１０２０２）。本発明は
、大きく、かつＡＴリッチである遺伝子を産生するための方法を提供する。例え
ば、トキシンＡの繰り返し単位は、約９８ｋＤａであり、そしてこの遺伝子配列
は、約７０％のＡＴ含量を有し、これは、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの約５０％のＡＴ
含量よりはるかに高い。本発明は、その希少なコドンを変化することも、希少な
ｔＲＮＡを供給することも伴わずに、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＡＴリッチな遺伝子
（非常に大きい遺伝子を含む）を高レベルで発現させる方法を提供する。
【００２０】 上記文献の引用は、その前述のいずれかが妥当な先行技術であることを容認す
るものとして意図されない。これらの文献のデータまたは内容に関する提示に関
する全ての記載は、本出願人に入手可能な情報に基づき、そしてこれらの文献の
データまたは内容の正確さに関するいかなる容認を構成するものではない。さら
に、本出願を通して引用される全ての文献は、本明細書中でその全体が参考とし
て援用される。詳細には、本出願は、米国特許仮出願番号第６０／１８６，２０
１号（２０００年３月１日に提出）および米国特許仮出願番号第６０／１２８，
６８６号（１９９９年４月９日に提出）（これらの特許仮出願は、本明細書中で
その全体が参考として援用される）に対する優先権を主張する。
るものとして意図されない。これらの文献のデータまたは内容に関する提示に関
する全ての記載は、本出願人に入手可能な情報に基づき、そしてこれらの文献の
データまたは内容の正確さに関するいかなる容認を構成するものではない。さら
に、本出願を通して引用される全ての文献は、本明細書中でその全体が参考とし
て援用される。詳細には、本出願は、米国特許仮出願番号第６０／１８６，２０
１号（２０００年３月１日に提出）および米国特許仮出願番号第６０／１２８，
６８６号（１９９９年４月９日に提出）（これらの特許仮出願は、本明細書中で
その全体が参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【００２１】 （発明の要旨） 本発明は、組換えタンパク質成分およびポリサッカリド成分を含む免疫原性組
成物に関する。このタンパク質成分をコードする遺伝子は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｌ
ｅの株から単離される。このポリサッカリド成分は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポ
リサッカリドではなく、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ以外の供給源から単離される。
成物に関する。このタンパク質成分をコードする遺伝子は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｌ
ｅの株から単離される。このポリサッカリド成分は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポ
リサッカリドではなく、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ以外の供給源から単離される。
【００２２】 本発明の好ましい実施形態において、このタンパク質成分は、トキシンまたは
トキシンフラグメントである。さらに好ましい実施形態において、このトキシン
は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡである。本発明のより好ましい実施形
態において、このタンパク質成分は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＡの繰り
返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントの全アミノ酸配列を含む。この免
疫原性組成物はさらに、哺乳動物における注射に適切な処方物中で、薬学的に受
容可能なキャリアまたは他の組成物を含み得る。
トキシンフラグメントである。さらに好ましい実施形態において、このトキシン
は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡである。本発明のより好ましい実施形
態において、このタンパク質成分は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＡの繰り
返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントの全アミノ酸配列を含む。この免
疫原性組成物はさらに、哺乳動物における注射に適切な処方物中で、薬学的に受
容可能なキャリアまたは他の組成物を含み得る。
【００２３】 別の好ましい実施形態において、このトキシンが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅト
キシンＢであることを提供する。さらに好ましい実施形態は、このタンパク質が
、トキシンＢの繰り返し単位（ｒＢＲＵ）を含むトキシンＢの部分またはそのフ
ラグメントからなる。
キシンＢであることを提供する。さらに好ましい実施形態は、このタンパク質が
、トキシンＢの繰り返し単位（ｒＢＲＵ）を含むトキシンＢの部分またはそのフ
ラグメントからなる。
【００２４】 本発明の別の実施形態は、免疫原性組成物を産生するための方法を包含し、こ
の方法は、以下の工程による：組換えタンパク質成分をコードする遺伝子配列を
構築する工程であって、このタンパク質成分をコードする遺伝子は、Ｃ．ｄｉｆ
ｆｉｃｉｌｅの株から単離される、工程；この組換えタンパク質を微生物宿主中
で発現させる工程；この微生物宿主の培養物から、この組換えタンパク質成分を
回収する工程；このタンパク質成分をポリサッカリド成分に結合させる工程であ
って、このポリサッカリド成分は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ以外の供給源から単
離される、工程；および、この結合されたタンパク質成分およびポリサッカリド
成分を回収する工程。好ましい実施形態において、このポリサッカリド成分は、
病原性微生物から単離されるか、または化学的に合成される。本発明のなおさら
に好ましい実施形態は、この微生物宿主におけるこのタンパク質成分をコードす
る遺伝子配列の発現を、この宿主細胞の増殖を通して一定かつ安定な選択圧によ
って維持する工程を包含する。
の方法は、以下の工程による：組換えタンパク質成分をコードする遺伝子配列を
構築する工程であって、このタンパク質成分をコードする遺伝子は、Ｃ．ｄｉｆ
ｆｉｃｉｌｅの株から単離される、工程；この組換えタンパク質を微生物宿主中
で発現させる工程；この微生物宿主の培養物から、この組換えタンパク質成分を
回収する工程；このタンパク質成分をポリサッカリド成分に結合させる工程であ
って、このポリサッカリド成分は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ以外の供給源から単
離される、工程；および、この結合されたタンパク質成分およびポリサッカリド
成分を回収する工程。好ましい実施形態において、このポリサッカリド成分は、
病原性微生物から単離されるか、または化学的に合成される。本発明のなおさら
に好ましい実施形態は、この微生物宿主におけるこのタンパク質成分をコードす
る遺伝子配列の発現を、この宿主細胞の増殖を通して一定かつ安定な選択圧によ
って維持する工程を包含する。
【００２５】 本発明のさらに好ましい実施形態において、病原性微生物は、以下：Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｄｉｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；およびＳｈｉｇｅｌｌａ
種からなる群より選択される。なおさらに好ましい実施形態において、この病原
性微生物は、以下：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；コアグラー
ゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種；Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒ種；Ｃａｎｄｉｄａ種；；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
；およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種を含む、院内感染を引き起こす被包性の微生
物病原体からなる。
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｄｉｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；およびＳｈｉｇｅｌｌａ
種からなる群より選択される。なおさらに好ましい実施形態において、この病原
性微生物は、以下：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；コアグラー
ゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種；Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒ種；Ｃａｎｄｉｄａ種；；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
；およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種を含む、院内感染を引き起こす被包性の微生
物病原体からなる。
【００２６】 本発明の別の実施形態は、発現ベクターおよび形質転換された微生物宿主細胞
を含み、ここで、この発現ベクターは、このタンパク質成分をコードする遺伝子
を含む。好ましい実施形態において、このタンパク質成分をコードする遺伝子は
、１以上の制御可能な遺伝子調節発現エレメントに作動可能に連結される。なお
より好ましい実施形態において、このタンパク質成分コードする遺伝子は、第２
の遺伝子配列に融合され、その発現は、融合タンパク質の産生を生じる。さらに
より好ましい実施形態において、この制御可能な遺伝子調節発現エレメントは、
このタンパク質成分をコードする遺伝子の上流に作動可能に配置される誘導性プ
ロモーター配列を含み、かつこの誘導性プロモーター配列は、この微生物宿主中
で機能的である。本発明のさらにより好ましい実施形態は、発現可能な遺伝子配
列によってその発現ベクター上にコードされる選択的表現型を含み、微生物宿主
中でのその発現は、この選択的表現型がその微生物宿主の増殖に必要である条件
下で、その宿主を培養させた場合に、その微生物宿主の安定な増殖およびそのタ
ンパク質成分の定常的な産生を生じる。なおより好ましい実施形態は、その微生
物宿主に対して薬剤耐性を付与する選択的表現型を含み、さらにより好ましい実
施形態において、その薬剤耐性遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子であり、その
発現は、その微生物宿主を、培養培地中のカナマイシン存在下で生存することを
可能にする。
を含み、ここで、この発現ベクターは、このタンパク質成分をコードする遺伝子
を含む。好ましい実施形態において、このタンパク質成分をコードする遺伝子は
、１以上の制御可能な遺伝子調節発現エレメントに作動可能に連結される。なお
より好ましい実施形態において、このタンパク質成分コードする遺伝子は、第２
の遺伝子配列に融合され、その発現は、融合タンパク質の産生を生じる。さらに
より好ましい実施形態において、この制御可能な遺伝子調節発現エレメントは、
このタンパク質成分をコードする遺伝子の上流に作動可能に配置される誘導性プ
ロモーター配列を含み、かつこの誘導性プロモーター配列は、この微生物宿主中
で機能的である。本発明のさらにより好ましい実施形態は、発現可能な遺伝子配
列によってその発現ベクター上にコードされる選択的表現型を含み、微生物宿主
中でのその発現は、この選択的表現型がその微生物宿主の増殖に必要である条件
下で、その宿主を培養させた場合に、その微生物宿主の安定な増殖およびそのタ
ンパク質成分の定常的な産生を生じる。なおより好ましい実施形態は、その微生
物宿主に対して薬剤耐性を付与する選択的表現型を含み、さらにより好ましい実
施形態において、その薬剤耐性遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子であり、その
発現は、その微生物宿主を、培養培地中のカナマイシン存在下で生存することを
可能にする。
【００２７】 本発明の方法および組成物はまた、１リットル培養物あたり約１０ｍｇを超え
るレベル、より好ましくは、１リットルあたり約５０ｍｇより高いレベル、そし
てなおより好ましくは、１リットルあたり１００ｍｇ以上の、微生物宿主中での
組換えタンパク質の発現レベルを提供する。このタンパク質の分子量は、約３０
ｋＤａより大きく、好ましくは、約５０ｋＤａより大きく、そしてなおより好ま
しくは、約９０ｋＤａより大きい。また本発明において、このタンパク質は、タ
ンパク質の単離および回収についての当業者に公知の任意の多くの方法によって
回収され得るが、好ましくは、この回収は、硫酸アンモニウム沈殿、およびその
後のイオン交換クロマトグラフィーによる。
るレベル、より好ましくは、１リットルあたり約５０ｍｇより高いレベル、そし
てなおより好ましくは、１リットルあたり１００ｍｇ以上の、微生物宿主中での
組換えタンパク質の発現レベルを提供する。このタンパク質の分子量は、約３０
ｋＤａより大きく、好ましくは、約５０ｋＤａより大きく、そしてなおより好ま
しくは、約９０ｋＤａより大きい。また本発明において、このタンパク質は、タ
ンパク質の単離および回収についての当業者に公知の任意の多くの方法によって
回収され得るが、好ましくは、この回収は、硫酸アンモニウム沈殿、およびその
後のイオン交換クロマトグラフィーによる。
【００２８】 本発明はさらに、免疫原性組成物を調製するための方法を包含し、ここで、こ
のタンパク質は、当業者に公知の多くの手順の１つによってポリサッカリドに結
合されるが、好ましくは、最初に、このタンパク質をスクシニル化によって誘導
体化し、次いで、このタンパク質およびポリサッカリド成分と１，エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（１，ｅｔｈｙ
ｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｉｉｍｉ
ｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）との反応によって、このポリサッカリド成
分をこのタンパク質に結合させることによる。さらに、本発明は、任意のいくつ
かの試薬、好ましくは、臭化シアンの使用によって、このポリサッカリド成分を
活性化させることを意図する。このポリサッカリドは、アジピン酸ジヒドラジド
によってさらに誘導体化されてもよい。ｒＡＲＵを用いて合成された結合体はま
た、還元的アミノ化または当該分野で公知の任意の他の方法によって調製され得
る（Ｇｒａｙ ＧＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ５０：１５５−１６０
（１９７８）；Ｐａｗｌｏｗｓｋｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１４７４−１４
８３）。
のタンパク質は、当業者に公知の多くの手順の１つによってポリサッカリドに結
合されるが、好ましくは、最初に、このタンパク質をスクシニル化によって誘導
体化し、次いで、このタンパク質およびポリサッカリド成分と１，エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（１，ｅｔｈｙ
ｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｉｉｍｉ
ｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）との反応によって、このポリサッカリド成
分をこのタンパク質に結合させることによる。さらに、本発明は、任意のいくつ
かの試薬、好ましくは、臭化シアンの使用によって、このポリサッカリド成分を
活性化させることを意図する。このポリサッカリドは、アジピン酸ジヒドラジド
によってさらに誘導体化されてもよい。ｒＡＲＵを用いて合成された結合体はま
た、還元的アミノ化または当該分野で公知の任意の他の方法によって調製され得
る（Ｇｒａｙ ＧＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ５０：１５５−１６０
（１９７８）；Ｐａｗｌｏｗｓｋｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１４７４−１４
８３）。
【００２９】 本発明はさらに、病原性微生物に感染された哺乳動物被験体の処置のための、
本発明の組成物の使用の方法を包含する。同様に、本発明は、病原性微生物によ
る哺乳動物被験体の感染に対する防御を提供するための、本発明の組成物の使用
の方法を提供する。
本発明の組成物の使用の方法を包含する。同様に、本発明は、病原性微生物によ
る哺乳動物被験体の感染に対する防御を提供するための、本発明の組成物の使用
の方法を提供する。
【００３０】 （発明の詳細な説明） 本発明は、免疫原性組成物に関する。この組成物は、少なくとも１つの組換え
タンパク質成分およびポリサッカリド成分を含む。ここで、このタンパク質成分
をコードする遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株から
単離される。このポリサッカリド成分は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリサッカリ
ドではなく、そしてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ以外の供給源から単離される。この
ポリサッカリドは医療上有用であり、そして病原性微生物から単離されるかまた
は合成される。本発明の好ましい実施形態は、そのタンパク質がトキシンまたは
トキシンフラグメントであることを提供する。なおさらに好ましい実施形態は、
そのトキシンがトキシンＡであることを提供し、ここで、なおさらに好ましい実
施形態は、トキシンＡ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントのアミ
ノ酸配列のすべてを含むトキシンの一部分である。別の好ましい実施形態は、そ
のトキシンがトキシンＢであることである。ここで、さらに別の好ましい実施形
態は、繰り返し単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントのアミノ酸配列の全て
を含むそのトキシンの一部分である。免疫原性組成物は、さらに、哺乳動物にお
ける注射のために適切な処方物において、薬学的に受容可能なキャリアまたは他
の組成物を含み得る。
タンパク質成分およびポリサッカリド成分を含む。ここで、このタンパク質成分
をコードする遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株から
単離される。このポリサッカリド成分は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリサッカリ
ドではなく、そしてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ以外の供給源から単離される。この
ポリサッカリドは医療上有用であり、そして病原性微生物から単離されるかまた
は合成される。本発明の好ましい実施形態は、そのタンパク質がトキシンまたは
トキシンフラグメントであることを提供する。なおさらに好ましい実施形態は、
そのトキシンがトキシンＡであることを提供し、ここで、なおさらに好ましい実
施形態は、トキシンＡ繰り返し単位（ｒＡＲＵ）またはそのフラグメントのアミ
ノ酸配列のすべてを含むトキシンの一部分である。別の好ましい実施形態は、そ
のトキシンがトキシンＢであることである。ここで、さらに別の好ましい実施形
態は、繰り返し単位（ｒＢＲＵ）またはそのフラグメントのアミノ酸配列の全て
を含むそのトキシンの一部分である。免疫原性組成物は、さらに、哺乳動物にお
ける注射のために適切な処方物において、薬学的に受容可能なキャリアまたは他
の組成物を含み得る。
【００３１】 本発明のこれらの免疫原性組成物は、哺乳動物宿主において免疫応答を惹起す
る。この動物にはヒトおよび他の動物が含まれる。免疫応答は、細胞依存性応答
または抗体依存性の応答のいずれかあるいはその両方であり得、そしてさらにそ
の応答は、免疫記憶またはブースター効果あるいはその両方を、その哺乳動物宿
主において提供し得る。これらの免疫原性組成物はワクチンとして有用であり、
そしてＣｌｏｓｔｅｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株による感染からの哺乳
動物被検体または宿主による保護的応答を提供し得る。
る。この動物にはヒトおよび他の動物が含まれる。免疫応答は、細胞依存性応答
または抗体依存性の応答のいずれかあるいはその両方であり得、そしてさらにそ
の応答は、免疫記憶またはブースター効果あるいはその両方を、その哺乳動物宿
主において提供し得る。これらの免疫原性組成物はワクチンとして有用であり、
そしてＣｌｏｓｔｅｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株による感染からの哺乳
動物被検体または宿主による保護的応答を提供し得る。
【００３２】 本発明は、さらに、以下による免疫原性組成物を生成するための方法を包含す
る：組換えタンパク質成分をコードする遺伝子配列を構築する工程であって、こ
こでそのタンパク質成分をコードする遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉ
ｆｆｉｃｉｌｅの株から単離される、工程；その組換えタンパク質成分を微生物
宿主中で発現する工程；その組換えタンパク質をその宿主の培養物から回収する
工程；そのタンパク質を第二のタンパク質成分と結合する工程、ならびにその結
合されたタンパク質およびポリサッカリド成分を回収する工程。このタンパク質
成分はまた、融合タンパク質からなり得、ここでは、その組換えタンパク質の一
部は、第二のタンパク質に遺伝子的に融合されている。好ましくは、遺伝子配列
の発現は、その配列の上流に作動可能に配置され、そしてその宿主細胞中で機能
性である誘導プロモーターによって調節される。なおさらに、その遺伝子配列は
、定常的かつ安定な選択圧力によって、その宿主の増殖の間維持される。その発
現ベクターの維持は、選択遺伝子型をコードする遺伝子配列の発現ベクターへの
取り込みにより付与され得る。その微生物宿主細胞におけるその配列の発現は、
選択表現型を生じる。そのような選択遺伝子型は、カナマイシンのような抗生物
質に対する耐性をコードする遺伝子を含む。カナマイシンの存在のような選択剤
または状態の存在下で発現ベクター上のこの選択遺伝子型配列の発現は、その宿
主の増殖の間、そのベクターの安定な維持を生じる。選択的遺伝子型配列はまた
、条件的に致死変異を補完する遺伝子を含み得る。
る：組換えタンパク質成分をコードする遺伝子配列を構築する工程であって、こ
こでそのタンパク質成分をコードする遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉ
ｆｆｉｃｉｌｅの株から単離される、工程；その組換えタンパク質成分を微生物
宿主中で発現する工程；その組換えタンパク質をその宿主の培養物から回収する
工程；そのタンパク質を第二のタンパク質成分と結合する工程、ならびにその結
合されたタンパク質およびポリサッカリド成分を回収する工程。このタンパク質
成分はまた、融合タンパク質からなり得、ここでは、その組換えタンパク質の一
部は、第二のタンパク質に遺伝子的に融合されている。好ましくは、遺伝子配列
の発現は、その配列の上流に作動可能に配置され、そしてその宿主細胞中で機能
性である誘導プロモーターによって調節される。なおさらに、その遺伝子配列は
、定常的かつ安定な選択圧力によって、その宿主の増殖の間維持される。その発
現ベクターの維持は、選択遺伝子型をコードする遺伝子配列の発現ベクターへの
取り込みにより付与され得る。その微生物宿主細胞におけるその配列の発現は、
選択表現型を生じる。そのような選択遺伝子型は、カナマイシンのような抗生物
質に対する耐性をコードする遺伝子を含む。カナマイシンの存在のような選択剤
または状態の存在下で発現ベクター上のこの選択遺伝子型配列の発現は、その宿
主の増殖の間、そのベクターの安定な維持を生じる。選択的遺伝子型配列はまた
、条件的に致死変異を補完する遺伝子を含み得る。
【００３３】 他の遺伝子配列は、発現ベクター中に取り込まれ得る（例えば、他の薬物耐性
遺伝子または致死変異を補完する遺伝子）。
遺伝子または致死変異を補完する遺伝子）。
【００３４】 本発明の微生物宿主は、以下を含み得る：グラム陽性細菌；グラム陰性細菌；
好ましくはＥ．ｃｏｌｉ細胞、酵母；糸状真菌細胞；哺乳動物細胞；昆虫細胞；
または植物細胞。
好ましくはＥ．ｃｏｌｉ細胞、酵母；糸状真菌細胞；哺乳動物細胞；昆虫細胞；
または植物細胞。
【００３５】 本発明の方法はまた、約１０ｍｇ／Ｌ培養物を超える、より好ましくは約５０
ｍｇ／Ｌを超える、そしてさらにより好ましくは約１００ｍｇ／Ｌでの、または
約１００ｍｇ／Ｌを超えるレベルで、その宿主中の組換えタンパク質の発現のレ
ベルを提供する。そのタンパク質の分子量は、約３０ｋＤａを超え、好ましくは
約５０ｋＤａを超え、そしてさらにより好ましくは、約９０ｋＤａを超える。本
発明はまた、そのタンパク質がタンパク質の単離および回収について当業者に公
知の多数のいずれかの方法によって回収され得るが、好ましくは、その回収が硫
酸アンモニウム沈降、続いてイオン交換クロマトグラフィーによることを提供す
る。
ｍｇ／Ｌを超える、そしてさらにより好ましくは約１００ｍｇ／Ｌでの、または
約１００ｍｇ／Ｌを超えるレベルで、その宿主中の組換えタンパク質の発現のレ
ベルを提供する。そのタンパク質の分子量は、約３０ｋＤａを超え、好ましくは
約５０ｋＤａを超え、そしてさらにより好ましくは、約９０ｋＤａを超える。本
発明はまた、そのタンパク質がタンパク質の単離および回収について当業者に公
知の多数のいずれかの方法によって回収され得るが、好ましくは、その回収が硫
酸アンモニウム沈降、続いてイオン交換クロマトグラフィーによることを提供す
る。
【００３６】 本発明はさらに、当業者に公知の多数の手段の一つによってポリサッカリドに
そのタンパク質を結合させることを提供する。好ましくは、これは、まずそのタ
ンパク質をスクシニル化によって誘導体化し、そして次いでそのポリサッカリド
成分をそのタンパク質に、そのタンパク質とそのポリサッカリドとの、１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリドでの反
応を通じて、連結することによる。さらに、本発明は、いくつかの試薬のいずれ
かの使用による、ポリサッカリド成分の活性化を企図する。これは、好ましくは
、臭化シアンによる。このサッカリドアジピン酸ジヒドラジドによりさらに誘導
体化され得る。
そのタンパク質を結合させることを提供する。好ましくは、これは、まずそのタ
ンパク質をスクシニル化によって誘導体化し、そして次いでそのポリサッカリド
成分をそのタンパク質に、そのタンパク質とそのポリサッカリドとの、１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリドでの反
応を通じて、連結することによる。さらに、本発明は、いくつかの試薬のいずれ
かの使用による、ポリサッカリド成分の活性化を企図する。これは、好ましくは
、臭化シアンによる。このサッカリドアジピン酸ジヒドラジドによりさらに誘導
体化され得る。
【００３７】 多数のポリサッカリド成分が選択され得、そして本発明のタンパク質成分と結
合され得る。本発明の免疫原性組成物は、さらに、ポリサッカリド、リポポリサ
ッカリド、莢膜ポリサッカリドまたは他のポリサッカリド成分を含み得る。その
ようなポリサッカリド成分は、例えば、病原体微生物から選択され得る。この病
原体微生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｓｈｉｇ
ｅｌｌａ種；およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからなる群より選択され
る。
合され得る。本発明の免疫原性組成物は、さらに、ポリサッカリド、リポポリサ
ッカリド、莢膜ポリサッカリドまたは他のポリサッカリド成分を含み得る。その
ようなポリサッカリド成分は、例えば、病原体微生物から選択され得る。この病
原体微生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｓｈｉｇ
ｅｌｌａ種；およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからなる群より選択され
る。
【００３８】 このようなポリサッカリド成分は、例えば、以下からなる群の血清型より選択
されるＳｔｒｅｐｔｏｃｕｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型からより
詳細に選択され得る：１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０
Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、
２２Ｆ、２３Ｆ、２５および３３Ｆ。また、そのポリサッカリド成分は、Ｓｈｉ
ｇｅｌｌａの任意の種から選択され得、これには、例えば、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒ
ｉが含まれ、そしてそのポリサッカリド成分は、任意の血清型のＳｈｉｇｅｌｌ
ａ種（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ血清型２ａ）が含まれ得る。そのポリサッカリドは
、ある型のＥ．ｃｏｌｉ例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１から特に選択され得る。
されるＳｔｒｅｐｔｏｃｕｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型からより
詳細に選択され得る：１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０
Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、
２２Ｆ、２３Ｆ、２５および３３Ｆ。また、そのポリサッカリド成分は、Ｓｈｉ
ｇｅｌｌａの任意の種から選択され得、これには、例えば、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒ
ｉが含まれ、そしてそのポリサッカリド成分は、任意の血清型のＳｈｉｇｅｌｌ
ａ種（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ血清型２ａ）が含まれ得る。そのポリサッカリドは
、ある型のＥ．ｃｏｌｉ例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１から特に選択され得る。
【００３９】 そのポリサッカリド成分はまた、任意の院内病原性微生物から選択され得、こ
れは、以下からなる群に由来する：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ
ｓ；コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ種；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種；Ｃａｎｄｉｄａ種；Ｂ型Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ種。ポリサッカリド成分は、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの血清型からより詳
細に選択され得る、これには、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ血清型５またはＳ．ａｕｒｅｕ
ｓ 血清型８が含まれる。
れは、以下からなる群に由来する：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ
ｓ；コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ種；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種；Ｃａｎｄｉｄａ種；Ｂ型Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ種。ポリサッカリド成分は、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの血清型からより詳
細に選択され得る、これには、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ血清型５またはＳ．ａｕｒｅｕ
ｓ 血清型８が含まれる。
【００４０】 また、組換えタンパク質の高収量は、増殖条件、発現速度およびＡＴリッチ遺
伝子配列を発現するために使用される時間の長さに依存し得る。一般に、ＡＴリ
ッチ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、指数関数増殖期の後または遅延増殖期の
間により高いレベルで発現されるようである。コードされるタンパク質の高レベ
ルの産生は、より短い時間（例えば、４〜６時間）にわたる指数関数的増殖の間
の高レベルの発現の代表的なアプローチではなく、長期（例えば、２０〜２４時
間）の指数関数的後の増殖期にわたる中程度のレベルの発現を必要とする。この
点に関して、長期の増殖の間のその遺伝子またはその発現ベクターについての定
常的選択圧力を維持することにより、目的の遺伝子を有するプラスミドを維持す
ることがより効率的である。本発明の１つの局面は、アンピリシンを用いてみい
だされるように、発現宿主細胞の増殖の間に不活化または分解されない抗生物質
を用いることである。１つのそのような好ましい実施形態は、その発現ベクター
を維持するための選択表現型としてのカナマイシンに対する耐性をコードする遺
伝子の発現を含む。このベクターは、そのようなカナマイシン遺伝子配列を含む
。Ｅ．ｃｏｌｉにおける本発明の方法により提供されるレベル（＞１００ｍｇ／
Ｌ）の大きなＡＴリッチクロストリジアム遺伝子の発現は、これまで未知であっ
た。
伝子配列を発現するために使用される時間の長さに依存し得る。一般に、ＡＴリ
ッチ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、指数関数増殖期の後または遅延増殖期の
間により高いレベルで発現されるようである。コードされるタンパク質の高レベ
ルの産生は、より短い時間（例えば、４〜６時間）にわたる指数関数的増殖の間
の高レベルの発現の代表的なアプローチではなく、長期（例えば、２０〜２４時
間）の指数関数的後の増殖期にわたる中程度のレベルの発現を必要とする。この
点に関して、長期の増殖の間のその遺伝子またはその発現ベクターについての定
常的選択圧力を維持することにより、目的の遺伝子を有するプラスミドを維持す
ることがより効率的である。本発明の１つの局面は、アンピリシンを用いてみい
だされるように、発現宿主細胞の増殖の間に不活化または分解されない抗生物質
を用いることである。１つのそのような好ましい実施形態は、その発現ベクター
を維持するための選択表現型としてのカナマイシンに対する耐性をコードする遺
伝子の発現を含む。このベクターは、そのようなカナマイシン遺伝子配列を含む
。Ｅ．ｃｏｌｉにおける本発明の方法により提供されるレベル（＞１００ｍｇ／
Ｌ）の大きなＡＴリッチクロストリジアム遺伝子の発現は、これまで未知であっ
た。
【００４１】 本明細書において使用される用語は、その当該分野において認識される意味に
基づき、そして当業者に明白に理解されるはずである。
基づき、そして当業者に明白に理解されるはずである。
【００４２】 ｒＡＲＵは、Ｄｏｖｅらによって規定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆ
ｆｉｃｉｌｅ トキシンＡの繰り返し単位を含む組換えタンパク質である（Ｄｏ
ｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−４８８ （１９９０））。
ｒＡＲＵをコードするヌクレオチド配列およびｒＡＲＵのアミノ酸配列は、図２
および３にそれぞれ示される。ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrによって発現され
るｒＡＲＵは、トキシンＡの繰り返し単位領域の全体を含む。本発明はさらに、
単独で発現されるものであれ、融合タンパク質としてであれ、この組換えタンパ
ク質成分、またはトキシンＡの繰り返し単位全体を含む他の任意のタンパク質成
分またはその中の任意のフラグメントの使用を企図する。
ｆｉｃｉｌｅ トキシンＡの繰り返し単位を含む組換えタンパク質である（Ｄｏ
ｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−４８８ （１９９０））。
ｒＡＲＵをコードするヌクレオチド配列およびｒＡＲＵのアミノ酸配列は、図２
および３にそれぞれ示される。ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrによって発現され
るｒＡＲＵは、トキシンＡの繰り返し単位領域の全体を含む。本発明はさらに、
単独で発現されるものであれ、融合タンパク質としてであれ、この組換えタンパ
ク質成分、またはトキシンＡの繰り返し単位全体を含む他の任意のタンパク質成
分またはその中の任意のフラグメントの使用を企図する。
【００４３】 融合タンパク質は、遺伝子または遺伝子のフラグメントによってコードされる
組換えタンパク質である。
組換えタンパク質である。
【００４４】 免疫原性組成物は、その免疫原性組成物が注射または他の方法で導入されると
きに、哺乳動物宿主における免疫応答を惹起する物質の任意の組成物である。免
疫反応は、体液性、細胞性またはその両方であり得る。
きに、哺乳動物宿主における免疫応答を惹起する物質の任意の組成物である。免
疫反応は、体液性、細胞性またはその両方であり得る。
【００４５】 ブースター効果とは、同じ免疫原性組成物に対する哺乳動物宿主の続いての曝
露の際の免疫原性組成物に対する免疫応答の増加をいう。
露の際の免疫原性組成物に対する免疫応答の増加をいう。
【００４６】 体液性応答は、免疫原性組成物に対する曝露の際に哺乳動物宿主による抗体の
産生を生じる。
産生を生じる。
【００４７】 ここまで、本発明を一般的に記載してきたことから、本発明は、以下の実施例
を参酌してより容易に理解される。これらの実施例は、例示の目的で提供され、
そして特定しない限り本発明の限定を意図しない。
を参酌してより容易に理解される。これらの実施例は、例示の目的で提供され、
そして特定しない限り本発明の限定を意図しない。
【００４８】 （実施例） （実施例１：ｒＡＲＵ発現ベクターの構築） 発現および精製のために使用したベクターをクローニングのための標準的な技
術を用いて構築した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｖ Ｍａｎｕａｌ （１９８９））。ｒＡＲＵをコ
ードするトキシンＡ遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列は、クローニングさ
れたトキシンＡ遺伝子から得（Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８．
４８０−４８８ （１９９０）；Ｐｈｅｌｐｓら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．
５９：１５０−１５３ （１９９１））、そして図２に示す。この遺伝子フラグ
メントは、タンパク質８６７アミノ酸長をコードする（図３）。ここで、算出さ
れる分子量は９８ｋＤａである。この遺伝子フラグメントを発現ベクターｐＲＳ
ＥＴＢへとサブクローニングした。カナマイシン耐性遺伝子を、次にこのベクタ
ーへとサブクローニングした。得られたベクターｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍr
は、ｒＡＲＵを発現する。この組換えタンパク質のＮ末端にはさらに３１アミノ
酸が発現ベクターｐＲＳＥＴＢによって与えられる。その組換えタンパク質の最
後の算出分子量は１０２ｋＤａである。
術を用いて構築した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｖ Ｍａｎｕａｌ （１９８９））。ｒＡＲＵをコ
ードするトキシンＡ遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列は、クローニングさ
れたトキシンＡ遺伝子から得（Ｄｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８．
４８０−４８８ （１９９０）；Ｐｈｅｌｐｓら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．
５９：１５０−１５３ （１９９１））、そして図２に示す。この遺伝子フラグ
メントは、タンパク質８６７アミノ酸長をコードする（図３）。ここで、算出さ
れる分子量は９８ｋＤａである。この遺伝子フラグメントを発現ベクターｐＲＳ
ＥＴＢへとサブクローニングした。カナマイシン耐性遺伝子を、次にこのベクタ
ーへとサブクローニングした。得られたベクターｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍr
は、ｒＡＲＵを発現する。この組換えタンパク質のＮ末端にはさらに３１アミノ
酸が発現ベクターｐＲＳＥＴＢによって与えられる。その組換えタンパク質の最
後の算出分子量は１０２ｋＤａである。
【００４９】 （実施例２：ｒＡＲＵの発現および精製） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｔ７ 発現宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）を
、記載されるように、ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrで形質転換した（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ （１９８９））。１Ｌの培養物を、ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋ
ｍrを含む１０ｍｌのＥ．ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ
３）の一晩培養物に接種し、、そして２５ μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＴ
ｅｒｒｉｆｉｃブロス （Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．，ＭＯ）中で１．
８〜２．０にまでＯ．Ｄ．６００増殖させ、そしてイソプロピルβ−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度４０μＭにまで添加した。細胞を、誘
導の２２時間後採集し、０．２％のカザミノ酸を含む０．１Ｌの標準的なリン酸
緩衝化生理食塩水ｐＨ７に懸濁化し、そして超音波処理により破壊した。細胞砕
片を遠心分離により溶解物から除去した。溶解物は、代表的に、ＴＯＸ−Ａ試験
ＥＩＡにおいて１０6の力価（０．２を超えるＡ４５０を有する最高希釈物の逆
数）を含んだ（ＴｅｃｈＬａｂ．Ｉｎｃ．．Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ， ＶＡ）。
溶解物を、４０％硫酸アンモニウムで飽和させ、４℃で一晩攪拌し、そして沈澱
したタンパク質を遠心分離により採取した。この硫酸アンモニウム画分を０．１
Ｌの５ｍＭ Ｋ2ＰＯ4， ０−１ Ｍ ＮａＣ１2、ｐＨ ８．０中に懸濁し、
そして４℃で同じ緩衝液に対して徹底的に透析した。可溶性材料を遠心分離によ
り除去した。透析した溶液をＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂクロマトグラフィ
ー媒体（５０ｍｌ媒体／１００ｍｌ溶液）を含むカラムに通した。画分を収集し
、そしてｒＡＲＵの存在について、ＴＯＸ−Ａ試験を用いてＥＩＡによりモニタ
ーした。ＥＩＡ活性を含む画分を、およそ１０２ＫＤａの分子量でのｒＡＲＵの
存在についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分析した。単一バンドのｒＡＲＵを含む
画分をプールした。純度をさらに確実とするために、プールされた溶液をＳｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ カラム（２５ｍｌ媒体／１００ｍｌタンパク質溶液
）に対して通過させた。精製されたｒＡＲＵを含む溶液を２２μフィルターを通
過させることによりフィルター濾過し、そして４℃で保存した。精製されたｒＡ
ＲＵを、精製（溶解物および透析された硫酸アンモニウム画分）の工程からのサ
ンプルとともに、図５に示す。その手順は、代表的に、１リットルのＥ．ｃｏｌ
ｉ／ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍr培養物あたりおよそ１００ｍｇ ｒＡＲＵを
得る。併せて６リットルのバッチにより、合計で７４８ｍｇのｒＡＲＵについて
０．８８ｍｇ／ｍｌでまたは１２５ｍｇ／リットルの培養物０．８５０リットル
のｒＡＲＵが得られた。回収されたｒＡＲＵの量は可溶性タンパク質の合計の２
３％を示す。
、記載されるように、ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrで形質転換した（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ （１９８９））。１Ｌの培養物を、ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋ
ｍrを含む１０ｍｌのＥ．ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ
３）の一晩培養物に接種し、、そして２５ μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＴ
ｅｒｒｉｆｉｃブロス （Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．，ＭＯ）中で１．
８〜２．０にまでＯ．Ｄ．６００増殖させ、そしてイソプロピルβ−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度４０μＭにまで添加した。細胞を、誘
導の２２時間後採集し、０．２％のカザミノ酸を含む０．１Ｌの標準的なリン酸
緩衝化生理食塩水ｐＨ７に懸濁化し、そして超音波処理により破壊した。細胞砕
片を遠心分離により溶解物から除去した。溶解物は、代表的に、ＴＯＸ−Ａ試験
ＥＩＡにおいて１０6の力価（０．２を超えるＡ４５０を有する最高希釈物の逆
数）を含んだ（ＴｅｃｈＬａｂ．Ｉｎｃ．．Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ， ＶＡ）。
溶解物を、４０％硫酸アンモニウムで飽和させ、４℃で一晩攪拌し、そして沈澱
したタンパク質を遠心分離により採取した。この硫酸アンモニウム画分を０．１
Ｌの５ｍＭ Ｋ2ＰＯ4， ０−１ Ｍ ＮａＣ１2、ｐＨ ８．０中に懸濁し、
そして４℃で同じ緩衝液に対して徹底的に透析した。可溶性材料を遠心分離によ
り除去した。透析した溶液をＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂクロマトグラフィ
ー媒体（５０ｍｌ媒体／１００ｍｌ溶液）を含むカラムに通した。画分を収集し
、そしてｒＡＲＵの存在について、ＴＯＸ−Ａ試験を用いてＥＩＡによりモニタ
ーした。ＥＩＡ活性を含む画分を、およそ１０２ＫＤａの分子量でのｒＡＲＵの
存在についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分析した。単一バンドのｒＡＲＵを含む
画分をプールした。純度をさらに確実とするために、プールされた溶液をＳｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ カラム（２５ｍｌ媒体／１００ｍｌタンパク質溶液
）に対して通過させた。精製されたｒＡＲＵを含む溶液を２２μフィルターを通
過させることによりフィルター濾過し、そして４℃で保存した。精製されたｒＡ
ＲＵを、精製（溶解物および透析された硫酸アンモニウム画分）の工程からのサ
ンプルとともに、図５に示す。その手順は、代表的に、１リットルのＥ．ｃｏｌ
ｉ／ｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍr培養物あたりおよそ１００ｍｇ ｒＡＲＵを
得る。併せて６リットルのバッチにより、合計で７４８ｍｇのｒＡＲＵについて
０．８８ｍｇ／ｍｌでまたは１２５ｍｇ／リットルの培養物０．８５０リットル
のｒＡＲＵが得られた。回収されたｒＡＲＵの量は可溶性タンパク質の合計の２
３％を示す。
【００５０】 （実施例３：ポリサッカリド−ｒＡＲＵ結合体の合成） ポリサッカリド。肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型ポリサッカリ
ド、Ｌｏｔ ４０２３５−００１は、Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、Ｐｅａｒｌ Ｒｉｖｅｒ，ＮＹにより製造された。Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ
２ａ型Ｏ特異的ポリサッカリドおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１ポリサッカリドを記載
されるように精製した（Ｃｏｈｅｎ Ｄ．ら、Ｌａｎｃｅｔ ３４９：１５５−
１５９ （１９９７）；Ｄｅｖｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８８：７１７５−７１７９（１９９１）；Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：３５２８−３５３２（１９９２））。すべての
調製物は、１％未満のタンパク質および核酸を有した。
ド、Ｌｏｔ ４０２３５−００１は、Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、Ｐｅａｒｌ Ｒｉｖｅｒ，ＮＹにより製造された。Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ
２ａ型Ｏ特異的ポリサッカリドおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１ポリサッカリドを記載
されるように精製した（Ｃｏｈｅｎ Ｄ．ら、Ｌａｎｃｅｔ ３４９：１５５−
１５９ （１９９７）；Ｄｅｖｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８８：７１７５−７１７９（１９９１）；Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：３５２８−３５３２（１９９２））。すべての
調製物は、１％未満のタンパク質および核酸を有した。
【００５１】 化学物質。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
（１，ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａ
ｒｂｏｉｉｍｉｄｅ）（ＥＤＣ）、無水コハク酸、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリ
ノ］−エタンスルホン酸）水和物、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸ナ
トリウム塩、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）およびチメロサールを
、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手し；アジピン酸ジヒド
ラジド、臭化シアン、およびアセトニトリルを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，
Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから入手し；ＣＬ−４ｂおよびＣＬ−６Ｂ Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０をＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔ
ａｗａｙ， ＮＪから得た。
（１，ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａ
ｒｂｏｉｉｍｉｄｅ）（ＥＤＣ）、無水コハク酸、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリ
ノ］−エタンスルホン酸）水和物、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸ナ
トリウム塩、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）およびチメロサールを
、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手し；アジピン酸ジヒド
ラジド、臭化シアン、およびアセトニトリルを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，
Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから入手し；ＣＬ−４ｂおよびＣＬ−６Ｂ Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０をＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔ
ａｗａｙ， ＮＪから得た。
【００５２】 分析方法。その結合体のタンパク質およびサッカリド成分を、記載されるよう
にアッセイした（Ｃｈｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：４４５０−４４
５８ （１９９１））。アジピン酸ジヒドラジドでの誘導体化を、トリニトロベ
ンゼンスルホン酸アッセイに（Ｃｈｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：４
４５０−４４５８ （１９９１））。リジンを標準として用いてスクシニル化の
程度を、ｒＡＲＵのアミノ基の減少により間接的に測定した（Ｆｉｅｌｄｓ Ｒ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１２４：５８１−５９０ （１９７１）；Ｐａｖｌｉｏ
ｋｏｖａら． Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５５２６−５５２９ （１９
９９））。
にアッセイした（Ｃｈｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：４４５０−４４
５８ （１９９１））。アジピン酸ジヒドラジドでの誘導体化を、トリニトロベ
ンゼンスルホン酸アッセイに（Ｃｈｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：４
４５０−４４５８ （１９９１））。リジンを標準として用いてスクシニル化の
程度を、ｒＡＲＵのアミノ基の減少により間接的に測定した（Ｆｉｅｌｄｓ Ｒ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１２４：５８１−５９０ （１９７１）；Ｐａｖｌｉｏ
ｋｏｖａら． Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５５２６−５５２９ （１９
９９））。
【００５３】 ｒＡＲＵのスクシニル化。予備的実験によって、ヤギ抗ＣＤＴＡを用いた二重
免疫拡散によって測定されるようにその抗原性を維持しつつｒＡＲＵをスクシニ
ル化した条件を決定した（Ｐａｖｌｉａｋｏｖａら Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ
． ６７：５５２６−５５２９ （１９８９））。コハク酸無水物を、ｒＡＲＵ
に１／１０のｗ／ｗで室温で混合しながら添加した：ｐＨをｐＨスタット中で０
．５Ｍ ＮａＯＨを用いて７．２〜７．５に維持した。２０分後、反応混合物を
、０．２Ｍ ＮａＣｌ中で２．５×５０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラ
ムを通して通過させ、そしてボイド容積のピークをプールし、そして濃縮した。
免疫拡散によって測定されるようにその抗原性を維持しつつｒＡＲＵをスクシニ
ル化した条件を決定した（Ｐａｖｌｉａｋｏｖａら Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ
． ６７：５５２６−５５２９ （１９８９））。コハク酸無水物を、ｒＡＲＵ
に１／１０のｗ／ｗで室温で混合しながら添加した：ｐＨをｐＨスタット中で０
．５Ｍ ＮａＯＨを用いて７．２〜７．５に維持した。２０分後、反応混合物を
、０．２Ｍ ＮａＣｌ中で２．５×５０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラ
ムを通して通過させ、そしてボイド容積のピークをプールし、そして濃縮した。
【００５４】 ポリサッカリドのｒＡＲＵまたはｒＡＲＵｓｕｃｃへの結合。肺炎球菌１４型
ポリサッカリドおよびＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ型 Ｏ特異的ポリサッカリド
を、臭化シアンを用いて活性化し、アジピン酸ジヒドラジドで誘導体化し、そし
て以下を除いて記載のとおりにｒＡＲＵまたはｒＡＲＵｓｕｃｃに対して水溶性
カルボジイミド濃縮物により結合させた：反応物のｐＨを０．１ＭＥＳ、ｐＨ６
．０で維持した（Ｃｈｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ５９：４４５０−４
４５８ （１９９１）；Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．ら、Ｌａｎｃｅｔ ３４９：１５５−
１５９ （１９９７）；Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
６０：３５２８−３５３２ （１９９２））。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１ポリサッカリ
ドは、アジピン酸ジヒドラジドで誘導体化され、そしてＥＤＣにより処置によっ
て、ｒＡＲＵまたはｒＡＲＵｓｕｃｃに結合した（Ｄｅｖｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７１７５−７１７９ （１９９１））
。アジピン酸ジヒドラジド誘導体化ポリサッカリドおよびその結合体の組成物を
表１に示す。ｒＡＲＵをキャリアとして用いると低収量の結合体が肺炎球菌１４
型およびＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２型のポリサッカリドを用いて得られたことに留
意されたい。本発明者らは、Ｋ１ポリサッカリドの結合体をｒＡＲＵを用いて合
成し得なかった。
ポリサッカリドおよびＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ型 Ｏ特異的ポリサッカリド
を、臭化シアンを用いて活性化し、アジピン酸ジヒドラジドで誘導体化し、そし
て以下を除いて記載のとおりにｒＡＲＵまたはｒＡＲＵｓｕｃｃに対して水溶性
カルボジイミド濃縮物により結合させた：反応物のｐＨを０．１ＭＥＳ、ｐＨ６
．０で維持した（Ｃｈｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ５９：４４５０−４
４５８ （１９９１）；Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．ら、Ｌａｎｃｅｔ ３４９：１５５−
１５９ （１９９７）；Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
６０：３５２８−３５３２ （１９９２））。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１ポリサッカリ
ドは、アジピン酸ジヒドラジドで誘導体化され、そしてＥＤＣにより処置によっ
て、ｒＡＲＵまたはｒＡＲＵｓｕｃｃに結合した（Ｄｅｖｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７１７５−７１７９ （１９９１））
。アジピン酸ジヒドラジド誘導体化ポリサッカリドおよびその結合体の組成物を
表１に示す。ｒＡＲＵをキャリアとして用いると低収量の結合体が肺炎球菌１４
型およびＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２型のポリサッカリドを用いて得られたことに留
意されたい。本発明者らは、Ｋ１ポリサッカリドの結合体をｒＡＲＵを用いて合
成し得なかった。
【００５５】
【表１】 （実施例４：その結合体のポリサッカリドに対する免疫応答） マウスのワクチン接種。ＮＩＨでの雌性５週齢の一般目的のＳｗｉｓｓ Ａｌ
ｂｉｎｏマウスまたは異系交配させたｈｓｄ／ＩＣＲマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓ
ｐｒａｇｕｅ Ｄｅｒｂｙ、Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に、
結合体中に２．５μｇのポリサッカリドを含む０．１ｍｌを２週間おきに皮下注
射した。マウス（ｎ＝１０）を第一の注射後２週間、および第二および第三の注
射後１週間で放血した。
ｂｉｎｏマウスまたは異系交配させたｈｓｄ／ＩＣＲマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓ
ｐｒａｇｕｅ Ｄｅｒｂｙ、Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に、
結合体中に２．５μｇのポリサッカリドを含む０．１ｍｌを２週間おきに皮下注
射した。マウス（ｎ＝１０）を第一の注射後２週間、および第二および第三の注
射後１週間で放血した。
【００５６】 血清学。Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ型ＬＰＳおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１ポリ
サッカリドに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を 記載されるようにＥＬＩＳＡに
よって測定した（Ｃｈｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９．４４５０−４４
５８ （１９９１）；ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
８：７１７５−７１７９ （１９９１））。ＩｇＧ抗肺炎球菌１４型ポリサッカ
リドを、ＥＬＩＳＡでアッセイし、そしてポリサッカリド抗体の合計を、放射免
疫アッセイ（ＲＩＡ）によりそして記載されるようにアッセイした（Ｋａｙｈｔ
ｙら、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：１２７３−１２７８ （１９９５）
；Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ６０：３５２８−３
５３２（１９９２）；Ｓｈｉｆｆｉｎａｎら． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ３３：１３０−１４４ （１９９２））。
サッカリドに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を 記載されるようにＥＬＩＳＡに
よって測定した（Ｃｈｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９．４４５０−４４
５８ （１９９１）；ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
８：７１７５−７１７９ （１９９１））。ＩｇＧ抗肺炎球菌１４型ポリサッカ
リドを、ＥＬＩＳＡでアッセイし、そしてポリサッカリド抗体の合計を、放射免
疫アッセイ（ＲＩＡ）によりそして記載されるようにアッセイした（Ｋａｙｈｔ
ｙら、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：１２７３−１２７８ （１９９５）
；Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ６０：３５２８−３
５３２（１９９２）；Ｓｈｉｆｆｉｎａｎら． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ３３：１３０−１４４ （１９９２））。
【００５７】 肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型（Ｐｎ１４）抗体（表２）。両
方の結合体（Ｐｎ１４−ｒＡＲＵおよびｐＮ１４−ｒＡＲＵｓｕｃｃ）は、第一
および第二の注射後にＩｇＧ抗体の統計学的に有意な上昇を惹起した（ｐ＜０．
００５）。両方の結合体の第三注射は、ＩｇＧ（４．３８ＥＵから６．４１へ（
Ｐｎｌ４−ｒＡＲＵ）および６．１０ＥＵから９．７６ＥＵへ（Ｐｎｌ４−ｒＡ
ＲＵｓｕｃｃ））およびＩｇＭ（４．８２から７．５７へ（Ｐｎｌ４−ｒＡＲＵ
）および６．１６から８．５４へ（Ｐｎｌ４−ｒＡＲＵｓｕｃｃ））における上
昇を惹起したが、これらは統計学的には有意ではなかった。肺炎球菌１４型ポリ
サッカリド単独は、微量レベルの抗体をマウスにおいて惹起したのみでった （
Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６０：３５２８−３
５３２ （１９９２））。ＰＢＳは、Ｐｎ１４抗体を惹起しなかった。
方の結合体（Ｐｎ１４−ｒＡＲＵおよびｐＮ１４−ｒＡＲＵｓｕｃｃ）は、第一
および第二の注射後にＩｇＧ抗体の統計学的に有意な上昇を惹起した（ｐ＜０．
００５）。両方の結合体の第三注射は、ＩｇＧ（４．３８ＥＵから６．４１へ（
Ｐｎｌ４−ｒＡＲＵ）および６．１０ＥＵから９．７６ＥＵへ（Ｐｎｌ４−ｒＡ
ＲＵｓｕｃｃ））およびＩｇＭ（４．８２から７．５７へ（Ｐｎｌ４−ｒＡＲＵ
）および６．１６から８．５４へ（Ｐｎｌ４−ｒＡＲＵｓｕｃｃ））における上
昇を惹起したが、これらは統計学的には有意ではなかった。肺炎球菌１４型ポリ
サッカリド単独は、微量レベルの抗体をマウスにおいて惹起したのみでった （
Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６０：３５２８−３
５３２ （１９９２））。ＰＢＳは、Ｐｎ１４抗体を惹起しなかった。
【００５８】
【表２】 ６週齢マウスに２．５ｍｇの肺炎球菌１４型ポリサッカリドを結合体として、
２週間おきに注射した。マウス（ｎ＝１０）を第一注射後２週間でならびに第二
および第三の注射の７日後に放血し、そしてそれらの血清を、ＩｇＧおよびＩｇ
Ｍにつき、抗肺炎球菌１４型ポリサッカリドについてＥＬＩＳＡによってアッセ
イした。１００ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）の値を任意に割り当てた超免疫血清を、
規準とした。
２週間おきに注射した。マウス（ｎ＝１０）を第一注射後２週間でならびに第二
および第三の注射の７日後に放血し、そしてそれらの血清を、ＩｇＧおよびＩｇ
Ｍにつき、抗肺炎球菌１４型ポリサッカリドについてＥＬＩＳＡによってアッセ
イした。１００ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）の値を任意に割り当てた超免疫血清を、
規準とした。
【００５９】 ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡによって測定されるところの、すべてのワクチン接種
後血清について結合体誘導される肺炎球菌１４型ポリサッカリド抗体の幾何平均
レベルの間の補正係数は、統計学的に有意であった（表３）。
後血清について結合体誘導される肺炎球菌１４型ポリサッカリド抗体の幾何平均
レベルの間の補正係数は、統計学的に有意であった（表３）。
【００６０】
【表３】 肺炎球菌１４型抗体を、単位として表現されるＥＬＩＳＡによって、およびｎ
ｇ抗体／ｍｌ血清として表現されるＲＩＡによって測定した。
ｇ抗体／ｍｌ血清として表現されるＲＩＡによって測定した。
【００６１】 Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｅｘｎｅｒｉ ２ａ型（ＳＦ）ＩｇＧ ＬＰＳ抗体（表
４）。ＳＦ−ｒＡＲＵおよびＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃの両方は、ワクチン接種レ
ベル前と比較した第二の注射後に、ＬＰＳ抗体を惹起した。第三回のための再注
射は、両方の結合体についてＩｇＧ抗ＬＰＳの上昇を惹起したが、統計学的には
ＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃ（２．４８対０．３７、ｐ＝０．０４）についてのみ有
効であった。２つの結合体によって誘導されるＳＦ ＩｇＧ抗ＬＰＳレベルは、
統計学的には異ならなかった。
４）。ＳＦ−ｒＡＲＵおよびＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃの両方は、ワクチン接種レ
ベル前と比較した第二の注射後に、ＬＰＳ抗体を惹起した。第三回のための再注
射は、両方の結合体についてＩｇＧ抗ＬＰＳの上昇を惹起したが、統計学的には
ＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃ（２．４８対０．３７、ｐ＝０．０４）についてのみ有
効であった。２つの結合体によって誘導されるＳＦ ＩｇＧ抗ＬＰＳレベルは、
統計学的には異ならなかった。
【００６２】 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１（髄膜炎Ｂ群）ＩｇＧ抗体。Ｋ１−
ｒＡＲＵｓｕｃｃは、３回すべての注射後に抗体において有意な上昇を惹起した
：第一注射（１．３５ＥＵ）、第二（１２．４対１３．４、ｐ＝０．０００１）
および第三（１０４対１２．４、ｐ＝０．００２）。
ｒＡＲＵｓｕｃｃは、３回すべての注射後に抗体において有意な上昇を惹起した
：第一注射（１．３５ＥＵ）、第二（１２．４対１３．４、ｐ＝０．０００１）
および第三（１０４対１２．４、ｐ＝０．００２）。
【００６３】
【表４】 ６週齢マウスに２．５ｍｇのＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ型Ｏ特異的ポリサッ
カリド単独または結合体として２週間おきに注射した。マウス（ｎ＝１０）を、
第二および第三の注射後７日で放血し、そしてその血清を、ＩｇＧ抗ＬＰＳにつ
いてＥＬＩＳＡによってアッセイした。超免疫血清プールを、任意に１００ＥＬ
ＩＳＡ単位（ＥＵ）と割り当てて、これを規準として使用した。
カリド単独または結合体として２週間おきに注射した。マウス（ｎ＝１０）を、
第二および第三の注射後７日で放血し、そしてその血清を、ＩｇＧ抗ＬＰＳにつ
いてＥＬＩＳＡによってアッセイした。超免疫血清プールを、任意に１００ＥＬ
ＩＳＡ単位（ＥＵ）と割り当てて、これを規準として使用した。
【００６４】 （実施例５：結合体のｒＡＲＵ成分に対する免疫応答） Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＡ（ＣＤＴＡ）に対する抗体。ネイティブト
キシンＡに対する抗体を、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅから単離されたトキシンＡｗ
ｏコーティング抗原として使用したＥＬＩＳＡ、および細胞傷害性のインビトロ
中和によってにより測定した（Ｌｖｅｒｌｖら．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３
５：１１４７−１１５０ （１９８２））。ヒト小腸上皮ＨＴ−２９細胞（ＡＴ
ＣＣ ＨＴＩ３ ３８）を、５％ＣＯ2雰囲気下で１０％の仔ウシ血清を補充し
たＭｃＣｏｖ５Ａ培地を有する９６ウェルプレート中に維持した。ＨＴ−２９細
胞を選択した。なぜなら、それらは、その表面に高密度の糖レセプターにおそら
く起因してＣＤＴＡに対して高感度であるからである。連続的に２倍の希釈の血
清を、０．４μｇ／ｍｌのＣＤＴＡとともに３０分で室温でインキュベートした
。ＣＤＴＡ血清混合物を、ウェルに、最終容量０．２ｍｌ中に、１ウェルあたり
最終濃度２０ｎｇ（ＨＴ−２９細胞についての最小細胞傷害性用量の約２００倍
）のトキシンＡで添加した。中和力価を、細胞傷害性を完全に中和した最高希釈
の逆数として表す。
キシンＡに対する抗体を、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅから単離されたトキシンＡｗ
ｏコーティング抗原として使用したＥＬＩＳＡ、および細胞傷害性のインビトロ
中和によってにより測定した（Ｌｖｅｒｌｖら．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３
５：１１４７−１１５０ （１９８２））。ヒト小腸上皮ＨＴ−２９細胞（ＡＴ
ＣＣ ＨＴＩ３ ３８）を、５％ＣＯ2雰囲気下で１０％の仔ウシ血清を補充し
たＭｃＣｏｖ５Ａ培地を有する９６ウェルプレート中に維持した。ＨＴ−２９細
胞を選択した。なぜなら、それらは、その表面に高密度の糖レセプターにおそら
く起因してＣＤＴＡに対して高感度であるからである。連続的に２倍の希釈の血
清を、０．４μｇ／ｍｌのＣＤＴＡとともに３０分で室温でインキュベートした
。ＣＤＴＡ血清混合物を、ウェルに、最終容量０．２ｍｌ中に、１ウェルあたり
最終濃度２０ｎｇ（ＨＴ−２９細胞についての最小細胞傷害性用量の約２００倍
）のトキシンＡで添加した。中和力価を、細胞傷害性を完全に中和した最高希釈
の逆数として表す。
【００６５】
【表５】 すべての５つの結合体は、高いレベルの抗ＣＤＴＡ（１９４−６１３μｇ／ｍ
ｌ）を惹起した（表５）。２．５μｇの免疫用量の結合体は、そのポリサッカリ
ド含量に基づいていたことから、注射したｒＡＲＵの量は、各結合体について異
なった。例えば、タンパク質重量ベースで、Ｐｎｌ４−ｒＡＲＵは、１．２９μ
ｇのｒＡＲＵとともに、１９４μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌ（１５０．３μｇＡｂ
／μｇｒ注射したＡＲＵ）を惹起した。対照的に、１用量あたり７．３μｇのｒ
ＡＲＵを含んだＰｎ Ｉ４−ｒＡＲＵｓｕｃｃは、３７１μｇ ＣＤＴＡ抗体／
ｍｌ（５０．８μｇ Ａｂ／注射したμｇ ｒＡＲＵｓｕｃｃ）を惹起した。Ｐ
ｎＩ４−ｒＡＲＵは、１μｇのｒＡＲＵあたり、Ｐｎ１４−ｒＡＲＵｓｃｃより
多くの抗ＣＤＴＡを誘導したが、Ｐｎ１４−ｒＡＲＵｓｃｃによって惹起された
合計量の抗ＣＤＴＡは、ｒＡＲＵのそのより高い含量に起因して多かった。Ｐｎ
１４−ｒＡＲＵによって惹起される抗ＣＤＴＡ（１９４μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍ
ｌ）、Ｐｎ１４−ｒＡＲＵ−ｒＡＲＵｓｕｃｃによって惹起される抗ＣＤＴＡ（
３７１μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌ）に比較しての相違は、顕著であった。
ｌ）を惹起した（表５）。２．５μｇの免疫用量の結合体は、そのポリサッカリ
ド含量に基づいていたことから、注射したｒＡＲＵの量は、各結合体について異
なった。例えば、タンパク質重量ベースで、Ｐｎｌ４−ｒＡＲＵは、１．２９μ
ｇのｒＡＲＵとともに、１９４μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌ（１５０．３μｇＡｂ
／μｇｒ注射したＡＲＵ）を惹起した。対照的に、１用量あたり７．３μｇのｒ
ＡＲＵを含んだＰｎ Ｉ４−ｒＡＲＵｓｕｃｃは、３７１μｇ ＣＤＴＡ抗体／
ｍｌ（５０．８μｇ Ａｂ／注射したμｇ ｒＡＲＵｓｕｃｃ）を惹起した。Ｐ
ｎＩ４−ｒＡＲＵは、１μｇのｒＡＲＵあたり、Ｐｎ１４−ｒＡＲＵｓｃｃより
多くの抗ＣＤＴＡを誘導したが、Ｐｎ１４−ｒＡＲＵｓｃｃによって惹起された
合計量の抗ＣＤＴＡは、ｒＡＲＵのそのより高い含量に起因して多かった。Ｐｎ
１４−ｒＡＲＵによって惹起される抗ＣＤＴＡ（１９４μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍ
ｌ）、Ｐｎ１４−ｒＡＲＵ−ｒＡＲＵｓｕｃｃによって惹起される抗ＣＤＴＡ（
３７１μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌ）に比較しての相違は、顕著であった。
【００６６】 ３．９μｇのｒＡＲＵを含むＳＦ−ｒＡＲＵは、４３７μｇのＣＤＴＡ抗体／
ｍｌ（１１２．０μｇ Ａｂ／注射されたμｇ ｒＡＲＵ）は、ＳＦ−ｒＡＲＵ
ｓｕｃｃ（３４．９μｇ Ａｂ／注射したμｇ ｒＡＲＵｓｕｃｃ）についての
５１８μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌに匹敵した。ｒＡＲＵｓｕｃｃに対する特定の
免疫原性活性は、ＳＦ結合体においてｒＡＲＵのものよりも低かったが、２つの
結合体によって惹起されるＣＤＴＡ抗体のレベルの間には統計学的な差異はなか
った（ＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃについて４３７μｇ Ａｂ／ｍｌに対してＳＦ−
らＲＵについての２４２μｇ Ａｂ／ｍｌ）。
ｍｌ（１１２．０μｇ Ａｂ／注射されたμｇ ｒＡＲＵ）は、ＳＦ−ｒＡＲＵ
ｓｕｃｃ（３４．９μｇ Ａｂ／注射したμｇ ｒＡＲＵｓｕｃｃ）についての
５１８μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌに匹敵した。ｒＡＲＵｓｕｃｃに対する特定の
免疫原性活性は、ＳＦ結合体においてｒＡＲＵのものよりも低かったが、２つの
結合体によって惹起されるＣＤＴＡ抗体のレベルの間には統計学的な差異はなか
った（ＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃについて４３７μｇ Ａｂ／ｍｌに対してＳＦ−
らＲＵについての２４２μｇ Ａｂ／ｍｌ）。
【００６７】 ３９０μｇ ＣＤＴＡ抗体／ｍｌを含むＫ１−ｒＡＲＵｓｕｃｃは、そのｒＡ
ＲＵ成分の匹敵する特異的免疫原性活性を有した（１μｇのｒＡＲＵｓｕｃｃあ
たり４８μｇ Ａｂ／ｍｌ） （実施例６：ＣＤＴＡ中和抗体） その結合体の第三注射の後７日で得た個々の血清を、ヒト小腸上皮ＨＴ−２９
細胞に対するＣＤＴＡの細胞傷害性用量の約２００倍のその中和について個々に
アッセイした。その結合体で免疫したマウスからのすべての血清は、６４以上の
中和力価を有した。各結合体についての中和力価の幾何平均の範囲を表６に示す
。 結合体誘導された抗体レベルは、ホルマリン不活化ＣＤＴＡで惹起された、
０．５ｍｇ／ｍｌを含むアフィニティー精製された薬学的組成物ギ抗体の中和活
性に近づくかまたは超過していた。
ＲＵ成分の匹敵する特異的免疫原性活性を有した（１μｇのｒＡＲＵｓｕｃｃあ
たり４８μｇ Ａｂ／ｍｌ） （実施例６：ＣＤＴＡ中和抗体） その結合体の第三注射の後７日で得た個々の血清を、ヒト小腸上皮ＨＴ−２９
細胞に対するＣＤＴＡの細胞傷害性用量の約２００倍のその中和について個々に
アッセイした。その結合体で免疫したマウスからのすべての血清は、６４以上の
中和力価を有した。各結合体についての中和力価の幾何平均の範囲を表６に示す
。 結合体誘導された抗体レベルは、ホルマリン不活化ＣＤＴＡで惹起された、
０．５ｍｇ／ｍｌを含むアフィニティー精製された薬学的組成物ギ抗体の中和活
性に近づくかまたは超過していた。
【００６８】
【表６】 （実施例７：ＣＤＴＡでの致死チャレンジからの保護（表７）） Ｈｓｄ／ＩＣＲマウスに、ＳＦ−ｒＡＲＵ、ＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃまたはｒ
ＡＲＵを、上記実施例４に記載のように注射した。第三注射の後１週間で、その
マウスに、致死用量（１５０ｎｇ）のＣＤＴＡで腹腔内チャレンジした。結合体
またはｒＡＲＵのいずれかをワクチン接種したほぼすべてのマウスが保護された
。注射されたｒＡＲＵの量に基づいて、ｒＡＲＵおよびＳＦ−ｒＡＲＵは、抗Ｃ
ＤＴＡの類似のレベルを惹起した。予測されるように、ＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃ
は、他の２つの免疫原よりもより低いレベルの抗ＣＤＴＡを惹起したがレシピエ
ントは比較的保護された。
ＡＲＵを、上記実施例４に記載のように注射した。第三注射の後１週間で、その
マウスに、致死用量（１５０ｎｇ）のＣＤＴＡで腹腔内チャレンジした。結合体
またはｒＡＲＵのいずれかをワクチン接種したほぼすべてのマウスが保護された
。注射されたｒＡＲＵの量に基づいて、ｒＡＲＵおよびＳＦ−ｒＡＲＵは、抗Ｃ
ＤＴＡの類似のレベルを惹起した。予測されるように、ＳＦ−ｒＡＲＵｓｕｃｃ
は、他の２つの免疫原よりもより低いレベルの抗ＣＤＴＡを惹起したがレシピエ
ントは比較的保護された。
【００６９】
【表７】 本発明を、直接の説明および実施例によって説明してきた。上記のように、実
施例は、本発明の例示のみであり、そして本発明を何らの意味でも限定しないこ
とが意図される。さらに、本発明に関連する当業者は、明細書および上記特許請
求の範囲に鑑み、本発明の請求された局面と等価物が存在することを認識する。
本発明者らは、請求された本発明の合理的範囲内にそれらの等価物が包含される
ことを意図する。
施例は、本発明の例示のみであり、そして本発明を何らの意味でも限定しないこ
とが意図される。さらに、本発明に関連する当業者は、明細書および上記特許請
求の範囲に鑑み、本発明の請求された局面と等価物が存在することを認識する。
本発明者らは、請求された本発明の合理的範囲内にそれらの等価物が包含される
ことを意図する。
【００７０】 （引用された文献） 米国特許文献
【００７１】
【表８】 他の参考文献
【００７２】
【表９】
【図１】 図１は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡおよびト
キシンＢを模式的に示す。トキシンＡおよびトキシンＢの細胞傷害性を担う酵素
活性は、Ｎ末端グリコシルトランスフェラーゼドメインに含まれる（Ｊｕｓｔら
、Ｎａｔｕｒｅ ３７５：５００−５０３（１９９５）；Ｊｕｓｔら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７０：１３９３２−１３９３９（１９９５））。グリコシル
トランスフェラーゼに共通のＤＸＤモチーフは、酵素活性に必須である（Ｂｕｓ
ｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７３：１９５６６−１９５７２（１９９８
））。このトキシンの酵素ドメインおよび中間領域は、ｒＡＲＵ（結合ドメイン
を含む、トキシンＡの繰り返し単位）をコードするこのトキシンＡ遺伝子のフラ
グメントから欠失される。トキシンＡの末端の小さい無地のボックスは、疎水性
アミノ酸の小さいストレッチを表す。
キシンＢを模式的に示す。トキシンＡおよびトキシンＢの細胞傷害性を担う酵素
活性は、Ｎ末端グリコシルトランスフェラーゼドメインに含まれる（Ｊｕｓｔら
、Ｎａｔｕｒｅ ３７５：５００−５０３（１９９５）；Ｊｕｓｔら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７０：１３９３２−１３９３９（１９９５））。グリコシル
トランスフェラーゼに共通のＤＸＤモチーフは、酵素活性に必須である（Ｂｕｓ
ｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７３：１９５６６−１９５７２（１９９８
））。このトキシンの酵素ドメインおよび中間領域は、ｒＡＲＵ（結合ドメイン
を含む、トキシンＡの繰り返し単位）をコードするこのトキシンＡ遺伝子のフラ
グメントから欠失される。トキシンＡの末端の小さい無地のボックスは、疎水性
アミノ酸の小さいストレッチを表す。
【図２】 図２は、ｒＡＲＵおよびトキシンＡの終止コドンをコードするトキシンＡの遺
伝子領域のヌクレオチド配列（番号５６９０−８２９３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番
号Ｍ３０３０７、Ｄｏｖｅら、１９９３）を示す。この配列は、Ｄｏｖｅら（Ｄ
ｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−４８８（１９９０））に
よって定義されるようなＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株ＶＰＩ１０４６３由来のトキ
シンＡの繰り返し単位全体をコードする。さらに、これは、この繰り返し単位の
開始部位の上流の４アミノ酸、およびトキシンＡの末端の疎水性アミノ酸の小さ
いストレッチをコードする。この配列の開始部位のＳａｕ３Ａ部位（下線）は、
この遺伝子フラグメントを発現ベクターにサブクローニングするために使用した
。この配列の末端の終止ドンを、イタリックで示す。
伝子領域のヌクレオチド配列（番号５６９０−８２９３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番
号Ｍ３０３０７、Ｄｏｖｅら、１９９３）を示す。この配列は、Ｄｏｖｅら（Ｄ
ｏｖｅら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−４８８（１９９０））に
よって定義されるようなＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株ＶＰＩ１０４６３由来のトキ
シンＡの繰り返し単位全体をコードする。さらに、これは、この繰り返し単位の
開始部位の上流の４アミノ酸、およびトキシンＡの末端の疎水性アミノ酸の小さ
いストレッチをコードする。この配列の開始部位のＳａｕ３Ａ部位（下線）は、
この遺伝子フラグメントを発現ベクターにサブクローニングするために使用した
。この配列の末端の終止ドンを、イタリックで示す。
【図３】 図３は、ｒＡＲＵのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３０３３０７）
を示す。本発明は、結合体ワクチン組成物のためのキャリアとしての、このアミ
ノ酸配列を含む任意の組換えタンパク質、それらの任意のフラグメント、ｒＡＲ
Ｕまたはそれらのフラグメントを含む任意の融合タンパク質、およびｒＡＲＵの
全てまたは一部を保持するトキシンＡ由来の任意のより大きいフラグメントの使
用を意図する。
を示す。本発明は、結合体ワクチン組成物のためのキャリアとしての、このアミ
ノ酸配列を含む任意の組換えタンパク質、それらの任意のフラグメント、ｒＡＲ
Ｕまたはそれらのフラグメントを含む任意の融合タンパク質、およびｒＡＲＵの
全てまたは一部を保持するトキシンＡ由来の任意のより大きいフラグメントの使
用を意図する。
【図４】 図４は、ｒＡＲＵの発現のために使用される、発現ベクターｐＲＳＥＴＢ−Ａ
ＲＵ−Ｋｍrを示す。ｒＡＲＵ、終止コドン、およびトキシンＡ終止コドンの下
流の小さい領域をコードするヌクレオチド配列全体を含む、約２．７ｋｂのＳａ
ｕ３Ａ／ＨｉｎｄＩＩＩ遺伝子フラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化したベクターｐＲＳＥＴＢにサブクローニングした。引き続く工程にお
いて、カナマイシン耐性遺伝子を、ｒＡＲＵ遺伝子フラグメントの下流に位置す
るＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。Ｋｍr遺伝子をコードする１．
２ｋｂフラグメントは、ｐＵＣ４Ｋ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０６４０４）か
らＥｃｏＲＩでの消化によって誘導され、そしてこのベクターおよびＫｍrカセ
ットのＫｌｅｎｏｗフラグメントでの平滑末端後にこのＨｉｎｄＩＩＩ部位にサ
ブクローニングした。発現ベクターｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrを、Ｔ７プロ
モーターの制御下でのｒＡＲＵの発現のために、ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換
した。 ＊ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位は、平滑末端によって除去される。
ＲＵ−Ｋｍrを示す。ｒＡＲＵ、終止コドン、およびトキシンＡ終止コドンの下
流の小さい領域をコードするヌクレオチド配列全体を含む、約２．７ｋｂのＳａ
ｕ３Ａ／ＨｉｎｄＩＩＩ遺伝子フラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化したベクターｐＲＳＥＴＢにサブクローニングした。引き続く工程にお
いて、カナマイシン耐性遺伝子を、ｒＡＲＵ遺伝子フラグメントの下流に位置す
るＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。Ｋｍr遺伝子をコードする１．
２ｋｂフラグメントは、ｐＵＣ４Ｋ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０６４０４）か
らＥｃｏＲＩでの消化によって誘導され、そしてこのベクターおよびＫｍrカセ
ットのＫｌｅｎｏｗフラグメントでの平滑末端後にこのＨｉｎｄＩＩＩ部位にサ
ブクローニングした。発現ベクターｐＲＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍrを、Ｔ７プロ
モーターの制御下でのｒＡＲＵの発現のために、ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換
した。 ＊ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位は、平滑末端によって除去される。
【図５】 図５は、ｒＡＲＵ発現および精製工程のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１５％アクリ
ルアミド）を示す。レーン：１）４μｌの１０×ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌ
ｉ／ｐＲＥＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍr溶解物、２）元の培養容量に対して１０×
で透析した、４μｌの４０％硫酸アンモニウム画分、３）ＣＬ−６８ Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅイオン交換クロマトグラフィーによって精製した、５μｌのｒＡＲＵ
（０．８８ｍｇ／ｍｌ）。
ルアミド）を示す。レーン：１）４μｌの１０×ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌ
ｉ／ｐＲＥＳＥＴＢ−ＡＲＵ−Ｋｍr溶解物、２）元の培養容量に対して１０×
で透析した、４μｌの４０％硫酸アンモニウム画分、３）ＣＬ−６８ Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅイオン交換クロマトグラフィーによって精製した、５μｌのｒＡＲＵ
（０．８８ｍｇ／ｍｌ）。
【図６】 図６は、ｒＡＲＵに結合されたポリサッカリドの化学構造を示す。肺炎球菌（
Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型は、中性の高分子量の分枝コポリマーであり
（Ｌｉｎｄｂｅｒｇら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．５８：１７７−１８６（
１９７７））、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａのＯ−特異的ポリサ
ッカリドは、比較的低い分子量の中性の分枝コポリマーであり（Ｃａｒｌｉｎら
、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３９：１８９−１９４（１９８４）；Ｋｅｎ
ｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９１：２７９−２８４（１９７８））、
そしてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１（直鎖状の高分子量ホモポリマー）の各サブユニット
は、負に荷電している（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５０：１９２６−１９３２（１９７５））。各ポリサッカリドのｒＡＲＵ
への結合は、高レベルの抗体応答を生じた。従って、キャリアとしてのｒＡＲＵ
の使用は、全てのポリサッカリドに適用可能であるようである。
Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型は、中性の高分子量の分枝コポリマーであり
（Ｌｉｎｄｂｅｒｇら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．５８：１７７−１８６（
１９７７））、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａのＯ−特異的ポリサ
ッカリドは、比較的低い分子量の中性の分枝コポリマーであり（Ｃａｒｌｉｎら
、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３９：１８９−１９４（１９８４）；Ｋｅｎ
ｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９１：２７９−２８４（１９７８））、
そしてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１（直鎖状の高分子量ホモポリマー）の各サブユニット
は、負に荷電している（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５０：１９２６−１９３２（１９７５））。各ポリサッカリドのｒＡＲＵ
への結合は、高レベルの抗体応答を生じた。従って、キャリアとしてのｒＡＲＵ
の使用は、全てのポリサッカリドに適用可能であるようである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ０７Ｋ 14/33 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ０７Ｋ 14/33 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウィルキンズ， トレイシー ディー． アメリカ合衆国 バージニア 24149， ライナー， チェスナット リッジ ロー ド 6254 (72)発明者 ライラリー， デイビッド エム． アメリカ合衆国 バージニア 24141， ラッドフォード， マックアーサー アベ ニュー 204 (72)発明者 モンクリエフ， ジェイ． スコット アメリカ合衆国 バージニア 24073， クリスチャンズバーグ， チャールズ ス トリート 615 (72)発明者 パヴリャコヴァ， ダンカ アメリカ合衆国 ニューヨーク 14534， ピッツフォード， ル ペル ドライブ 31 (72)発明者 シェアソン， ラッチェル アメリカ合衆国 メリーランド 20814， ベゼスダ， ウェイマウス ストリート 10601 (72)発明者 ロビンズ， ジョン ビー． アメリカ合衆国 メリーランド 20815， チェビー チェイス， ローズマリー ストリート 3901 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 BA38 CA02 CA07 DA06 GA11 GA19 HA03 4B064 AG30 AG31 CA02 CA19 CC01 CC24 CE02 CE03 CE04 CE06 CE11 DA01 DA13 4B065 AA23Y AA26X AA58X AA72X AA87X AB01 AC14 BA02 BB01 BD01 BD14 BD15 BD17 CA24 CA45 CA46 4C085 AA03 BA08 BA12 BA14 BA15 BA16 BA19 BA21 BB11 CC13 CC24 DD38 DD62 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 BA53 CA11 DA83 DA86 EA20 EA50 FA52 FA74 GA01 GA06 GA10 GA15 GA23
Claims (61)
- 【請求項１】 組換えタンパク質およびポリサッカリド成分を含む免疫原性
組成物であって、ここで、該タンパク質は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆ
ｉｃｉｌｅの株由来の遺伝子によってコードされ、かつ該ポリサッカリド成分は
、病原性微生物の株から単離されるか、または化学的に合成される、免疫原性組
成物。 - 【請求項２】 前記タンパク質が、トキシンまたはそのフラグメントである
、請求項１に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項３】 前記ポリサッカリド成分が、莢膜ポリサッカリドまたはリポ
ポリサッカリドである、請求項１に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項４】 前記タンパク質が、トキシンＡまたはそのフラグメントであ
る、請求項１に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項５】 前記タンパク質が、トキシンＡの繰り返し単位（ｒＡＲＵ）
またはそのフラグメントを含む組換えアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の免
疫原性組成物。 - 【請求項６】 前記タンパク質が、融合タンパク質である、請求項５に記載
の免疫原性組成物。 - 【請求項７】 前記タンパク質が、トキシンＢまたはそのフラグメントであ
る、請求項１に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項８】 前記タンパク質が、トキシンＢの繰り返し単位（ｒＢＲＵ）
またはそのフラグメントを含む組換えアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の免
疫原性組成物。 - 【請求項９】 前記タンパク質が、融合タンパク質である、請求項８に記載
の免疫原性組成物。 - 【請求項１０】 哺乳動物宿主において、Ｔ細胞依存性の免疫応答を誘発す
る、請求項１に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項１１】 哺乳動物宿主において、Ｔ細胞非依存性の免疫応答を誘発
する、請求項１に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項１２】 哺乳動物宿主において、Ｔ細胞依存性およびＴ細胞非依存
性の両方の免疫応答を誘発する、請求項１に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項１３】 前記免疫応答が、細胞依存性免疫応答である、請求項１０
、１１または１２に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項１４】 前記免疫応答が、前記哺乳度物宿主においてブースター効
果を生じる、請求項１０、１１または１２に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項１５】 前記免疫応答が、前記病原性微生物の株に対する防御応答
を誘発する、請求項１０、１１または１２に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項１６】 哺乳動物宿主において、体液性免疫応答を誘発する、請求
項１０、１１または１２に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項１７】 哺乳動物宿主において、体液性免疫応答および細胞依存性
免疫応答の両方を誘発する、請求項１０、１１または１２に記載の免疫原性組成
物。 - 【請求項１８】 前記免疫応答が、病原性微生物の株に対する防御応答を誘
発する、請求項１０、１１または１２に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項１９】 前記病原性微生物の株が、インビボで前記ポリサッカリド
を生成する、請求項１８に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項２０】 前記ポリサッカリドが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；およびＳｈｉｇｅｌｌａの株からなる群より選択
される病原性微生物の株から単離される、請求項１９に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項２１】 前記免疫応答が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；およびＳｈｉｇｅｌｌａの株からなる群より選択される
病原性微生物の株に対する防御応答を誘発する、請求項２０に記載の免疫原性組
成物。 - 【請求項２２】 前記ポリサッカリドが、以下の血清型：１、２、３、４、
５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１
７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２５および３３Ｆから
なる群より選択される、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの
血清型から単離される、請求項１９に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項２３】 前記ポリサッカリドが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型１４から単離される、請求項１９に記載の免疫原性
組成物。 - 【請求項２４】 前記免疫応答が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅの株に対する防御応答を誘発する、請求項１８に記載の免疫原性組
成物。 - 【請求項２５】 前記ポリサッカリドが、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅ
ｒｉの株、血清型２ａのから単離される、請求項１８に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項２６】 前記免疫応答が、Ｓｈｉｇｅｌｌａの株に対する防御応答
を誘発する、請求項１８に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項２７】 前記ポリサッカリドが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ Ｋ１から単離される、請求項１８に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項２８】 前記病原性微生物が、グループＢ髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅ
ｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 血清型Ｂ）である、請求項１９に記載の免
疫原性組成物。 - 【請求項２９】 前記病原性微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｋ１である、請求項１９に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項３０】 前記ポリサッカリドが、以下の群：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ；Ｅ
ｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種；Ｃａｎｄｉｄａ種；
グループＢ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
；およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種から選択される、請求項１９に記載の免疫原
性組成物。 - 【請求項３１】 前記免疫応答が、以下の株：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ ａｕｒｅｕｓ；コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ；Ｅｎｔｅ
ｒｏｃｏｃｃｕｓ種；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種；Ｃａｎｄｉｄａ種；グルー
プＢ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；およ
びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種からなる群より選択される院内病原性微生物の株に
対する防御応答を誘発する、請求項１９に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項３２】 前記ポリサッカリドが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ 血清型５から単離される、請求項１９に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項３３】 前記病原性微生物が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａ
ｕｒｅｕｓ 血清型５である、請求項１９に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項３４】 前記ポリサッカリドが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ 血清型８から単離される、請求項１９に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項３５】 前記病原性微生物が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａ
ｕｒｅｕｓ 血清型８である、請求項１９に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項３６】 組換えタンパク質およびポリサッカリド成分を含む免疫原
性組成物であって、ここで、該タンパク質は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆ
ｆｉｃｉｌｅの株から単離された遺伝子によってコードされ、かつ該ポリサッカ
リドは、病原性微生物の株から単離されたポリサッカリドであるか、または化学
的に合成されたポリサッカリドであり、そしてここで、該組成物は、薬学的に受
容可能なキャリアをさらに含む、免疫原性組成物。 - 【請求項３７】 請求項３６に記載の免疫原性組成物を含む、ワクチン。
- 【請求項３８】 ヒトにおける使用のために処方される、請求項３７に記載
のワクチン。 - 【請求項３９】 動物における使用のために処方される、請求項３７に記載
のワクチン。 - 【請求項４０】 免疫原性組成物を生成するための方法であって、以下 組換えタンパク質をコードする遺伝子配列を構築する工程であって、ここで、
該遺伝子配列は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株から単離さ
れる、工程； 該組換えタンパク質を微生物宿主において発現させる工程； 該宿主の培養物から該組換えタンパク質を回収する工程； 該タンパク質をポリサッカリド成分に結合させる工程であって、ここで、該ポ
リサッカリド成分は、病原性微生物から単離されるか、または化学的に合成され
る、工程；および 該結合されたタンパク質およびポリサッカリド成分を回収する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項４１】 前記遺伝子配列の発現が、該配列の上流に作動可能に配置
され、かつ該宿主において機能的な、誘導性プロモーターによって調節される、
請求項４０に記載の方法。 - 【請求項４２】 該微生物宿主が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉであ
る、請求項４０に記載の方法。 - 【請求項４３】 前記組換えタンパク質が、約１０ｍｇ／ｍｌより高いレベ
ルで発現される、請求項４２に記載の方法。 - 【請求項４４】 前記組換えタンパク質が、１リットルの前記培養物あたり
約５０ｍｇより高いレベルで発現される、請求項４２に記載の方法。 - 【請求項４５】 前記組換えタンパク質が、１リットルの前記培養物あたり
約１００ｍｇより高いレベルで発現される、請求項４２に記載の方法。 - 【請求項４６】 前記タンパク質が、約５０ｋＤａより大きい、請求項４０
に記載の方法。 - 【請求項４７】 前記タンパク質が、約９０ｋＤａより大きい、請求項４０
に記載の方法。 - 【請求項４８】 前記タンパク質が、硫酸アンモニウム沈殿、およびその後
のイオン交換クロマトグラフィーによって回収される、請求項４０に記載の方法
。 - 【請求項４９】 前記タンパク質が、スクシニル化されている、請求項４０
に記載の方法。 - 【請求項５０】 前記タンパク質および前記ポリサッカリド成分の、１，エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリドとの
反応後に、該タンパク質が、該ポリサッカリド成分に結合される、請求項４０に
記載の方法。 - 【請求項５１】 前記ポリサッカリド成分が、臭化シアンによって活性化さ
れる、請求項４０に記載の方法。 - 【請求項５２】 前記ポリサッカリドが、アジピン酸ジヒドラジドによって
誘導体化される、請求項４０に記載の方法。 - 【請求項５３】 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの株由来の
タンパク質をコードする遺伝子を含む、組換え遺伝子配列。 - 【請求項５４】 前記遺伝子が、トキシンＡまたはそのフラグメントをコー
ドする、請求項５３に記載の組換え配列。 - 【請求項５５】 前記遺伝子が、トキシンＡの繰り返し単位（ｒＡＲＵ）ま
たはそのフラグメントをコードする、請求項５４に記載の組換え配列。 - 【請求項５６】 前記遺伝子が、トキシンＢまたはそのフラグメントをコー
ドする、請求項５３に記載の組換え配列。 - 【請求項５７】 前記遺伝子が、トキシンＢの繰り返し単位（ｒＢＲＵ）ま
たはそのフラグメントをコードする、請求項５６に記載の組換え配列。 - 【請求項５８】 請求項５３の遺伝子配列および微生物宿主に対して選択的
表現型を付与する遺伝子を含む、発現ベクター。 - 【請求項５９】 前記選択的表現型が、カナマイシンに対する耐性である、
請求項５８に記載の発現ベクター。 - 【請求項６０】 請求項５８または請求項５９に記載の発現ベクターで形質
転換された、微生物宿主。 - 【請求項６１】 前記病原性微生物の株に対する受動免疫療法のための抗体
の産生のための、請求項１に記載の免疫原性組成物の使用。
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