KR102650073B1 - 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19f 유래의 협막 다당류 단백질 접합체의 제조 방법 - Google Patents

스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19f 유래의 협막 다당류 단백질 접합체의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수송체 단백질에 접합된 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19F 유래의 협막 다당류를 이용한 다당류-단백질 접합체의 제조 방법을 제공한다. 본 방법은 자유 다당류를 제거하는 여과 전에 연장된 배양 단계를 포함한다 .

Description

스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19F 유래의 협막 다당류 단백질 접합체의 제조 방법
본 발명은 폐렴 구균의 혈청형 19F 협막 다당류 단백질 접합체의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 방법은 접합 후 및 여과 전 연장된 배양 시간을 제공해 폐렴 구균의 혈청형 19F를 가지는 다당류 단백질 접합체의 더 좋은 안정성을 제공한다. 본 발명은 또한 안정한 혈청형 19F 다당류 단백질 접합체를 포함하는 다가 폐렴 구균 접합체 백신의 제조에 관한 것이다.
수송체 단백질에 접합된 박테리아성 협막 다당류를 포함하는, 다당류-단백질 접합체 백신은, 지금까지 개발되어 왔고 추가적인 것들을 개발 중이다. 개발된 접합체 백신의 예는 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 유형 b (Hib) 접합체 백신 (예를 들어, 힙티터(HIBTITER)®) 뿐만 아니라 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae, 폐렴 연쇄상구균)에 대한 접합체 백신 (예를 들어, 프레브나르(PREVNAR)® 및 프레브나르 13®) 및 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis)에 대한 접합체 백신 (예를 들어, 멘주게이트 (MENJUGATE)®)을 포함한다.
수송체 단백질에 대한 다당류 항원의 접합 시, 반응 혼합물은 그에 접합된 단백질이 없는 자유 다당류, 그에 접합된 다당류 항원이 없는 자유 수송체 단백질 및 저분자량 다당류 단백질 접합체를 제거해 정제될 수 있다. 자유 다당류, 자유 단백질, 및 저분자량 접합체의 정제를 위한, 소수성 크로마토그래피, 접선 한외 여과, 투석 여과 등을 포함하는, 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공보 WO00/38711, 미국 특허 제6,146,902호, 및 문헌[Lei et al., 2000, Dev. Biol. 103:259-264]을 참조.
안정한 다당류 단백질 접합체를 제조하고 자유 다당류 및 저분자량 접합체와 같은 불순물로부터 다당류 단백질 접합체를 정제하는 개선된 방법에 대한 계속적인 요구가 있다.
본 발명은
a) 다당류-단백질 접합체 및 자유 다당류를 포함하는 혼합물을 최소 6 시간 동안, 2 내지 30 ℃ 범위 온도에서, 5.0 내지 9.0의 범위 내의 pH를 가지는 완충액 중에서 배양하는 단계; 및
b) 자유 다당류의 제거를 가능케 하는 조건 하에서 크기 분리를 수행하는 단계;
를 포함하는, 상기 혼합물로부터의, 수송체 단백질에 공유 결합으로 연결된 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19F 협막 다당류를 포함하는 다당류-단백질 접합체의 제조 및 정제 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 크기 분리는 다당류-단백질 접합체가 보유액에 남도록 하는 100 내지 500 kDa의 공칭 분자량 컷 오프 (NMWCO) 막을 이용한다.
특정 실시양태에서, 방법은
c) 다당류-단백질 접합체를 수집하는 단계
를 추가로 포함한다.
본원에서 기술되는 방법은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 및 CRM197을 포함하나, 이에 한정되지 않는 수송체 단백질에 적용 가능하다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 수송체 단백질은 CRM197이다.
특정 실시양태에서, 보유된 다당류-단백질 접합체는 600 kDa 이상의, 또는 1000 kDa 이상의 평균 분자량을 가진다.
특정 실시양태에서, 배양의 pH는 5.8 내지 7.0 범위 내에 있다. 본 발명의 방법에서 사용된 완충액은 포스페이트 완충액, 히스티딘, 또는 TRIS로부터 선택될 수 있고 pH 5.8 내지 7.0의 범위 내의 pH를 가진다. 하나의 실시양태에서, 완충액은 pH 7.0을 가진다.
특정 실시양태에서, 배양의 온도는 4 내지 25 ℃의 범위 내로 통제된다.
특정 실시양태에서, 크기 분리는 크기-배제 크로마토그래피, 결합/용출 크로마토그래피, 또는 와이드-포어 한외 여과에 의한다. 하나의 측면에서, 크기 분리는 100 kDa 내지 300 kDa의 NMWCO를 가지는 막으로 와이드-포어 한외 여과에 의한다.
특정 실시양태에서, 배양은 적어도 12 시간 또는 적어도 20 시간, 예를 들어 108 내지 132 시간 동안 진행된다.
본 발명은 또한 상이한 혈청형 유래의 하나 이상의 추가적인 다당류-단백질 접합체와 함께 다당류-단백질 접합체를 제형화하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 방법은 아쥬반트와 함께 제형화하는 것을 추가로 포함한다.
도 1: 4 ℃에서 자유 다당류 (Ps) 변화에 의해 측정된 혈청형 19F 접합체 안정성. pH 7.0 및 4 ℃에서 2 개의 혈청형 19F-CRM197 접합체 로트 (lot)에 대한 시간의 함수로서의 자유 Ps 함량. 혈청형 19F 접합체 로트 A는 배양되지 않았고, 로트 B는 와이드-포어 한외 여과 정제에 앞서 22 ℃에서 대략 5 일 동안 배양되었다. 표 1을 참조.
도 2: 25 ℃에서 자유 Ps 변화에 의해 측정된 혈청형 19F 접합체 가속된 안정성. 3 개의 혈청형 19F- CRM197 접합체 로트에 대한 pH 5.8 및 25 ℃에서의 시간의 함수로서의 자유 Ps 함량. 혈청형 19F 접합체 로트 A는 배양되지 않았고, 로트 B는 와이드-포어 한외 여과 정제에 앞서 22 ℃에서 대략 5 일 동안 10 mM 히스티딘, 150 mM 염화 나트륨, pH 7.0 중에서 배양되었다. 표 1을 참조. 혈청형 19F 로트 C는 와이드-포어 한외 여과에 앞서 22 ℃에서 대략 5 일 동안 pH 7.0에서 25 mM 인산 칼륨, 150 염화 나트륨 중에서 배양되었다.
도 3: 원료 의약품 (DS) 및 완제품 (DP) 안정성을 개선하기 위한 공정-내 배양 단계 중의 2 개의 혈청형 19F 접합체 로트 B 및 C 내의 시간의 함수로서의 자유 Ps 함량 (표 1 및 도 2에 기술됨). 배양 중 생성된 자유 Ps는 이어지는 와이드-포어 한외 여과 단계에서 제거된다.
본 발명은, 한외 여과를 포함하는 전통적인 방법이, S.뉴모니아 혈청형 19F를 위한 안정한 다당류-단백질 접합체를 공급하기에 불충분하다는 발견에 부분적으로 기초한다. 특히, 19F 접합체는 불안정하고 감소된 효능을 가진다고 밝혀졌다. 실시예에 나타난 바와 같이, 출원인의 작업은 혈청형 19F 다당류의 CRM197에 대한 접합 후, 접합된 19F 다당류는 분해되기 쉬우며, 상승된 자유 다당류 수치와 감소된 접합체 크기를 가지는 생성물을 생성한다는 것을 증명한다. 25 내지 30 % 사이의 안정된 수준의 자유 다당류가 4 ℃ (대략 3 개월 후) 또는 22 ℃ 내지 25 ℃ (대략 5 내지 7 일 후)에서 수득되었다.
임의의 이론에 얽매이지 않고, 이러한 분해 현상은 19F 다당류 상의 불안정한 부위의 존재에 의한 것이라고 여겨진다. 접합 후 및 정제 전 연장된 배양 시간을 통해, 불안정한 부위의 붕괴가 나타나도록 해, 생성된 접합체는 안정화될 수 있어 자유 다당류 함량, 접합체 크기, 및 접합체 효력이 시간이 지나도 변하지 않는다.
따라서, 본 발명은 다당류-단백질 접합체 및 자유 다당류를 포함하는 혼합물을 6 시간 또는 그 초과, 12 시간 또는 그 초과, 20 시간 또는 그 초과, 24 시간 또는 그 초과 동안 적절한 완충액 (예컨대 포스페이트, 히스티딘, 또는 6 내지 9의 범위 내 pKa의 임의의 완충액) 중에서 배양하고; 정제 단계, 예컨대 와이드-포어 한외 여과를 자유 다당류의 제거를 가능케하는 조건 하에서 수행하고, 임의로 다당류-단백질 항원을 보유액으로부터 수집함으로써, 상기 혼합물로부터 수송체 단백질에 공유 결합으로 연결된 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19F를 포함하는 다당류-단백질 접합체의 제조 방법을 기술한다. 자유 다당류는 임의로 한외 여과 투과물로부터 수집될 수 있고, 만약 원한다면, 접합 반응에서 재-사용될 수 있다.
접합 반응 혼합물은 다당류 항원-수송체 단백질 접합체 및 자유 다당류를 포함할 수 있다. 혼합물은 또한 자유 수송체 단백질, 저분자량 접합체 및 다른 단백질을 함유할 수 있다. 본 발명의 방법은 더 높은 안정성의 다당류-단백질 접합체를 제공한다.
본 발명은 혈청형 19F 유래의 정제된 다당류-단백질 접합체를 추가적인 S. 뉴모니아 혈청형 유래의 추가적인 다당류-단백질 접합체와 혼합해 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 추가로 제공한다.
본원에서 사용된, 용어 "포함한다"가 본 발명의 면역원성 조성물과 함께 사용될 때는, 이는 (항원 혼합물에 대해 "이루어지는"이라는 언어로 제한되기 쉬운) 임의의 다른 성분, 예컨대 아쥬반트 및 부형제의 포함을 지칭한다. 용어 "이루어지는"은 다가 다당류-단백질 접합체 혼합물과 사용될 때 특정한 S. 뉴모니아 다당류 단백질 접합체인 것들을 가지고 상이한 혈청형 유래의 다른 S. 뉴모니아 다당류 단백질 접합체를 갖지 않는 혼합물을 지칭한다.
본원에서 사용된, 어구 "완제품"은 제형화된, 2 개 이상의 혈청형 유래의 다당류-수송체 단백질 접합체의 블렌드를 지칭한다.
본원에서 사용된, 어구 "원료 의약품"은 주어진 혈청형 유래의 개별 다당류-수송체 단백질 접합체를 지칭한다.
본원에서 사용된, 어구 "혈청형 유래의 다당류-단백질 접합체"는 특정된 혈청형, 예를 들어 19F로부터 수득된 S. 뉴모니아 협막 다당류 및 수송체 단백질, 예를 들어, CRM197을 가지는 접합체를 지칭한다.
본원에서 사용된, 예를 들어 pH 및 온도에서 사용된 범위는, 포괄적인 의미이다. 예를 들어, pH 5.0 내지 9.0의 범위는 pH 5.0 및 pH 9.0을 포함한다는 의미이다. 비슷하게, 4 내지 25 ℃의 온도 범위는 범위의 바깥 한계, 즉, 4 ℃ 및 25 ℃를 포함한다는 의미이다.
스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류
혈청형 19F를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니아 유래의 협막 다당류는, 통상의 기술자에게 공지된 표준 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 다당류는 박테리아로부터 단리될 수 있고 공지된 방법에 의해 (예를 들어, 유럽 특허 제 EP497524호 및 제 EP497525호 참조); 및 바람직하게는 균질화기를 이용해 달성된 미세유동화에 의해 또는 화학적 가수분해에 의해 일정한 수준으로 크기가 조정될 수 있다. 특정 기술에서, 각 다당류 혈청형에 상응하는 S. 뉴모니아 균주는 대두-기반 배지에서 성장된다. 개별 다당류는 다음으로 원심 분리, 침전, 및 한외 여과를 포함하는 표준 단계를 통해 정제된다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제2008/0286838호 및 미국 특허 제5,847,112호를 참조하라. 다당류는 점도를 줄이고/거나 여과능을 및 이어지는 접합된 제품의 로트-대-로트 간 일관성을 개선하기 위해 크기가 조정될 수 있다. 협막 다당류는 다가 폐렴 구균 다당류 단백질 접합체 백신에 포함하기 위해 또한 하나 이상의 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 20, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B, 35F, 또는 38로부터 제조될 수 있다.
수송체 단백질
본 발명의 특정 실시양태에서, CRM197은 수송체 단백질로 사용된다. CRM197은 디프테리아 독소의 비-독성 변이체 (즉, 톡소이드)이다. 하나의 실시양태에서, 이는 카사미노산 (casamino acid) 및 효소 추출물-기반 배지에서 성장된 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria) 균주 C7 (β197)의 양물로부터 단리된다. 또 다른 실시양태에서, CRM197은 미국 특허 제5,614,382호에서 기술된 방법에 따라 재조합에 의해 제조된다. 대개, CRM197은 한외 여과, 암모늄 설페이트 침전, 및 이온-교환 크로마토그래피의 조합을 통해 정제된다. 일부 실시양태에서, CRM197은 페넥스 익스프레션 테크놀로지(Pfenex Expression Technology)™ (페넥스 주식회사 (Pfenex Inc.), 샌디에고, 캘리포니아주)을 이용해 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) 내에서 제조된다.
다른 적합한 수송체 단백질은 추가적인 불활성화된 박테리아 독소 예컨대 DT (디프테리아 톡소이드), TT (파상풍 톡소이드) 또는 TT의 단편C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드 (예를 들어, 국제 특허 출원 공보 WO 2004/083251에 기술됨), E.콜라이 LT (E. coli LT), E. 콜라이 ST (E. coli ST), 및 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래의 외독소 A를 포함한다. 박테리아 외막 단백질 예컨대 외막 복합체 c (OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 폐렴 구균 표면 단백질 A (PspA; 국제 특허 출원 공보 WO 02/091998 참조), 폐렴 구균 표면 접착 단백질 (PsaA), 군 A 또는 군 B 연쇄상구균 유래의 C5a 펩티다제, 또는 헤모필루스 인플루엔자 단백질 D, 몇몇 방식으로 해독된 플라이(ply)를 포함하는 폐렴 구균 용혈소 (문헌[Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2706-13]), 예를 들어 dPLY-GMBS (국제 특허 출원 공보 WO 04/081515 참조) 또는 dPLY-formol, PhtA, PhtB, PhtD, PhtE 및 Pht 단백질의 융합체, 예를 들어 PhtDE 융합체, PhtBE 융합체 (국제 특허 출원 공보 WO 01/98334 및 WO 03/54007 참조)를 포함하는 PhtX가, 또한 사용될 수 있다. 다른 단백질, 예컨대 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin, KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD), PorB (N. 메닝기티디스 유래), PD (헤모필루스 인플루엔자 단백질 D; 예를 들어, 유럽 특허 EP 0 594 610 B 참조), 또는 그들의 면역학적으로 기능적 동등물, 합성 펩티드 (유럽 특허 EP0378881 및 EP0427347 참조), 열 충격 단백질 (국제 특허 출원 공보 WO 93/17712 및 WO 94/03208 참조), 백일해 단백질 (국제 특허 출원 공보 WO 98/58668 및 유럽 특허 EP0471177 참조), 사이토킨, 림포킨, 성장 인자 또는 호르몬 (국제 특허 출원 공보 WO 91/01146 참조), 다양한 병원체 유래 항원 유래의 다중 인간 CD4+T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질 (문헌[Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31:3816-3824] 참조), 예컨대 N19 단백질 (문헌[Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72:4884-7] 참조), 철 섭취 단백질 (국제 특허 출원 공보 WO 01/72337 참조), C.디피실리의 독소 A 또는 B (국제 특허 공보 WO 00/61761 참조), 및 플라젤린 (문헌[Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64:9] 참조)이 또한 수송체 단백질로 사용될 수 있다.
다른 DT 돌연변이, 예컨대 CRM176, CRM228, CRM45 (문헌[Uchida et al., 1973, J Biol Chem 218:3838-3844]); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 및 CRM107 및 문헌[Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992]에 의해 기술된 다른 돌연변이; Glu-148의 삭제 또는 Asp, Gln 또는 Ser로의 및/또는 Ala 158의 Gly로의 돌연변이 및 미국 특허 제4,709,017호 또는 미국 특허 제4,950,740호에 개시된 다른 돌연변이; 적어도 하나 이상의 잔기 Lys 516, Lys 526, Phe 530 및/또는 Lys 534의 돌연변이 및 미국 특허 제5,917,017호 또는 미국 특허 제6,455,673호에 개시된 다른 돌연변이; 또는 미국 특허 제5,843,711호에 개시된 단편이 사용될 수 있다.
다당류-단백질 접합
정제된 다당류는 대개 수송체 단백질과 반응하는 것이 가능한 관능성을 도입하기 위해 화학적으로 활성화되어 있다. 일단 활성화되면, 각각의 협막 다당류는 개별적으로 수송체 단백질에 접합되어 글리코접합체를 형성한다. 다당류 접합체는 공지된 커플링 기술에 의해 제조될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 다당류의 화학적 활성화 및 이어지는 수송체 단백질에 대한 접합은 미국 특허 제4,365,170호, 제4,673,574호 및 제4,902,506호에 기술된 방법에 의해 달성된다. 간단히, 폐렴 구균 다당류는 과아이오딘산염-기반 산화제 예컨대 과아이오딘산 나트륨, 과아이오딘산 칼륨, 또는 과아이오딘산과 반응해 인접 히드록시기의 무작위 산화성 절단을 초래해 반응성 알데히드기를 생성한다.
산화된 다당류의 단백질 수송 상의 1 차 아민기 (주로 리신 잔기)에 대한 직접적인 아미노 커플링은 환원성 아미노화에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 접합은 활성화된 다당류와 수송체 단백질의 혼합물을 환원제 예컨대 나트륨 시아노보로히드리드와 함께 니켈의 존재 하에서 반응시켜 수행된다. 접합 반응은 수성 용액 중에서 또는 유기 용매 예컨대 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에서 수행될 수 있다. 예를 들어, US2015/0231270 A1, EP 0471 177 B1, US2011/0195086 A1을 참조한다. 접합 반응의 마무리 단계에서, 반응하지 않은 알데히드는 강한 환원제, 에컨대 나트륨 보로히드리드의 첨가에 의해 임의로 환원된다.
하나의 실시양태에서, 제형화 전, 각 폐렴 구균 협막 다당류 항원은 개별적으로 S. 뉴모니아로부터 정제되고, 활성화되어 반응성 알데히드를 형성하고, 다음으로 니켈의 존재 하에 나트륨 시아노보로히드리드로 환원성 아미노화를 이용해 수송체 단백질에 공유 결합으로 접합된다. 니켈은 환원성 아미노화에 사용된 나트륨 시아노보로히드리드 환원제의 잔여의, 간섭하는 시안화물과 복합체를 형성한다. 따라서, 니켈은 더 좋은 접합 반응 효율을 위해서, 그리고 자유 시안화물 제거를 돕기 위해, 본 발명의 방법에서 사용된다.
전이 금속은 시안화물과 안정한 복합체를 형성한다고 알려져 있고 단백질 아미노기 및 포름알데히드의 나트륨 시아노보로히드리드와의 환원성 메틸화를 개선한다고 알려져 있다. 문헌[Gidley et al., Biochem J. 1982, 203: 331-334]; 문헌[Jentoft et al. Anal Biochem. 1980, 106: 186-190]을 참조한다. 그러나, 출원인은 놀랍게도 잔여의, 간섭하는 시안화물을 복합체화 해, 니켈의 첨가가 접합 중 단백질의 소비를 증가시키고 더 큰, 잠재적으로 더욱 면역원성인 접합체의 형성으로 이어진다는 것을 발견했다.
시판 나트륨 시아노보로히드리드 시약 로트 내의 자유 시안화물 농도의 가변성은 불균일한 접합 성능으로 이어질 수 있으며, 분자 질량 및 다당류-대-단백질 비를 포함하는 접합체 속성의 가변성을 초래할 수 있다. 접합 반응에 대한 니켈의 첨가는 자유 시안화물의 농도를 낮추고 그에 따라 로트-대-로트 간 접합체 균일도를 개선한다.
또 다른 실시양태에서, 접합 방법은 시아네이트 에스테르를 형성하기 위해 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP)에 의한 다당류의 활성화를 이용할 수 있다. 활성화된 당류는 수송체 단백질 상의 아미노기에 직접 커플링될 수 있다.
대안적인 실시양태에서, 반응성 동종이관능기 또는 이종이관능기는 시아네이트 에스테르를 몇몇 개의 사용 가능한 종류 중 어느 하나와 반응시켜 활성화된 다당류에 도입될 수 있다. 예를 들어, 시스타민 또는 시스테아민이, 말레이미드-활성화된 수송체 단백질 (예를 들어 GMBS를 이용해) 또는 할로아세틸화된 수송체 단백질 (예를 들어 아이오도아세트이미드 [예를 들어, 에틸 아이오도아세트이미드 HCl] 또는 N-숙신이미딜 브로모아세테이트 또는 SIAB, 또는 SIA, 또는 SBAP를 이용해)과의 반응 후 수득되는 티오에테르 연결기를 통해 수송체에 커플링될 수 있는 티올화된 다당류를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 접합체는 국제 특허 출원 공보 제WO 93/15760호, 제WO 95/08348호 및 제WO 96/29094호; 및 문헌[Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40:245-256]에 기술되어 있다.
다른 적합한 접합 방법은 카르보디이미드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보레인, p-니트로벤조산, N-히드록시숙신이미드, S--NHS, EDC, TSTU를 이용한다. 다수가 국제 특허 출원 공보 제WO 98/42721호에 기술되어 있다. 접합은 당류의 자유 히드록시기와 CDI의 반응에 이어 카르바메이트 연결을 형성하는 수송체 단백질과의 반응에 의해 형성될 수 있는 카르보닐 연결기 (문헌[Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218:509-18] 참조)와 관련될 수 있다. 이러한 화학 반응은 1 차 히드록시기를 형성하기 위한 탄수화물의 아노머성 말단의 환원과 이어지는 카르바메이트 중간체를 형성하기 위한 1 차 히드록시기와 CDI의 반응 및 이어지는 단백질 수송체 아미노기에 대한 커플링으로 구성된다. 반응에서 당류 상의 다른 1 차 히드록시기의 임의적인 보호/탈보호가 필요할 수 있다.
접합에 이어, 다당류-단백질 접합체는, 농축/투석 여과 공정, 한외 여과, 침전/용출, 칼럼 크로마토그래피, 및 심층 여과를 포함하는, 통상의 기술자에게 널리 공지된 하나 이상의 임의의 기술로 정제되어, 과량의 접합 시약 뿐만 아니라 잔여 자유 단백질 및 자유 다당류를 제거한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,146,902호를 참조한다.
혈청형 19F에 대해, 접합된 물질의 상대적 불안정성을 나타내는, 시간에 따른 역가의 급속한 감소가 있었다는 것이 발견되었다. 이는 자유 다당류의 증가 및 접합체 크기의 감소와 관련된다고 밝혀졌다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 자유 다당류를 제거하기 위한, 예를 들어 와이드-포어 한외 여과 단계를 이용하는, 접합 후 정제 전의 배양 기간이, 다당류 단백질 접합체의 안정성을 개선한다고 밝혀졌다. 이러한 자유 다당류의 증가는 19F 다당류 상의 불안정한 부위의 존재 때문이라고 여겨진다. 19F 다당류를 접합 후 (및 정제 전) 배양해, 분해되기 쉬운 19F 다당류의 일부 (~25 내지 30 %)가 분해되도록 할 수 있고 여과 단계에서 제거될 수 있다.
배양 조건은 19F 다당류가 그의 불안정한 부위를 통해 분해할 수 있도록 선택되어야 한지만, 다른 매커니즘을 통해 다당류를 분해할 수 있는 조건, 예컨대 과도하게 높거나 낮은 pH를 포함하지 않아야 한다. 실시예에 나타난 바와 같이, 비-배양된 19F 접합체의 자유 다당류로의 분해는 4 ℃에서 약 3 개월만에 및 25 ℃에서 약 7 일만에 약 30 %의 안정기에 도달했다. 시간과 온도 (및 pH)는 몇몇 상이한 조건 하에서 변할 수 있어 불안정한 부위를 함유하는 접합체의 해당 부분의 최대 분해를 수득한다는 것이 이미 명백하다.
배양은 최적의 자유 Ps 제거를 달성하기 위해 길게는 5 일 이상, 예를 들어 5 내지 7 일이 소요될 수 있다. 그러나, 자유 Ps의 상당한 감소가 적게는 1 일 만에 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 배양이 최소 1, 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 60 또는 72 시간 동안 발생하는 방법을 제공한다. 배양은 최대 60, 72, 84, 96, 108, 120, 또는 132 시간 동안 발생할 수 있다. 본 발명은 예를 들어, 6 내지 96 시간, 24 내지 84 시간, 48 내지 60 시간, 뿐만 아니라 72 시간 내지 132 시간, 96 시간 내지 132 시간 및 108 시간 내지 132 시간을 포함하는 이러한 배양 시간의 모든 조합을 포괄한다. 132 시간을 초과하는, 예를 들어 150 시간, 180 시간, 200 시간, 240 시간 및 이를 초과하는 시간이, 분해에 끼치는 영향을 최소로 하며 사용될 수 있을 것이라 예상할 수 있다. 일반적으로, 더 높은 온도에서 더 높은 분해 속도가 나타날 것이고 따라서 더 높은 온도가 사용될 때, 배양 시간은 더 짧아질 수 있다.
배양은 바람직하게는 접합 또는 접합 후에 사용되는 완충액 내에서 수행된다. 완충액은 6.0 내지 9.0, 6.0 내지 8.5, 또는 6.5 내지 7.5의 범위 내 pH의 히스티딘, 포스페이트, TRIS 또는 임의의 완충액으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충액은 pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 또는 9.0을 가진다.
완충액은 임으로 추가적으로 염화 나트륨 및 염화 칼륨으로부터 선택된 염을 함유한다. 염 농도의 범위는 0 내지 500 mM이다. 하나의 실시양태에서, 완충액은 10 mM 히스티딘 또는 25 mM 인산 칼륨이고 추가로 150 mM 염화 나트륨을 포함한다.
배양의 pH는 pH 5.0 내지 9.0, 5.8 내지 7.0, 또는 7.0±0.2 사이에서 나타날 수 있다.
배양의 온도는 2 내지 30 ℃, 4 내지 25 ℃, 15 내지 25 ℃, 또는 20 내지 25 ℃ 사이에서 나타날 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, 더 높은 온도에서, 분해의 반응 속도는 더욱 빠르게 나타난다. 더 높은 온도에서, 배양 시간은 더 짧아질 수 있다. 반대로, 더 낮은 온도에서, 분해의 반응 속도는 더욱 느리게 나타난다. 더 낮은 온도에서, 배양 시간은 일반적으로 더 길다.
협막 다당류가 수송체 단백질에 접합된 후, 다당류-단백질 접합체가 하나 이상의 다양한 기술을 이용하는 크기 분리에 의해 정제된다 (예를 들어 자유 다당류를 제거함으로써 원하는 크기 범위의 다당류-단백질 접합체의 양이 풍부해진다). 이러한 기술의 예는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 농축/투석 여과 공정, 와이드-포어 한외 여과를 포함하는 한외 여과, 침전/용출, 크기-배제를 포함하는 칼럼 크로마토그래피, 결합/용출 크로마토그래피, 및 심층 여과를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,146,902호를 참조한다. 적절한 분자량 컷 오프 (cut off)가 100 kDa 내지 500 kDa, 예를 들어, 100 kDa, 200 kDa, 250 kDa, 300 kDa, 400 kDa 또는 500 kDa으로부터 선택될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 크기 분리는 100 kDa 내지 300 kDa의 MWCO를 가지는 막으로 와이드-포어 한외 여과에 의해 달성된다.
정제는 자유 다당류를 제거할 뿐만 아니라 저분자량 접합체 또한 제거할 수 있어 다당류-단백질 접합체의 전체적인 평균 분자량을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 보존된 접합체의 평균 분자량은 600 kDa, 700 kDa, 800 kDa, 900 kDa, 또는 1000 kDa 또는 그 초과이다.
다당류 단백질 접합체는 다음으로 표준 기술을 이용해 필터 또는 칼럼 상의 보유액으로부터 수집될 수 있다.
정제 단계에 이어서, 생성물은 제형화를 위한 준비로 대개 0.2-미크론으로 여과된다.
제약/백신 조성물
본 발명의 방법을 이용해 제조된 혈청형 19F 접합체는, 제약상 허용 가능한 담체 및 아쥬반트와 함께 상기 기술된 임의의 다당류 혈청형 조합을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 그렇지 않으면, 이들로 이루어진 제약, 면역원성 및 백신 조성물을 비롯한 조성물에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 조성물은, 2 내지 35, 예를 들어, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35 개의 별개의 다당류-단백질 접합체를 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 각각의 접합체는 개별적으로 하나 이상의 수송체 단백질에 접합된 상이한 협막 다당류를 함유하고, 여기서 협막 다당류는 (19F에 더해) 추가로 제약상 허용 가능한 담체 및 아쥬반트와 함께 스트렙토코커스 뉴모니아의 적어도 하나의 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 20, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B, 35F, 또는 38을 포함한다. 특정 실시양태에서, 수송체 단백질은 CRM197이다.
개별적 글리코접합체가 상기 기술된 바와 같이 제조되고 정제되고 여과된 후, 그들은 표준 기술을 이용해 배합되어 본 발명의 면역원성 조성물을 제형화한다. 이들 폐렴 구균 접합체는 별개의 공정에 의해 제조되고 단일 투여형 제제로 벌크 제형화된다.
본 발명의 다당류-단백질 접합체의 제형화는 해당 업계에 공지된 방법을 이용해 달성될 수 있다. 예를 들어, 9, 11, 13, 15 또는 그 초과의 개별적인 폐렴 구균 접합체가 생리학적으로 허용 가능한 비히클과 함께 제형화되어 조성물을 제조할 수 있다. 이러한 비히클의 예는, 물, 완충된 염수, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 덱스트로스 용액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 실시양태에서, 백신 조성물은 L-히스티딘 완충액 중에서 염화 나트륨과 함께 제형화된다.
본원에 정의된 바와 같이, "아쥬반트"는 본 발명의 면역원성 조성물의 면역원성을 증진하는 역할을 하는 물질이다. 면역 아쥬반트는 단독으로 투여되었을 때, 약하게 면역원성인 항원에 대한 면역 반응을 증진할 수 있으며, 예를 들어, 없거나 약한 항체가 또는 세포-매개된 면역 반응을 유도하거나, 항원에 대한 항체가를 증가시키고/거나, 개체에서 면역 반응을 달성하기에 효과적인 항원의 용량을 낮춘다. 따라서, 면역 반응을 증가시키기 위해 아쥬반트가 종종 제공되고 이는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 조성물의 효율성을 증진시키기에 적합한 아쥬반트는,
(1) 알루미늄 염 (alum), 예컨대 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 황산 알루미늄, 등;
(2) 수-중-유 에멀전 제제 (다른 특정한 면역자극제 예컨대 무라밀 펩티드 (하기 정의됨) 또는 박테리아 세포 벽 성분을 포함하거나 포함하지 않음), 예컨대, 예를 들어, (a) 모델 110Y 미세유동화기 (마이크로플루이딕스 (Microfluidics), 뉴턴, 매사추세츠주)와 같은 미세유동화기를 이용해 초미세 입자로 제형화된, 5 % 스쿠알렌, 0.5 % 트윈(Tween) 80, 및 0.5 % 스판 (Span) 85를 함유하는 (임의로 다양한 양의 MTP-PE를 함유하는) MF59 (국제 특허 출원 공보 WO 90/14837), (b) 초미세 에멀전으로 미세유동화되거나 볼텍싱되어 더 큰 입자 크기의 에멀전을 생성하는, 10 % 스쿠알렌, 0.4 % 트윈 80, 5 % 플루로닉-블록 중합체 L121, 및 thr-MDP를 함유하는 SAF, (c) 2 % 스쿠알렌, 0.2 % 트윈 80, 및 미국 특허 제4,912,094호에 기술된 3-O-데아실화된 모노포스포릴리피드A (MPL™), 트레할로스 디미콜레이트 (TDM), 및 세포벽 골격 (CWS)으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 박테리아 세포 벽 성분, 바람직하게는 MPL+CWS (데톡스(Detox)™)를 함유하는 리비(Ribi)™ 아쥬반트 시스템 (RAS), (코릭사 (Corixa), 해밀턴, 몬태나주); 및 (d) 몬타니드(Montanide) ISA
(3) 사포닌 아쥬반트, 예컨대 퀼(Quil) A 또는 스티뮬론 (STIMULON)™ QS-21 (안티제닉스(Antigenics), 프레이밍햄, 매사추세츠주) (예를 들어, 미국 특허 제5,057,540호 참조)가 사용될 수 있거나 그로부터 생성된 입자 예컨대 ISCOM (콜레스테롤, 사포닌, 인지질, 및 양친매성 단백질의 조합에 의해 형성된 면역자극 복합체) 및 이스코매트릭스 (Iscomatrix)® (단백질을 제외하고는 ISCOM과 본질적으로 동일한 구조를 가진다);
(4) 박테리아성 지질다당류, 합성 지질 A 유사체 예컨대 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물 (AGP), 또는 그들의 유도체 또는 유사체로, 코릭사에서 입수 가능한 것들, 및 미국 특허 제6,113,918호에 기술된 것들; 하나의 그러한 AGP는 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3--테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]-b-D-글루코피라노시드이며, 이는 또한 529 (이전에는 RC529로 공지됨)로 공지되어 있고, 이는 수성 형태로 또는 안정한 에멀전으로 제형화 된다;
(5) 합성 폴리뉴클레오티드 예컨대 CpG 모티프(들)를 함유하는 올리고뉴클레오티드 (미국 특허 제6,207,646호); 및
(6) 사이토킨, 예컨대 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, 등), 인터페론 (예를 들어, 감마 인터페론), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 매크로파지 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF), 공촉진 분자 B7-1 및 B7-2, 등; 및
(7) 보체, 예컨대 보체 성분 C3d의 삼량체
를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 실시양태에서, 아쥬반트는 2, 3, 또는 그 초과의 상기 아쥬반트, 예를 들어 SBAS2의 혼합물이다 (수-중-유 에멀전은 또한 3-데아실화된 모노포스포릴 리피드 A 및 QS21을 함유).
무라밀 펩티드는, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닌-2-(1'-2' 디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE), 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시양태에서, 아쥬반트는 알루미늄 염이다. 알루미늄 염 아쥬반트는 알루미늄 염-침전된 백신 또는 알루미늄 염-흡착된 백신일 수 있다. 알루미늄-염 아쥬반트는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Harlow, E. and D. Lane (1988; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)] 및 문헌[Nicklas, W. (1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493)]에 기술되어 있다. 알루미늄 염은, 수화된 알루미나, 알루미나 수화물, 알루미나 삼수화물 (ATH), 알루미늄 수화물, 알루미늄 삼수화물, 알히드로겔, 수퍼포스 (Superfos), 암포겔 (Amphogel), 수산화 알루미늄 (III), 알루미늄 히드록시포스페이트 설페이트 (알루미늄 포스페이트 아쥬반트 (APA)), 무정형 알루미나, 삼수화된 알루미나, 또는 트리히드록시알루미늄을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
APA는 알루미늄 히드록시포스페이트의 수성 현탁액이다. APA는 염화 알루미늄과 인산 나트륨을 1:1 부피비로 블렌딩해 알루미늄 히드록시포스페이트를 침전해 제조된다. 블렌딩 공정 후, 재료는 고-전단 혼합기로 소형화되어 단분산 입자 크기 분포를 달성한다. 생성물은 다음으로 생리 염수에 대해 투석 여과되고 증기 멸균된다.
특정 실시양태에서, 상업적으로 입수 가능한 Al(OH)3 (예를 들어, 뉴욕주, 웨스트버리, 덴마크/아큐레이트 케미칼 앤 사이언티픽 주식회사 (Denmark/Accurate Chemical and Scientific Co.)의 알히드로겔 또는 수퍼포스)이 단백질을 흡착하기 위해 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 단백질의 흡착은, 단백질의 pI (등전 pH) 및 배지의 pH에 의존적이다. 낮은 pI의 단백질은 더 높은 pI의 단백질보다 양 전하로 대전된 알루미늄 이온에 더욱 강하게 흡착한다. 알루미늄 염은 2 내지 3 주의 기간에 걸쳐 서서히 방출되는 항원의 저장부를 설립할 수 있고, 매크로파지의 비특이적 활성화에 관여하고 활성화를 보완하고/하거나, 선천성 면역 매커니즘을 (아마 요산의 촉진을 통해) 촉진한다. 예를 들어, 문헌[Lambrecht et al., 2009, Curr Opin Immunol 21:23]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 단일원자가 벌크 수성 접합체는 대개 함께 블렌딩되고 6B (만약 사용된다면, 이는 표적 16 ㎍/mL로 희석될 것임)를 제외한 모든 혈청형에 대해 표적 8 ㎍/mL로 희석된다. 일단 희석되면, 배치는 여과 멸균될 것이고, 동일한 부피의 알루미늄 포스페이트 아쥬반트가 250 ㎍/mL의 최종 알루미늄 농도를 목표로 무균 상태로 첨가된다. 아쥬반트된, 제형화된 배치는 대개 단일-사용의, 0.5 mL/투여 바이알에 채워질 것이다.
특정 실시양태에서, 아쥬반트는 CpG-함유 뉴클레오티드 시퀀스, 예를 들어, CpG-함유 올리고뉴클레오티드, 특히 CpG-함유 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN)이다. 또 다른 실시양태에서, 아쥬반트는 ODN 1826이고, 이는 콜리 파마수티칼 그룹 (Coley Pharmaceutical Group)으로부터 습득될 수 있다.
"CpG-함유 뉴클레오티드", "CpG-함유 올리고뉴클레오티드", "CpG 올리고뉴클레오티드," 및 유사한 용어는 비메틸화된 CpG 부분을 함유하는 6 내지 50 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 예를 들어, 문헌[Wang et al., 2003, Vaccine 21:4297]을 참조한다. 또 다른 실시양태에서는, 해당 업계에서 사용되는 용어의 임의의 다른 정의가 의도된다. CpG-함유 올리고뉴클레오티드는 임의의 합성 인터뉴클레오시드 연결기, 개질된 염기 및/또는 개질된 설탕을 이용하는 개질된 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
CpG 올리고뉴클레오티드의 사용을 위한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Sur et al., 1999, J Immunol. 162:6284-93]; 문헌[Verthelyi, 2006, Methods Mol Med. 127:139-58]; 및 문헌[Yasuda et al., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110]에 기술되어 있다.
투여/투여량
본 발명의 조성물 및 제제는, 백신을 전신 또는 점막 경로를 통해 투여해 감염, 예를 들어 폐렴 구균 감염에 민감한 인간을 보호하거나 치료하는데 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은, 인간에게 면역학상 유효량의 본 발명의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, S. 뉴모니아 협막 다당류 접합체에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 인간에게 면역학상 유효량의 본 발명의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 폐렴 구균 감염에 대해 인간을 예방 접종하는 방법을 제공한다.
특정한 백신에 대한 성분의 최적의 양은 대상에서의 적절한 면역 반응의 관찰에 관련된 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 또 다른 실시양태에서, 인간 예방 접종의 투여량은 동물 연구로부터의 인간 데이터에 대한 외삽법에 의해 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 투여량은 경험적으로 결정된다.
본 발명의 조성물의 "유효량"은 이어지는 도전 중, 세균, 예를 들어 S. 뉴모니아의 감염성의 가능성 또는 중증도를 상당히 감소시키는 항체를 유발하기 위해 필요한 투여량을 지칭한다.
본 발명의 조성물은 침윤성 감염 (뇌막염, 폐렴, 및 균혈증), 및 비침윤성 감염 (급성 중이염, 및 부비강염) 모두를 포함하는, 세균, 예를 들어 S.뉴모니아로부터 야기된 초발 임상 증상의 예방 및/또는 감소를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여는 근육 내, 복강 내, 피부 내 또는 피하 경로를 통한; 또는 경구/소화관, 기도 또는 비뇨 생식관으로의 점막 투여를 통한 주사 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 비강 내 투여가 폐렴 또는 중이염의 치료를 위해 사용된다 (폐렴 구균의 비인강 수송이 보다 효과적으로 예방될 수 있으므로, 초기 단계에서 감염을 약화시킨다).
각각의 백신 투여량 내의 접합체의 양은 심각한 부작용 없이, 면역보호성 반응을 유발하는 양으로 선택된다. 그러한 양은 폐렴 구균 혈청형에 의존적으로 변할 수 있다. 일반적으로, 다당류-기반 접합체의 경우, 각각의 투여량에는 0.1 내지 100 ㎍의 각각의 다당류, 특히 0.1 내지 10 ㎍, 및 더욱 특정하게는 1 내지 5 ㎍이 포함될 것이다. 예를 들어, 각각의 투여량에는 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 또는 750 ng 또는 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7.5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 ㎍이 포함될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 알루미늄 염의 투여량은 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500, 또는 700 ㎍, 또는 1, 1.2, 1.5, 2, 3, 5 mg 또는 그 초과이다. 또한 또 다른 실시양태에서, 상기 기술된 알루미늄 염의 투여량은 재조합 단백질의 ㎍ 당이다.
본원에서 기술된 조성물은 바람직하게는 인간 대상에 투여된다. 특정 실시양태에서, 인간 환자는 젖먹이 (1 살 미만), 유아 (대략 12 내지 24 개월), 또는 어린 아이 (대략 2 내지 5 살)이다. 다른 실시양태에서, 인간 환자는 노인 환자 (>65 세)이다. 본 발명의 조성물은 또한 좀더 나이든 아이, 청소년 및 성인 (예를 들어, 18 내지 45 세 또는 18 내지 65 세)에게 사용하기에 적합하다.
본원에 기술된 조성물은 단일 접종으로서 투여될 수 있다. 백신은 2 회, 3 회 또는 4 회 또는 그 초과, 적절하게 간격을 두고 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개월 간격으로 또는 그들의 임의의 조합으로 투여될 수 있다. 면역화 스케쥴은 폐렴 구균 백신을 위해 지정된 것을 따를 수 있다. 예를 들어, S.뉴모니아에 의해 야기된 침윤성 질환에 대한 젖먹이 및 유아를 위한 정기 스케쥴은 2, 4, 6회 및 12 내지 15 개월의 연령이다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 조성물은 2, 4, 6 및 12 내지 15 개월의 연령에서 4-투여 시리즈로서 투여된다.
조성물은 또한 S.뉴모니아 유래의 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 포함되기에 적합한 S. 뉴모니아 단백질의 예는 국제 특허 출원 공보 제WO 02/083855호 및 제WO 02/053761호에 식별된 것들을 포함한다.
제제
본원에 기술된 조성물은 통상의 기술자에게 공지된, 하나 이상의 방법에 의해, 예컨대 비경구적으로, 점막 내로, 경피로, 근육 내로, 정맥 내로, 진피 내로, 비강 내로, 피하로, 복강 내로 대상에 투여될 수 있고, 그에 따라 제형화될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 조성물은 액체 제제의 표피 주사, 근육 내 주사, 정맥 내, 동맥-내, 피하 주사, 또는 호흡기-내 점막 주사를 통해 투여될 수 있다. 주사를 위한 액체 제제는 용액 등을 포함한다.
조성물은 단일 투여 바이알, 다중-투여 바이알로 또는 사전-충전된 주사기로 제형화될 수 있다.
본원에 기술된 조성물은 경구로 투여될 수 있고, 따라서 경구 투여에 적합한 형태, 즉 고체 또는 액체 제제로 제형화될 수 있다. 고체 경구 제제는 정제, 캡슐, 환제, 과립, 펠렛 등을 포함한다. 액체 경구 제제는 액체, 현탁액, 분산액, 에멀전, 오일 등을 포함한다.
액체 제제를 위한 제약상 허용 가능한 담체는 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 에멀전 또는 오일이다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 주입성 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 염수 및 완충된 매질을 포함해 물, 알콜성/수성 용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 오일의 예는 동물, 채소, 또는 합성에서 유래한 것들, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 올리브유, 해바라기유, 어간유, 또 다른 수산 유지, 또는 우유 또는 달걀의 지질이다.
제약 조성물은 등장성, 저장성 또는 고장성일 수 있다. 그러나 주입 또는 주사를 위한 제약 조성물은, 투여될 때, 필수적으로 등장성인 것이 종종 바람직하다. 따라서, 저장을 위해 제약 조성물은 바람직하게는 등장성 또는 고장성일 수 있다. 만약 제약 조성물이 저장을 위해 고장성이면, 이는 투여 전 등장성 용액이 되기 위해 희석될 수 있다.
등장제는 이온성 등장제 예컨대 염 또는 비-이온성 등장제 예컨대 탄수화물일 수 있다. 이온성 등장제의 예는 염화 나트륨 (NaCl), 염화 칼슘 (CaCl2), 염화 칼륨 (KCl) 및 염화 마그네슘 (MgCl2)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비-이온성 등장제의 예는 만니톨, 솔비톨 및 글리세롤을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
적어도 하나의 제약상 허용 가능한 첨가제는 완충액인 것이 또한 바람직하다. 어떤 목적을 위해, 예를 들어, 제약 조성물을 주입 또는 주사할 계획인 경우, 용액을 4 내지 10, 예컨대 5 내지 9, 예를 들어 6 내지 8의 범위 내의 pH로 완충하는 것이 가능하도록, 조성물이 완충액을 포함하는 것이 종종 바람직하다.
완충액은 예를 들어 TRIS, 아세테이트, 글루타메이트, 락테이트, 말레에이트, 타르트레이트, 포스페이트, 시트레이트, 카르보네이트, 글리시네이트, 히스티딘, 글리신, 숙시네이트, 및 트리에탄올아민 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
완충액은 나아가, 특히 제약 제제가 비경구적 용도인 경우, 예를 들어 비경구적 용도를 위한 USP 적합성 완충액으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 완충액은 일염기산 예컨대 아세트산, 벤조산, 글루콘산, 글리세린산 및 락트산; 이염기산 예컨대 아코니트산, 아디프산, 아스코르브산, 탄산, 글루탐산, 말산, 숙신산 및 타르타르산, 다염기산 예컨대 시트르산 및 인산; 및 염기 예컨대 암모니아, 디에탄올아민, 글리신, 트리에탄올아민, 및 TRIS로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
(피하, 정맥 내, 동맥 내, 또는 근육 내 주사를 위한) 비경구 비히클은 염화 나트륨 용액, 링거의 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화 나트륨, 젖산 링거 및 비휘발성 오일을 포함한다. 정맥 내 비히클은 유체 및 영양 보충액, 전해질 보충액 예컨대 링거의 덱스트로스 등에 기반한 것들을 포함한다. 예는 멸균 용액 예컨대 계면활성제 및 다른 제약상 허용 가능한 아쥬반트의 첨가가 있거나 없는, 물 및 오일이다. 일반적으로, 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 관련된 설탕 용액, 글리콜 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이, 특히 주입성 용액을 위한, 바람직한 액체 담체이다. 오일의 예는 동물, 채소, 또는 합성에서 유래된 것들, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 올리브유, 해바라기유, 어간유, 또 다른 수산 유지, 또는 우유 또는 달걀의 지질이다.
본원에서 기술된 DP 제제는 또한 계면활성제를 함유할 수 있다. 바람직한 계면활성제는, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 에스테르 계면활성제 (흔히 트윈즈라고 지칭된다); 상표명 다우팍스 (DOWFAX)™ 하에 판매되는, 에틸렌 옥시드 (EO), 프로필렌 옥시드 (PO), 및/또는 부틸렌 옥시드 (BO)의 공중합체, 예컨대 선형 EO/PO 블록 공중합체; 반복되는 에톡시기 (옥시-1,2-에탄디일)의 개수가 변할 수 있는, 옥톡시놀, 특히 관심이 가는 것인 옥톡시놀-9 (트리톤 (Triton) X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올); (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질 예컨대 포스파티딜콜린 (레시틴); 노닐페놀 에톡시레이트, 예컨대 테르기톨 (Tergitol)™ NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알콜로부터 유래된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르 (브리즈 계면활성제로 알려짐), 예컨대 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르 (브리즈 30); 및 솔비탄 에스테르 (흔히 스판(SPAN)로 알려짐), 예컨대 솔비탄 트리올레에이트 (스판 85) 및 솔비탄 모노라우레이트를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
계면활성제의 혼합물, 예를 들어 PS80/스판(Span) 85 혼합물이 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 솔비탄 에스테르 예컨대 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레에이트 (PS80) 및 옥톡시놀 예컨대 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (트리톤 X-100)의 조합이 또한 적합하다. 또 다른 유용한 조합은 라우레스 9에 더해진 폴리옥시에틸렌 솔비탄 에스테르 및/또는 옥톡시놀을 포함한다.
분석
폐렴 구균 접합체 백신에 있어서, 방출 및 안정성 테스트는 품질 관리를 위해 중요하다. 상업용 로트 내의 각각의 다당류-단백질 접합체는 적절한 투여량 및/또는 역가를 확실히 하기 위해 참조 표준에 대해 테스트된다. 안정한 참조 표준은 방출 및 안정성 테스트 양쪽 모두에서 균일하고 강건한 테스트 결과를 보장한다. 만약 참조 표준이 시간이 지남에 따라 분해되면, 관련된 분석에서 생성된 테스트 결과, 예컨대 역가를 측정하는데 종종 사용된 것들은, 시간이 지남에 따라 표류할 것이다.
출원인의 19F에 대한 작업은 정제에 앞선 추가적인 배양이 그의 안정성을 높인다는 것을 나타냈다. 따라서, 본원에 기술된 공정에 따라 이루어진 19F 접합체를 참조 표준으로 사용하는 것이 시간에 따라 균일한 시험 결과를 더 보장하고 더 나은 방법 정밀성과 정확성을 가능케 할 수 있다. 만약 이러한 추가적인 배양 단계를 거치지 않은 19F 접합체가 참조 표준으로 사용되면, 19F에서 볼 수 있는 분해가 시험 결과에서 체계적인 편차를 야기할 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 또한 19F 접합체를 참조 표준으로 이용해 폐렴 구균 접합체 백신 제조 로트의 투여량 및/또는 역가를 측정하기 위한 다당류 단백질 접합체 면역 분석에 직결된다. 그러한 면역분석은 실시예의 분석 세션에 기술된 샌드위치 ELISA를 포함한다.
첨부된 설명 및 도면을 참조해 본 발명의 다양한 실시양태를 기술했지만, 본 발명은 이러한 정확한 실시양태에 한정되지 않으며, 첨부된 청구 범위에 정의된 본 발명의 범위와 사상을 벗어나지 않고 다양한 변경 및 수정이 통상의 기술자에 의해 행해질 수 있음을 이해할 것이다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하지만, 한정하지 않는다.
실시예
분석 방법
HPSEC/UV/MALS/RI분석법을 이용한 접합체의 분자량 및 농도 분석
접합체 샘플이 주입되었고 고 성능 크기-배제 크로마토그래피 (HPSEC)에 의해 분리되었다. 검출은 일련의 자외선 (UV), 다각 광 산란 (MALS) 및 굴절률 (RI) 검출기에 의해 달성된다. 단백질 농도는 A280 (280 nm에서 흡광)로부터 흡광 계수를 이용해 계산되었다. 다당류 농도는, 용질 농도의 변화에 따른 용액의 굴절률의 변화를 ml/g로 나타낸, dn/dc 인자를 이용해 RI 신호로부터 데콘볼루션되었다 (deconvoluted) (단백질 및 다당류 둘 다가 기여함). 샘플의 평균 분자량은 전체 샘플 피크에 걸쳐 측정된 농도 및 광 산란 정보를 이용해 아스트라 (Astra) 소프트웨어 (와이엇 테크놀러지 주식회사 (Wyatt Technology Corporation), 산타 바바라, 캘리포니아)에 의해 계산되었다. 다분산된 분자에 대한 분자량의 평균값의 여러 형태가 있다. 예를 들어, 수-평균 분자량 Mn, 중량-평균 분자량 Mw, 및 z-평균 분자량 Mz (문헌[Molecules, 2015, 20, 10313-10341]). 달리 명시되지 않는 한, 분자량은 중량-평균 분자량이다.
자유 다당류 테스트
접합체 샘플 내의 자유 다당류 (CRM197과 접합되지 않은 다당류)는 먼저 자유 단백질 및 접합체를 데옥시콜레이트 (DOC) 및 염산으로 침전시켜 측정된다. 침전물은 다음으로 여과되고 여액은 HPSEC/UV/MALS/RI에 의해 자유 다당류 농도에 대해 분석된다. 자유 다당류는 HPSEC/UV/MALS/RI에 의해 측정되어 총 다당류의 퍼센트로 계산된다.
총 다당류 ELISA
총 다당류 (Ps) 샌드위치 ELISA (Sandwich ELISA)는 완제품 샘플 내의 다당류의 총량을 측정하기 위한 다가 면역분석법이다. Ps는 혈청형-특이적 항체에 의해 포획되고 검출되며, 희석 곡선의 평행선 분석에 의해 다당류 함량을 표준과 상대적으로 비교한다. 혈청형-특이적 항체는 먼저 미량정량판 상에 직접 코팅된다. 블록킹 단계 후, 표준 및 샘플의 희석 곡선은 코팅된 미량정량판에 적용된다. 고정된 다당류는 혈청형-특이적 항체 및 알칼리성 포스파타제에 접합된 2 차 항체 (AP 접합체)의 혼합물에 의해 검출된다. 형광 신호는 4-메틸룸벨리페릴 포스페이트 (4-MuP)로 발생된다.
실시예 1: S. 뉴모니아 협막 다당류의 제조
폐렴 구균을 배양하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52]을 참조한다. 폐렴 구균 협막 다당류의 제조 방법 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허 제EP0497524호를 참조한다. 폐렴 구균 아형의 단리물은 아메리칸 타입 컬처 콜렉션 (American Type Culture Collection) (머내서스, 버지니아주)에서 입수 가능하다. 박테리아는 혈액한천배지 상에서 알파-용혈성인 캡슐화된, 비-운동성인, 그램-양성의, 랜싯-형의 쌍구균으로 식별된다. 아형은 특정한 항혈청을 사용해 팽화 (Quelling) 반응을 기반으로 분화될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,847,112호를 참조한다.
존재하는 S. 뉴모니아 혈청형 각각을 나타내는 세포 은행은 머크 컬처 콜렉션 (Merck Culture Collection) (라흐웨이, 뉴저지주)에서 동결 바이알로 수득되었다. 해동된 종 배양은 S. 뉴모니아에게 적합한 사전-멸균된 증식 배지를 함유하는 종 발효기로 옮겨졌다. 배양물은 종 발효기 내에서 온도 및 pH를 조절하며 성장했다. 종 발효기의 총 부피가 사전-멸균된 증식 배지를 함유하는 제조 발효기로 옮겨졌다. 제조 발효는 공정의 최종 세포 성장 단계였다. 온도, pH, 및 교반 속도가 통제되었다.
발효 공정은 불활성화제의 첨가를 통해 종결되었다. 불활성화 후, 배치는 불활성 탱크로 옮겨졌고 통제된 온도 및 교반에서 유지되었다. 세포 파편 (cell debris)은 원심 분리 및 여과의 조합을 이용해 제거되었다. 배치는 한외 여과되고 투석 여과되었다. 배치는 다음으로 불순물을 제거하고 다당류를 회수하는 용매-기반 분별화를 한다.
실시예 2: 수용액 중 환원성 아미노화를 이용한 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F의 CRM197에 대한 접합
상이한 혈청형 다당류가 통상적인 공정 흐름을 이용해 정제된 CRM197 수송체 단백질에 개별적으로 접합되었다. 다당류는 용해되고, 소형화되고, 화학적으로 활성화되고 한외 여과에 의해 완충-교환되었다. 정제된 CRM197은 다음으로 반응 혼합물 중에서 NiCl2 (2 mM)을 활용해 활성화된 다당류에 접합되었고, 생성된 접합체는 최종 0.2-미크론 여과에 앞서 한외 여과에 의해 정제되었다. 각각의 단계 내의 몇몇 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도, 및 시간이 하기 섹션에 기술된 바와 같은 혈청형-특이적 값으로 통제된다.
다당류 소형화 및 활성화
정제된 폐렴 구균 협막 Ps 분말은 수중에 용해되고, 혈청형 19A를 제외한, 모든 혈청형은, 0.45-미크론 여과된다. 혈청형 19A를 제외한, 모든 혈청형은, Ps의 분자 질량을 줄이기 위해 균질화되었다. 혈청형 19A는 그의 상대적으로 낮은 출발 크기로 인해 소형화되지 않았다. 균질화 압력 및 균질화기를 통과하는 횟수는 혈청형-특이적 표적 (150 내지 1000 bar; 4 내지 7 회)으로 통제되어 혈청형-특이적 분자 질량을 달성한다. 소형화된 다당류는 0.2-미크론 여과되고 다음으로 농축되고 10 kDa NMWCO 접선 유동 한외 여과 막을 이용해 물에 대해 투석 여과된다.
다당류 용액은 다음으로 활성화 단계 중 Ps 소형화를 최소화하기 위해 혈청형-특이적 온도 (4 내지 22 ℃) 및 pH (4 내지 5)로 아세트산 나트륨 완충액을 이용해 조절되었다. 다당류 활성화는 과아이오딘산염 산화를 통해 수행되었다. 활성화 전, 혈청형 4의 경우, 배치는 대략 50 ℃ 및 pH 4.0에서 배양되어 Ps를 부분적으로 탈케탈화한다. Ps 활성화는 메타과아이오딘산 나트륨 용액의 첨가로 개시된다. 첨가된 메타과아이오딘산 나트륨의 양은 혈청형-특이적으로, 다당류 반복 단위의 몰 당 대략 0.1 내지 0.5 몰의 범위의 메타과아이오딘산 나트륨이다. 메타과아이오딘산 나트륨의 혈청형-특이적 전하는 Ps 활성화의 목표 수준을 달성하도록 선택된다 (Ps 반복 단위의 몰 당 알데하이드 몰 수).
혈청형 5 및 7F를 제외한 모든 혈청형에 대해, 활성화된 생성물은 10 kDa NMWCO 접선 유동 한외 여과 막을 이용해 pH 6.4의 10 mM 인산 칼륨에 대해 투석 여과되었다. 혈청형 5 및 7F는 pH 4 내지 5의, 10 mM 아세트산 나트륨에 대해 투석 여과되었다. 모든 혈청형에 대한 한외 여과는 2 내지 8 ℃에서 수행되었다.
CRM 197 에 대한 다당류 접합
산화된 다당류 용액이 물과 1.5 M 인산 칼륨과 혼합되고, 혈청형에 따라 pH 6.0 또는 pH 7.0에서 완충되었다. 완충액 pH는 접합 반응 중 활성화된 Ps의 안정성을 최적화하도록 선택되었다. 앞서 기술된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스의 발현을 통해 수득된, 정제된 CRM197은, 0.2-미크론 여과되고 다당류 대 CRM197 질량 비가 혈청형에 따라 0.4 내지 1.0 w/w 범위에서, 완충된 다당류 용액과 결합되었다. 질량비는 생성된 접합체 내의 다당류 대 CRM197 비를 통제하도록 선택되었다. 다당류 및 포스페이트 농도는 혈청형-특이적이며, 혈청형에 따라, 각각, 3.6 내지 10.0 g/L 및 100 내지 150 mM 범위이다. 혈청형-특이적 Ps 농도는 생성된 접합체의 크기를 조절하도록 선택되었다. 용액은 다음으로 0.2-미크론 여과되었다. 100 mM 염화 니켈 용액을 이용해 염화 니켈이 대략 2 mM로 첨가되었다. 시아노보로히드리드 나트륨 (다당류 반복 단위의 몰 당 2 몰)이 첨가되었다. Ps 및 단백질의 소모를 최대화하기 위해 접합은 혈청형-특이적 지속 시간 (72 내지 120 시간) 동안 진행되었다.
나트륨 보로히드리드로 환원
접합 반응에 이어, 배치는 대략 3.5 g/L의 Ps 농도로 희석되었고, 2 내지 8 ℃로 냉각되고, 1.2-미크론 여과되었다. 모든 혈청형 (혈청형 5 제외)는 2 내지 8 ℃에서 pH 7.0인 100 mM 인산 칼륨에 대해, 100 kDa NMWCO 접선 유동 한외 여과 막을 이용해 투석 여과된다. 보유액에서 회수된 배치는, 다음으로 대략 2.0 g Ps/L로 희석되었고 pH 9.4의 1.2 M 중탄산 나트륨의 첨가로 pH-조정되었다. 나트륨 보로히드리드 (다당류 반복 단위의 몰 당 1 몰)이 첨가되었다. pH 6.0의 1.5 M 인산 칼륨이 다음으로 첨가되었다. 혈청형 5는, 100 kDa NMWCO 접선 유동 한외 여과 막을 이용해 pH 9인 300 mM 중탄산 나트륨에 대해 투석 여과되었고 다음으로 pH-중성화되었다.
멸균 여과 및 생성물 저장
배치는 다음으로 농축되고, 300 kDa NMWCO 접선 유동 한외 여과 막을 이용해 4 ℃에서 pH 7.0인, 150 mM 염화 나트륨 중의 10 mM 히스티딘에 대해 투석 여과되었다. 보유액 배치는 0.2-미크론 여과되었다.
혈청형 19F는 대략 7 일 동안 22 ℃에서 배양되었고, 100 kDa NMWCO 접선 유동 한외 여과 막을 이용해 4 ℃에서 pH 7.0인, 150 mM 염화 나트륨 중의 10 mM 히스티딘에 대해 투석 여과되었고, 0.2-미크론 여과되었다.
배치는 추가적인 pH 7.0인 150 mM 염화 나트륨 중의 10 mM 히스티딘으로 1.0 g/L의 Ps 농도로 조절되었다. 배치는 분취액으로 분배되고 ≤-60 ℃에서 동결되었다.
실시예 3: 디메틸술폭시드 중의 환원성 아미노화를 이용한 혈청형 6A, 6B, 7F, 9V, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F의 CRM197에 대한 접합 방법
상이한 혈청형 다당류가 통상적인 공정 흐름을 이용해 정제된 CRM197 수송체 단백질에 개별적으로 접합되었다. 다당류는 용해되었고, 표적 분자 질량으로 크기가 조절되었고, 화학적으로 활성화되고 한외 여과에 의해 완충-교환되었다. 활성화된 다당류 및 정제된 CRM197는 개별적으로 동결 건조되고 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에 재용해되었다. 재용해된 다당류 및 CRM197 용액은 다음으로 하기 기술된 바와 같이 조합되고 접합되었다. 생성된 접합체는 최종 0.2-미크론 여과 전 한외 여과에 의해 정제되었다. 각 단계 내의 몇몇 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도, 및 시간이 하기 섹션에서 혈청형-특이적 값으로 통제되었다.
다당류 소형화 및 활성화
정제된 폐렴 구균 협막 Ps 분말이 수중에 용해되었고, 19A를 제외한 모든 혈청형이, 0.45-미크론 여과되었다. 혈청형 18C 및 19A를 제외한 모든 혈청형이, Ps의 분자 질량을 줄이기 위해 균질화되었다. 균질화 압력 및 균질화기를 통과하는 경로의 횟수는 혈청형-특이적 표적으로 통제되었다 (150 내지 1000 bar; 4 내지 7 회). 혈청형 18C는 ≥90 ℃에서 산 가수 분해에 의해 소형화되었다. 혈청형 19A는 소형화되지 않았다.
소형화된 다당류는 0.2-미크론 여과되었고 다음으로 농축되고 10 kDa NMWCO 접선 유동 한외 여과 막을 이용해 물에 대해 투석 여과되었다. 5 kDa NMWCO 막이 혈청형 18C를 위해 사용되었다.
다당류 용액은 다음으로 아세트산 나트륨 완충액으로 혈청형-특이적 온도 (4 내지 22 ℃) 및 pH (4 내지 5)로 조절되었다. 다당류 활성화는 과아이오딘산 산화를 통해 수행되었다. Ps 활성화는 나트륨 메타과아이오딘산 용액의 첨가로 개시되었다. 첨가된 나트륨 메타과아이오딘산의 양은 혈청형-특이적이며, 다당류 반복 단위의 몰 당 대략 0.1 내지 0.5 몰의 나트륨 메타과아이오딘산 범위이다.
모든 혈청형에 대해, 활성화된 생성물이 10 kDa NMWCO 접선 유동 한외 여과 막을 이용해 pH 6.4의 10 mM 인산 칼륨, 및 물에 대해 투석 여과되었다. 5 kDa NMWCO 막이 혈청형 18C에 대해 사용되었다. 모든 혈청형에 대한 한외 여과가 2 내지 8 ℃에서 수행되었다.
CRM 197 에 대한 다당류 접합
앞서 기술된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스의 발현을 통해 수득된, 정제된 CRM197은, 5 kDa NMWCO 접선 유동 한외 여과 막을 이용해 pH 7.0 완충액인 2 mM 포스페이트에 대해 투석 여과되었고, 0.2-미크론 여과되었다.
산화된 다당류 용액은 물과 수크로스와 함께 동결 건조를 위한 제제로 제형화되었다. 단백질 용액은 물, 포스페이트 완충액, 및 수크로스와 함께 동결 건조를 위한 제제로 제형화되었다. 동결 건조 후에 DMSO 내에서 최적의 재용해를 달성하기 위한 수크로스 농도는 1 내지 5 % 범위였다.
제형화된 Ps 및 CRM197 용액은 개별적으로 동결 건조되었다. 동결 건조된 Ps 및 CRM197 물질은 DMSO 중에 재용해되었고 티-믹서 (tee-mixer)를 이용해 조합되었다. 나트륨 시아노보로히드리드 (다당류 반복 단위 몰 당 1 몰)이 첨가되었고, 혈청형-특이적 지속 시간 (1 내지 48 시간) 동안 접합이 진행되어 목표 접합체 크기를 달성했다.
나트륨 보로히드리드로 환원
나트륨 보로히드리드 (다당류 반복 단위의 몰 당 2 몰)이 접합 반응 후에 첨가되었다. 배치는 대략 4 ℃에서 150 mM 염화 나트륨으로 희석되었다. 인산 칼륨 완충액이 다음으로 첨가되어 pH를 중성화했다. 배치는 농축되었고 30 kDa NMWCO 접선 유동 한외 여과 막을 이용해 대략 4 ℃에서 150 mM 염화 나트륨에 대해 투석 여과되었다.
최종 여과 및 생성물 저장
각각의 배치는 다음으로 농축되고, 300 kDa NMWCO 접선 유동 한외 여과 막을 이용해 4 ℃에서 pH 7.0인 150 mM 염화 나트륨 중의 10 mM 히스티딘에 대해 투석 여과되었다. 보유액 배치는 0.2-미크론 여과되었다.
혈청형 19F는 대략 5 일 동안 22 ℃에서 배양되었고, 300 kDa NMWCO 접선 유동 한외 여과 막을 이용해 대략 4 ℃에서 pH 7.0인, 150 mM 염화 나트륨 중의 10 mM 히스티딘에 대해 투석 여과되었고, 0.2-미크론 여과되었다.
배치는 추가적인 pH 7.0인 150 mM 염화 나트륨 중의 10 mM 히스티딘으로 희석되고 분취액으로 분배되고 ≤-60 ℃에서 동결되었다.
실시예 4: 개선된 접합체 안정성을 위한 혈청형 19F-CRM197 접합체의 공정-내 배양
루틴 공정 개발 중, 실시예 3에서 기술된 바와 같이, 배양 없이 제조된 (300 kDa 한외 여과 후, 최종 여과 및 생성물 저장에서의) 혈청형 19F-CRM197 접합체를 이용한 4 ℃에서의 완제품 (DP) 안정성 연구는 혈청형 19F 역가의 초기의 급속한 감소를 시간과 함께 나타냈다 (표 1, 접합체 로트 A). 대략 3 개월 동안의 초기 수준으로부터의 대략 20 %의 상대적인 역가 감소는 혈청형 19F 접합체가 불안정했다는 것을 밝혔다. 다른 혈청형에서는 그러한 경향이 관찰되지 않았다는 점을 유의한다. 상응하여, 동일한 혈청형 19F-CRM197 접합체를 이용한 원료 의약품 (DS) 안정성 연구는 자유 다당류 (Ps) 함량에서 초기의 급속한 증가 (도 1-2, 접합체 로트 A) 및 접합체 크기에서 감소 (표 2-3, 접합체 로트 A)를 나타내고, 이는 접합된 Ps 손실의 지표이다. 자유 Ps의 초기의 급속한 증가는 자유 Ps 함량의 평준화로 이어지며, 혈청형 19F 접합체 내의 불안정한 부위의 분포가 있음을 제시한다. 이러한 불안정한 부위는 통상적인 저장 조건 하에서 빠르게 분해되어 자유 Ps를 유리하고, 접합체 크기를 줄이고, 역가 손실을 야기한다. 결국은, 불안정한 부위가 감소했을 때, 시간에 따른 자유 Ps 및 역가 변화가 상당히 감소한다.
표 1: 총 다당류 ELISA 결과에 기반한, DP 제제 내의 4 ℃에서의 혈청형 19F 접합체 로트에 대한 상대적 역가
혈청형 19F 접합체 로트 B는, 와이드-포어 한외 여과 정제 및 DP 제형화에 앞서 22 ℃에서 10 mM 히스티딘, 150 mM 염화 나트륨, pH 7.0 중에서 대략 5 일 동안 배양되었다. 혈청형 19F 접합체 로트 A는 DP 제형화 전 그의 제조 중 배양되지 않았다.
표 2: 4 ℃에서 접합체 크기 변화에 의해 측정된 혈청형 19F 접합체 안정성. pH 7.0 및 4 ℃에서 혈청형 19F-CRM197 접합체 로트 A 및 B에 대한 시간의 함수로서의 접합체 크기 변화. 혈청형 19F 접합체 로트 A 및 B는 표 1에 기술되어 있다. 접합체 크기 (Mw)는 UV 흡수, 다각 광 산란, 및 굴절률 검출과 함께 고 성능 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되었다 (HPSEC UV-MALS-RI).
표 3: 25 ℃에서 접합체 크기 변화에 의해 측정된 혈청형 19F 접합체 안정성. pH 5.8 및 25 ℃에서 3 개의 혈청형 19F-CRM197 접합체 로트에 대한 시간의 함수로서의 접합체 크기 변화. 혈청형 19F 접합체 로트 A 및 B는 표 1에 기술되어 있다; 혈청형 19F 접합체 로트 C는 도 2에 기술되어 있다. 접합체 크기 (Mw)는 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 측정되었다.
도 1-2 및 표 1-2에 나타난 혈청형 19F 로트 A에 대한 결과에 기반해, 공정-내 배양 단계가 개발되었고 DS 제작 공정 내에 도입되어 혈청형 19F 접합체의 안정성을 개선했다. 공정-내 배양 단계에 이어, 접합체는 와이드-포어 한외 여과 단계를 이용해 정제되어 배양으로부터 비롯된 자유 Ps 및 저분자량 접합체를 제거했다. 공정-내 배양 단계는 나트륨 보로히드리드로 환원한 후 수행되었고 그렇지않으면 DS 또는 DP에서 시간이 지남에 따라 발달할 수 있는 자유 Ps의 유리 및 제거를 가능케했다. 상기 기술된 바와 같이, 도 1-2 및 표 1-2 내의 혈청형 19F 접합체 로트 B 및 C는 그들의 제조 중 pH 7.0에서 대략 5 일 동안 22 ℃에서 150 mM 염화 나트륨 중에서 10 mM 히스티딘 (로트 B) 또는 25 mM 인산 칼륨 (로트 C)와 함께 배양되었다. 로트 A 대 로트 B 또는 C에 대한 안정성 결과의 비교는 공정-내 배양이 혈청형 19F 접합체의 안정성을 상당히 개선했다는 것을 보여준다.
접합체 로트 B 및 C의 공정-내 배양 중의 실제 자유 Ps 프로파일은 도 3에서 나타난다. 결과는 배양 중 자유 Ps 함량이 즉시 증가되기 시작했고 그 후 대략 5 일 근처에서 안정 상태가 유지되었다는 것을 나타낸다.
배양 단계의 부재 하에서, 원료 의약품 내에서 및/또는 완제품 내에서 자유 Ps는 비슷한 속도로 생성될 것이라 예상되어 백신 내 증가된 자유 Ps 함량으로 이어진다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 혈청형 19F를 포함하는 다가 폐렴 구균 접합체 백신은 쥐, 토끼, 비-인간 영장류 및 인간에서 면역원성인 것으로 발견되었다 (데이터 나타나지 않음).

Claims (18)

  1. a) 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae, 폐렴 연쇄상구균) 혈청형 19F 다당류가 CRM197 수송체 단백질에 공유 연결되는 접합 반응을 수행하며, 여기서 접합 반응은 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19F 다당류-CRM197 수송체 단백질 접합체 및 자유 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19F 다당류를 포함하는 반응 혼합물을 생성하는 것인 단계;
    b) 상기 혼합물을 5 내지 7일 동안, 20 내지 25 ℃ 범위 온도에서, 6.5 내지 7.5의 범위 내의 pH를 갖는 완충액 중에서 배양하는 단계; 및
    c) 자유 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19F 다당류의 제거를 가능케 하는 조건 하에서 크기 분리를 수행하는 단계
    를 포함하는, CRM197 수송체 단백질에 공유 결합으로 연결된 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae, 폐렴 연쇄상구균) 혈청형 19F 협막 다당류를 포함하는 안정한 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19F 다당류-CRM197 수송체 단백질 접합체의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 크기 분리는 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19F 다당류-CRM197 수송체 단백질 접합체가 보유액에 남도록 하는 100 내지 500 kDa의 공칭 분자량 컷 오프 막을 이용하는 것인 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    d) 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19F 다당류-CRM197 수송체 단백질 접합체를 수집하는 단계
    를 추가로 포함하는 제조 방법.
  4. 제2항에 있어서, 보유된 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19F 다당류-CRM197 수송체 단백질 접합체가 600 kDa 이상의 평균 분자량을 갖는 것인 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19F 다당류-CRM197 수송체 단백질 접합체가 1000 kDa 이상의 평균 분자량을 갖는 것인 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 완충액이 포스페이트 완충액, 히스티딘, 및 TRIS로부터 선택되는 것인 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 크기 분리가 크기-배제 크로마토그래피, 결합/용출 크로마토그래피, 또는 와이드-포어 한외 여과에 의한 것인 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 크기 분리가 100 kDa 내지 300 kDa의 MWCO를 갖는 막을 사용한 와이드-포어 한외 여과에 의한 것인 제조 방법.
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