KR102610292B1 - 스트랩토코커스 뉴모니애 다당류와 운반체 단백질의 접합체 제조 방법 - Google Patents

스트랩토코커스 뉴모니애 다당류와 운반체 단백질의 접합체 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시는 스트랩토코커스 뉴모니애 협막 다당류와 운반체 단백질의 접합체 제조에 있어, 잔류 시아나이드(cyanide)를 효율적이고, 간단하게 줄일 수 있는 방법을 제공한다.

Description

스트랩토코커스 뉴모니애 다당류와 운반체 단백질의 접합체 제조 방법{A method of preparing a conjugate of Streptococcus pneumoniae polysaccharide and carrier protein}
본 개시는 스트렙토코커스 뉴모니애의 다당류에 운반체 단백질을 접합시키는 공정에 관한 것이다. 특히, 시안화수소화붕소나트륨(NaBH3CN)을 이용하는 접합 공정 후 독성 잔류물인 시아나이드(cyanide)를 제거 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다.
스트랩토코커스 뉴모니애 협막 다당류는 박테리아를 중화할 수 있는 옵소닌 포식 세포 항체를 유도하기 때문에 수년간 백신에 사용되어 왔다. 그러나 이러한 다당류는 T-independent 항원이며 결과적으로 영아와 노인에서 면역원성이 약하다. 이러한 문제를 해소하기 위해 다당류와 운반체 단백질의 접합체 백신이 이용되고 있다. 다당류와 운반체 단백질의 공유 결합은 T-independent 항원을 T-dependent 항원으로 전환하여 기억 반응을 향상시키고 이러한 환자 집단에서 보호 면역을 발달시킬 수 있다.
스트랩토코커스 뉴모니애 협막 다당류와 운반체 단백질의 접합체는 통상적으로 (i) 정제된 다당류를 산화제와 반응시켜 활성화된 다당류를 생성시키고; (ii) (임의적으로 동결 건조된) 활성화 다당류와 운반체 단백질을 디메틸설폭사이드(DMSO), DMF 등의 유기용매 또는 인산 완충액 등의 수성용매에 (재)현탁시키고; (iii) 혼합된 활성화된 다당류와 운반체 단백질을 적당한 환원제와 반응시켜 다당류:운반체 단백질 접합체를 생성시키고; (iv) 다당류:운반체 단백질 접합체 중의 미반응된 알데히드를 캡핑(capping)시켜 접합 반응을 종결시키고; (v) 다당류:운반체 단백질 접합체를 정제하는 방법으로 제조된다. 이러한 접합 공정을 통해 다당류의 많은 유리 하이드록실기와 운반체 단백질의 많은 아미노기 사이에서 임의적인 교차결합이 일어나게 되며, 복수의 다당류와 단백질을 포함하는 격자 구조(lattice)를 형성하게 된다.
상기 환원제를 이용하는 reductive amination 접합 과정에서 Schiff's base를 환원시키기 위해 환원제를 사용하는데, Schiff base의 이민(imine)만 환원시키기 위하여 주로 약한 환원제인 sodium cyanoborohydride(시안화수소화붕소나트륨(NaBH3CN))를 사용한다. 그러나, 이러한 sodium cyanoborohydride를 이용 시 접합체 결과물 내에, 특히 대량 생산 과정에서 cyanide가 잔류하는 문제가 있으며, 이러한 시아나이드 물질은 독성이 매우 강하여 여러 문제를 야기할 수 있다.
따라서, 접합 공정 후 또는 접합 과정에서 시아나이드 화합물을 효과적으로 줄일 수 있는 방법이 필요하다.
한국등록특허 10-0947757
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 독성이 높은 시아나이드 잔류 함량을 줄일 수 있는 접합체 백신의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 개시는 스트랩토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 협막 다당류와 운반체 단백질을 시안화수소화붕소나트륨(NaBH3CN)을 이용하여 접합(conjugation)시킨 후 여과하는 방법으로 정제하는 과정에 있어서, 여과에 이용되는 완충액의 pH가 7.5-10인 것을 특징으로 하는 잔류 시아나이드(cyanide)를 제거 또는 감소시키는 방법을 제공한다. 이때, 여과는 크기 차이를 이용한 여과 방법, 소수성을 이용한 여과 방법, 입자의 전기적 성질을 이용한 여과 방법 등이 있으며, 특히 본 개시는 크기 차이를 이용한 여과에 유용하다.
본 개시의 바람직한 일 양태에 있어, 상기 여과에 이용되는 완충액의 pH는 8-10이다. 본 개시의 더 바람직한 일 양태에 있어, 상기 여과에 사용되는 완충액의 pH는 8.1-10, 8.2-10, 8.3-10, 8.4-10, 8.5-`10, 8.6-10, 8.7-10, 8.8-10, 8.9-10, 9-10, 9.1-10, 9.2-10, 9.3-10일 수 있다.
본 발명자들은 접합 공정 후 크기 차이에 의한 방법으로 완충액 교환 시 완충액의 pH가 특정 범위이면 범위 밖의 pH buffer 또는 saline을 사용하는 것에 비해 최종 접합체 결과물 내의 잔류 cyanide가 효과적으로 제거됨을 확인하여 본 발명의 일 측면을 완성하였다.
본 발명자들은 잔류 시아나이드의 수준(level)을 감소시키기 위하여 여러 첨가제들(예를 들어, 시아나이드와 complex를 형성하는 물질)을 추가하는 방법을 시도하였으나, 그 효과가 만족할 만한 수준이 아니었으며, 더욱이 첨가물들이 다시 불순물이 되는 문제가 있었다. 또한, 여과 과정에서 filtration membrane을 변경하거나 접합 반응시 완충액의 pH를 변경하는 등 다른 시도도 하였으나, 생성된 접합체의 최종 물성에 예상치 못한 영향을 미쳐 실질적으로 이용이 어렵거나 실제 대량 생산에 이용하기에 어려움이 많았다. 이에 반해 본 개시의 방법은 여과에 이미 사용되는 완충액의 pH를 조절하는 방법으로 생성된 접합체의 면역원성에 부정적인 영향이 없이 간편하게 목적을 달성할 수 있었다.
일반적으로, 스트랩토코커스 뉴모니애 다당류와 운반체 단백질의 접합 공정을 주로 DMSO, DMF와 같은 유기용매에서 수행하고 있다. 이러한 유기용매 공정의 이용 시 잔류 시아나이드의 함량이 매우 낮을 뿐만 아니라 스트랩토코커스 뉴모니애 다당류의 면역원성에 영향을 미치는 O-acetate 함량도 잘 보존된다는 장점이 있다.
그러나, 이러한 유기용매 이용 과정은 공정 후 유기용매를 제거해야 하는 다른 불편함을 초래할 뿐만 아니라, 유기용매의 사용으로 인해 항원 물질인 다당류 및 운반체 단백질의 구조에 예기치 못한 변형을 가져올 우려가 있다.
따라서, 본 발명자들은 접합 과정에서 가능한 수성 용매 (예를 들어, 인산 나트륨 용액)를 이용하고자 하였으나, 이러한 수성 용매 하의 접합 공정 후에는 잔류 시아나이드 함량이 높아진다는 예기치 못한 문제가 발생함을 확인하였으며, 더 나아가 이러한 문제점을 본 개시의 방법을 통해 해결하였다.
접합 과정에 있어 단백질 등의 입체 구조에 영향을 미치는 DMSO 등의 유기용매를 사용하는 경우보다 수성용매를 사용하는 경우 잔류 시아나이드 수준이 변경되는 것으로 보아, 본 개시에 따른 특정 범위의 pH는 반응에 참여한 물질들의 전하에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 접합체를 구성하는 협막 다당류 및 운반체 단백질의 입체 구조에도 영향을 미쳐 접합체에 흡착된 잔류 시아나이드가 분리되고, 결과적으로 여과 등의 과정에서 제거되는 것으로 추측되나, 본 발명은 이러한 이론적 추측에 한정되는 것은 아니다.
따라서, 본 개시의 바람직한 일 양태는 스트랩토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 협막 다당류와 운반체 단백질을 시안화수소화붕소나트륨(NaBH3CN)을 이용하여 수성용매 하에서 접합(conjugation)시킨 후 크기 차이를 이용하여 여과하는 방법으로 정제하는 과정에 있어서, 여과에 이용되는 완충액의 pH가 7.5-10인 것을 특징으로 하는 잔류 시아나이드(cyanide)를 제거 또는 감소시키는 제조 방법을 제공한다. 이러한 방법에 있어, 상기 여과에 이용되는 완충액의 pH는 8-10이 바람직하며, pH는 8.1-10, 8.2-10, 8.3-10, 8.4-10, 8.5-`10, 8.6-10, 8.7-10, 8.8-10, 8.9-10, 9-10, 9.1-10, 9.2-10, 9.3-10일 수 있다.
즉, 본 개시의 방법은 유기용매 또는 수성용매를 포함하는 다양한 접합 공정 후 잔류 시아나이드의 제거에 유용하며, 특히 접합 공정이 유기용매인 DMSO(다이메틸설폭사이드), DMF(다이메틸포름아미드) 등을 포함하지 않은 수성용매 하에서 이루어질 경우 더욱 더 유용하다.
본 개시의 바람직한 일 양태에서, 상기 접합 공정이 이루어지는 수성용매는 인산 나트륨 수용액, 인산 칼륨 수용액, PBS (phosphate buffer saline), MES (2-morpholinoethanesulfonic acid) 용액, HEPES (Hydroxyethyl Piperazine Ethane Sulfonicacid) 용액, Bis-tris, ADA (N-(2-acetamido)iminodiacetic acid) 용액, PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) 용액, MOPSO (2-Hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid) 용액, BES (bis(2-hydroxyethyl)amine) 용액, MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) 용액, DIPSO (3-(N,N-Bis[2-hydroxyethyl]amino)-2-hydroxypropanesulfonic acid) 용액, MOBS (4-(N-Morpholino)butanesulfonic acid) 용액, HEPPSO (N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-hydroxypropanesulphonic acid) 용액, POPSO (Piperazine-N,N'-bis(2-hydroxypropanesulfonic acid)) 용액, TEA (Tris acetate-EDTA) 용액, EPPS (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-propanesulfonic acid) 용액, Bicine 용액, HEPB 용액 등이 있을 수 있으며, 특히 접합 공정이 일어나는 수성용매는 인산 나트륨 완충액이 바람직하다.
본 개시에 따른 상기 방법에 있어, 여과 공정에 적용되는 완충액으로는 인산 나트륨, MES, Bis-Tris, ADA, ACES, PIPES, MOPSO, Bis-Tris Propane, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, MOBS, TAPSO, Tris, Trizma®, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, Tricine, Gly-Gly, Bicine, HEPBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, CHES, CAPSO, AMP, CAPS, CABS, Hydrochloric acid/Potassium chloride, Glycine/Hydrochloric acid, Potassium hydrogen phthalate/Hydrochloric acid, Citric acid/Sodium citrate, Sodium acetate/Acetic acid, Potassium hydrogen phthalate/Sodium hydroxide, Disodium hydrogen phthalate/Sodium dihydrogen orthophosphate, Dipotassium hydrogen phthalate/Potassium dihydrogen orthophosphate, Potassium dihydrogen orthophosphate/sodium hydroxide, Barbitone sodium/Hydrochloric acid, Tris (hydroxylmethyl) aminomethane/Hydrochloric acid, Sodium tetraborate/Hydrochloric acid, Glycine/Sodium hydroxide, Sodium carbonate/Sodium hydrogen carbonate, Sodium tetraborate/Sodium hydroxide, Sodium bicarbonate/Sodium hydroxide, Sodium hydrogen orthophosphate/Sodium hydroxide, Potassium chloride/Sodium hydroxide 등으로 제조된 완충액이 사용될 수 있으며, 잔류 시아나이드 제거 효과, 면역원성 유지, 안전성 등 다양한 측면을 고려하여 적절한 완충액을 선별하여 적용할 수 있다.
본 개시의 일 양태에 있어, 바람직하게, 스트랩토코커스 뉴모니애는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 7C, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19F, 19A, 22F, 23F, 23 A, 23B, 24F, 24B, 31, 33F, 33B, 34, 35F, 35B, 38, 20A 또는 20B의 스트랩토코커스 뉴모니애일 수 있으며, 이 외에도 접합체로 제조하기 위한 어떤 혈청형도 될 수 있다.
일반적으로 접합공정에서는 유기용매와 수성용매를 모두 사용할 수는 있으나, 일부 혈청형의 경우 유기용매에서 접합 공정을 실행할 때 앞서 기재한 바와 같이 다당류 및 단백질 구조에 변형이 나타나 면역원성, 안정성 또는 접합 수율이 감소하거나 바람직하지 않은 접합체 특성을 나타낼 수 있으며, 이로 인하여 수성 용매에서 접합 공정을 실행하는 것이 선호된다. 그러나, 수성 용매에서 접합 공정을 실행시, 잔류 시아나이드의 농도가 높아져 인체에 투여할 때 안전성이 문제될 수 있다. 따라서, 본 개시의 방법은 수성 용매에서 접합 공정을 실행해야 하는 혈청형의 접합체 백신 제조에 특히 유용하다.
상기 수성용매에서 접합 공정을 실행할 수 있는 혈청형은 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 7C, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19F, 19A, 22F, 23F, 23 A, 23B, 24F, 24B, 31, 33F, 33B, 34, 35F, 35B, 38, 20A 및 20B 일 수 있으며, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9N, 9V, 10A, 14, 15A, 15C, 15B, 18C, 22F, 23A, 23B, 24F, 33F, 또는 35B일 수 있고, 더욱 바람직하게는 10A, 15B, 22F, 33F, 8, 4, 9N, 9V일 수 있다.
또, 본 발명자들은 여과에 이용되는 완충액의 volume이 시료 volume의 10배 이상, 바람직하게는 20배 이상, 더욱 바람직하게는 30배 이상 교환될 때 cyanide 농도가 급격히 감소되는 것을 확인하여 본 발명의 일 측면을 완성하였다.
따라서 본 개시의 다른 양태는 스트랩토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 협막 다당류와 운반체 단백질을 시안화수소화붕소나트륨(NaBH3CN)을 이용하여 접합(conjugation)시킨 후 (바람직하게는 수성용매 하에서 접합시킨 후) 크기 차이를 이용하여 여과하는 방법으로 정제하는 과정에 있어서, 여과에 이용되는 완충액의 pH가 7.5-10이고, 여과에 이용되는 완충액의 부피가 시료 부피의 10배 이상, 바람직하게는 20배 이상, 더욱 바람직하게는 30배 이상인 제조 방법을 제공한다.
본 개시의 다른 양태에 있어, 상기 여과에 이용되는 완충액의 부피는 여과될 시료 부피의 20-50배, 바람직하게는 30-50배이다. 이러한 여과 완충액의 총 부피는 한꺼번에 이용될 수도 있으며, 횟수를 나누어 순차적으로 이용될 수도 있다.
본 개시의 제조 방법에 있어, 상기 운반체 단백질로는 본 발명이 속한 분야에 잘 알려진 스트랩토코커스 뉴모니애 접합 백신 운반체 단백질인 DT (diphtheria toxoid), TT (tetanus toxoid), PD (Haemophilus influenzae protein D), 및 이들의 면역학적 기능 등가물로 이루어진 군으로부터 선택된 운반체 단백질이 이용될 수 있으며, 이들 이외에도 다양한 운반체 단백질이 이용될 수 있다.
특히, 본 개시의 제조 방법에 이용되는 운반체 단백질은 DT의 비독성 변이체인 CRM197 (Cross Reacting Material 197) 또는 TT이며, 본 개시의 제조 공정은 본 개시의 특정 혈청형들과 CRM197 운반체 단백질의 접합체에서 잔류 시아나이드 제거에 특히 더 유용하다.
본 개시에 있어, 상기 여과 공정은 diafiltration을 포함하는 한외여과, size exclusion chromatography, dialysis 방법 등일 수 있다. 본 개시의 바람직한 일 양태에 있어, 상기 제조 방법의 여과는 diafiltration을 이용해 수행된다.
스트랩토코커스 뉴모니애 다당류와 운반체 단백질의 접합체 제조는 본 발명이 속한 분야에 잘 알려져 있다. 즉, 앞서 언급된, 본 개시의 특징적인 제조 공정, 원료 물질 등 이외에 사항들은 공지의 방법, 물질 등을 이용할 수 있다.
예를 들어, 정제된 스트랩토코커스 뉴모니애 다당류는 화학적으로 활성화되어 담체 단백질과 반응할 수 있는 기능을 도입할 수 있다. 간단하게, 스트랩토코커스 뉴모니애 다당류는 나트륨 퍼아이오데이트(sodium periodate), 칼륨 퍼아이오데이트, 또는 과요오드산 등과 같은 과요오드산염류의 산화제로 반응시켜 수산기의 산화적 절단을 야기하고 이를 통해 반응성 알데히드 기를 형성한다. 이렇게 활성화된 다당류와 운반체 단백질은 접합 전에 각각 동결건조한 후 혼합할 수도 있고, 혼합한 후에 함께 동결건조할 수도 있다.
활성화된 다당류와 운반체 단백질은 디메틸설폭사이드(DMSO), DMF 등의 유기용매 또는 인산 완충액 등의 수성용매 하에서 시안화수소화붕소나트륨(NaBH3CN)를 이용하여 접합체를 형성한다.
다당류 상의 반응하지 않은 알데히드는 나트륨 보로하이드라이드(borohydride)와 같은 강력한 환원제의 첨가로 선택적으로 환원된다. 일반적으로 강력한 환원제를 사용하는 것이 바람직하다. 그러나 일부 다당류의 경우에는 이러한 단계가 덜 바람직하다. 예를 들어, S. pneumoniae 혈청 형 5는 강한 환원제와 쉽게 반응할 수 있는 케톤기를 포함하며, 이 경우, 다당류의 항원 구조를 보호하기 위해 환원 단계를 생략하는 것이 바람직할 수 있다. 강한 환원제는 나트륨 보로하이드라이드와 같은 보로하이드라이드염이다.
접합체 생성 및 선택적인 미반응 알데히드의 캡핑 공정 후 다당류-단백질 접합체는 크기(size) 차이에 의한 방법으로 완충액을 교환하여 정제된다. 이 과정을 통하여 과량의 접합반응 시약들 및 결합되지 않은 유리 단백질과 다당류가 제거된다. 본 개시의 방법에 있어 바람직하게 정제 공정은 diafiltration을 통해 이루어진다.
이외에 스트랩토코커스 뉴모니애 협막 다당류와 운반체 단백질의 접합체의 제조 방법은 예를 들어, 통상의 기술자에게 가능한 공지된 방법으로 자유롭게 이루어질 수 있다.
상기 과제의 일 측면을 해결하기 위하여, 본 개시는 스트랩토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 협막 다당류와 운반체 단백질을 시안화수소화붕소나트륨(NaBH3CN)을 이용하여 접합(conjugation)시킨 후 크기 차이를 이용하여 여과하는 방법으로 정제하는 과정에 있어서, 여과에 이용되는 완충액의 pH가 7.5-10인 것을 특징으로 하는 스트랩토코커스 뉴모니애 협막 다당류 및 운반체 단백질의 접합체 제조시 잔류 시아나이드를 제거 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
상기 다당류, 운반체 단백질, 접합 공정, 여과 공정, 완충액, 완충액의 pH 등에 관한 사항은 전술한 바와 같다.
상기 과제의 일 측면을 해결하기 위하여, 본 개시는 상기 제조 방법으로 제조된 것인, 스트랩토코커스 뉴모니애 협막 다당류 및 운반체 단백질의 접합체를 제공한다.
상기 다당류, 운반체 단백질, 접합체 등에 관한 사항은 전술한 바와 같다.
본 발명은 스트랩토코커스 뉴모니애 협막 다당류와 운반체 단백질의 접합체 제조에 있어, 잔류 시아나이드를 효율적이고, 간단하게 줄일 수 있는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
제조예
1. 다당류의 활성화 공정
스트랩토코커스 뉴모니애 배양과 협막 다당류의 정제는 당업자에게 공지된 방법에 의해서 수행하였다. 정제된 협막 다당류를 산화제와 반응시켜 활성화하였다. 활성화된 협막 다당류와 CRM197을 1: 1 내지 1.5의 질량비로 배합한 후에 동결 건조했다.
2. 접합물 제조 공정
제조예 1에서 동결건조된 활성화된 다당류와 운반체 단백질을 함유하는 병을 -20 내지 -30 ℃에서 보관하였다.
동결건조된 활성화된 다당류와 운반체 단백질을 0.1M 인산나트륨 용액 (pH 7.2±0.1) 중에서 재조성하였다. 반응 용액 중의 최종 다당류 농도는 약 15.0 g/L이다. 1.2 몰당량의 시안화수소화붕소나트륨(NaBH3CN)를 반응 혼합물에 가하여 접합 반응을 개시시키고, 37 ℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 그 후 접합 반응액과 동일한 부피의 0.9% 염화나트륨 용액과 2.0 몰당량의 수소화붕소나트륨(NaBH4)를 첨가하여 반응하지 않은 알데히드를 캡핑시켜 접합 반응이 종료되었다. 상기 캡핑 반응은 23 ℃에서 4.5시간 동안 수행되었다.
접합물 제조 공정이 완료된 접합물에 하기 실시예와 같은 다양한 조건에서 여과 공정을 수행하였다.
실시예
실시예 1. 여과 공정의 완충액 pH에 따른 잔류 cyanide 농도 차이
상기 제조예의 접합물을 diafiltration을 이용하여 정제하고 최종적으로 0.22㎛ 필터로 여과하였다. diafiltration 시 사용된 완충액의 종류는 대조군인 생리식염수 Saline 0.9%과 실험군인 0.1M sodium phosphate buffer(pH 8.0)이었다. pH, 온도, 농도 및 시간 등의 공정 파라미터는 하기에 기재된 바와 같았다. 잔류 시아나이드 농도는 하기와 같은 방법으로 측정되었다.
여과 공정이 완료된 다양한 혈청형의 접합물에서 780㎕의 시료를 각각 채취하고, 이에 인산용액 80㎕를 첨가하고 혼합한다. 그 후 클로라민 T 시액 40㎕를 첨가하고 흰색 층이 사라질 때까지 혼합한다. 피리딘/바르비탈산 시액 100㎕를 첨가하고 혼합한다. 각각의 시료를 차광하여 5분간 정치한다. 3차 증류수를 reference로 하여 파장 578nm에서 흡광도를 측정한다. 시료의 흡광도를 추세식에 대입하여 잔류 시아나이드 농도를 구한다.
완충액 종류별 접합물 최종 산물에서의 잔류 시아나이드(Cyanide) 농도를 하기 표 1에 나타내었다.
접합체 혈청형 diafiltration 완충액
0.9% Saline (pg/μg*)
(대략 pH 5.5-6.0)		 0.1M Sodium phosphate pH 8.0
(pg/μg*)
10A 165 38
15B 159 62
22F 121 65
33F 200 71
8 48 37
4 92 60
9N 164 104
9V 76 56
*pg/μg: picogram of Cyanide per microgram of polysaccharide
상기 표 1에 나타나는 바와 같이, diafiltration 시 사용되는 완충액으로 saline 대신 pH 8.0의 인산나트륨 완충액을 사용 시 잔류 시아나이드 농도를 획기적으로 줄일 수 있었다.
실시예 2. 완충액의 pH에 따른 잔류 cyanide 함량의 감소
상기 제조예의 접합물을 한외여과 필터로 농축 및 투석여과하였다. 하기 표 2와 같이 종류와 pH가 상이한 완충액들을 사용하였다. 잔류 Cyanide 농도를 하기 표 2에 종합하여 나타내었다.
접합체 혈청형 교환 완충액 잔류 Cyanide (pg/μg)
33F 5mM succinate / 0.9% NaCl pH 6.0 156
0.1M Sodium phosphate pH 6.0 121
0.1M Sodium phosphate pH 7.2 50
0.1M Sodium phosphate pH 8.0 25
0.1M Sodium phosphate pH 8.4 20
0.1M Sodium phosphate pH 9.2 18
0.1M Sodium phosphate pH 10 21
0.1M Sodium phosphate pH 11 27
0.1M Sodium carbonate pH 9.2 23
상기 표 2에 나타나는 바와 같이, 교환 완충액의 pH가 7 이상일때 잔류 시아나이드의 농도가 낮아졌고, 8 이상일 때 훨씬 낮았다. pH가 10을 초과할 때는 잔류 시아나이드는 농도는 충분히 낮지만 과도하게 높은 수소이온농도로 인하여 접합물의 안전성이 저하되었다
실시예 3. 교환 완충액의 적정 volume
접합물을 한외여과 필터로 농축 및 투석여과 하였다. 교환 완충액의 사용 volume에 따른 잔류 cyanide 농도를 확인하기 위해 표 3과 같이 0.1M sodium phosphate buffer(pH 8.0)를 이용하여 diafiltration을 실시하였다.
교환 완충액 사용 volume 증가에 따라 감소하는 잔류 Cyanide 함량 (pg/μg) pattern을 하기 표 3에 종합하여 나타내었다.
접합체 혈청형 한외여과 횟수 교환 완충액 volume (시료 volume 대비)
10배 20배 30배
8 1차 150 103 93
2차 (1차 30X sample) 26 27 21
10A 1차 230 71 33
2차 (1차 30X sample) 24 25 23
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 교환 완충액의 사용 volume이 증가할수록 잔류 cyanide 함량이 감소하였다. 예를 들어, 여과에 이용되는 완충액의 부피가 시료 부피의 10배 이상, 바람직하게는 20배 이상, 더욱 바람직하게는 30배 이상일 경우 바람직하였다.
1차 diafiltration 공정에서 30배 완충액 volume을 교환한 시료를 이용하여 2차 diafiltration 공정을 진행하였다. 충분한 양의 부피인 30배 완충액 부피로 diafiltration이 진행된 후에는 2차 공정에서는 volume에 무관하게 농도가 변하지 않았다. 1차 공정에서 적절한 pH의 완충액과 volume으로 충분히 여과하여, 잔류 시아나이드 함량이 이미 최대한 낮아졌기 때문이다.

Claims (11)

  1. 스트랩토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 협막 다당류와 운반체 단백질을 시안화수소화붕소나트륨(NaBH3CN)을 이용하여 접합(conjugation)시킨 후 크기 차이를 이용하여 여과하는 방법으로 정제하는 과정에 있어서,
    상기 스트랩토코커스 뉴모니애는 혈청형 10A, 15B, 22F, 33F, 8, 4, 9N, 및, 9V로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이고,
    운반체 단백질은 CRM197 또는 TT이며,
    여과에 이용되는 완충액의 pH가 8-10인 것을 특징으로 하는 스트랩토코커스 뉴모니애 협막 다당류 및 운반체 단백질의 접합체 제조시 잔류 시아나이드(cyanide)를 제거 또는 감소시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 여과에 이용되는 완충액의 부피는 여과될 시료 부피의 10 내지 50배인, 스트랩토코커스 뉴모니애 협막 다당류 및 운반체 단백질의 접합 체 제조시 잔류 시아나이드(cyanide)를 제거 또는 감소시키는 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 방법에 이용되는 완충액은 인산 나트륨 완충액인, 스트랩토코커스 뉴모니애 협막 다당류 및 운반체 단백질의 접합체 제조시 잔류 시아나이드(cyanide)를 제거 또는 감소시키는 방법.
  7. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 방법의 접합 반응은 유기용매를 이용하지 않는 수성용매에서 이루어지는, 스트랩토코커스 뉴모니애 협막 다당류 및 운반체 단백질의 접합체 제조시 잔류 시아나이드(cyanide)를 제거 또는 감소시키는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 수성용매는 인산 나트륨 완충액인 스트랩토코커스 뉴모니애 협막 다당류 및 운반체 단백질의 접합체 제조시 잔류 시아나이드(cyanide)를 제거 또는 감소시키는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 유기용매는 DMSO(디메틸설폭사이드) 또는 DMF(다이메틸포름아미드)인, 스트랩토코커스 뉴모니애 협막 다당류 및 운반체 단백질의 접합체 제조시 잔류 시아나이드(cyanide)를 제거 또는 감소시키는 방법.
  10. 삭제
  11. 스트랩토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 협막 다당류와 운반체 단백질을 시안화수소화붕소나트륨(NaBH3CN)을 이용하여 접합(conjugation)하는 다당류-단백질 접합체의 제조 방법에 있어서,
    상기 스트랩토코커스 뉴모니애는 혈청형 10A, 15B, 22F, 33F, 8, 4, 9N, 및, 9V로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이고,
    운반체 단백질은 CRM197 또는 TT이며,
    접합반응 후 크기 차이를 이용하여 여과하는 방법으로 정제하는 단계를 포함하고, 이 때 여과에 이용되는 완충액의 pH가 8-10인 것을 특징으로 하는, 잔류 시아나이드를 제거 또는 감소시키는 다당류-단백질 접합체의 제조 방법.
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