RU2758090C2 - Новые конъюгаты полисахарида с белком и способ их получения - Google Patents

Новые конъюгаты полисахарида с белком и способ их получения Download PDF

Info

Publication number
RU2758090C2
RU2758090C2 RU2018135066A RU2018135066A RU2758090C2 RU 2758090 C2 RU2758090 C2 RU 2758090C2 RU 2018135066 A RU2018135066 A RU 2018135066A RU 2018135066 A RU2018135066 A RU 2018135066A RU 2758090 C2 RU2758090 C2 RU 2758090C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
polysaccharide
conjugate
protein
activated
specified
Prior art date
Application number
RU2018135066A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2018135066A3 (ru
RU2018135066A (ru
Inventor
Ракеш РАНА
Джунед ДАЛАЛ
Манодж Кумар ЧХИКАРА
Девиндер Джилл
Original Assignee
Мсд Уэлком Траст Хиллеман Лабораторис Пвт. Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Мсд Уэлком Траст Хиллеман Лабораторис Пвт. Лтд. filed Critical Мсд Уэлком Траст Хиллеман Лабораторис Пвт. Лтд.
Publication of RU2018135066A publication Critical patent/RU2018135066A/ru
Publication of RU2018135066A3 publication Critical patent/RU2018135066A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2758090C2 publication Critical patent/RU2758090C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая конъюгат полисахарида с белком с высокой иммуногенностью, где указанный конъюгат является стабильным и его можно использовать в качестве кандидата вакцины, и способ получения вышеуказанного конъюгата. В одном из вариантов реализации конъюгат содержит полисахарид, полученный из грамотрицательных бактерий, где грамотрицательной бактерией является Neisseria meningitidis (Men), белок-носитель, выбранный из TT (столбнячный анатоксин), DT (дифтерийный анатоксин), CRM197 (нетоксический мутант DT) или OMPV (везикулы из белков наружной мембраны), причем полисахарид разлагается в диапазоне размеров коэффициента распределения, составляющего 0,38±0,06 kD, конъюгат характеризуется стабильной карбаматной связью -O- (C=O)-N-, и формула указанного конъюгата представляет собой PS-L1-L2-CR, где PS представляет собой полисахарид, L1 представляет собой карбаматную связь, L2 представляет собой гидразидную связь, и CR представляет собой белок-носитель. Изобретение расширяет арсенал средств с высокой иммуногенностью и стабильностью для использования в качестве кандидата вакцины. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 8 ил., 7 табл., 12 пр.

Description

Область настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к новым конъюгатам полисахарида с белком и способам их получения. Более конкретно, настоящее изобретение относится к конъюгатам полисахарида с белком, полученным с использованием карбаматной химии, которые можно использовать в получении моновалентной вакцины или мультивалентных комбинированных вакцин, а также диагностического средства. Более конкретно, настоящее изобретение относится конъюгату полисахарида Neisseria meningitidis серогруппы X, А, С, Y и W135 с белком-носителем с использованием карбаматной химии и способу его получения.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
N. meningitidis (менингококк) представляет собой аэробную грамотрицательную бактерию, которую серологически классифицировали, главным образом, на 13 серогрупп: А, В, С, D, 29Е, Н, I, K, L, W135, X, Y и Z. Система классификации по группам основана на капсульных полисахаридах организма. На официальном сайте ВОЗ упоминается, что N. meningitidis представляет собой одну из наиболее распространенных причин бактериального менингита во всем мире и единственную бактерию, способную вызывать большие эпидемии менингита. Сообщалось о взрывоопасных эпидемиях с показателями заболеваемости до 1000 случаев на 100000 жителей, особенно в странах Африки к югу от Сахары.
N. meningitidis передается воздушно-капельным путем или непосредственным контактом с респираторными секретами пациентов или здоровых людей-носителей. Как правило, эндемическое заболевание возникает, главным образом, у детей и подростков, с наивысшими показателями пораженности у детей грудного возраста от 3 до 12 месяцев, тогда как в эпидемии могут быть более вовлечены дети старшего возраста и молодые взрослые. Тем не менее, быстрое прогрессирование менингококковой инфекции часто приводит к смерти в течение 1-2 дней после начала. Можно проводить профилактику инфекций N. meningitidis путем вакцинации.
Haemophilus influenzae типа b представляет собой грамотрицательную бактерию, которая вызывает менингит и острые респираторные инфекции, главным образом, у детей. На официальном сайте ВОЗ упоминается, что в развитых и развивающихся странах она представляет собой важную причину неэпидемического менингита у маленьких детей, и часто ассоциируется с тяжелым неврологическим осложнением, даже если антибиотики вводят быстро.
Инфекция Haemophilus influenzae передается капельным путем от инфицированных (но не всегда проявляющих симптомы) людей. Можно проводить профилактику инфекций Н. influenzae типа b путем вакцинации.
Преобладающее большинство менингококковых инфекций вызвано 6 серогруппами, а именно: А, В, С, Y, W135 и X. Исторически сложилось так, что большинство случаев в менингитном поясе вызваны менингококками серогруппы А. Менингококки серогруппы С отвечали за вспышки в менингитном поясе в 1980-х годах, и новая вспышка также наблюдалась в Нигере в 2015 году, а серогруппа W (ранее W-135) возникла как причина эпидемии менингита начиная с 2000 года. Распространенность серогруппы Y в Африке является минимальной; тем не менее, эта серогруппа больше проявляется в случаях менингита в Южной Америке. Согласно одной публикации NCBI менингококки серогруппа X ранее считались редкой причиной спорадического менингита, но в течение 2006-2010 гг. вспышки вызванного серогруппой X менингита произошли в Нигере, Уганде, Кении, Того и Буркина-Фасо, в последней стране сообщалось по меньшей мере о 1300 случаев менингита серогруппы X среди 6732.
Согласно другой публикации NCBI в Того в течение 2006-2009 гг.менингококки серогруппы X являлись причиной 16% из 702 подтвержденных случаев бактериального менингита. В районе Kozah произошла вспышка менингококков серогруппы X в марте 2007 года с сезонной кумулятивной заболеваемостью менингококками серогруппы X, составляющей 33/100000. В Буркина-Фасо в течение 2007-2010 гг. менингококки серогруппы X являлись причиной 7% из 778 подтвержденных случаев бактериального менингита с увеличением с 2009 по 2010 год (от 4% до 35% всех подтвержденных случаев, соответственно). В 2010 году вызванные менингококками серогруппы X эпидемии произошли в северных и центральных районах Буркина-Фасо; наибольшую районную кумулятивную заболеваемость менингококками серогруппы X оценивали как составляющую 130/100000 в течение марта-апреля.
Исходя из вышеизложенных фактов пятивалентная вакцина ACYWX на основе конъюгата полисахарида с белком могла предложить более широкий охват менингококковой инфекции, за исключением серогруппы В. Иммунизация - единственный эффективный подход к борьбе с менингококковой инфекцией. В настоящее время различные моновалентные или мультивалентные вакцины, включающие в себя конъюгаты полисахаридов серогруппы А, С, Y и W135, получили разрешение для продажи на рынке, но не существует ни одной разрешенной к применению вакцины против менингококков серогруппы X. Конъюгаты полисахарида серогруппы X с белком станут новым дополнением к разработке мультивалентных менингококковых конъюгированных вакцин применительно к потребности общественного здравоохранения.
Несколько исследований показывают, что размер сахаридного фрагмента может влиять на иммуногенность конъюгированных вакцин. Первоначальные исследования по иммуногенности конъюгатов декстрана с белком обнаружили, что декстран низкой молекулярной массы, конъюгированный с куриным сывороточным альбумином, индуцировал сильный ответ против декстрана у мышей, при этом увеличение размера декстрана приводило к сниженной иммуногенности. Laferriere с соавт. обнаружили небольшое влияние длины углеводной цепи на иммуногенность пневмококковых конъюгированных вакцин у мышей. Эти исследования указывают на то, что отсутствует явная корреляция между длиной полисахаридной цепи и иммуногенностью конъюгированной вакцины. Тем не менее Rana с соавт. посчитали важным установить оптимальную длину сахаридной цепи для разработки иммуногенной вакцины на основе полисахаридного конъюгата Hib.
Реакция полисахаридов с CDI была показана в нескольких литературных ссылках. Карбонилдиимидазол, особенно предпочтительный реагент, реагирует с гидроксильными группами с образованием имидазолилуретанов полисахарида, и арилхлорформиатов, включая в себя, например, нирофенилхлорформиат, давая в результате смешанные карбонаты полисахарида. В каждом случае полученный активированный полисахарид является очень чувствительным к действию нуклеофильных реагентов, таких как амины, и за счет этого трансформируется в соответствующие уретаны.
Для любой химии конъюгирования структура полисахарида играет очень важную роль. Выбранная химия для конъюгирования любого полисахарида с белком-носителем зависит от доступных функциональных групп на данном полисахариде. Наряду с тем, что некоторые полисахариды содержат химические группы, которые можно без труда использовать для конъюгирования, например, амины, карбоксилы или альдегиды, многие полисахариды нуждаются в активации и дериватизации перед тем, как их можно соединить с белками. Как видно из литературы, вакцины на основе конъюгата полисахарида с белком можно получить с помощью линкера или без него, при этом линкер может представлять собой часть полисахарида, или его можно прикрепить к белку-носителю.
В существующем уровне техники раскрыты вакцины для лечения различных серогрупп, включая в себя Neisseria meningitidis серогрупп А, В, С, W и Y, например, в заявке на выдачу патента США № US 2015/0044253 раскрыта иммуногенная композиция, содержащая сахаридный фрагмент, полученный из Н. influenzae серотипа В (Hib), N. meningitidis серогруппы А, В, С, W, Y, конъюгированный с белком-носителем. Тем не менее, в заявке на выдачу патента США № US 2015/0044253 карбаматный линкер присоединяют напрямую на аминогруппы белка-носителя, что приводит к низкой эффективности конъюгирования.
В международной патентной публикации WO 2004/019992 также раскрыт модифицированный капсульный сахарид и конъюгаты сахарида с белком для N. meningitidis серогруппы А, полученные путем восстановительного аминирования, тем не менее, в указанной заявке речь идет только о серогруппе А.
Существует несколько раскрытий, доступных в отношении N. meningitidis серогруппы X, такие как международная патентная публикация WO 2013/174832, в которой раскрыт конъюгат N. meningitidis серогруппы X, полученный путем химии конъюгирования на основе восстановительного аминирования.
Основным недостатком раскрытий в существующем уровне техники является то, что ни в одном из раскрытий предшествующего уровня техники с использованием карбаматной химии не раскрыто растворение полисахарида в органическом растворителе для облегчения процесса конъюгирования. Доступные в настоящее время конъюгаты страдают от проблем со стабильностью. Более конкретно, недоступны стабильные и коммерчески целесообразные конъюгаты для N. meningitidis серогруппы X.
Цель настоящего изобретения
Для устранения недостатков в существующем уровне техники главной целью настоящего изобретения является обеспечение новых конъюгатов полисахарида с белком.
Другая цель настоящего изобретения представляет собой обеспечение стабильных конъюгатов полисахарида с белком, которые можно использовать для получения новых конъюгированных вакцин.
Еще одна цель настоящего изобретения представляет собой обеспечение конъюгата полисахарида N. meningitidis серогруппы X с белком-носителем, чтобы выше расширить охват заболеваемости менингококковой инфекции, предотвращаемой существующими в настоящее время разрешенными к применению вакцинами.
Еще одна цель настоящего изобретения представляет собой обеспечение способа получения указанных новых конъюгатов полисахарида с белком.
Еще одна цель настоящего изобретения представляет собой обеспечение способа получения указанных новых конъюгатов полисахарида с белком с использованием карбаматной химии.
Еще одна цель настоящего изобретения представляет собой обеспечение способа быстрой солюбилизации полисахарида в неводных апротонных растворителях.
Еще одна цель настоящего изобретения представляет собой проведение реакции конъюгирования в более широком диапазоне рН.
Еще одна цель настоящего изобретения представляет собой завершение способа конъюгирования за очень короткий промежуток времени с высокими выходами.
Еще одна цель настоящего изобретения представляет собой получение новых конъюгатов полисахарида с белком с высокой иммуногенностью, которые можно использовать в вакцине и в качестве диагностического средства.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Соответственно, настоящее изобретение относится к новым конъюгатам полисахарида (PS) с белком и способу их получения. Более конкретно, настоящее изобретение относится к получению конъюгатов полисахарида с белком с помощью карбаматной химии для получения новых конъюгированных вакцин. Более конкретно, настоящее изобретение относится к конъюгату полисахарида N. meningitidis серогруппы X, А, С, Y и W135 с белком-носителем с использованием карбаматной химии и к способу его получения.
Настоящее изобретение относится к способу конъюгирования, при котором капсульный полисахарид разлагают до меньших размеров, подходящих для конъюгирования с белком-носителем для получения конъюгатов с повышенной антигенностью.
Белок-носитель выбран из следующего: ТТ (столбнячный анатоксин), DT (дифтерийный анатоксин), CRM 197 (нетоксический мутант DT), OMPV (везикулы из белков наружной мембраны) или другие подходящие белки-носители. Полисахаридный фрагмент получен из группы грамотрицательных бактерий, включая в себя без ограничения Haemophilus influenza типа b (Hib), Neisseria meningitidis (Men), Streptococcus pneumoniae.
Согласно способу конъюгирования капсульный полисахарид Neisseria meningitidis, более предпочтительно капсульный полисахарид Men А, С, Y, W или X разлагают. Такое разложение проводят с использованием нескольких техник, доступных в предшествующем уровне техники. Более предпочтительно разложение проводят с помощью обработки ультразвуком и/или ультразвуковой обработки зонда в лабораторном масштабе и с помощью микрофлюидизатора в больших масштабах. Нативный капсульный полисахарид N. meningitidis разлагают в диапазоне размеров коэффициента распределения, составляющего 0,38+0,06 Kd, что определяют с помощью гель-проникающей хроматографии (GPC) на высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
После проведения способа разложения указанные разложенный полисахарид растворяют в сильных электролитных солях для обмена противоионов, включая в себя без ограничения галогениды лития, хлорид лития и гидраты галогенидов четвертичного аммония. Обеспечивают правильное смешивание раствора в течение 60±30 минут. Влагу удаляют из полученного капсульного полисахарида с помощью любой техники сушки, такой как роторное испарение. Высушенный капсульный полисахарид затем растворяют в неводных апротонных растворителях, включая в себя без ограничения безводный диметилсульфоксид (DMSO), диметилформамид (DMF), N-метилпирролидон (NMP) или диметилацетамид. Указанный разложенный и высушенный капсульный полисахарид в неводном апротонном растворителе приводят в реакцию с 5-50 молярной избыточной концентрацией не содержащих влаги активирующих средств, включая в себя без ограничения N,N'-карбонилдиимидазол (CDI), N,N'-ди-сукцинимидилкарбонат (DSC) или N,N'-ди-сукцинимидилоксалат (DSO), и смесь выдерживают в присутствии 4-диметиламинопиридина (DMAP) или пиридина в течение заданного периода времени для завершения реакции.
Полученный активированный капсульный полисахарид очищают путем осаждения полисахарида в избытке низкополярного растворителя, включая в себя без ограничения этилацетат, дихлорметан, н-бутилацетат или их смесь в различных пропорциях, с последующим растворением осажденного полисахарида в водном буферном растворе хлорида натрия для получения очищенного активированного капсульного полисахарида.
Очищенный активированный капсульный полисахарид, полученный таким образом, растворяют в водном буфере с активированным белком-носителем. Активированный белок-носитель можно метить карбогидразидом, или ADH, или гидразином.
Раствор очищенного активированного капсульного полисахарида и активированного белка-носителя оставляют смешиваться при комнатной температуре в течение заданного периода времени, предпочтительно 15±5 часов, при диапазоне различных значений рН в зависимости от того, является ли указанный полисахарид активированным с помощью CDI, активированным с помощью DSC или активированным с помощью DSO. Диапазон рН для активированного с помощью CDI полисахарида составляет 8-10, при этом диапазон рН для активированного с помощью DSC или активированного с помощью DSO полисахарида составляет 6-9. Во время этой реакции амин гидразидного фрагмента на белке и -N-содержащий ароматический остаток карбаматного или карбонатного фрагмента на активированном полисахариде реагируют и приводят к образованию конъюгата полисахарида с белком со стабильной карбаматной связью -О- (C=O)-N-. В результате этого получают конечный конъюгат с формулой PS-L1-L2-CR, где PS представляет собой полисахарид, L1 представляет собой карбаматную связь, L2 представляет собой гидразидную связь, и CR представляет собой белок-носитель. Очищенные конъюгаты получают с помощью способа очистки, включая в себя без ограничения ультрафильтрацию, осаждение сульфатом аммония, гель-проникающую хроматографию.
Согласно настоящему изобретению также раскрыто прикрепление одного линкера, предпочтительно карбамата, к полисахариду и второго линкера, предпочтительно гидразина, к белку-носителю с последующей реакцией активированного полисахарида и активированного белка, имеющих отдельные линкеры, для получения конъюгата.
Настоящий улучшенный способ конъюгирования завершается за более короткий промежуток времени и дает на выходе конъюгаты с более стабильной ковалентной связью в широком рабочем диапазоне рН. Новый конъюгат полисахарида с белком согласно настоящему изобретению проявляет большую стабильность, высокий выход и высокую иммуногенность.
Согласно настоящему изобретению также раскрыт способ растворения полисахарида в неводном апротонном растворителе, что облегчает реакцию конъюгирования между полисахаридом и образующим карбамат средством для завершения способа конъюгирования за более короткий промежуток времени.
Наиболее значимым результатом улучшенного способа согласно настоящему изобретению является получение новых конъюгатов полисахарида с белком, которые можно использовать в вакцине или в качестве диагностического средства. Указанный новый конъюгат полисахарида с белком вызывает специфический и гомологичный иммунный ответ и, следовательно, является применимым в получении моновалентной вакцины или мультивалентных комбинированных вакцин, а также диагностического средства.
Краткое описание графических материалов
На фигуре 1 изображена схема реакции поперечного сшивания EDC (карбодиимида) (R-NH2 представляет собой либо гидразин (H2N-NH2), либо дигидразид адипиновой кислоты (ADH) (NH2NHCO(CH2)4CONHNH2).
На фигуре 2 изображено мономерное звено химической структуры капсульного полисахарида Men X.
На фигуре 3 изображен профиль HPLC-SEC, на котором показан элюирующий объем на колонке TSKgel PWXL5000 - PWXL4000 при скорости потока, составляющей 1 мл/мин, показан свободный объем, общий объем и элюирующий объем образца.
На фигуре 4 изображен полученный с помощью HPLC-SEC профиль сравнения нативного полисахарида Men X с доведенными до нужных размеров полисахаридами.
На фигуре 5 изображен полученный с помощью HPLC-SEC профиль сравнения дериватизированного гидразином ТТ с нативным ТТ.
На фигуре 6 изображена хроматограмма, на которой показана очистка дериватизированного гидразидом ТТ на sephadex G25.
На фигуре 7 изображена полная схема карбаматного конъюгирования.
На фигуре 8 изображен полученный с помощью HPLC-SEC профиль сравнения дериватизированного гидразином ТТ с сырым конъюгатом Men X.
Подробное раскрытие настоящего изобретения с иллюстрациями и примерами
Настоящее изобретение относится к новым конъюгатам полисахарида с белком и способу их получения. Более конкретно, настоящее изобретение относится к получению химически стабильных конъюгатов полисахарида с белком с помощью карбаматной химии. Полисахаридный фрагмент получают из группы грамотрицательных бактерий, включая в себя без ограничения Haemophilus influenzae типа b (Hib), Neisseria meningitidis (Men), Streptococcus pneumoniae, более предпочтительно N. meningitidis серогруппы Men A, C, Y, W и предпочтительно Men X. Настоящее изобретение также относится к получению новых конъюгатов полисахарида с белком с высокой иммуногенностью, которые можно использовать в вакцине индивидуально или в комбинациях или в качестве диагностического средства.
Настоящее изобретение также относится к способу конъюгирования, при котором указанный капсульный полисахарид разлагают до меньших размеров, подходящих для конъюгирования с белком-носителем, для получения конъюгатов с повышенной антигенностью.
Настоящее изобретение относится к способу конъюгирования с использованием CDI для активации гидроксильной группы для образования конъюгатов полисахарида с белком с помощью карбаматной химии.
Белок-носитель выбран из следующего: ТТ (столбнячный анатоксин), DT (дифтерийный анатоксин), CRM 197 (нетоксический мутант DT), OMPV (везикулы из белков наружной мембраны) или другие подходящие белки-носители.
Указанные капсульный полисахарид разлагают с использованием некоторых техник, доступных в предшествующем уровне техники. Более предпочтительно разложение проводят с помощью обработки ультразвуком и/или ультразвуковой обработки зонда в лабораторном масштабе и с помощью микрофлюидизатора в больших масштабах. Нативный капсульный полисахарид N. meningitidis разлагают в диапазоне размеров коэффициента распределения, составляющего 0,38+0,06 Kd. Размер полисахарида определяют с помощью гель-проникающей хроматографии (GPC) на высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
После проведения способа разложения указанный разложенный полисахарид растворяют в сильных электролитных солях для обмена противоионов, включая в себя без ограничения галогениды лития, хлорид лития и гидраты галогенидов четвертичного аммония. Обеспечивают правильное смешивание раствора в течение 60±30 минут. Влагу удаляют из полученного капсульного полисахарида с помощью любой техники сушки, такой как роторное испарение. Высушенный капсульный полисахарид затем растворяют в неводных апротонных растворителях, включая в себя без ограничения безводный диметилсульфоксид (DMSO), диметилформамид (DMF), N-метилпирролидон (NMP) или диметилацетамид. Указанный разложенный и высушенный капсульный полисахарид в неводном апротонном растворителе приводят в реакцию с 5-50 молярной избыточной концентрацией не содержащих влаги активирующих средств, включая в себя без ограничения N,N'-карбонилдиимидазол (CDI), N,N'-ди-сукцинимидилкарбонат (DSC) или N,N'-ди-сукцинимидилоксалат (DSO), и смесь выдерживают в присутствии 4-диметиламинопиридина (DMAP) или пиридина в течение заданного периода времени для завершения реакции. PS Men содержит свободную гидроксильную группу в своем повторяющемся звене, которая при проведении реакции с карбонилдиимидазолом (CDI) образует промежуточное соединение имидазолилкарбамат и побочный продукт имидазол.
Полученный активированный капсульный полисахарид очищают путем осаждения полисахарида в избытке низкополярного растворителя, включая в себя без ограничения этилацетат, дихлорметан, н-бутилацетат или их смесь в различных пропорциях, с последующим растворением осажденного полисахарида в водном буферном растворе хлорида натрия для получения очищенного активированного капсульного полисахарида.
Белок-носитель приводят в реакцию с водорастворимым карбодиимидом EDC (N-(3-диметиламинопропил)-N-этилкарбодиимидгидрохлорид) в присутствии гидразина или ADH с получением на выходе стабильных имидных связей с выступающими концевыми гидразидными группами. EDC реагирует с доступными карбоксилатными группами с образованием промежуточного соединения, в высокой степени реакционноспособной о-ацилизомочевины. Этот активный сложный эфир далее может реагировать с нуклеофилами, такими как гидразид, с получением на выходе стабильного конечного продукта (фиг. 1). Схема поперечного сшивания EDC (R-NH2) представляет собой либо гидразин, либо ADH.
Карбонилы реагируют с гидразидами и аминами при рН 5-7. Гидролиз EDC представляет собой параллельную реакцию во время сочетания и он зависит от температуры, рН и состава буфера. 4-Морфолиноэтансульфоновая кислота (MES) представляет собой эффективный буфер карбодиимидной реакции. Фосфатные буферы снижают эффективность реакции EDC, но увеличение количества EDC может компенсировать сниженную эффективность. Трис-, глицин- и ацетат-содержащие буферы не могут быть использованы в качестве буферов для конъюгирования.
Гидразиды, метящие ТТ, определяют с помощью анализа TNBS; и концентрацию белка определяют с помощью анализа Лоури. Степень дериватизации рассчитывают путем деления моль образованных гидразидов на моль белка.
Очищенный активированный капсульный полисахарид, полученный таким образом, растворяют в водном буфере с активированным белком-носителем. Активированный белок-носитель можно метить с помощью карбогидразида, или ADH, или гидразина.
Раствор очищенного активированного капсульного полисахарида и активированного белка-носителя оставляли для смешивания при комнатной температуре в течение 15±5 часов при диапазоне различных значений рН в зависимости от того, является ли указанный полисахарид активированным с помощью CDI, активированным с помощью DSC или активированным с помощью DSO. Диапазон рН для активированного с помощью CDI полисахарида составляет 8-10, при этом диапазон рН для активированного с помощью DSC или активированного с помощью DSO полисахарида составляет 6-9. Во время этой реакции амин гидразидного фрагмента на белке и -N-содержащий ароматический остаток карбаматного или карбонатного фрагмента на активированном полисахариде реагируют и приводят к образованию конъюгата полисахарида с белком со стабильной карбаматной связью -О- (C=O)-N-. В результате этого получают конечный конъюгат с формулой PS-L1-L2-CR, где PS представляет собой полисахарид, L1 представляет собой карбаматную связь, L2 представляет собой гидразидную связь, и CR представляет собой белок-носитель. Очищенные конъюгаты получают с помощью способа очистки, включая в себя без ограничения ультрафильтрацию, осаждение сульфатом аммония, гель-проникающую хроматографию.
Конъюгаты, полученные с использованием карбаматной химии, подвергали испытанию для определения соотношения полисахарида к белку, количества свободного полисахарида в конъюгатах и распределения по размерам молекул. Согласно настоящему изобретению различные эксперименты по оптимизации проводили для достижения соотношения полисахарида к белку в диапазоне от 0,30 до 1,0 и выходов конъюгирования, составляющих вплоть до 60%, при этом среднее значение составляет 30±5%.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления PS Men, полученный из бактериальной ферментации, очищают с помощью последующего способа очистки и анализируют после очистки в отношении всех критически важных параметров качества. Химическая структура PS Men состоит из повторяющихся звеньев со свободной(ыми) гидроксильной(ыми) группой(ами), например, PS Men X (фиг. 2) состоит из повторяющегося звена с фосфатным каркасом и N-ацетилированием в положении 3. Гидроксильные группы в положении 4 и 7 действуют как реакционноспособные функциональные группы для конъюгирования с карбаматом, индуцируя химические соединения, подобные CDI. Мономерные повторяющиеся звенья называются моносахариды, и длинная цепь, образованная ковалентной связью между моносахаридными звеньями, составляет полисахарид. Тип моносахарида является специфическим для конкретной серогруппы (таблица 1).
Figure 00000001
Figure 00000002
Нативные PS Men характеризуются диапазоном размеров коэффициента распределения, составляющим 0,38+0,06 Kd, что определяют с помощью SEC на HPLC с использованием пуллулановых стандартов. Карбаматная химия согласно настоящему изобретению и структура полисахарида вносят вклад в образование стабильных конъюгатов полисахарида с белком, которые подлежат использованию в качестве кандидата вакцины либо отдельно, либо в комбинации.
Содержание разложенного полисахарида определили с помощью физико-химических анализов, например, анализа с использованием фосфора в отношении Men X и Men А, и обнаружили, что оно являлось сходным с содержанием исходного полисахарида.
Различные эксперименты проводили для оптимизации и достижения коэффициентом распределения оптимального диапазона, составляющего 0,38+0,06 Kd. Использовали различные условия, поскольку условия варьируют для различных партий в зависимости от начального размера молекул и структуры отдельного полисахарида.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления полисахарид Men X разлагают до меньших размеров, подходящих для конъюгирования с белком-носителем для получения конъюгатов с высокой антигенностью. Столбнячный анатоксин (ТТ) используют в качестве белка-носителя. Указанный разложенный полисахарид Men X растворяют в хлориде лития. Обеспечивают правильное смешивание раствора в течение 60±30 минут. Влагу удаляют из полученного капсульного полисахарида с помощью одной известной техники сушки, такой как роторное испарение. Разложенный и высушенный капсульный полисахарид затем растворяют в безводном диметилсульфоксиде (DMSO). Высушенный капсульный полисахарид в неводном апротонном растворителе приводят в реакцию с 5-50 молярной избыточной, предпочтительно 30 молярной избыточной концентрацией активирующего средства N,N'-карбонилдиимидазола (CDI) и смесь выдерживают для смешивания в течение периода, составляющего 2 ч - 3 ч для завершения реакции. рН реакционной смеси поддерживают при 7-10, предпочтительно при 9,0. Полученный активированный полисахарид Men X очищают путем осаждения полисахарида в избытке низкополярного растворителя этилацетата с последующим растворением осажденного полисахарида в водном буферном растворе хлорида натрия для получения очищенного активированного капсульного полисахарида.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления линкер представляет собой гидразин или его производное, прикрепленные к белку-носителю. Доведенный до нужного размера активный полисахарид и дериватизированный белок-носитель смешивают в пропорции, составляющей 0,5:1 - 1:0,5 масс./масс., более предпочтительно 1:1 масс./масс., в буфере с рН 7,0-10,0, предпочтительно 0,1 М карбоната натрия, 0,1 М NaCl, рН 9,0. Во время этой реакции амин гидразидного фрагмента на белке и -N-содержащий ароматический остаток карбаматного или карбонатного фрагмента на активированном полисахариде реагируют и приводят к образованию конъюгата полисахарида с белком с очень стабильной карбаматной связью -О- (C=O)-N-. Указанный конъюгат очищают с помощью известных техник и анализируют в отношении общего содержания полисахарида, содержания белка, свободного полисахарида, соотношения полисахарида к белку и выхода конъюгирования. Очищенные конъюгаты хранят при 2-8°С.
Конъюгаты согласно настоящему изобретению являются стабильными при действии на них высокотемпературных условий, составляющих 37°С. Конъюгаты Men согласно настоящему изобретению показывают высокую антигенность и высокую иммуногенность, что выявлено с помощью сывороточного бактерицидного теста (SBA) и различных иммуногенных анализов, таких как ELISA.
НЕОГРАНИЧИВАЮЩИЕ ПРИМЕРЫ
Пример 1: Получение нужного размера полисахарида Men X
200 мг полисахарида Men X помещают в концентрации, составляющей 10 мг/мл, в аналитический стакан на ледяной бане. Запускают ультразвуковой диспергатор с 20% амплитудой в течение 3 ч. Размер разложенного полисахарида определяют в единицах коэффициента распределения (Kd) путем проведения анализа на HP-GPC (таблица 2) с использованием датчика показателя преломления (RI). Образцы элюируют в 0,1 М NaNO3 при рН 7,2 в изократическом режиме на колонке TSKgel G5000 PWXL + G4000 PWXL последовательно. Элюирующие объемы измеряют в единицах времени удерживания. Свободный объем (Vo) колонки рассчитывают из времени удерживания инъекции высокомолекулярного декстрана и общий объем (Vt) колонки определяют по времени удерживания инъекции азида натрия, соответственно. Kd рассчитывают из формулы Kd=(Ve-Vo/Vt-Vo). Ve представляет собой время удерживания (RT) элюирующего объема образца (фиг. 3). Данные, зарегистрированные с использованием датчика RI, показывают сдвиг пика вправо, указывая на деполимеризацию нативных полисахаридов (фиг. 4).
Figure 00000003
Пример 2: Активация полисахарида с помощью CDI
200 мг доведенного до нужного размера полисахарида и LiCl смешивали с медленным перемешиванием при комнатной температуре в течение 1 ч и после этого высушивали на роторном испарителе при 40°С. Затем повторно растворяли в 15 мл сухого DMSO и поддерживали перемешивание в течение 2 ч. Затем добавляли 30× молярный карбонилдиимидазол (CDI) к полисахариду. рН доводили до 9,0 путем добавления триэтиламина (TEA). Медленное перемешивание выполняли при комнатной температуре в течение 2 ч и охлаждали образец на льду для остановки реакции. Добавляли этилацетат и удаляли супернатант сверху. Снова добавляли этилацетат и удаляли супернатант сверху. Высушивали при высоком вакууме в течение 30 минут.
Пример 3: Активация ТТ
250 мг ТТ концентрируют с использованием центрифужного фильтра с MWCO (номинальным отсечением по молекулярной массе), составляющим 50 кДа, для получения конечных 10 мл. 2,75 мл моногидрата гидразина из маточного раствора 5 М или 2,5 г ADH, эквивалента 10× по массе ТТ, добавляют к 10 мл реакционного буфера, т.е. 0,15 М буфера MES, содержащего 0,2 М NaCl, рН 5,75 и добавляют к ТТ, описанному выше. К этой смеси добавляют равное количество EDAC (250 мг) в 1 мл реакционного буфера для получения конечной концентрации, составляющей приблизительно 30 мМ. рН реакционной смеси доводят до 5,85 и конечный объем реакционной смеси доводят до 25 мл. Концентрация ТТ в реакционной смеси составляет 10 мг/мл. В реакционной смеси поддерживают медленное перемешивание в течение 1,0 ч на ледяной бане. Дериватизированный ТТ далее очищают и анализируют в отношении степени активации и SEC-HPLC для мониторинга профиля пиков. Сравнение полученного с помощью HPLC-SEC профиля активированного гидразином ТТ с нативным ТТ показано на фиг. 5, где образцы пропускали через хроматографическую колонку в изократическом режиме и данные регистрировали с использованием датчика PDA.
Пример 4: Очистка активированного ТТ
Очистка представляет собой одну из наиболее важных стадий в способе и в активации ТТ. Необходимо убедиться, что избавились от всего непрореагировавшего гидразина или ADH до возможного максимума. Очистку проводят с помощью способа обессоливания с использованием Sephadex G-25. Обессоливают реакционную смесь на колонке Sephadex G25 против 50 мМ фосфатного буфера, содержащего 75 мМ NaCl, рН 7,5 для очистки дериватизированного белка. Хроматографическую колонку уравновешивают с помощью 50 мМ фосфатного буфера, содержащего 75 мМ NaCl, рН 7,5 с последующей загрузкой образца и элюированием при скорости потока 110 см/ч. Элюированные фракции, по 10 мл каждая, собирают и фракции, соответствующие пику при 280 нМ при УФ (фиг. 6), объединяют и концентрируют с помощью мембраны Amikon с MWCO, составляющим 50 кДа. Выбранные фракции, содержащие ТТ, концентрируют до такого объема, чтобы получить концентрацию ТТ, составляющую приблизительно 30-50 мг/мл (учитывая приблизительно 75% извлечение активированного ТТ после обессоливания). Конечный активированный ТТ анализируют в отношении концентрации белка с помощью анализа Лоури и в отношении гидразидного мечения с помощью анализа TNBS. Оба значения используют для расчета степени активации (DOA) ТТ. Активированный ТТ анализируют на HPLC в концентрации, составляющей 1 мг/мл, с использованием колонок PWXL 5000 - PWXL 4000 последовательно для проверки профиля пиков в отношении его целостности.
Способ согласно настоящему изобретению активирует гидроксильные группы различных полисахаридов, предпочтительно PS Men X, с помощью различных активирующих средств, предпочтительно карбонилдиимидазола, чтобы сделать его реакционноспособным в отношении белка-носителя для образования стабильного конъюгата PS-TT (фиг. 7).
Пример 5: Реакция конъюгирования активированного Men X и дериватизированного ТТ
Дериватизированный ТТ добавляли к активированному PS Men X непосредственно в 3 мл буферного раствора, содержащего 0,1 М карбоната натрия, 0,1 М NaCl, при рН 9,0 и поддерживали рН при 9,0. Активированный полисахарид и дериватизированный ТТ смешивают в пропорции 1:1 масс./масс., для реакции конъюгирования. Образование конъюгата подтверждают только через три часа, но сырую смесь конъюгата перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Реакцию затем гасят с использованием 5-10 молярного избытка амин-содержащего реагента, такого как глицин.
Течение конъюгирования подвергают мониторингу с помощью анализа SEC-HPLC по изменению времени удерживания активированного ТТ и сдвигу пиков влево. Полученный с помощью HPLC-SEC профиль конъюгата показывает, что реакция конъюгирования завершается максимально в течение трех - четырех часов. Полученные с помощью SEC-HPLC профили нативного и активированного ТТ и конъюгата указывают на то, что при активации размер активированного ТТ остается неизменным по сравнению с нативным ТТ, указывая на то, что происходит лишь небольшая агрегация или она не происходит вообще. Образцы пропускали через хроматографическую колонку со скоростью потока, составляющей 1,0 мл/мин, с использованием буфера, содержащего 0,1 М нитрата натрия, рН 7,2, в изократическом режиме и данные регистрировали с использованием датчика PDA. После конъюгирования высокомолекулярный пик появлялся слева от пика дериватизированного ТТ, что указывает на образование конъюгатов PS-TT (фиг. 8).
Пример 6: Удаление непрогреагировавшего (свободного) полисахарида из сырого конъюгата с помощью осаждения сульфатом аммония
Далее сырой конъюгат очищают с помощью способа осаждения белка для удаления свободного или непрореагировавшего полисахарида. Очистку проводят путем медленного добавления твердого сульфата аммония к реакционной смеси до выпадения конъюгата в осадок из раствора. Осадки отделяли с помощью центрифугирования при 5000×g в течение 45 минут. Супернатант отбрасывают и осадки заново растворяют в 30 мл 50 мМ буфера MES, содержащего 100 мМ NaCl, рН 6,5.
Пример 7: Очистка конъюгата полисахарида с белком с помощью тангенциальной проточной фильтрации (TFF)
Образец конъюгата после очистки сульфатом аммония далее очищают с использованием кассет от Pall с MWCO, составляющим 300 кДа. Эта стадия обеспечивает удаление свободного белка (если он есть) из конъюгата и дополнительно отделение свободного PS от конъюгированного PS. Конъюгат подвергают диафильтрации с 20× объемом буфера MES, рН 6,5 и в конце концов концентрируют до объема, составляющего 35 мл.
Следовательно, удаление остаточных реагентов, используемых в течение всего способа конъюгирования, обеспечивают на четырех стадиях: первая для PS: во время стадии осаждения активированного PS, вторая для белка-носителя: на стадии очистки с помощью GPC, третья для всего способа конъюгирования: с помощью осаждения сульфатом аммония, и четвертая: с помощью стадии диафильтрации 300 кДа. Далее проводят фильтрование с помощью 0,2 мкм фильтров и хранение при 2-8°С.
Пример 8: Определение характеристик конъюгата Men Х-ТТ
Очищенный конъюгат анализируют в отношении общего содержания полисахарида с помощью анализа с использованием фосфора для конъюгатов Men Х-ТТ. Содержание белка определяют с помощью анализа Лоури. Свободный полисахарид, определенный путем осаждения с помощью способа с использованием дезоксихолата натрия, и супернатант анализируют с помощью соответствующего колориметрического анализа. Различные анализы для определения различных остаточных продуктов проводят перед его использованием для получения состава. Очищенные конъюгаты хранят при 2-8°С.
Конъюгаты согласно настоящему изобретению анализировали в отношении различных параметров качества (таблица 3) и обнаружили, что они дают соотношение полисахарида к белку в диапазоне, составляющем 0,3-0,7 (масс./масс.). Количество свободного полисахарида является различным для различных конъюгатов, тем не менее, во всех очищенных конъюгатах свободный полисахарид составлял меньше чем 10%. Выход конъюгирования также варьировал для различных конъюгатов от 18% до 43%. Согласно настоящему изобретению пробовали различные масштабы конъюгирования от 20 мг до 230 мг.
Figure 00000004
Пример 9: Определение характеристик конъюгатов Men А, С, Y, W, полученных с помощью карбаматной химии
Способом, аналогичным для Men X, получали конъюгаты серогрупп Men А, С, Y и W с использованием настоящего изобретения. Все конъюгаты характеризовали в отношении различных параметров качества и обнаружили, что они дают требуемые результаты (таблица 4).
Figure 00000005
Пример 10: Стабильность конъюгата Men Х-ТТ
Конъюгаты согласно настоящему изобретению подвергают действию высокотемпературных условий, составляющих 37°С в течение 28 дней. Образцы забирали на 7, 14, 21 и 28 день для мониторинга образованного свободного полисахарида. Стабильность конъюгатов Men X, полученных с помощью заданной карбаматной химии, согласно настоящему варианту осуществления, подтверждала применимость способа для получения чрезвычайно стабильных конъюгатов (таблица 5).
Figure 00000006
Пример 11: Иммуногенность конъюгатов Men X
Группы из 8 самок мышей BALB/c возрастом 5-9 недель иммунизировали в дни 0, 14 и 28 двумя различными партиями конъюгированного PS Men X антигена, составленного в нормальном растворе хлорида натрия (таблица 6) с уровнем дозы, составляющим 1 мкг. Все иммунизации проводят путем введения 200 мкг разведения вакцины подкожным путем. Нормальный раствор хлорида натрия отдельно используют для группы отрицательного контроля. Производят забор сыворотки через 7-14 дней после 2 и 3 доз. Титры специфического IgG антитела к PS оценивают с помощью ELISA после 2 и 3 доз.
Максимальные титры IgG для конъюгатов Men X достигаются после двух бустер-доз. Обнаружили, что для Men X увеличение значения титра после 3 доз, по сравнению с отрицательным контролем, является приблизительно 100-кратным в партии 1 конъюгата Men X и 150-кратным в партии 2 конъюгата Men X (таблица 6).
Figure 00000007
Пример 12: Сывороточный бактерицидный тест (SBA) для конъюгатов Men X
Равный объем каждого сывороточного образца, принадлежащего группе мышей, объединяют вместе, чтобы создать пулы групп сывороток для тестирования сывороточным бактерицидным тестом. Анализ проводят следующим образом:
Наносят штрихами целевой штамм N. meningitidis серогруппы X для выделения отдельной колонии и инкубируют в течение ночи при 37°C с 5% CO2 на планшете с овечьим кровяным агаром. Штамм субкультивируют путем распространения клеток по всей поверхности другого планшета с овечьим кровяным агаром и затем инкубируют для свежего роста при 37°C с 5% CO2. Бактерии ресуспендируют в ~ 5 мл буфера для бактерицидного анализа. OD650 суспензии корректируют эквивалентно числу колоний, составляющему приблизительно 1×105 КОЕ/мл. Сыворотки серийно разводят 2-кратно и буфер для анализа добавляют в контрольные лунки. 10 мкл рабочего раствора бактерий добавляют к каждой лунке. 10 мкл инактивированного тепловой обработкой комплемента (выдержанного при 56°С в течение 30 мин) добавляют во все контрольные лунки с неактивным комплементом и 10 мкл указанного инактивированного комплемента добавляют к лункам, содержащим сыворотки, и контрольным лункам с активным комплементом. Встряхивали планшеты и их инкубировали в течение 1 ч при 37°С.
После инкубации наносили пятнами по 10 мкл из каждой лунки на планшет со скошенными краями с кровяным агаром. Инкубировали все планшеты с агаром в течение ночи при 37°C с 5% CO2. Подсчитывали количество колоний в каждом пятне планшетов. Самое высокое разведение сыворотки, показывающие ≥50% гибели бактерий по сравнению с контролем - комплементом, считали титром SBA для этого образца сыворотки.
Данные SBA показывают незначительный ответ от иммунизаций носителем после 3 доз, тогда как обе исследуемые партии конъюгатов Men X показали значимо высокие титры SBA по сравнению с контролем носителем, что указывает на то, что вакцина является эффективной in vivo в мышиной модели (таблица 7).
Figure 00000008

Claims (35)

1. Конъюгат полисахарида с белком с высокой иммуногенностью, причем указанный конъюгат полисахарида с белком содержит следующее:
- полисахарид, полученный из грамотрицательных бактерий, где грамотрицательной бактерией является Neisseria meningitidis (Men);
- белок-носитель, выбранный из следующего: TT (столбнячный анатоксин), DT (дифтерийный анатоксин), CRM197 (нетоксический мутант DT) или OMPV (везикулы из белков наружной мембраны); причем
- указанный полисахарид разлагается в диапазоне размеров коэффициента распределения, составляющего 0,38±0,06 kD,
- указанный конъюгат полисахарида с белком характеризуется стабильной карбаматной связью -O- (C=O)-N-, и
- формула указанного конъюгата представляет собой PS-L1-L2-CR, где PS представляет собой полисахарид, L1 представляет собой карбаматную связь, L2 представляет собой гидразидную связь, и CR представляет собой белок-носитель; и
где указанная высокая иммуногенность указанного конъюгата, выявленная с помощью ELISA, находится в диапазоне от 100-кратного до 150-кратного увеличения в значении титра после трех доз по сравнению с отрицательным контролем, и где указанный конъюгат является стабильным и его можно использовать в качестве кандидата вакцины либо отдельно, либо в комбинации.
2. Конъюгат полисахарида с белком по п. 1, где указанный полисахарид представляет собой предпочтительно капсульный полисахарид Neisseria meningitides, более предпочтительно капсульный полисахарид Neisseria meningitides серогруппы A, C, Y, W или X.
3. Конъюгат полисахарида с белком по п. 2, где указанный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Neisseria meningitidis серогруппы X.
4. Конъюгат полисахарида с белком по п. 1, причем указанный конъюгат является стабильным при комнатных температурах.
5. Конъюгат полисахарида с белком по п. 1, причем указанный конъюгат характеризуется постепенным увеличением содержания свободного полисахарида, составляющим меньше чем 10,5%, при хранении при 37°C в течение 28 дней.
6. Конъюгат полисахарида с белком по п. 1, причем указанный конъюгат показывает титры в сывороточном бактерицидном тесте в диапазоне от 32-кратного до 128-кратного после двух доз и от 118-кратного до 198-кратного после трех доз по сравнению с контролем носителем.
7. Способ получения конъюгата полисахарида с белком с высокой иммуногенностью, содержащего:
- полисахарид, полученный из грамотрицательных бактерий, где грамотрицательной бактерией является Neisseria meningitidis (Men);
- белок-носитель, выбранный из следующего: TT (столбнячный анатоксин), DT (дифтерийный анатоксин), CRM197 (нетоксический мутант DT) или OMPV (везикулы из белков наружной мембраны); причем
- указанный полисахарид разлагается в диапазоне размеров коэффициента распределения, составляющего 0,38±0,06 kD,
- указанный конъюгат полисахарида с белком характеризуется стабильной карбаматной связью -O- (C=O)-N-, и
- формула указанного конъюгата представляет собой PS-L1-L2-CR, где PS представляет собой полисахарид, L1 представляет собой карбаматную связь, L2 представляет собой гидразидную связь, и CR представляет собой белок-носитель, где указанная высокая иммуногенность указанного конъюгата, выявленная с помощью ELISA, находится в диапазоне от 100-кратного до 150-кратного увеличения в значении титра после трех доз по сравнению с отрицательным контролем, и где указанный конъюгат является стабильным и его можно использовать в качестве кандидата вакцины либо отдельно, либо в комбинации;
где указанный способ предусматривает стадии, на которых:
(a) разлагают капсульный полисахарид до оптимального диапазона размеров коэффициента распределения, составляющего 0,38±0,06 kD ,
(b) растворяют указанный разложенный полисахарид согласно стадии (a) в сильных электролитных солях и обеспечивают правильное смешивание полученной смеси в течение заданного периода времени, причем указанный заданный период времени находится в диапазоне от 30 мин до 90 мин,
(c) удаляют влагу из полученной смеси, полученной на стадии (b), с помощью известных техник, включая в себя без ограничения лиофилизацию, роторное испарение или вакуумную сушку, для получения высушенного полисахарида,
(d) растворяют указанный высушенный полисахарид согласно стадии (c) в неводном апротонном растворителе,
(e) проводят реакцию полученного раствора согласно стадии (d) с заданной концентрацией не содержащего влаги активирующего средства в диапазоне от 5 до 50 молярного избытка, предпочтительно 30 молярный избыток,
(f) выдерживают полученную смесь согласно стадии (e) в течение заданного периода времени с линкером для получения полисахарида, который представляет собой активированный полисахарид, причем указанный заданный период времени находится в диапазоне от 2 ч до 3 ч, где линкер на активированном полисахариде представляет собой карбамат,
(g) очищают указанный активированный полисахарид согласно стадии (f) с помощью известных способов, включая в себя без ограничения осаждение сульфатом аммония, диафильтрацию, гель-фильтрацию и/или их комбинацию, и
(h) проводят реакцию указанного очищенного активированного полисахарида согласно стадии (g) с активированным белком-носителем, имеющим встроенный линкер, в течение заданного периода времени при pH в диапазоне от pH 6 до pH 10, причем указанный заданный период времени находится в диапазоне от 2 ч до 20 ч, где указанный линкер на активированном белке-носителе представляет собой гидразид.
8. Способ получения конъюгата полисахарида с белком по п. 7, где указанный неводный апротонный растворитель выбран без ограничения из безводного диметилсульфоксида (DMSO), диметилформамида (DMF), N-метилпирролидона (NMP) или диметилацетамида.
9. Способ получения конъюгата полисахарида с белком по п. 7, где указанное не содержащее влаги активирующее средство представляет собой Ν,Ν'-карбонилдиимидазол (CDI), Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат (DSC) или Ν,Ν'-дисукцинимидилоксалат (DSO).
10. Способ получения конъюгата полисахарида с белком по п. 7, где указанный разложенный и активированный полисахарид и указанный активированный белок-носитель смешивают в пропорции, находящейся в диапазоне от 0,5:1 до 1:0,5 масс./масс., более предпочтительно 1:1 масс./масс. в буфере с pH 7,0-10,0, предпочтительно pH 9,0.
11. Способ получения конъюгата полисахарида с белком по п. 10, где указанный буфер выбирают без ограничения из карбонатного буфера, боратного буфера.
12. Способ получения конъюгата полисахарида с белком по п. 7, где соотношение полисахарида к белку в указанном конъюгате находится в диапазоне от 0,3 до 1,0 (масс./масс.).
13. Способ получения конъюгата полисахарида с белком по п. 7, где указанный конъюгат характеризуется свободным полисахаридом, составляющим меньше чем 10% в очищенном конъюгате.
14. Способ получения конъюгата полисахарида с белком по п. 7, где выход конъюгата, полученного с помощью указанного способа конъюгирования, составляет вплоть до 60%.
15. Способ получения конъюгата полисахарида с белком по п. 7, где средний выход конъюгата, полученного с помощью указанного способа конъюгирования, составляет 30±5%.
RU2018135066A 2016-03-15 2017-03-10 Новые конъюгаты полисахарида с белком и способ их получения RU2758090C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN201611008901 2016-03-15
IN201611008901 2016-03-15
PCT/IB2017/051408 WO2017158480A1 (en) 2016-03-15 2017-03-10 Novel polysaccharide-protein conjugates and process to obtain thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2018135066A RU2018135066A (ru) 2020-04-06
RU2018135066A3 RU2018135066A3 (ru) 2020-11-10
RU2758090C2 true RU2758090C2 (ru) 2021-10-26

Family

ID=59851687

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018135066A RU2758090C2 (ru) 2016-03-15 2017-03-10 Новые конъюгаты полисахарида с белком и способ их получения

Country Status (9)

Country Link
JP (1) JP2019508468A (ru)
KR (1) KR102428253B1 (ru)
CN (1) CN108883192A (ru)
AU (1) AU2017234319B2 (ru)
BR (1) BR112018068523A2 (ru)
MX (1) MX2018010920A (ru)
RU (1) RU2758090C2 (ru)
WO (1) WO2017158480A1 (ru)
ZA (1) ZA201806043B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2770877C1 (ru) * 2021-04-08 2022-04-22 Федеральное бюджетное учреждение науки "Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии" Способ получения антигенной конъюгированной субстанции гемофильного типа b микроба для создания вакцинных препаратов

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3033364A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 Sanofi Pasteur, Inc. Neisseria meningitidis vaccine
US20200147198A1 (en) * 2017-06-27 2020-05-14 MSD Wellcome Trust Hiiieman Laboratories PVT., Ltd. Novel Multivalent Polysaccharide-Protein Conjugate Vaccine Composition and Formulation Thereof
CN110652585B (zh) * 2018-10-26 2023-05-26 武汉博沃生物科技有限公司 多糖-蛋白缀合物免疫制剂及其制备与应用
CN110302375A (zh) * 2019-06-27 2019-10-08 康希诺生物股份公司 一种糖缀合物及其用途
CN114965784B (zh) * 2022-06-01 2023-10-27 艾美探索者生命科学研发有限公司 多糖活化度的测定方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2233172C2 (ru) * 1997-07-17 2004-07-27 Бакстэ Хелскеа С.А. Иммуногенный коньюгат полисахарид h. influenzae - порин менингококка группы b (варианты), способ его получения, фармацевтическая композиция и способ индукции иммунного ответа у животного в отношении h.influenzae
WO2007000314A2 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
WO2011041003A2 (en) * 2009-06-22 2011-04-07 Wyeth Llc Compositions and methods for preparing staphylococcus aureus serotype 5 and 8 capsular polysaccharide conjugate immunogenic compositions

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030157129A1 (en) * 1995-06-23 2003-08-21 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine comprising a polysaccharide antigen - carrier protein conjugate and free carrier protein
GB0220198D0 (en) * 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Modified saccharides,conjugates thereof and their manufacture
CN1709505B (zh) * 2005-07-13 2010-06-16 北京绿竹生物制药有限公司 多价细菌荚膜多糖-蛋白质结合物联合疫苗
TR201900778T4 (tr) * 2012-01-30 2019-02-21 Serum Institute Of India Private Ltd İmmünojenik bileşim.
EP2870974A1 (en) * 2013-11-08 2015-05-13 Novartis AG Salmonella conjugate vaccines

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2233172C2 (ru) * 1997-07-17 2004-07-27 Бакстэ Хелскеа С.А. Иммуногенный коньюгат полисахарид h. influenzae - порин менингококка группы b (варианты), способ его получения, фармацевтическая композиция и способ индукции иммунного ответа у животного в отношении h.influenzae
WO2007000314A2 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
EA012214B1 (ru) * 2005-06-27 2009-08-28 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Иммуногенная композиция
WO2011041003A2 (en) * 2009-06-22 2011-04-07 Wyeth Llc Compositions and methods for preparing staphylococcus aureus serotype 5 and 8 capsular polysaccharide conjugate immunogenic compositions

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2770877C1 (ru) * 2021-04-08 2022-04-22 Федеральное бюджетное учреждение науки "Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии" Способ получения антигенной конъюгированной субстанции гемофильного типа b микроба для создания вакцинных препаратов

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180121564A (ko) 2018-11-07
RU2018135066A3 (ru) 2020-11-10
KR102428253B1 (ko) 2022-08-02
JP2019508468A (ja) 2019-03-28
AU2017234319B2 (en) 2021-11-04
RU2018135066A (ru) 2020-04-06
ZA201806043B (en) 2019-05-29
BR112018068523A2 (pt) 2019-01-22
WO2017158480A1 (en) 2017-09-21
AU2017234319A1 (en) 2018-09-27
MX2018010920A (es) 2019-03-06
CN108883192A (zh) 2018-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2758090C2 (ru) Новые конъюгаты полисахарида с белком и способ их получения
JP5361767B2 (ja) 水中において改善された安定性を持つ修飾糖
ES2658851T3 (es) Vacunas de matriz de proteína y métodos de preparación y administración de tales vacunas
US11191822B2 (en) Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
ES2293002T5 (es) Vacunas de polisacárido y glucoconjugado mejoradas
JP2019526573A (ja) ナイセリア・メニンギティディスのワクチン
US20230248839A1 (en) Immunogenic compositions
EP1590373A1 (fr) Conjugues obtenus par amination reductrice du polysaccharide capsulaire du pneumocoque de serotype 5
CN108367059B (zh) 针对肺炎链球菌血清型2的合成疫苗
US11014952B2 (en) Stable hydrolysis-resistant synthetic polyribosylribitolphosphate derivatives as vaccines against Haemophilus influenzae type b
US20170198004A1 (en) Novel semi-synthetic meningococcal conjugate vaccine
EP1000076A1 (en) HEXADECASACCHARIDE-PROTEIN CONJUGATE VACCINE FOR $i(SHIGELLA DYSENTERIAE) TYPE 1
AU2003216633B2 (en) Modified saccharides having improved stability in water