CN114965784B - 多糖活化度的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多糖活化度的测定方法，包括如下步骤：对供试品进行预处理：取部分作为第一样品，并获得第一样品中多糖含量，记为m；另取一部分进行酸水解处理，得到第二样品；依据DMAP对照样品获得关于DMAP的峰面积‑含量标准线性回归方程；在同等条件下对第二样品进行处理得到对应的DMAP的峰面积，并通过DMAP的峰面积‑含量标准线性回归方程获得第二样品中的DMAP含量，记为n；依据第二样品中的DMAP含量和第一样品中的多糖含量，获得所述供试品的活化度。本发明提供的多糖活化度的测定方法，能够更加准确的测出活化多糖的活化度。
Description
技术领域
本发明是关于多糖活化度测定领域，特别是关于一种多糖活化度的测定方法。
背景技术
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)作为兼性厌氧革兰氏阳性菌，是引起获得性肺炎、鼻窦炎、中耳炎、脑膜炎和菌血症等严重疾病的重要病菌，荚膜多糖是其致病的主要毒力因子。疫苗是预防肺炎链球菌感染最有效的手段。多糖疫苗虽有在人体内直接诱导B细胞产生抗体，但由于荚膜多糖是T细胞非依赖性抗原(TI-Ag),不能对2岁以下的婴幼儿激发保护性免疫反应，也不能产生免疫记忆，故肺炎多糖疫苗只能用于2岁以上的儿童和成人。荚膜多糖在免疫原性上的这种局限性可以通过给荚膜多糖引入载体蛋白质，即将荚膜多糖与载体蛋白共价交联，使其转化为T细胞依赖性抗原(TD-Ag)来解决，从而产生保护性T细胞依赖性记忆反应。
荚膜多糖在与载体蛋白结合之前需要进行活化，1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟化硼(1-cyano-4-dimethy-laminopyridinium tetrafluoroborate，CDAP)是一种可用于异脲键连接反应中多糖活化的试剂，活化后的肺炎链球菌荚膜多糖具有吡啶异脲结构。CDAP虽能在水溶液的环境中活化荚膜多糖，但在水溶液中并不稳定，在中性水溶液中数小时即降解，而在碱性水溶液中则会迅速降解，CDAP的降解产物为4-二甲氨基吡啶(DMAP)，会影响测定肺炎链球菌活化荚膜多糖活化度的准确性。
免疫原性是多糖结合疫苗质量评判的一个重要方面。通过肺炎球菌活化多糖的活化度数据来评定肺炎球菌多糖结合疫苗的衍化率，从而作为肺炎球菌多糖结合疫苗免疫原性的一种质控方法。因此，有必要提供一种多糖活化度的测定方法来测定肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度。本方法具体通过优化活化条件，控制活化度达到较高的衍化率，减少游离多糖的含量，使肺炎球菌多糖结合疫苗达到更好的免疫原性
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多糖活化度的测定方法，其能够有效填补肺炎链球菌活化荚膜多糖活化度测定方面的空白。
为实现上述目的，本发明的实施例提供了一种多糖活化度的测定方法,包括如下步骤：
对供试品进行预处理：取部分作为第一样品，并获得第一样品中多糖含量，记为m；另取一部分进行酸水解处理，得到第二样品；
依据DMAP对照样品获得关于DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程；
在同等条件下对第二样品进行处理得到对应的DMAP的峰面积，并通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程获得第二样品中的DMAP含量，记为n；
依据第二样品中的DMAP含量和第一样品中的多糖含量，获得所述供试品的活化度。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述供试品的预处理包括透析处理。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述透析处理的时间为16-24h。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述酸水解溶液包括盐酸溶液，且盐酸溶液的浓度为0.15-0.22μmol/ml。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述酸水解时间为0.5-6h。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述酸水解的温度为20-22℃。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述第二样品处理还包括过滤。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述过滤包括滤膜过滤，所述滤膜的孔径包括0.22、0.3、0.4和0.45μm。
在本发明的一个或多个实施方式中，测量所述第二样品中DMAP含量的方法包括RP-HPLC法。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述供试品的活化度的计算公式如下：
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，
其中，122为DMAP相对分子量，a为透析后的供试品在酸水解处理时的稀释倍数。
与现有技术相比，根据本发明实施方式的多糖活化度的测定方法，通过透析和酸处理，以及DMAP对照样品标准线性方程的获得和使用，使得肺炎链球菌活化荚膜多糖活化度的测定更加准确。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的组成部分，而并未排除其它组成部分。
样品处理探究
活化多糖里游离的DMAP为小分子物质，可以通过超滤离心和透析两个方法去除，超滤离心过程样品的溶液体系会发生变化，影响样品的稳定性，且不能一次性完全去除游离的DMAP，多次超滤离心会使活化多糖发生交联，导致多糖吸附在滤膜上使糖含量降低，故选用透析的方式去除游离的DMAP。
(1)透析时间的探究。通过取透析液中DMAP含量来检测透析的程度：取10ml活化糖放入1L的纯化水中透析且每2h换一次液，分别取透析2h、4h、6h、8h和10h的透析液测定DMAP含量，分别为9.198μmol/ml、0.248μmol/ml、0.418μmol/ml、0.113μmol/ml、0.128μmol/ml，透析过后取22h和24h透析液测DMAP含量为0.083μmol/ml、0.062μmol/ml，初步认为24h基本可以去除游离的DMAP。对透析时间进行进一步确认，取10ml样品放入1L的纯化水中透析，取透析4h、16h、18h和20h透析液测DMAP含量，结果分别为0.189μmol/ml、0.005μmol/ml、0.002μmol/ml和未检出，故最终确定将透析时间定为16-24h。
(2)透析时间确认。透析处理活化多糖样品时，每隔2-3h换一次透析液，透析过夜后再换一次透析液透析2h以上取透析液测DMAP含量。若检测结果低于检测限，认为透析结束；若检测结果大于检测限，则继续透析1-2h后再次取样检测，直至DMAP含量随透析时间延长结果无变化认为透析结束。
盐酸参数的选择
盐酸水解浓度：选用在室温环境下的透析后的供试品，需要加入过量的盐酸来使透析后的供试品水解充分，同时考虑到色谱柱的耐酸碱性，盐酸的浓度不能过高，选用0.2mol/l HCl和0.4mol/l HCl来探索水解时间。为了提供足够的时间使其反应充分，故盐酸浓度和水解时间探究如下：
盐酸水解浓度选择：选用0.2mol/l HCl和0.4mol/l HCl分别与透析后的供试品1：1混合，水解0.5h、1h和2h后，过滤，采用RP-HPLC法测DMAP含量，结果见表1。
表1不同浓度盐酸水解结果
由表1数据可以得出0.2mol/l HCl水解更充分。
盐酸水解时间选择：选用0.2mol/l HCl分别与透析后的供试品按1：1的比例混合，水解30min、1h、2h和6h，过滤，采用RP-HPLC法测DMAP含量。结果见表2。
表2不同时间盐酸水解结果
由表2数据可以得出0.2mol/l HCl水解1小时后可将DMAP基本脱落完全。
结论：盐酸参数的确定，由上述数据结果可看出0.2mol/l HCl水解透析后的供试品1h为最佳水解条件。但由于各型的样品不同，根据实际测定结果将本方法盐酸浓度定为：0.15-0.22mol/l HCl；水解时间定为0.5-6h。
流动相的选择：反相高效液相色谱法常用有机相和盐溶液作为流动相，常用的有机相有甲醇和乙腈；查阅资料得知，TEA有改善拖尾现象的作用，同时对低浓度的硫酸和磷酸均有提高分离度的作用，故尝试用TEA来改善峰形和提高分离度。磷酸盐也作为常用的盐溶液用于流动相，有磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，由于氢含量更高的磷酸二氢钠可增加流动相的极性，故优先考虑磷酸二氢钠。针对以上可以选用的流动相依次进行尝试，对比目标峰的保留时间、峰高和峰面积(如表3)。样品多糖峰大概会出现在2.0-2.6min，流动相的溶剂峰保留时间大概会在2.8-3.1min，为了提高目标峰与样品多糖峰和溶剂峰分离度，最终流动相确定为流动相9(乙腈：3g/L磷酸二氢钠＝10：90)和12(乙腈：4g/L磷酸二氢钠＝10：90)。在改变流动相的浓度考察本发明方法的耐用性时，发现流动相在乙腈：磷酸二氢钠(2.5-5.5g/L)＝8-20:80-92范围内均适用于本发明。考虑到色谱柱的稳定性，一般有机相不低于5％，故在平衡系统前，用100％有机相冲一遍系统提高柱效。
表3不同流动相检测DMAP结果
方法确认
(1)色谱柱
色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶柱，粒径5μm，孔径4.6mm，柱长25cm。
(2)供试品的处理
活化的肺炎链球菌荚膜多糖(1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型)样品经过透析16h以上去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.15～0.22mol/l HCl1:1比例混合，在温度为20-22℃下水解0.5～6h，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
(3)测定方法
制备对照样品：称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，经0.45μm滤膜过滤使用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(2.5-5.5g/L)＝8-20:80-92，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
(4)结果计算
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得第二样品中4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量(μmol/ml)。再根据活化度的计算公式获得多糖的活化度。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，
122为DMAP相对分子量，a为透析后的供试品在酸水解处理时的稀释倍数。
实施例1
取1型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析20h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为22℃下水解45min，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.22μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(4g/L)＝10:90，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.22μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.374μmol/ml，另测得多糖含量m＝395.62μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％％，1型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为23.1％。
实施例2
取2型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析18h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.22mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为22℃下水解45min，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.35μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(2.5g/L)＝8:92，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.3μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.31μmol/ml。另测得多糖含量m＝2124.14μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，2型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为3.6％。
实施例3
取3型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析24h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.15mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为22℃下水解45min，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(2.5g/L)＝8:92，柱温30℃，流速为1.0ml/min；检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过后滤取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.62μmol/ml。另测得多糖含量m＝1495.46μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，3型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为10.12％。
实施例4
取4型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析22h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为22℃下水解2h，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(4g/L)＝10:90，柱温30℃，流速为1.0ml/min；检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.153μmol/ml。另测得多糖含量m＝631.74μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，4型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为5.9％。
实施例5
取5型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析18h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为22℃下水解2h，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.4μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(5g/L)＝15:85，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.4μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.372μmol/ml。另测得多糖含量m＝1783.21μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，5型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为5.1％。
实施例6
取6A型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析19h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.18mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为20℃下水解80min，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.3μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(5g/L)＝15:85，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.3μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.320μmol/ml。另测得多糖含量m＝111.36μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，6A型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为4.4％。
实施例7
取6B型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析18h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为20℃下水解1h，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.22μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(4g/L)＝10:90，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.22μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.209μmol/ml。另测得多糖含量m＝1573.57μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，6B型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为3.2％。
实施例8
取7F型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析18h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为20℃下水解75min，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(5.5g/L)＝15:85，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.097μmol/ml。另测得多糖含量m＝1708.61μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，7F型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为1.4％。
实施例9
取8型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析24h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.22mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为20℃下水解2h，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.3μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(4g/L)＝10:90；柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.3μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.284μmol/ml。另测得多糖含量m＝2147.445μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，8型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为3.2％。
实施例10
取9N型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析22h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为20℃下水解1h，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml HCL和1μmol/ml HCL的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(5.5g/L)＝15:85，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.45μmol/ml。另测得多糖含量m＝1438.55μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，9N型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为7.6％。
实施例11
取9V型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析18h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为20℃下水解80min，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml HCL)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.22μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(4g/L)＝10:90，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.22μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.372μmol/ml。另测得多糖含量m＝1783.21μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，9V型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为5.1％。
实施例12
取10A型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析16h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.18mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为21℃下水解1h，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(3g/L)＝10:90，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml HCL，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.463μmol/ml。另测得多糖含量m＝1495.08μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，10A型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为7.6％。
实施例13
取11A型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析17h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为21℃下水解65min，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(5g/L)＝15:85，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.403μmol/ml。另测得多糖含量m＝1885.12μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，11A型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为5.2％。
实施例14
取12F型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析22h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为21℃下水解3h，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(3g/L)＝10:90，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.201μmol/ml。另测得多糖含量m＝1557.4μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，12F型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为3.2％。
实施例15
取14型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析24h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.22mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为21℃下水解4h，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml HCL)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(5g/L)＝15:85；柱温30℃；流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.288μmol/ml。另测得多糖含量m＝1601.24μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，14型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为4.4％。
实施例16
取15B型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析17h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为21℃下水解1h，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml HCL)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.35μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(4g/L)＝10:90，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.5μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.380μmol/ml。另测得多糖含量m＝1682.69μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，15B型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为5.5％。
实施例17
取17F型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析20h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为21℃下水解70min，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(4g/L)＝10:90，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.30μmol/ml。另测得多糖含量m＝1716.27μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，17F型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为4.2％。
实施例18
取18C型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析16h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为21℃下水解45min，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(4g/L)＝10:90，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.312μmol/ml。另测得多糖含量m＝2663.245μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，18C型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为2.9％。
实施例19
取19A型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析19h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为21℃下水解75min，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(5g/L)＝15:85，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.449μmol/ml。另测得多糖含量m＝1506.88μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，19A型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为7.3％。
实施例20
取19F型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析16h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为21℃下水解70min，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(4g/L)＝10:90，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.367μmol/ml。另测得多糖含量m＝1420.56μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，19F型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为6.3％。
实施例21
取20型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析20h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为21℃下水解1h，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(2.5g/L)＝8:92，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.52μmol/ml。另测得多糖含量m＝1856.04μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，20型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为6.8％。
实施例22
取22F型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析18h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.15mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为21℃下水解80min，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(2.5g/L)＝8:92，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.222μmol/ml。另测得多糖含量m＝2072.41μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，22F型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为3.0％。
实施例23
取23F型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析20h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.2mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为21℃下水解55min，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(4g/L)＝10:90，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.229μmol/ml。另测得多糖含量m＝1991.62μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，23F型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为3.2％。
实施例24
取33F型活化的肺炎链球菌样品5ml经过透析21h去除游离的4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，取1ml作为第一样品，测多糖含量(μg/ml)，结果记为m；另取1ml与0.18mol/l HCl以比例为1:1混合，在温度为21℃下水解1h，作为第二样品，测DMAP含量(μmol/ml)，结果记为n。
称取12.217mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于10ml纯化水中，即得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)，取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品贮备液(10μmol/ml)0.5ml加入4.5ml纯化水，得4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)。取4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品工作液(1μmol/ml)0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别置于离心管中，补加纯化水至1.0ml，即得浓度为0.1μmol/ml、0.2μmol/ml、0.4μmol/ml、0.6μmol/ml、0.8μmol/ml和1μmol/ml的4-二甲氨基吡啶(DMAP)对照样品溶液，再经孔径为0.45μm滤膜过滤备用。
流动相为乙腈：磷酸二氢钠(4g/L)＝10:90，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm，待基线稳定后，分别量取上述对照样品溶液10μl注入高效液相色谱仪，运行时间6分钟，记录图谱。第二样品经孔径为0.45μm滤膜过滤后取10μl注入色谱仪，同法测定，记录图谱。
按照GC-LC定量法来处理图谱：选定序列关联方法，指定目标峰为化合物4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在化合物校正中设置化合物的浓度单位为μmol/ml，每个级别值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1，在进样列表中指定对照样品为校正样品，对应其样品的峰面积和含量，获得DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程。在同等条件下，测得第二样品出现的峰面积，通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程，计算得4-二甲氨基吡啶(DMAP)的含量n＝0.14μmol/ml。另测得多糖含量m＝1866.17μg/ml。
活化度(％)＝n*122*a/m×100％，33F型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度为1.8％。
上述实施例得到的数据如下表所示：
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根据表中数据可以明确得知各型肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (6)
1.一种多糖活化度的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
对供试品进行预处理：取部分作为第一样品，并获得第一样品中多糖含量，记为m；另取一部分进行酸水解处理，得到第二样品，其中所述供试品为活化的肺炎链球菌荚膜多糖，且所述预处理包括透析处理，用于去除供试品中游离的DMAP；
依据DMAP对照样品获得关于DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程；
在同等条件下对第二样品进行处理得到对应的DMAP的峰面积，并通过DMAP的峰面积-含量标准线性回归方程获得第二样品中的DMAP含量，记为n，其中所述同等条件为：流动相为乙腈：磷酸二氢钠(2.5-5.5g/L)＝8-20:80-92，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测器波长280nm；
依据第二样品中的DMAP含量和第一样品中的多糖含量，获得所述供试品的活化度，其中所述供试品的活化度的计算公式如下：活化度(％)＝n*122*a/m×100％，
其中，122为DMAP相对分子量，a为透析后的供试品在酸水解处理时的稀释倍数，所述酸水解溶液包括盐酸溶液，且盐酸溶液的浓度为0.15-0.22μmol/ml，
其中测量所述第二样品中DMAP含量的方法包括RP-HPLC法。
2.如权利要求1所述的多糖活化度的测定方法，其特征在于，所述透析处理的时间为16-24h。
3.如权利要求1所述的多糖活化度的测定方法，其特征在于，所述酸水解时间为0.5-6h。
4.如权利要求1所述的多糖活化度的测定方法，其特征在于，所述酸水解的温度为20-22℃。
5.如权利要求1所述的多糖活化度的测定方法，其特征在于，所述第二样品的处理包括过滤。
6.如权利要求5所述的多糖活化度的测定方法，其特征在于，所述过滤包括滤膜过滤，所述滤膜的孔径包括0.22、0.3、0.4和0.45μm。
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