CN114544841A - 一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中dmap残留量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其中，所述检测方法采用高效液相色谱法检测肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中的DMAP残留量，其中流动相为5mmol/L庚烷磺酸钠溶液与乙腈混合液，色谱柱为C18色谱柱。本发明采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法采用反相离子对色谱法，通过优化的色谱条件，实现了DMAP在色谱柱上的保留，并且排除了溶剂和杂质的干扰，准确度高，重复性好，将该方法用于肺炎球菌‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的测定，结果良好。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，属于疫苗的下游生产领域。
背景技术
肺炎球菌是肺炎、脑膜炎、中耳炎和鼻窦炎的主要病原菌，也是引起婴幼儿和老年人发病和死亡的重要病因。细菌荚膜多糖疫苗在预防由肺炎球菌、脑膜炎球菌、流感嗜血杆菌等引起的侵袭性疾病均有良好的效果，但肺炎球菌荚膜多糖是属于非T细胞依赖性抗原，婴幼儿的免疫系统发育不完全，多糖抗原不能对两岁以下幼儿产生有效免疫应答，而多糖-蛋白结合疫苗可将非T细胞依赖性抗原转变为T细胞依赖性抗原，并在婴幼儿体内产生免疫原性和保护力。
多糖-蛋白结合疫苗是通过化学方法将多糖抗原与载体蛋白共价结合，多糖-蛋白结合疫苗制备工艺中常见的多糖活化剂有溴化氰和1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟化硼(CDAP)。溴化氰可以在水环境下几分钟内完成活化过程，操作简便，但是它毒性较大。相对溴化氰，CDAP活化条件相对温和，活化效率更高，而毒性却低很多，因此近年来，CDAP被广泛应用于多糖-蛋白结合疫苗工艺制备中。
文献报道CDAP活化多糖有两种机理，第一种活化机理中，CDAP上氰基活化多糖上的羟基，产生多糖衍生物和DMAP，而第二种活化机理中CDAP上的氰基活化多糖上的羟基后产生多糖衍生物，此时并无DMAP产生，而DMAP是在蛋白加入之后产生。
第一种活化机理：
第二种活化机理：
无论哪种活化机理，CDAP最终都转化为DMAP，而相对于溴化氰，DMAP是一种低毒性化合物，但仍具有毒性、刺激性，可损伤眼睛、皮肤、呼吸系统和神经系统等，危害人体健康，因此控制和监测多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量，对于保障其质量和使用安全性具有非常重要的意义。
目前DMAP检测的相关研究较少，已有报道采用GC-MS和HPLC法测定，其中GC-MS法测定灵敏度高，但方法较为繁琐，而且检测成本较高；HPLC法检测具有操作简便，专属性强，检测成本低等优点，但是DMAP是一种强极性碱性化合物，在常规反相色谱上无保留，无法实现与溶剂峰的分离。本申请采用离子对反相色谱法，不仅实现了DMAP在色谱柱上的保留，同时也实现了CDAP在色谱柱上的保留，并且可有效的将二者分离。此方法可对多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量有效监测，也可验证CDAP活化多糖的反应机理，为结合疫苗的质量控制提供了依据。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法的技术方案如下：
所述检测方法采用高效液相色谱法检测肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中的DMAP残留量，其中流动相为5mmol/L庚烷磺酸钠溶液与乙腈混合液，色谱柱为C18色谱柱。
由于DMAP是一种强极性的碱性化合物，在反相色谱分离模式下无保留，且峰形不佳。为增加保留、改善峰形，考察了氨水溶液-乙腈体系、醋酸铵溶液-乙腈体系、庚烷磺酸钠/磷酸二氢钾(离子对缓冲液)溶液-乙腈体系对DMAP保留行为和峰形的影响。结果表明，氨水溶液-乙腈体系、醋酸铵溶液-乙腈体系下DMAP有保留，但是色谱峰拖尾，柱效低，而庚烷磺酸钠/磷酸二氢钾溶液-乙腈体系下，如图1所示，DMAP不仅有保留，而且峰形对称、柱效高，故选择庚烷磺酸钠/磷酸二氢钾溶液-乙腈体系为流动相，继而又考察了庚烷磺酸钠浓度、磷酸氢二钾浓度，离子对试剂缓冲液pH值，离子对试剂缓冲液与乙腈的比例对保留行为及峰形的影响。综合考虑DMAP的保留时间、峰形和色谱柱的长期稳定性，优选5mmol/L庚烷磺酸钠溶液(含20mmol/L磷酸二氢钾，磷酸调pH至3.0):乙腈＝13:87(V/V)作为流动相。考虑DMAP极性强的特点，选择嵌入了极性基团的C18色谱柱，在选定的5mmol/L庚烷磺酸钠溶液为流动相的条件下，考察了Ultimate Polar-RP和Sepax HP-C18两款极性C18色谱柱。前者柱效低，寿命短，故优选选择Sepax HP-C18色谱柱。
优选地，所述检测方法以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得出标准曲线Y＝1E+07X+340514，相关系数R2＝0.9999。进一步的，所述标准品的制备为：准确称取DMAP标准品50mg，用甲醇/水＝90/10(V/V)溶解并定容至50ml，浓度为1mg/ml。
作为一种优选的实施方式，标准品储备溶液，分别用流动相稀释至浓度为0.05μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、10μg/ml以绘制标准曲线。
优选地，DMAP作为CDAP的活化产物，CDAP活化多糖中间产物的制备步骤如下：
a)加入蛋白前中间产物制备：取肺炎球菌多糖溶液搅拌均匀，加入CDAP乙腈溶液，用NaOH调节pH至9.5，搅拌均匀，取样用0.45μm水系滤器过滤；
b)加入蛋白后中间产物制备：取肺炎球菌多糖溶液搅拌均匀，加入CDAP乙腈溶液，用NaOH调节pH至9.5，持续搅拌2min，加入CRM197蛋白溶液，用NaOH调节pH至9.5，搅拌均匀，取样用0.45μm水系滤器过滤。
优选地，供试品溶液的制备方法为：取1ml肺炎球菌多糖-蛋白结合液，加100μl10％脱氧胆酸钠溶液(现配现用)，涡旋混匀，于冰水浴中放置30min。取出后立即加入50μl盐酸溶液(86→1000)，涡旋混匀，10000rpm离心15min，取上清液用0.45μm水系滤器过滤。
与现有技术相比，本发明采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法采用反相离子对色谱法，通过优化的色谱条件，实现了DMAP在色谱柱上的保留，并且排除了溶剂和杂质的干扰。该方法准确度高，重复性好，将该方法用于肺炎球菌-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的测定，结果良好。
附图说明
图1为DMAP标准品与供试品色谱图；
图2为标准品与供试品光谱图；
图3为标准品与供试品光谱归一化图；
图4为中间产物DMAP检测色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
1仪器与试剂
带二极管阵列检测器的高效液相色谱仪(1260，安捷伦)，Sepax HP-C18(5μm,4.6×250mm，苏州赛分)，十万分之一电子天平(MS105DU，梅特勒-托利多)，pH计(FE20，梅特勒-托利多)，离心机(X1R，赛默飞)。
DMAP标准品(Sigma，纯度>99％)，CDAP标准品(Sigma，纯度>99％)，乙腈、甲醇(色谱纯，TEDIA)、庚烷磺酸钠(天津科密欧，分析纯)，脱氧胆酸钠(Sigma，分析纯)，磷酸二氢钾(默克，分析纯)，磷酸、盐酸(国药，分析纯)，肺炎球菌多糖-CRM197蛋白结合液(武汉博沃生物科技有限公司)。
2色谱条件
色谱柱：Sepax HP-C18(5μm，4.6×250mm)，流动相：5mmol/L庚烷磺酸钠溶液(含20mmol/L磷酸二氢钾，磷酸调pH至3.0):乙腈＝87:13(V/V)，检测波长：280nm，流速：1ml/min，进样体积：10μl，柱温：35℃。
3样品制备
3.1标准品储备溶液制备
准确称取DMAP标准品50mg，用甲醇/水＝90/10(V/V)溶解并定容至50ml，浓度为1mg/ml。
3.2标准品工作溶液制备
取标准品储备溶液，分别用流动相稀释至浓度为0.05μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、10μg/ml。
3.3供试品溶液制备
取1ml肺炎球菌多糖-蛋白结合液，加100μl10％脱氧胆酸钠溶液(现配现用)，涡旋混匀，于冰水浴中放置30min。取出后立即加入50μl盐酸溶液(86→1000)，涡旋混匀，10000rpm离心15min，取上清液用0.45μm水系滤器过滤。
3.4空白溶液制备
取1ml去离子水，按照3.3方式处理。
3.5CDAP活化多糖中间产物制备
第一步中间产物制备(加入蛋白之前)：取肺炎球菌多糖溶液搅拌均匀，加入CDAP乙腈溶液，用NaOH调节pH至9.5，搅拌均匀，取样用0.45μm水系滤器过滤。
第二步中间产物制备(加入蛋白之后)：取肺炎球菌多糖溶液搅拌均匀，加入CDAP乙腈溶液，用NaOH调节pH至9.5，持续搅拌2min，加入CRM197蛋白溶液，用NaOH调节pH至9.5，搅拌均匀，取样用0.45μm水系滤器过滤。
4专属性检测
分别取13种血清型的肺炎球菌多糖-蛋白结合液经处理后，进样分析。在DMAP出峰处无杂质干扰，对比DMAP标准品光谱图和供试品中DMAP色谱峰的光谱图，如图2所示发现两者光谱图一致，光谱图归一化后两者完全重合(如图3所示)，并且利用二极管阵列检测器的峰纯度鉴定功能得出供试品中DMAP色谱峰纯度为99.8％，表明该方法不受供试品基质和前处理溶剂的影响，是一种高选择性的分离方法。
5检出限、定量限检测
将0.1μg/ml DMAP标准品工作溶液逐级稀释，进样检测，当某一浓度DMAP标准品溶液所产生的信号值为3倍和10倍噪声值时，该浓度即为仪器的检出限和定量限，带入稀释倍数(1.15)，计算方法检出限和定量限。结果表明，浓度为3.1ng/ml和12.5ng/ml的DMAP标准品溶液的信噪比(S/N)分别为4.1和14.2，则该方法的检出限和定量限分别为3.6ng/ml和14.4ng/ml。
6线性检测
将浓度分别为0.05、0.1、1、2、10μg/ml的DMAP标准品工作溶液分别进样分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得出标准曲线Y＝1E+07X+340514，相关系数R2＝0.9999，该方法在0.05～10μg/ml范围内，线性相关性良好。
7准确度检测
为考察供试品所有浓度范围的准确度，取DMAP残留量最高和最低的2种血清型肺炎球菌多糖-CRM197单价原液为供试品，分别向其中加入已知量的DMAP对照品，三个浓度水平加标，每个加标浓度水平平行加标测定3次。将实测值与理论值比较，计算加标回收率。从表1中数据可得，加标回收率在83～105％之间，满足痕量分析的准确度要求，表明该方法具有较高的准确度。
表1供试品加标回收率结果
3.6重复性和重现性
取单价原液混合液为供试品，由一名实验员在同一天内平行测定6次，计算6次测定结果的相对标准偏差考察方法的重复性；在不同实验室间，在不同天由不同的实验员平行测定24次，计算24次测定结果的相对标准偏差，考察方法的重现性。结果表明，同一实验员平行6次测定的RSD值为0.28～0.72％，不同实验员平行24次测定的RSD值为7.38％。
表2重复性和重现性结果
8肺炎球菌多糖-CRM197蛋白结合液中DMAP残留量测定
将该方法用于肺炎球菌多糖-CRM197蛋白结合液中DMAP残留量的检测，13种不同血清型的肺炎球菌多糖-CRM197蛋白单价原液中DMAP的残留量在0.135～1.635μg/ml之间。
9CDAP活化多糖反应机理验证
分别将步骤3.5的中间产物进样分析，如图4所示，第一步中间产物进样分析，即可检测出DMAP，且产物稳定，而此时并无残留的CDAP存在，此结果可证实CDAP活化多糖为第一种活化机理，即CDAP活化多糖后立即转化为DMAP，产生的多糖衍生物再和蛋白结合。结果表明采用反相离子对色谱法，通过优化的色谱条件，实现了DMAP在色谱柱上的保留，并且排除了溶剂和杂质的干扰。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述检测方法采用高效液相色谱法检测肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中的DMAP残留量，其中流动相为5mmol/L庚烷磺酸钠溶液与乙腈混合液，色谱柱为C18色谱柱。
2.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，5mmol/L庚烷磺酸钠溶液与乙腈混合液的体积比为13:87。
3.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述5mmol/L庚烷磺酸钠溶液含20mmol/L磷酸二氢钾，磷酸调pH至3.0。
4.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述检测方法以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得出标准曲线Y＝1E+07X+340514，相关系数R2＝0.9999。
5.根据权利要求4所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，绘制所述标准曲线的标准品浓度为1mg/ml。
6.根据权利要求5所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述标准品的制备为：准确称取DMAP标准品50mg，用甲醇/水＝90/10(V/V)溶解并定容至50ml。
7.根据权利要求5所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述标准品溶液分别用流动相稀释至浓度为0.05μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、10μg/ml以绘制标准曲线。
8.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述色谱柱为Sepax HP-C18色谱柱。
9.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，DMAP作为CDAP的活化产物，CDAP活化多糖中间产物的制备步骤如下：
a)加入蛋白前中间产物制备：取肺炎球菌多糖溶液搅拌均匀，加入CDAP乙腈溶液，用NaOH调节pH至9.5，搅拌均匀，取样用0.45μm水系滤器过滤；
b)加入蛋白后中间产物制备：取肺炎球菌多糖溶液搅拌均匀，加入CDAP乙腈溶液，用NaOH调节pH至9.5，持续搅拌2min，加入CRM197蛋白溶液，用NaOH调节pH至9.5，搅拌均匀，取样用0.45μm水系滤器过滤。
10.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，供试品溶液的制备方法为：取1ml肺炎球菌多糖-蛋白结合液，加100μl10％脱氧胆酸钠溶液(现配现用)，涡旋混匀，于冰水浴中放置30min。取出后立即加入50μl盐酸溶液(86→1000)，涡旋混匀，10000rpm离心15min，取上清液用0.45μm水系滤器过滤。
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