CN110940746A - 一种分析肉桂多糖中单糖组成的测定方法 - Google Patents

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许蔼飞
孟冬玲
范忠
朱静
唐桂芳
陈志燕
周芸
蒋光辉
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Abstract

本发明公开了一种分析肉桂多糖中单糖组成的测定方法，采用水提醇沉法提取肉桂多糖，得到肉桂粗多糖物质，粗多糖水解后，水解液经有机滤膜过滤，采用高效液相色谱‑电喷雾检测器法(HPLC‑CAD)测定肉桂多糖中的单糖组成。本发明采用高效液相色谱‑电喷雾检测器检测肉桂多糖的单糖组成，水解后的多糖样品直接进样，无需衍生化，缩短了前处理所需的时间，本方法可快速、准确检测出肉桂多糖中的单糖组成，且重复性和回收率好，适用于大批量样品的分析。

Description

一种分析肉桂多糖中单糖组成的测定方法
技术领域
本发明属于理化检验技术领域，具体涉及分析肉桂多糖中单糖组成的测定方法。
背景技术
多糖具有广泛的生理活性，如：免疫调节作用、抗肿瘤、降血脂、抗衰老等作用。活性多糖组成往往比较复杂，对其进行单糖组成分析，对于进一步确定其结构，具有重要意义。多糖的单糖组成测定有多种方法，如薄层色谱法、气相色谱法、高效毛细管电泳法、柱前衍生-高效液相色谱法等。但目前通过高效液相色谱-电喷雾检测器法(HPLC-CAD)分析肉桂多糖的单糖组成未见公开报道，为方便、高效检测肉桂多糖的单糖组成，建立高效液相色谱-电喷雾检测器法(HPLC-CAD)分析肉桂多糖的单糖组成测定方法意义重大。
发明内容
本发明弥补了现有分析技术的不足，提供一种分析肉桂多糖中单糖组成的测定方法。
本发明的技术方案是提供一种分析肉桂多糖中单糖组成的测定方法，其具体方法为：
①提取粗多糖：采用水提醇沉法提取肉桂多糖，得到多糖物质；
②配制单糖混合标准溶液：配制鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖7种单糖混合标准溶液，浓度为1000ug/ml；
③样品前处理及分析：准确称取一定量多糖样品，加入浓度2mol/L的稀硝酸溶液2mL，于120℃条件下反应水解15小时。水解完成待样品冷却至室温后，将其转移至比色管中，再用氢氧化钠溶液(1mol/L)中和至pH＝7.0，用超纯水定容到刻度线，离心后上清液过有机滤膜，供分析用。
④标准曲线的绘制：将1000ug/ml7种单糖混合标准储备液，逐级稀释成0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml系列标准溶液，用水定容，摇匀，得6级工作标准溶液；对上述系列标准溶液进行液相色谱分析，以各单糖的峰面积和对应的质量浓度进行线性回归分析，求得7种单糖的标准曲线；
⑤数据处理与检测：按外标法，根据回归方程，由组分峰面积计算组分浓度；
进一步地，在步骤③中，称取的粗多糖量为6mg；
进一步地，在步骤③中，比色管体积为15ml；
进一步地，在步骤③中，有机滤膜为0.45μm尼龙滤膜过滤；
进一步地，在步骤③和④中，液相色谱配备的检测器为电喷雾检测器(CAD)；
进一步地，在步骤③和④中，高效液相色谱条件为：
色谱柱：Grace_Alltech Prevail Carb-ES 5um,4.6x 250mm糖色谱柱；
进样量15μl；
柱温为25℃；
流速为0.8ml/min，，梯度洗脱程序为：
Figure BDA0002297124880000021
进一步地，在步骤③和④中，检测器为电喷雾检测器(CAD)，主要参数为：雾化器温度：35℃。
本发明的有益效果是：
本发明使用的仪器和设备均为实验室常规分析设备，发明方法易于推广，检测成本低；
本发明采用电喷雾检测器(CAD)，方法的前处理不需要进行衍生化反应，提高了检测效率。
本发明首次提出了采用高效液相色谱-电喷雾检测器法(HPLC-CAD)测定肉桂多糖的单糖组成分析方法，方法分析速度快，重复性和回收率好，适用于大批量样品的分析。
附图说明
图1是七种单糖的标准色谱图；其中，1-鼠李糖，2-阿拉伯糖，3-果糖，4-甘露糖，5-葡萄糖，6-蔗糖，7-麦芽糖
图2是肉桂多糖样品色谱图；
其中，1-鼠李糖，2-阿拉伯糖，3-果糖，5-葡萄糖，6-蔗糖，7-麦芽糖
具体实施方式
为便于更好的理解本发明，本发明结合具体的实施例进一步说明：
实施例1
仪器与试剂、材料：七种单糖的标准品：鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖(德国Dr.Ehrensorfer公司)；硝酸、乙醇和氢氧化钠均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司))；试验用水为二级水。液相色谱仪：型号为U3000RSLC(配置电喷雾检测器(CAD)，美国Thermo-Fisher公司)；冷冻干燥器(北京博医康实验仪器有限公司，FD-IA-50)；离心机：(型号为Sigma 3-30K德国SIGMA公司)；涡旋振荡器：(型号为945066美国HENRYTROEMNERLLC公司)；其他：0.45μm尼龙滤膜过滤头(上海兴亚净化材料厂)，布氏漏斗(巩义市予华仪器有限责任公司)，电热恒温水浴锅(德国MEMMERT公司)、旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)。
提取粗多糖：采用水提醇沉法提取肉桂多糖，得到多糖物质；
配制单糖混合标准溶液：配制鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖7种单糖混合标准溶液，浓度为1000ug/ml；
样品前处理及分析：准确称取肉桂多糖样品6mg，加入浓度2mol/L的稀硝酸溶液2mL，于120℃条件下反应水解15小时。水解完成待样品冷却至室温后，将其转移至比色管中，再用氢氧化钠溶液(1mol/L)中和至pH＝7.0，用超纯水定容到刻度线，离心后上清液过有机滤膜，供分析用。
高效液相色谱条件：
色谱柱：Grace_Alltech Prevail Carb-ES 5um,4.6x 250mm糖色谱柱；
进样量15μL；
柱温为25℃；
流速为0.8mL/min，梯度洗脱程序如表1所示：
表1高效液相色谱梯度洗脱条件
Figure BDA0002297124880000041
标准曲线的绘制：将1000ug/ml7种单糖混合标准储备液，逐级稀释成0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml系列标准溶液，用水定容，摇匀，得6级工作标准溶液；对上述系列标准溶液进行液相色谱分析，以各单糖的峰面积和对应的质量浓度进行线性回归分析，求得7种单糖的标准曲线；7种单糖的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限如表2所示。
七种单糖的标准色谱图见图1。
表2 7种单糖的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限
Figure BDA0002297124880000051
精密度：为了考察方法的精密度，以水解后的肉桂多糖样品进行5次日内重复实验，测定结果表明7种单糖日内测定结果的相对标准偏差在2.24％～6.51％之间，表明方法的日内精密度良好。同时，对样品进行了5天日间重复实验，测定结果表明7种单糖日间测定结果的相对标准偏差在3.12％～8.44％之间，结果表明该方法的日间重复性良好。
回收率：采用样品加标法，对水解后的肉桂多糖样品在高、中、低三个含量水平上进行了回收率的测定，结果表明，7种单糖的平均回收率的结果在94.16％-100.48％之间，回收率较高，满足分析要求。
实际样品的测定：采用本发明建立的方法测定1个肉桂多糖的单糖组成,肉桂多糖样品色谱图见图2；样品中含有鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，摩尔比为：18.2:50.0:91.6:22.2:8.8:5.8。

Claims (7)

1.一种分析肉桂多糖中单糖组成的测定方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
①提取粗多糖：采用水提醇沉法提取肉桂多糖，得到多糖物质；
②配制单糖混合标准溶液：配制鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖7种单糖混合标准溶液，浓度为1000ug/ml；③样品前处理及分析：准确称取一定量多糖样品，加入浓度2mol/L的稀硝酸溶液2mL，于120℃条件下反应水解15小时。水解完成待样品冷却至室温后，将其转移至比色管中，再用1mol/L的氢氧化钠溶液()中和至pH＝7.0，用超纯水定容到刻度线，离心后上清液过有机滤膜，供分析用；④标准曲线的绘制：将1000ug/ml7种单糖混合标准储备液，逐级稀释成0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml系列标准溶液，用水定容，摇匀，得6级工作标准溶液；对上述系列标准溶液进行液相色谱分析，以各单糖的峰面积和对应的质量浓度进行线性回归分析，求得7种单糖的标准曲线；⑤数据处理与检测：按外标法，根据回归方程，由组分峰面积计算组分浓度。
2.根据权利要求1所述的分析肉桂多糖中单糖组成的测定方法，其特征在于：在步骤③中，称取的粗多糖量为6mg。
3.根据权利要求1所述的分析肉桂多糖中单糖组成的测定方法，其特征在于：在步骤③中，比色管体积为15ml。
4.根据权利要求1所述的分析肉桂多糖中单糖组成的测定方法，其特征在于：在步骤③中，所述有机滤膜为0.45μm尼龙滤膜。
5.根据权利要求1所述的分析肉桂多糖中单糖组成的测定方法，其特征在于：在步骤③和④中，液相色谱配备的检测器为电喷雾检测器(CAD)。
6.根据权利要求1所述的分析肉桂多糖中单糖组成的测定方法，其特征在于：在步骤③和④中，检测器为电喷雾检测器(CAD)，主要参数为：雾化器温度：35℃。
7.根据权利要求1-6中任一所述的分析肉桂多糖中单糖组成的测定方法，其特征在于：在步骤③和④中，液相色谱条件为：
色谱柱：Grace_Alltech Prevail Carb-ES 5um,4.6x 250mm糖色谱柱；
进样量15μl；
柱温为25℃；
流速为0.8ml/min，梯度洗脱程序为：
Figure FDA0002297124870000021
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