CN113109489B - 中药多糖醛糖、酮糖、糖醇、糖醛酸和氨基糖的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了中药多糖醛糖、酮糖、糖醇、糖醛酸和氨基糖的分析方法，包括：(1)分别制备木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的标准品工作液；(2)制备待检测的样品溶液；(3)采用超高效液相色谱‑质谱联用方法对待检测的样品溶液中醛糖、酮糖、糖醇、糖醛酸和氨基糖进行定性和定量分析。本发明所建立的分析方法符合方法学验证的要求，并且操作简便、灵敏度高、适用性强，具有良好的专属性、精密度、稳定性、重复性和准确度，能够用于对中药中多糖单糖组成的分析。

Description

中药多糖醛糖、酮糖、糖醇、糖醛酸和氨基糖的分析方法

技术领域

本发明涉及中药多糖和氨基酸的分析方法，尤其涉及一种同时对中药多糖中醛糖、酮糖、糖醇、糖醛酸和氨基糖进行定性和定量分析的方法，属于中药多糖和氨基酸的液相色谱质谱分析领域。

背景技术

中药多糖是指由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚合物，广泛存在于植物、微生物、藻类和动物体内。中药多糖对肿瘤、肝炎、心血管病等疾病的预防和治疗，以及调节糖代谢和抗衰老等方面具有独特的生物活性，且毒副作用低，被广泛研究和开发应用。由于中药多糖所具有生物活性与其结构紧密相关，而多糖的结构又相当复杂，有效成分及其结构和功能不清楚制约了它的发展，因此，多糖结构的测定越来越引起国内外科研工作者的兴趣，并成为当前的研究热点。

在中药多糖的结构特征、理化性质及其构效关系的研究中，单糖组成是最基本的研究对象。传统的衍生化方法主要包括1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、阿尔迪醇衍生化、糖腈衍生化，检测方法主要要包括高效液相仪、气相色谱-质谱联用仪、高效液相-质谱联用仪。然而，目前报道的分析方法对糖醛酸的灵敏度较低，并且不能同时对醛糖、酮糖和糖醇进行检测。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种能够同时定性和定量分析醛糖、酮糖、糖醇、糖醛酸和氨基糖的液相色谱质谱分析方法；

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：

一种同时定性和定量检测分析中药多糖中醛糖、酮糖、糖醇、糖醛酸和氨基糖的方法，包括：

(1)分别制备木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的标准品工作液；

(2)制备待检测的样品溶液；

(3)采用超高效液相色谱-质谱联用方法，对待检测的样品溶液中木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸进行定性和定量分析。

作为本发明一种优选的具体实施方案，制备木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的标准品工作液的方法优选为：

(a)分别将木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸对照品中加入盐酸羟胺再溶于吡啶进行反应；(b)反应液放凉后加入盐酸甲醇进行反应；(c)将步骤(b)的反应液减压浓缩至干加入0.1％盐酸甲醇溶液振荡后再次减压浓缩至干；(d)加入乙酸酐和吡啶进行反应；(e)向反应产物中加入氯仿后，加入少量超纯水充分震荡后，除去上层水溶液；(f)氯仿层氮气吹干，用乙腈溶解产物得到对照品溶液。

进一步优选的，步骤(a)中分别称定木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸的对照品各2.00mg，分别加入10mg盐酸羟胺，溶于500μL吡啶；步骤(a)中所述的反应优选在90℃下反应30min。

进一步优选的，步骤(b)中反应液放凉后加入0.9M盐酸甲醇2mL，所述的反应优选在100℃下反应1h。

进一步优选的，步骤(c)中将步骤(b)的反应液在50℃减压浓缩至干，加入0.1％盐酸甲醇溶液适量，振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次。

进一步优选的，步骤(d)中加入乙酸酐和吡啶各500μL在90℃下反应30min。

进一步优选的，步骤(e)中向反应产物加入1mL氯仿后，加入少量超纯水充分震荡后，除去上层水溶液，重复3次。

作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(2)中待检测的样品溶液的制备方法包括：

(a)将待检测的样品加入三氟乙酸进行水解反应；(b)将水解液减压浓缩至干加入甲醇溶液振荡后再次减压浓缩至干；(c)浓缩后的产物加入盐酸羟胺后溶于吡啶中进行反应；(d)步骤(c)的反应产物放凉后加入盐酸甲醇进行反应；(e)反应溶液减压浓缩至干后加入0.1％盐酸甲醇溶液，振荡后减压浓缩至干；(f)浓缩后的产物加入乙酸酐和吡啶进行反应后再加入氯仿，加入少量超纯水充分震荡除去上层水溶液；(g)氯仿层氮气吹干，乙腈溶解，过滤，制备得到样品溶液。

进一步优选的，步骤(a)中称取待检测的供试样品2.00mg，加入3M的三氟乙酸3mL；所述的水解反应的条件优选为在110℃的温度下水解5h。

进一步优选的，步骤(b)中将水解液50℃减压浓缩至干加入甲醇溶液适量振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次。

进一步优选的，步骤(c)中将浓缩后的产物加入10mg盐酸羟胺，溶于500μL吡啶于90℃下反应30min。

进一步优选的，步骤(d)中将反应产物放凉至室温后加入0.9M盐酸甲醇2mL在100℃下反应1h。

进一步优选的，步骤(e)中将反应溶液在50℃减压浓缩至干加入0.1％盐酸甲醇溶液适量，振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次。

进一步优选的，步骤(f)中加入乙酸酐和吡啶各500μL，于90℃下反应30min，加入1mL氯仿后，加入少量超纯水充分震荡后，除去上层水溶液，重复3次。

进一步优选的，步骤(g)所述的过滤采用0.22μm微孔滤膜过滤。

作为本发明一种优选的具体实施方案，优选的，步骤(3)中所述的超高效液相色谱-质谱联用方法的条件包括：

色谱柱：Waters Acquity BEH Shield RP 18column(150mm×2.1mm,1.7μm)；柱温：25℃；流速：0.3mL/min；进样量：1μL；流动相：A％∶B％＝0.1％甲酸水溶液∶0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱条件如下：0～10min，15％～23％ B；10～16min，23％ B；16～28min，23-28％B；采用电喷雾离子源，正模式下选用选择离子监测模式检测；锥孔电压：40V；探头温度：40℃；离子喷雾电压：4500.0V；离子源温度：450.0℃,帘气：30L/h；雾化气：50L/h,加热气：50L/h；碰撞电压：20-30V；去簇电压：80-120V；检测离子对：338→278(阿拉伯糖，木糖，核糖)；352→298(岩藻糖，鼠李糖)；410→350(葡萄糖，半乳糖，甘露糖)；470→338(果糖)；409→349(氨基葡萄糖，氨基半乳糖，氨基甘露糖)；457→397(葡萄糖醇，半乳糖醇，甘露糖醇)；396→336(葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸)。

其中，检测木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸的碰撞电压为20V；检测葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇以及甘露糖醇的碰撞电压为25V；检测果糖的碰撞电压为30V。

其中，检测木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖的去簇电压优选为80V；检测葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸的去簇电压优选为90V；检测氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇以及甘露糖醇的去簇电压优选为110V；检测果糖的去簇电压优选为120V。

当前国内外尚无将超高效液相色谱-质谱联用仪与糖腈衍生化方法相结合分析中药多糖中的单糖组成。本发明在超高效液相色谱-质谱联用的基础上，对糖腈衍生化进行改进，成功解决现有技术存在的问题，同时对中药多糖中木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸进行定性定量分析，进一步完善传统测定方法的不足，为中药多糖单糖组成分析提供了一种新的研究方法。

本发明的主要有益效果包括：

1、本发明建立的一种同时分析醛糖、酮糖、糖醇、糖醛酸和氨基糖的液相色谱-质谱联用方法，符合方法学验证的要求，并且操作简便，灵敏度高，测定准确，适用性强，有良好的专属性、精密度、稳定性、重复性和准确度，能够用于对中药中多糖单糖组成的分析。

2、目前，尚未有在糖腈衍生化的基础上，采用液相色谱-质谱联用技术，同时对醛糖、酮糖、糖醇、氨基糖、糖醛酸进行定性定量分析的方法，该方法准确可靠、简便快捷，可作为研究中药多糖中单糖组成的分析手段，为中药多糖的进一步研究提供理论基础。

附图说明

图1盐酸甲醇摩尔浓度优化结果。

图2盐酸甲醇反应时间优化结果。

图3碰撞电压优化结果。

图4去簇电压优化结果。

图5专属性试验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1对川芎多糖样品中的醛糖、酮糖、糖醇、糖醛酸和氨基糖进行定性和定量分析

步骤1：木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸标准品工作液的制备：

精密称定木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸对照品各2.00mg，分别加入10mg盐酸羟胺，溶于500μL吡啶，于90℃下反应30min，放凉至室温，加入0.9M盐酸甲醇2mL，100℃下反应1h，溶液在50℃减压浓缩至干，加入0.1％盐酸甲醇溶液适量，振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次，加入乙酸酐和吡啶各500μL，于90℃下反应30min，加入1mL氯仿后，加入少量超纯水充分震荡后，除去上层水溶液，重复3次，氯仿层氮气吹干，乙腈溶解得17种单项对照品溶液。

步骤2：川芎多糖供试品溶液的制备：

精密称定川芎多糖供试品2.00mg，加入3M的三氟乙酸3mL，在110℃水解5h,将水解液50℃减压浓缩至干，加入甲醇溶液适量，振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次，浓缩后分别加入10mg盐酸羟胺，溶于500μL吡啶，于90℃下反应30min，放凉至室温，加入0.9M盐酸甲醇2mL，100℃下反应1h，溶液在50℃减压浓缩至干，加入0.1％盐酸甲醇溶液适量，振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次，加入乙酸酐和吡啶各500μL，于90℃下反应30min，加入1mL氯仿后，加入少量超纯水充分震荡后，除去上层水溶液，重复3次，氯仿层氮气吹干，乙腈溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。

步骤3：以超高效液相色谱-质谱联用技术为平台，川芎多糖供试品溶液中木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸含量的测定：

色谱柱：Waters Acquity BEH Shield RP 18column(150mm×2.1mm,1.7μm)；柱温：25℃；流速：0.3mL/min；进样量：1μL；流动相：A％∶B％＝0.1％甲酸水溶液∶0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱条件如下：0～10min，15％～23％B；10～16min，23％ B；16～28min，23-28％B；采用电喷雾离子源，正模式下选用选择离子监测模式检测；锥孔电压：40V；探头温度：40℃；离子喷雾电压：4500.0V；离子源温度：450.0℃,帘气：30L/h；雾化气：50L/h,加热气：50L/h；碰撞电压：20-30V；去簇电压：80-120V；检测离子对：338→278(阿拉伯糖，木糖，核糖)；352→298(岩藻糖，鼠李糖)；410→350(葡萄糖，半乳糖，甘露糖)；470→338(果糖)；409→349(氨基葡萄糖，氨基半乳糖，氨基甘露糖)；457→397(葡萄糖醇，半乳糖醇，甘露糖醇)；396→336(葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸)。

经过测定，该待检测物由半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖，半乳糖醛酸组成，摩尔比为1.00∶2.89∶0.11∶1.11。

实施例2对桔梗多糖样品中的醛糖、酮糖、糖醇、糖醛酸和氨基糖进行定性和定量分析

步骤1：木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸标准品工作液的制备：

精密称定木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸对照品各2.00mg，分别加入10mg盐酸羟胺，溶于500μL吡啶，于90℃下反应30min，放凉至室温，加入0.9M盐酸甲醇2mL，100℃下反应1h，溶液在50℃减压浓缩至干，加入0.1％盐酸甲醇溶液适量，振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次，加入乙酸酐和吡啶各500μL，于90℃下反应30min，加入1mL氯仿后，加入少量超纯水充分震荡后，除去上层水溶液，重复3次，氯仿层氮气吹干，乙腈溶解得17种单项对照品溶液。

步骤2：桔梗多糖供试品溶液的制备：

精密称定桔梗多糖供试品2.00mg，加入3M的三氟乙酸3mL，在110℃水解5h,将水解液50℃减压浓缩至干，加入甲醇溶液适量，振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次，浓缩后分别加入10mg盐酸羟胺，溶于500μL吡啶，于90℃下反应30min，放凉至室温，加入0.9M盐酸甲醇2mL，100℃下反应1h，溶液在50℃减压浓缩至干，加入0.1％盐酸甲醇溶液适量，振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次，加入乙酸酐和吡啶各500μL，于90℃下反应30min，加入1mL氯仿后，加入少量超纯水充分震荡后，除去上层水溶液，重复3次，氯仿层氮气吹干，乙腈溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。

步骤3：以超高效液相色谱-质谱联用技术为平台，川牛膝多糖供试品溶液中木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸含量的测定：

色谱柱：Waters Acquity BEH Shield RP18 column(150mm×2.1mm,1.7μm)；柱温：25℃；流速：0.3mL/min；进样量：1μL；流动相：A％∶B％＝0.1％甲酸水溶液∶0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱条件如下：0～10min，15％～23％ B；10～16min，23％ B；16～28min，23-28％B；采用电喷雾离子源，正模式下选用选择离子监测模式检测；锥孔电压：40V；探头温度：40℃；离子喷雾电压：4500.0V；离子源温度：450.0℃,帘气：30L/h；雾化气：50L/h,加热气：50L/h；碰撞电压：20-30V；去簇电压：80-120V；检测离子对：338→278(阿拉伯糖，木糖，核糖)；352→298(岩藻糖，鼠李糖)；410→350(葡萄糖，半乳糖，甘露糖)；470→338(果糖)；409→349(氨基葡萄糖，氨基半乳糖，氨基甘露糖)；457→397(葡萄糖醇，半乳糖醇，甘露糖醇)；396→336(葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸)。

经过测定，该待检测物由半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖醛酸组成，摩尔比为1.00∶3.04∶10.81∶14.69∶5.22。

实施例3对川牛膝多糖样品中的醛糖、酮糖、糖醇、糖醛酸和氨基糖进行定性和定量分析

步骤1：木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸标准品工作液的制备：

精密称定木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸对照品各2.00mg，分别加入10mg盐酸羟胺，溶于500μL吡啶，于90℃下反应30min，放凉至室温，加入0.9M盐酸甲醇2mL，100℃下反应1h，溶液在50℃减压浓缩至干，加入0.1％盐酸甲醇溶液适量，振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次，加入乙酸酐和吡啶各500μL，于90℃下反应30min，加入1mL氯仿后，加入少量超纯水充分震荡后，除去上层水溶液，重复3次，氯仿层氮气吹干，乙腈溶解得17种单项对照品溶液。

步骤2：川牛膝多糖供试品溶液的制备：

精密称定川牛膝多糖供试品2.00mg，加入3M的三氟乙酸3mL，在110℃水解5h,将水解液50℃减压浓缩至干，加入甲醇溶液适量，振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次，浓缩后分别加入10mg盐酸羟胺，溶于500μL吡啶，于90℃下反应30min，放凉至室温，加入0.9M盐酸甲醇2mL，100℃下反应1h，溶液在50℃减压浓缩至干，加入0.1％盐酸甲醇溶液适量，振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次，加入乙酸酐和吡啶各500μL，于90℃下反应30min，加入1mL氯仿后，加入少量超纯水充分震荡后，除去上层水溶液，重复3次，氯仿层氮气吹干，乙腈溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。

步骤3：以超高效液相色谱-质谱联用技术为平台，川牛膝多糖供试品溶液中木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸含量的测定：

色谱柱：Waters Acquity BEH Shield RP18 column(150mm×2.1mm,1.7μm)；柱温：25℃；流速：0.3mL/min；进样量：1μL；流动相：A％∶B％＝0.1％甲酸水溶液∶0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱条件如下：0～10min，15％～23％B；10～16min，23％ B；16～28min，23-28％B；采用电喷雾离子源，正模式下选用选择离子监测模式检测；锥孔电压：40V；探头温度：40℃；离子喷雾电压：4500.0V；离子源温度：450.0℃,帘气：30L/h；雾化气：50L/h,加热气：50L/h；碰撞电压：20-30V；去簇电压：80-120V；检测离子对：338→278(阿拉伯糖，木糖，核糖)；352→298(岩藻糖，鼠李糖)；410→350(葡萄糖，半乳糖，甘露糖)；470→338(果糖)；409→349(氨基葡萄糖，氨基半乳糖，氨基甘露糖)；457→397(葡萄糖醇，半乳糖醇，甘露糖醇)；396→336(葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸)。

经过测定，该待检测物由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖，葡萄糖氨基糖、半乳糖氨基糖、果糖、半乳糖醛酸组成，摩尔比为1.00∶4.30∶4.08∶2.05∶0.14∶0.14∶0.11∶2.14∶1.67。

试验例1衍生化条件以及质谱检测条件的考察试验

1.1盐酸甲醇摩尔浓度的考察

在酸性条件下，糖醛酸的羧基与甲醇反应，生成甲酯，产物结构稳定，灵敏度高，因此需考察还原后加入盐酸甲醇的摩尔浓度对糖醛酸甲酯化反应的影响。还原后加入0.2-1.8M盐酸甲醇2mL，100℃下反应1h，溶液在50℃减压浓缩至干，加入0.1％盐酸甲醇溶液适量，振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次。结果表明盐酸甲醇摩尔浓度与葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的反应程度呈正相关，当超摩尔浓度为0.9M时，葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的甲酯化程度完全(图1)。

1.2盐酸甲醇反应时间的考察

还原后加入0.9M盐酸甲醇2mL，100℃下反应0.25-2h，溶液在50℃减压浓缩至干，加入0.1％盐酸甲醇溶液适量，振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次。结果表明，葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的响应强度随盐酸甲醇摩尔浓度的升高而增强，当超反应时间为1h时，葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的甲酯化程度较完全(图2)。

2.质谱条件的考察

2.1碰撞电压的考察

采用电喷雾离子源，正模式下选用选择离子监测模式检测；锥孔电压：40V；探头温度：40℃；离子喷雾电压：4500.0V；离子源温度：450.0℃,帘气：30L/h；雾化气：50L/h,加热气：50L/h；碰撞电压：10-35V；去簇电压：70V；检测离子对：338→278(阿拉伯糖，木糖，核糖)；352→298(岩藻糖，鼠李糖)；410→350(葡萄糖，半乳糖，甘露糖)；470→338(果糖)；409→349(氨基葡萄糖，氨基半乳糖，氨基甘露糖)；457→397(葡萄糖醇，半乳糖醇，甘露糖醇)；396→336(葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸)。结果如图3所示，碰撞电压对分析物的灵敏程度影响很大，每个化合物最优碰撞电压如表1所示。

2.2去簇电压的考察

采用电喷雾离子源，正模式下选用选择离子监测模式检测；锥孔电压：40V；探头温度：40℃；离子喷雾电压：4500.0V；离子源温度：450.0℃,帘气：30L/h；雾化气：50L/h,加热气：50L/h；碰撞电压：20V；去簇电压：60-130V；检测离子对：338→278(阿拉伯糖，木糖，核糖)；352→298(岩藻糖，鼠李糖)；410→350(葡萄糖，半乳糖，甘露糖)；470→338(果糖)；409→349(氨基葡萄糖，氨基半乳糖，氨基甘露糖)；457→397(葡萄糖醇，半乳糖醇，甘露糖醇)；396→336(葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸)。结果如图4所示，随着去簇电压增大，分析物灵敏度增大，当去簇电压达到一定数值后，分析物的响应强度开始下降，每个化合物的最优去簇电压如表1所示。

表1碰撞电压、去簇电压优化结果

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试验例2本发明方法的方法学考察试验

1专属性试验

混合对照品溶液和川芎、桔梗、川牛膝供试品溶液，按确定的检测条件测定，色谱图详见图5。专属性结果表明，色谱峰相应保留时间附近无色谱峰出现，表明该方法具有良好的专属性。

2检出限(LOD)和定量限(LOQ)

精密吸取对照品溶液适量，加乙腈逐步稀释对照品溶液，配制成每1mL含17种单项对照品各40μg的对照品混合溶液，按确定的检测条件测定，至对照品峰高为相应噪音峰高的3倍，得到检出限；至对照品峰高为相应噪音峰高的10倍，得到定量限，见表1。

3标准曲线的制备

精密吸取对照品溶液适量，加乙腈稀释，配制成17种单项对照品的浓度均为2，10，20，40，60，80，100μg/mL的对照品混合溶液，按确定的检测条件测定，以对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和R²值。结果如表2所示，17种对照品在2～100μg/mL的范围内线性良好。

表2检出限、定量限和线性试验结果

4精密度试验

精密吸取对照品溶液适量，加甲醇稀释，配制成每1mL含17种单项对照品各40μg的对照品混合溶液，按确定的检测条件测定，连续进样6次，测定17种对照品峰面积。结果表示，木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的日间精密度RSD％分别为0.75％，1.44％，0.49％，1.44％，0.39％，0.32％，1.24％，0.75％，1.00％，0.37％，1.70％，1.46％，0.34％，0.73％，0.52％，0.67％；日内精密度RSD％分别为1.84％，1.26％，3.89％，2.51％，1.29％，1.14％，1.35％，1.01％，1.29％，0.70％，1.42％，1.58％，1.40％，0.46％，2.30％，0.73％，3.10％，结果表明该方法具有良好的精密度。

5稳定性试验

精密吸取对照品溶液适量，加甲醇稀释，配制成每1mL含17种单项对照品各40μg的对照品混合溶液，按确定的检测条件，分别在0、4、8、12、24、48h测定10种对照品峰面积。木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的日间精密度RSD％分别2.60％、2.24％、3.00％、1.75％、2.01％、3.19％、3.76％、3.87％、2.98％、4.15％、3.74％、3.44％、1.30％、1.83％、1.50％、2.30％、2.92％，结果表明供试品溶液在48h内稳定。

6重复性试验

精密吸取对照品溶液适量，加甲醇稀释，配制成每1mL含17种单项对照品各40μg的对照品混合溶液，共6份，按确定的检测条件测定，测定测定10种对照品峰面积。木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的日间精密度RSD％分别为0.80％、2.78％、2.67％、0.48％、1.11％、1.09％、1.67％、1.93％、1.94％、1.49％、2.43％、2.17％、0.58％、0.98％、1.36％、0.68％、2.64％，结果表明该方法具有良好的重复性。

7准确度试验

精密称取已知含量的川牛膝(每5g中含阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖醛酸各0.04154g、0.00301g、0.10459g、0.02435g、0.09922g、0.05672g、0.00351g、0.00258g、0.04374g)2.00mg共6份，均按步骤2制备川牛膝的供试品溶液1mL，分别加入木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的混合对照品溶液(浓度分别为0.02mg/mL、0.02mg/mL、0.02mg/mL、0.015mg/mL、0.015mg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL、0.04mg/mL、0.025mg/mL、0.0015mg/mL、0.04mg/mL、0.01mg/mL、0.01mg/mL、0.01mg/mL、0.001mg/mL、0.06mg/mL、0.02mg/mL)，按确定的检测条件测定，计算回收率。木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的的回收率分别为100.93％、95.37％、98.18％、100.59％、102.49％、99.45％、101.63％、101.10％、97.63％、104.27％、98.54％、103.40％、98.21％、101.46％、102.97％、101.37％、103.31％、RSD％分别为3.22％、1.79％、2.28％、2.62％、2.32％、3.37％、1.17％、2.88％、1.24％、1.20％、1.31％、1.49％、1.91％、1.40％、1.36％、1.41％、1.85％，结果表明该方法具有良好的准确度。

Claims (6)

1.对中药多糖中醛糖、酮糖、糖醇、糖醛酸和氨基糖的组成种类或含量同时进行分析的方法，其特征在于，包括：

(1)分别制备木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的标准品工作液；所述制备木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的标准品工作液的方法包括：(a)分别将木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸对照品中加入盐酸羟胺再溶于吡啶进行反应；(b)反应液放凉后加入盐酸甲醇进行反应；(c)将步骤(b)的反应液减压浓缩至干加入0.1％盐酸甲醇溶液振荡后再次减压浓缩至干；(d)加入乙酸酐和吡啶进行反应；(e)向反应产物中加入氯仿后再加入少量超纯水充分震荡后，除去上层水溶液；(f)氯仿层氮气吹干，用乙腈溶解产物得到对照品溶液；

(2)制备待检测的样品溶液；所述待检测的样品溶液的制备方法包括：

(Ⅰ)将待检测的样品加入三氟乙酸进行水解反应；(Ⅱ)将水解液减压浓缩至干加入甲醇溶液振荡后再次减压浓缩至干；(Ⅲ)浓缩后的产物加入盐酸羟胺后溶于吡啶中进行反应；(Ⅳ)步骤(Ⅲ)的反应产物放凉后加入盐酸甲醇进行反应；(Ⅴ)反应溶液减压浓缩至干后加入0.1％盐酸甲醇溶液，振荡后减压浓缩至干；(Ⅵ)浓缩后的产物加入乙酸酐和吡啶进行反应后再加入氯仿，加入少量超纯水充分震荡除去上层水溶液；(Ⅶ)氯仿层氮气吹干，乙腈溶解，过滤，制备得到样品溶液；

(3)采用超高效液相色谱-质谱联用方法，对待检测的样品溶液中木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的组成种类或含量进行分析；所述的超高效液相色谱-质谱联用方法的条件包括：色谱柱：Waters Acquity BEH ShieldRP18 column；柱温：25℃；流速：0.3mL/min；进样量：1μL；

流动相：A％∶B％＝0.1％甲酸水溶液∶0.1％甲酸乙腈；

梯度洗脱条件如下：0～10min，15％～23％B；10～16min，23％B；16～28min，23-28％B；采用电喷雾离子源，正模式下选用选择离子监测模式检测；碰撞电压：20-30V；去簇电压：80-120V；检测离子对：338→278阿拉伯糖，木糖，核糖；352→298岩藻糖，鼠李糖；410→350葡萄糖，半乳糖，甘露糖；470→338果糖；409→349氨基葡萄糖，氨基半乳糖，氨基甘露糖；457→397葡萄糖醇，半乳糖醇，甘露糖醇；396→336葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中分别称定木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸的对照品各2.00mg，分别加入10mg盐酸羟胺溶于500μL吡啶；步骤(a)中所述的反应在90℃下反应30min；

步骤(b)中反应液放凉后加入0.9M盐酸甲醇2mL，所述的反应在100℃下反应1h；

步骤(c)中将步骤(b)的反应液在50℃减压浓缩至干，加入0.1％盐酸甲醇溶液适量，振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次；

步骤(d)中加入乙酸酐和吡啶各500μL，于90℃下反应30min；

步骤(e)中向反应产物加入1mL氯仿后，加入少量超纯水充分震荡后，除去上层水溶液，重复3次。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，在制备待检测的样品溶液时,步骤(Ⅰ)中称取待检测的供试样品2.00mg，加入3M的三氟乙酸3mL；所述的水解反应为在110℃的温度下水解5h；

步骤(Ⅱ)中将水解液50℃减压浓缩至干加入甲醇溶液适量振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次；

步骤(Ⅲ)中将浓缩后的产物加入10mg盐酸羟胺溶于500μL吡啶于90℃下反应30min；

步骤(Ⅳ)中将反应产物放凉至室温后加入0.9M盐酸甲醇2mL在100℃下反应1h；

步骤(Ⅴ)中将反应溶液在50℃减压浓缩至干加入0.1％盐酸甲醇溶液适量，振荡后50℃减压浓缩至干，重复三次；

步骤(Ⅵ)中加入乙酸酐和吡啶各500μL在90℃下反应30min后加入1mL氯仿，再加入少量超纯水充分震荡后，除去上层水溶液，重复3次；

步骤(Ⅵ)所述的过滤采用0.22μm微孔滤膜过滤。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，检测木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸的碰撞电压为20V；检测葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇或甘露糖醇的碰撞电压为25V；检测果糖的碰撞电压为30V；

检测木糖、阿拉伯糖、核糖、岩藻糖或鼠李糖的去簇电压为80V；检测葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸的去簇电压为90V；检测氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖、葡萄糖醇、半乳糖醇或甘露糖醇的去簇电压为110V；检测果糖的去簇电压为120V。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超高效液相色谱-质谱联用方法的条件还包括：锥孔电压：40V；探头温度：40℃；离子喷雾电压：4500.0V；离子源温度：450.0℃,帘气：30L/h；雾化气：50L/h,加热气：50L/h。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的中药多糖包括川芎多糖、桔梗多糖或川牛膝多糖。

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