CN108254467B - 一种肺炎多糖疫苗水解液中戊糖、己糖、氨基糖和糖醛酸的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肺炎多糖疫苗水解液中戊糖、己糖、氨基糖和糖醛酸的含量测定方法，该方法适用于23种价态肺炎多糖疫苗水解液中该类化合物的定量检测。方法内容主要为以亲水色谱‑两性离子混合模式固定相为色谱柱，以乙腈、甲酸铵或(和)乙酸铵水溶液为洗脱剂，使得戊糖、己糖、糖醛酸和氨基糖在该固定相上保留，并以质谱为检测器、MRM模式定量。为肺炎多糖疫苗的质量评价提供了新途径。本方法解决了《欧洲药典》方法测定时间长、重复性差、容易受干扰等问题以及己糖含量测定方法缺乏的问题。本方法重复性好和可操作性强，易于实现标准化和产业化，对肺炎多糖疫苗的质量评价和批次重复性控制具有指导意义。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种肺炎多糖疫苗水解液中戊糖、己糖、氨基糖和糖醛酸的含量测定方法。属于疫苗质量评价技术领域。
背景技术
肺炎是老人、儿童和艾滋病人重要的致死因素之一。肺炎多糖疫苗的出现极大的减少了该类疾病的发生。目前市面上主要的肺炎多糖疫苗包括23价疫苗和13价疫苗。无论是 23价疫苗还是13价疫苗均需要通过定量各价态疫苗结构单元的含量，进而评价疫苗质量。己糖、戊糖、氨基糖和糖醛酸是肺炎多糖疫苗重要的结构单元。《欧洲药典》采用衍生-紫外分光光度计的方法检测戊糖、氨基糖和糖醛酸。肺炎多糖疫苗中己糖的含量测定方法缺乏。这些方法存在局限性：第一，测定时间较长(大约4小时每个样品)；第二，需要衍生，且无分离，存在方法稳定性和准确性的隐患；第三，不同同时测定己糖、戊糖、氨基糖和糖醛酸，需用三个方法分别测定戊糖、氨基糖和糖醛酸，且无己糖检测方法，耗时、耗力。质量评价方法的稳定性、准确性直接影响疫苗的质量安全。因此，建立一种稳定、准确、抗干扰能力强且可同时检测多种单糖含量的方法，对疫苗的质量评价尤为重要。
肺炎多糖疫苗水解液中单糖的检测中国尚无国家标准，中国生产的该产品采用《欧洲药典》(EP)标准进行检测。EP采用衍生-紫外分光光度计的方法，分别定量戊糖、氨基糖和糖醛酸。这些方法每检测一个样品中的一种糖通常需要4个小时左右，且重复性较差。已报到的单糖检测方法还有高效液相色谱-紫外可见检测(HPLC-UV/Vis)、高效液相色谱-示差折光检测器(HPLC-RID)、高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)和离子色谱-电化学检测(IC-ECD)方法。HPLC-UV/Vis方法可提供比EP方法更高的分离选择性，但仍然需要负责的衍生过程，不利于快速检测。HPLC-RID和HPLC-ELSD方法无须衍生即可实现单糖的检测，但这两种方法选择性较差，无法实现复杂基质(如疫苗)中多种单糖的同时检测。IC-ECD无须衍生，且提供比HPLC-UV/Vis、HPLC-RID和HPLC-ELSD更高的选择性，但该方法通常需要较长的分离时间、且难以实现同时定性和定量，以及复杂基质影响定量准确性。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种肺炎多糖疫苗水解液中戊糖、己糖、氨基糖和糖醛酸的含量测定方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种肺炎多糖疫苗水解液中戊糖、己糖、氨基糖和糖醛酸的含量测定方法，包括以下步骤：
(1)单一标准母液配制：分别称取适量葡萄糖、鼠李糖、葡醛酸、氨基鼠李糖、氨基葡萄糖、2-氨基-5羧基葡萄糖、2-氨基果糖、2,4-二氨基鼠李糖和羧基醚葡萄糖对照品，用乙腈：水(50:50，v/v)混合液溶解，配制成浓度为1mg/mL的母液备用；
(2)单一标准工作溶液的配制：用乙腈：水(50:50，v/v)混合液稀释上述母液到3.9-1000 μg/L浓度范围，得到标准工作溶液，标准工作溶液浓度点分别为1000，500，250，125， 62.6，31.3，15.6，7.8，3.9μg/L；
(3)绘制标准工作曲线：将上述标准工作溶液用高效液相色谱串联质谱进行分析，即可得到上述对照品的色谱图，根据溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线；
(4)样品检测：取肺炎多糖疫苗水解液用高效液相色谱串联质谱进行分析检测，根据待测组分的响应峰面积和标准工作曲线，得出水解液中戊糖、己糖、氨基糖和糖醛酸的含量。
优选的，所述氨基糖包括氨基戊糖、氨基己糖、2,4-二氨基戊糖、2-氨基-5-羧基己糖、 2-氨基果糖；所述糖醛酸包括己糖酸和羧基醚己糖，水解液中待测物的结构图如图1所示。
优选的，上述步骤(3)和步骤(4)所述色谱条件如下：
固定相：固定相1、固定相2或固定相3；
柱温：30℃；
流动相：A-含离子交换剂的有机溶剂水溶液；B-离子交换剂水溶液；
所述有机溶剂为与水相溶的有机溶剂，包括甲醇、乙腈和乙醇；有机溶剂：水＝60～100： 0～40，v/v；
离子交换剂为质谱兼容的酸或盐，或酸和盐的混合物；所述盐为甲酸铵或乙酸铵，所述酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸。
流动相A中所述离子交换剂在有机水溶液中的浓度为0～20mmol/L，流动相B中离子交换剂水溶液的浓度为：0～20mmol/L。
梯度：0～10min，100％A-0％A；
流速：0.2～0.5mL/min；
进样体积：10μL。
优选的，所述固定相1为一种亲水作用-阴阳离子交换混合模式固定相，其结构式如下：
所述固定相2为一种亲水作用模式固定相，其结构式如下：
所述固定相3为一种亲水作用模式固定相，其结构式如下：
其中R1，R2，R3为硅胶或聚苯乙烯。
上述步骤(3)和步骤(4)所述质谱条件如下：
离子源：ES+模式和ES-模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；
加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：230℃；加热模块温度：400℃；
干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV。
质谱检测器检测模式为多离子选择监控(MRM)，质谱检测参数见表1。
表1质谱检测参数
本发明采用高效液相色谱串联质谱方法，建立了一种无需衍生且快速、高选择性、高灵敏度的单糖检测方法，用于23种肺炎多糖疫苗水解液中己糖、戊糖、氨基糖和糖醛酸的定量分析。与已报到的方法相比，本方法有以下优势：1)本方法首次将高效液相色谱串联质谱用于了23种肺炎多糖疫苗水解液中己糖、戊糖、氨基糖和糖醛酸的同时定量，解决了原有肺炎多糖疫苗质量控制方法重复性差、时间长等问题；2)与其它已报到的高效液相色谱串联质谱定量单糖相比，本方法采用了3种特殊键合基团的亲水色谱固定相，这些固定相具有独特分离选择性、长期稳定性和快速平衡的特点；3)与其它已报到的高效液相色谱串联质谱定量单糖相比，本方法应用对象(23种肺炎多糖疫苗水解液)基质更为复杂，本方法所采用的亲水作用色谱柱具有独特的分离选择性和抗基质干扰能力，可实现23种肺炎多糖疫苗水解液中己糖、戊糖、氨基糖和糖醛酸的同时定量。
本发明的有益效果：
1、同时定量己糖、戊糖、氨基糖和糖醛酸。本发明采用了3种亲水固定相，为不同样品提供较好的保留和分离选择性，利用亲水固定相中酰胺基、氨基等保留己糖、戊糖、氨基糖和糖醛酸，且提供良好的分离选择性，从而实现一次进样同时保留和分离己糖、戊糖、氨基糖和糖醛酸；
2、高选择性和抗基质干扰。采用三重四级杆做检测器、多离子选择监控(MRM)为检测模式，从而排除基质的干扰，为定量方法提供高选择性和抗基质干扰能力；
3、快速。本方法无须衍生，6分钟即可实现多种己糖、戊糖、氨基糖和糖醛酸的同时定量；
4、定量化合物种类多。本发明可定量9种类型己糖、戊糖、氨基糖和糖醛酸(结构示意图如图1所示)；
5、质量评估的肺炎多糖疫苗血清类型态多。本发明可用于23种血清类型肺炎多糖疫苗质量评估，包括1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17A、 18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型肺炎多糖疫苗。
附图说明
图1为己糖、戊糖、己糖酸、氨基戊糖、氨基己糖、2,4-二氨基戊糖、2-氨基-5-羧基己糖、2-氨基果糖和羧基醚己糖结构图；
图2为23价肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图
图3为1型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图4为2型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图5为3型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图6为4型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图7为5型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图8为6B型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图9为7F型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图10为8型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图11为9N型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图12为9V型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图13为10A型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图14为11A型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图15为12F型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图16为14型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图17为15B型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图18为17A型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图19为18C型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图20为19A型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图21为19F型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图22为20型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图23为22F型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图24为23F型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图；
图25为33F型肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
1、实验仪器与设备：
高压二元泵、脱气机、自动进样器、柱温箱和三重四级杆质谱仪。
2、实验试剂：
葡萄糖、鼠李糖、葡醛酸、氨基鼠李糖购自Sigma，规格均为1g；氨基葡萄糖、2-氨基-5羧基葡萄糖、2-氨基果糖、2,4-二氨基鼠李糖和羧基醚葡萄糖由实验室合成所得，合成化合物的结构由多级质谱和文献数据确定。
3、检测条件：
色谱柱：固定相1，R1为硅胶；
流动相：A-含10mmol/L甲酸铵(用甲酸调节pH到4.3)的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为80％；B-10mmol/L甲酸铵(用甲酸调节pH到4.3)水溶液；
具体的，流动相A中甲酸铵在乙腈水溶液中的终浓度为10mmol/L。
梯度：0-10min 100％A-0％A；柱温：30℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。
质谱条件：
离子源：ES+模式和ES-模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：230℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV；质谱检测器检测模式为多离子选择监控(MRM)，质谱检测参数见表1。
4、标准曲线绘制：
(1)别称取适量葡萄糖、鼠李糖、葡醛酸、氨基鼠李糖、氨基葡萄糖、2-氨基-5羧基葡萄糖、2-氨基果糖、2,4-二氨基鼠李糖和羧基醚葡萄糖对照品，用乙腈：水(50:50，v/v)混合液溶解，配制成浓度为1mg/mL的母液备用；
(2)用乙腈：水(50:50，v/v)混合液稀释上述母液到3.9-1000μg/L浓度范围，得到标准工作溶液，标准工作溶液浓度点分别为1000，500，250，125，62.6，31.3，15.6，7.8， 3.9μg/L；
(3)将上述标准工作溶液用高效液相色谱串联质谱进行分析，即可得到上述对照品的色谱图，根据溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线。
5、样品检测：取23价肺炎多糖疫苗水解液用液相色谱串联质谱进行分析检测，根据待测组分的响应峰面积和标准工作曲线，得出待测组分的含量，23价肺炎多糖疫苗水解产物MRM叠加图如图2所示。
6、线性关系和灵敏度考察：
对上述标准工作曲线进行线性回归，并对方法进行灵敏度考察，结果见表2。结果表明各标准品在各自的质量范围内线性关系良好，证明本发明方法在所选线性范围内准确度高，方法灵敏度高。
表2线性关系和灵敏度考察
LOD和LOQ分别是指检出限和定量限。
7、重复性和回收率考察：
重复性测定：取浓度为50μg/L的9种对照品混合溶液，混合溶液中每种对照品的浓度均为50μg/L。重复进样6次，将6次所得化合物峰面积求相对标准偏差(即重复性)值如表3所示。
回收率测定：取浓度为100μg/L的9种对照溶液1mL，用23种肺炎多糖疫苗水解液样品稀释到2mL，作为加标样品。取浓度为100μg/L的9种对照溶液1mL，用乙腈：水 (50:50，v/v)稀释到2mL，作为对照品。取1mL 23价肺炎多糖疫苗水解液样品，用乙腈：水(50:50，v/v)稀释到2mL，作为样品。分别进样分析对照样品、加标样品和样品。将所得9种化合物峰面积按如下公式计算回收率：回收率＝((对照品+样品峰面积)/加标样品峰面积)x 100％，所得结果如表3所示。
表3重复性和回收率考察结果
本方法可同时定量23价肺炎疫苗水解液中9类型己糖、戊糖、氨基糖和糖醛酸的含量，且具有较高灵敏度、回收率、较好重复性和较宽的线性范围。
实施例2
1型肺炎多糖中2,4-二氨基戊糖和己糖酸的检测
1型肺炎多糖水解后可得2,4-二氨基戊糖和己糖酸。检测条件如下：
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含10mmol/L甲酸铵(用乙酸调节pH到6.5)的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为80％；B-10mmol/L甲酸铵(用乙酸调节pH到6.5)水溶液；
梯度：0-10min 80％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400 ℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
测得2,4-二氨基戊糖和己糖酸含量分别为404.5μg/mL和824.6μg/mL(图3)，满足欧洲药典要求。
实施例3：2型肺炎多糖中戊糖、己糖和己糖酸的检测
2型肺炎多糖水解后可得戊糖、己糖和己糖酸。检测条件如下：
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含5mmol/L甲酸铵(pH 6.5)的甲醇水溶液，甲醇水溶液中甲醇的体积浓度为80％；B-5mmol/L甲酸铵(pH 6.5)水溶液；
梯度：0-10min 75％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI负离子，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
测得戊糖、己糖和己糖酸含量分别为1973.1μg/mL、1322.7μg/mL、628.9μg/mL(图4)，满足欧洲药典要求。
实施例4：3型肺炎多糖中己糖和己糖酸的检测
3型肺炎多糖水解后可得己糖和己糖酸。检测条件如下：
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含8mmol/L甲酸铵(用乙酸调解pH到4.5)的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为80％；B-8mmol/L甲酸铵(用乙酸调解pH到4.5)水溶液；
梯度：0-10min 90％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI负离子，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
测得己糖和己糖酸含量分别为755.6和810.2μg/mL(图5)，满足欧洲药典要求。
实施例5：4型肺炎多糖中氨基戊糖、氨基己糖和羧基醚己糖的检测
4型肺炎多糖水解后可得氨基戊糖、氨基己糖和羧基己糖醚。
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含0.02％三氟乙酸的乙腈水溶液，0.02％为三氟乙酸在乙腈水溶液中的体积浓度；乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为80％；B-2mmol/L甲酸铵(用甲酸调pH到3.5)水溶液；
梯度：0-10min 70％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正离子，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
测得氨基戊糖、氨基己糖和羧基己糖醚含量分别为612.1μg/mL、642.1μg/mL和713.4 μg/mL(图6)，满足欧洲药典要求。
实施例6：5型肺炎多糖中己糖、氨基戊糖、2-氨基果糖和己糖酸的检测
5型肺炎多糖水解后可得己糖、氨基戊糖、2-氨基果糖和己糖酸。
固定相：固定相1，R1为聚苯乙烯；
流动相：A-含7mmol/L甲酸铵(用甲酸调节pH到4.0)的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为80％；B-7mmol/L甲酸铵(用甲酸调节pH到4.0)水溶液；
梯度：0-10min 78％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度 400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
测得己糖、氨基戊糖、2-氨基果糖和己糖酸含量分别为168.0μg/mL和312.8μg/mL、172.6 μg/mL和168.9μg/mL(图7)，满足欧洲药典要求。
实施例7：6B型肺炎多糖中己糖和戊糖的检测
6B型肺炎多糖水解后可得己糖和戊糖。
固定相：固定相2，R2为聚苯乙烯；
流动相：A-含9mmol/L甲酸铵(pH6.5)的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为80％；B-9mmol/L甲酸铵(pH6.5)水溶液；
梯度：0-10min 90％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400 ℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
测得己糖和戊糖含量分别为1458和721μg/mL(图8)，满足欧洲药典要求。
实施例8：7F型肺炎多糖中己糖、戊糖和氨基己糖的检测
7F型肺炎多糖水解后可得己糖、戊糖和氨基己糖。
固定相：固定相2，R2为硅胶；
流动相：A-含4mmol/L乙酸铵(pH 6.5)的乙醇水溶液，乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为70％；B-4mmol/L甲酸铵(pH 6.5)水溶液；
梯度：0-10min 95％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度 400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
测得己糖、戊糖和氨基己糖含量为712.5、452.1、497.1μg/mL图9)，该含量满足欧洲药典要求。
实施例9：8型肺炎多糖中己糖和己糖酸的检测
8型肺炎多糖水解后可得己糖和己糖酸。
固定相：固定相3，R3为硅胶；
流动相：A-含20mmol/L甲酸铵(用乙酸调pH到6.5)的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为60％；B-20mmol/L甲酸铵(用乙酸调pH到6.5)水溶液；
梯度：0-10min 80％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400 ℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
测得己糖和己糖酸含量分别为920.2μg/mL和320.4μg/mL(图10)，该含量满足欧洲药典要求。
实施例10：9N型肺炎多糖中己糖、氨基己糖和己糖酸的检测
9N型肺炎多糖水解后可得己糖、氨基己糖和己糖酸。
固定相：固定相3，R3为聚苯乙烯；
流动相：A-含15mmol/L甲酸铵(pH 6.5)的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为70％；B-15mmol/L甲酸铵(pH 6.5)水溶液；
梯度：0-10min 80％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400 ℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
测得己糖、氨基己糖、己糖酸含量分别为452.1μL/mL、466.2μg/mL、251.8μg/mL(图11)，该含量满足欧洲药典要求。
实施例11：9V型肺炎多糖己糖、氨基己糖和己糖酸的检测
9V型肺炎多糖疫苗水解后可得己糖、氨基己糖和己糖酸。
固定相：固定相1，R1为硅胶；
流动相：A-含12mmol/L乙酸铵(pH 6.5)的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为80％；B-12mmol/L甲酸铵(pH 6.5)水溶液；
梯度：0-10min 80％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度 400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
测得己糖、氨基己糖、己糖酸含量分别为3688.1μg/mL、1279.2μg/mL和1129.5μg/mL (图12)，该含量满足欧洲药典要求。
实施例12：10A型肺炎多糖中戊糖、己糖和氨基己糖的检测
10A型肺炎多糖水解后可得戊糖、己糖和氨基己糖。
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含18mmol/L甲酸铵(用甲酸调解pH到4.5)乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为80％；B-18mmol/L甲酸铵(用甲酸调解pH到4.5)水溶液；
梯度：0-10min 80％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度 400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
测得戊糖、己糖和氨基己糖含量为625.6μg/mL、3120.1μg/mL和658.9μg/mL(图13)，该含量满足欧洲药典要求。
实施例13：11A型肺炎多糖中己糖的检测
11A型肺炎多糖水解后可得己糖。
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含16mmol/L甲酸铵(用甲酸调解pH到4.0)乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为80％；B-16mmol/L甲酸铵(pH 6.5)水溶液；梯度：0-10min 80％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10 L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
测得己糖含量为2524μg/mL(图14)，该含量满足欧洲药典要求。
实施例14：12F型肺炎多糖中己糖、2-氨基-5-羧基己糖、氨基己糖和氨基戊糖的检测
12F型肺炎多糖水解后可得己糖、2-氨基-5-羧基己糖、氨基己糖和氨基戊糖。
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含0.02％三氟乙酸的80％乙腈水溶液；B-含0.02％三氟乙酸的水溶液；梯度：0-10min 80％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3 L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV。其他检测条件与实施例1相同。
测得己糖、2-氨基-5-羧基己糖、氨基己糖和氨基戊糖含量为1985.5μg/mL、704.5μg/mL、 692.1μg/mL和645.6μg/mL(图15)，满足欧洲药典。
实施例15：14型肺炎多糖中己糖和氨基己糖的检测
14型肺炎多糖水解后可得己糖和氨基己糖。
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含14mmol/L甲酸铵(pH 6.5)的80％乙腈水溶液；B-14mmol/L甲酸铵(pH 6.5)水溶液；
梯度：0-10min 80％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度 400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV。其他检测条件与实施例1相同。
测得氨基己糖和己糖含量为659.2μg/mL和1927.6μg/mL(图16)，满足欧洲药典要求。
实施例16：15B型肺炎多糖中己糖和氨基己糖的检测
15B型肺炎多糖水解后可得己糖和氨基己糖。
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含11mmol/L甲酸铵(pH 6.5)乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为80％；B-10mmol/L甲酸铵(pH 6.5)水溶液；梯度：0-11min 80％A-20％A；LC-MS 条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV。其他检测条件与实施例1相同。
测得己糖和氨基己糖含量为734.6μg/mL和2853.4μg/mL(图17)，满足欧洲药典要求。
实施例17：17F型肺炎多糖中戊糖和己糖的检测
17F型肺炎多糖水解后可得戊糖和己糖。
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含13mmol/L甲酸铵(pH 6.5)乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为80％；B-13mmol/L甲酸铵(pH 6.5)水溶液；梯度：0-10min 80％A-20％A；LC-MS 条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
测得戊糖和己糖含量为1710.3μg/mL和1809.5(图18)，满足欧洲药典要求。
实施例18：18C型肺炎多糖中己糖和戊糖的检测
18C型肺炎多糖水解后可得己糖和戊糖。
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含19mmol/L甲酸铵(用乙酸调解pH到4.5)乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为80％；B-19mmol/L甲酸铵(用乙酸调解pH到4.5)水溶液；梯度： 0-10min80％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV；其他检测条件与实施例1相同。
测得己糖和戊糖含量分别为2110.5μg/mL和512.3μg/mL(图19)，满足欧洲药典要求。
实施例19：19A型肺炎多糖中氨基己糖、己糖和戊糖的检测
19A型肺炎多糖水解后可得氨基己糖、己糖和戊糖。
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含9mmol/L甲酸铵(用甲酸调节pH到4.5)甲醇水溶液，甲醇水溶液中乙腈的体积浓度为95％；B-9mmol/L甲酸铵(用甲酸调节pH到4.5)水溶液；梯度：0-10 min80％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV。其他检测条件与实施例1相同。
测得氨基己糖、己糖和戊糖含量分别为703.8μg/mL、712.5μg/mL和695.4μg/mL(图20)，满足欧洲药典要求。
实施例20：19F型肺炎多糖中氨基己糖、己糖和戊糖的检测
19F型肺炎多糖水解后可得氨基己糖、己糖和戊糖。
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含10mmol/L甲酸铵(用甲酸调节pH到4.5)乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为80％；B-10mmol/L甲酸铵(用甲酸调节pH到4.5)水溶液；梯度： 0-10min80％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV。其他检测条件与实施例1相同。
测得氨基己糖、己糖和戊糖含量分别为926.2μg/mL、893.5μg/mL和885.4μg/mL(图21)，满足欧洲药典要求。
实施例21：20型肺炎多糖中氨基己糖和己糖的检测
20型肺炎多糖水解后可得己糖和氨基己糖。
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含12mmol/L甲酸铵(用0.02％三氟乙酸条件pH到3.5)乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为90％；B-12mmol/L甲酸铵(用0.02％三氟乙酸条件pH到3.5) 水溶液；梯度：0-10min 80％A-20％A；LC-MS条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV。其他检测条件与实施例1相同。
测得氨基己糖和己糖的含量分别为596.2μg/mL和2652.6μg/mL(图22)，满足欧洲药典要求。
实施例22：22F型肺炎多糖中己糖、戊糖和己糖酸的检测
22F型肺炎多糖水解后可得己糖、戊糖和己糖酸。
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含10mmol/L甲酸铵(pH 6.5)的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为80％；B-10mmol/L甲酸铵(pH 6.5)水溶液；梯度：0-10min 80％A-20％A；LC-MS 条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV。其他检测条件与实施例1相同。
测得己糖、戊糖和己糖酸含量分别为1572.3μg/mL、1089.1μg/mL和525.9μg/mL(图23)，满足欧洲药典要求。
实施例23：23F型肺炎多糖中己糖和戊糖的检测
23F型肺炎多糖水解后可得己糖和戊糖。
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含15mmol/L甲酸铵(pH 6.5)的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为80％；B-15mmol/L甲酸铵(pH 6.5)水溶液；梯度：0-10min 80％A-20％A；LC-MS 条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV。其他检测条件与实施例1相同。
测得己糖和戊糖含量分别为1263.4μg/mL、1635.6μg/mL(图24)，满足欧洲药典要求。
实施例24：33F型肺炎多糖中己糖的检测
33F型肺炎多糖水解后可得己糖。
固定相：同实施例1中所述固定相；
流动相：A-含14mmol/L甲酸铵(pH 6.5)的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为85％；B-14mmol/L甲酸铵(pH 6.5)水溶液；梯度：0-10min 80％A-20％A；LC-MS 条件：离子源：ESI正负离子同时扫描，雾化器流速3L/min，加热器流速10L/min，接口温度200℃，DL温度230℃，加热模块温度400℃，干燥气流速10L/min，接口电压3kV。其他检测条件与实施例1相同。
测得己糖含量为3602.7μg/mL(图25)，满足欧洲药典要求。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (1)
1.一种肺炎多糖疫苗水解液中戊糖、己糖、氨基糖和糖醛酸的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)单一标准母液配制：分别称取适量葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、氨基鼠李糖、氨基葡萄糖、2-氨基-5羧基葡萄糖、2-氨基果糖、2,4-二氨基鼠李糖和羧基醚葡萄糖对照品，用乙腈和水混合液溶解，其中以体积比计，乙腈：水＝50:50，配制成浓度为1mg/mL的母液备用；
(2)单一标准工作溶液的配制：用体积比为50:50的乙腈-水混合液稀释上述母液到3.9-1000μg/L浓度范围，得到标准工作溶液，标准工作溶液浓度点分别为1000，500，250，125，62.6，31.3，15.6，7.8，3.9μg/L；
(3)绘制标准工作曲线：将上述标准工作溶液用高效液相色谱串联质谱进行分析，即可得到上述对照品的色谱图，根据溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线；
(4)样品检测：取肺炎多糖疫苗水解液用高效液相色谱串联质谱进行分析检测，根据待测组分的响应峰面积和标准工作曲线，得出水解液中戊糖、己糖、氨基糖和糖醛酸的含量；
所述氨基糖包括氨基戊糖、氨基己糖、2,4-二氨基戊糖、2-氨基-5-羧基己糖、2-氨基果糖；所述糖醛酸包括己糖酸和羧基醚己糖；
步骤(3)和步骤(4)所述高效液相色谱的检测条件为：
固定相：为亲水固定相；
柱温：30℃；
流动相：A-含离子交换剂的有机溶剂水溶液；B-离子交换剂水溶液；
梯度：0～10min，100％A-0％A；
流速：0.2～0.5mL/min；
进样体积：10μL；
所述亲水固定相为固定相1、固定相2或固定相3；
固定相1为一种亲水作用-阴阳离子交换混合模式固定相，其结构式如下：
所述固定相2为一种亲水作用模式固定相，其结构式如下：
所述固定相3为一种亲水作用模式固定相，其结构式如下：
其中R1，R2，R3为硅胶或聚苯乙烯；
所述有机溶剂为与水相溶的有机溶剂，包括甲醇、乙腈和乙醇；有机溶剂与水的体积比为60～100：0～40；
所述离子交换剂为质谱兼容的酸或盐，或酸和盐的混合物；
所述盐为甲酸铵或乙酸铵，所述酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸；
所述流动相A中离子交换剂在有机水溶液中的浓度为0～20mmol/L，流动相B中离子交换剂水溶液的浓度为：0～20mmol/L；
步骤(3)和步骤(4)所述质谱的检测条件为：
质谱仪：三重四级杆质谱仪；离子源：ES+模式和ES-模式；雾化器流速：3L/min；加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：230℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV；质谱检测器检测模式为多离子选择监控。
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