CN110068645A - 液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的方法，包括以下步骤：(1)样本前处理：对尿液样本用阴离子交换固相萃取进行前处理，得到供试品溶液；(2)采用液质联用检测所述供试品溶液：色谱条件采用反相C18亲水色谱柱；采用梯度洗脱；质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；离子模式为正离子模式；监测模式为多反应监测。本发明还公开液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的内标定量检测方法。本发明的方法是首次建立了尿液样本中cAMP液相色谱串联质谱检测法，能够有效检出尿液样本中cAMP，具有分离效果好，基线平稳，检测时间短，线性好，准确度高，重现性好，灵敏度高，精密度高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种人尿液中环磷酸腺苷液相色谱串联质谱检测方法。
背景技术
环磷酸腺苷(cAMP)作为“第二信使”调控胞内酶或蛋白的活性以响应各类激素(如甲状旁腺激素)水平的变化。cAMP在正常细胞中含量较少，在激素作用下，可明显提高。大部分肽类激素，如胰高血糖素、甲状旁腺素、降钙素、抗利尿激素和催产素等可以通过相应受体激活靶细胞膜上的腺苷酸环化酶，从而使胞内cAMP的浓度增加。
目前，最常用的体液(血浆、尿液、脑脊液等)中cAMP检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)。虽然ELISA应用较广泛，但是仍存在一些缺点，主要为操作过程有些繁琐，易出现假阳性结果，重复性待提高。液相色谱串联质谱法相对于ELISA具有更加简单、快速、准确的优点。目前，尿液中cAMP液相色谱串联质谱检测法尚未见报道。尿液中cAMP检测的特点之一在于样本量多，通常是应用于临床样本(尿液)的高通量筛查。因此，尿液中cAMP的检测对检测过程简单、耗时短、检测结果准确性高、可靠性强提出了更高的要求。
本方法除首次建立了尿液中cAMP液相色谱串联质谱检测法外，并且针对现有方法检测过程繁琐、时间长的缺点进行了改进和优化，以节省检测时间、同时保证了检测的准确性和可靠性，从而使之更加有利于临床样本(尿液)的高通量筛查。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种环磷酸腺苷的液质联用检测方法，其具有操作简单、检测快、精密度和灵敏度高、重现性好的特点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的方法，包括以下步骤：
(1)样本前处理：对尿液样本用阴离子交换固相萃取进行前处理，得到供试品溶液；
(2)采用液质联用检测所述供试品溶液：
其中，液相色谱条件为：色谱柱采用反相C18亲水色谱柱；流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为0.005～100mM乙酸盐水溶液，所述乙酸盐选自乙酸铵、乙酸钾、乙酸钠中的一种或多种；流动相B为乙腈、或甲醇、或乙腈与甲醇的混合液；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～1.00min，流动相B体积百分比维持在0％～20％；1.00～1.5min，流动相B体积百分比由0％～20％增至20％～90％；1.50～1.80min，流动相B体积百分比由20％～90％递增至90％～100％；1.80～1.81min，流动相B体积百分比由90％～100％递减至0％～20％；1.81～3.00min，流动相B保持体积百分比为0％～20％；
质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；离子模式为正离子模式；监测模式为多反应监测。
具体的，所述步骤(1)中，所述尿液样本经上样、淋洗，然后用体积分数10-30％甲酸水溶液洗脱，收集的洗脱液用碱中和后，得到供试品溶液。
在一个优选的实施例中，固相萃取吸附剂类型为混合型强阴离子交换反相吸附剂。
在一个优选的实施例中，混合型强阴离子交换反相吸附剂的类型为96孔板。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，用体积分数15-25％甲酸水溶液洗脱。在一个优选的实施例中，用体积分数20％甲酸水溶液洗脱。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，上样时还加入cAMP内标工作液。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，淋洗时先后用水、甲醇进行淋洗。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，使用氨水进行中和。在一个优选的实施例中，氨水的质量百分浓度为5～20％。在一个优选的实施例中，氨水的质量百分浓度为10％。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，包括以下步骤：
1)上样：向强阴离子交换反相吸附剂固相萃取96孔板中加入样本，利用正压装置排干；
2)淋洗：向上述96孔固相萃取板的相应位置加纯水，正压装置排干；加甲醇，正压装置排干；
3)洗脱：向上述96孔固相萃取板的相应位置加20％甲酸水溶液洗脱，用另一96孔板收集洗脱液；
4)中和：向含有洗脱液的96孔板相应位置加入氨水，瞬离后震荡混匀。
在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，流动相A中乙酸盐水溶液的浓度为0.005～1mM。在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，流动相A中乙酸盐水溶液的浓度为0.005～0.5mM。在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，流动相A中乙酸盐水溶液的浓度为0.005～0.05mM。
在一个具体的实施例中，所述步骤(2)中，流动相A为0.005～0.05mM乙酸铵水溶液；流动相B为乙腈。在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，流动相A为0.01mM乙酸铵水溶液；流动相B为乙腈。
在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，梯度洗脱程序为：0～1.00min，流动相B体积百分比维持在20％；1.00～1.5min，流动相B体积百分比由20％递增至40％；1.50～1.80min，流动相B体积百分比由40％递增至90％；1.80～1.81min，流动相B体积百分比由90％递减至20％；1.81～3.00min，流动相B保持体积百分比为20％。
在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，色谱柱为ACQUITY HSS T3 1.8μm,2.1mm×50mm。
在一个具体的实施例中，所述步骤(2)中，液相色谱的柱温为20-45℃。在一个优选的实施例中，柱温为25～35℃。在一个优选的实施例中，柱温为25℃。
在一个具体的实施例中，所述步骤(2)中，液相色谱的进样量为0.5～50μL。在一个优选的实施例中，进样量为1～10μL。在一个优选的实施例中，进样量为2～5μL。
在一个具体的实施例中，所述步骤(2)中，液相色谱的流动相的流速为0.3～2mL/min。
在一些具体实施例中，所述步骤(2)中，质谱条件设置，驻留时间为0.079s，锥孔电压为20V，碰撞能量为30V。
在一些具体实施例中，所述步骤(2)中，质谱条件设置，定性离子对为cAMP：330.0→119.2，cAMP-IS：359.1→147.8，定量离子对为cAMP：330.0→136.2，cAMP-IS：359.1→164.7。
基于前述的液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的方法，本发明还提供一种液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的内标定量检测方法，包括以下步骤：
(1)溶液配置和样本前处理：
配制一系列浓度梯度的cAMP标准溶液及一定浓度的cAMP内标溶液；
用阴离子交换固相萃取对添加cAMP内标溶液的尿液样本进行前处理，得到供试品溶液；
用阴离子交换固相萃取对分别添加cAMP内标溶液的一系列浓度梯度的cAMP标准溶液进行前处理，得到一系列的对照品溶液；
(2)采用液质联用检测所述供试品溶液和对照品溶液：
其中，液相色谱条件为：色谱柱采用反相C18亲水色谱柱；流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为0.005～100mM乙酸盐水溶液，所述乙酸盐选自乙酸铵、乙酸钾、乙酸钠中的一种或多种；流动相B为乙腈、或甲醇、或乙腈与甲醇的混合液；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～1.00min，流动相B体积百分比维持在0％～20％；1.00～1.5min，流动相B体积百分比由0％～20％增至20％～90％；1.50～1.80min，流动相B体积百分比由20％～90％递增至90％～100％；1.80～1.81min，流动相B体积百分比由90％～100％递减至0％～20％；1.81～3.00min，流动相B保持体积百分比为0％～20％；
质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；离子模式为正离子模式；监测模式为多反应监测；
(3)定量测定方法：
将所述对照品溶液以及供试品溶液按所述(2)色谱条件依次进样，记录色谱图；将对照品溶液中cAMP对其内标物的峰面积的比值与cAMP浓度进行线性回归产生标准曲线和/或拟合方程，或由质谱软件系统自动生成标准曲线和/或拟合方程；将供试品溶液中cAMP对其内标物的峰面积的比值代入至所述标准曲线和/或拟合方程，计算得到尿液样本中cAMP浓度，或由质谱软件系统给出样本中cAMP浓度。
在一个优选的实施例中，一系列浓度梯度的cAMP标准溶液的浓度分别为：1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL；
在一个优选的实施例中，cAMP内标溶液浓度为0.005～0.5nmol/mL。在一个优选的实施例中，cAMP内标溶液浓度为0.005～0.5nmol/mL。
本发明提供一种人尿液中cAMP液相色谱质谱联用检测方法，先对样本采用阴离子交换固相萃取进行前处理，然后经色谱柱采用梯度洗脱分离，引入质谱进行分析。本发明还提供了采用内标法定量检测尿液中cAMP含量的方法。
本发明提供的方法的技术优势在于：
1.本发明的方法是首次建立了尿液样本中cAMP液相色谱串联质谱检测法，能够有效检出尿液样本中cAMP，分离效果好。尿液样本采集相对于血液、脑脊液等体液样本采集更加的无创、方便，更适用于临床样本的高通量筛查，适合临床检测的推广。
2.本发明的方法对尿液样本用阴离子交换固相萃取进行前处理，可有效的消除基质干扰，基线平稳，不发生漂移，而未经净化的尿液样品存在极强的干扰成分使目标成分无法检出。
3.本发明的方法检测时间短，只需3min即可完成检测过程，大大提高了检测效率，适合高通量筛选。
4.本发明的方法能节省溶剂，降低成本，操作安全简易，处理方便快捷，适合高通量筛选。
5.本发明的方法具有良好的线性关系，R2＝1，定量检测的准确度高，重现性好。
6.本发明的方法用于尿液样本中cAMP的定量检测，定量下限为0.5ng/mL，具有灵敏度高的优点。
7.本发明的方法用于尿液样本中cAMP的定量检测，经批内和批间精密度的检测，平变异系数(％CV)在15.0％以内，表明本方法具有良好的精密度。
附图说明
图1为本发明的方法中cAMP标准品及其内标的液相色谱图，其中，A表示cAMP标准品，B表示cAMP内标。
图2为固相萃取前尿液样本中cAMP的液相色谱图及其内标的离子流图，其中，A表示cAMP标准品，B表示cAMP内标的离子流图。
图3为固相萃取后尿液样本cAMP及其内标的液相色谱图，其中，A表示cAMP标准品，B表示cAMP内标。
图4为本发明的方法采用T灌注实验的空白基质图谱。
图5为本发明的方法线性范围的测定得到的标准曲线。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.色谱条件与质谱参数的设定
色谱柱：ACQUITY HSS T3 1.8μm,2.1mm×50mm；
柱温：25℃；
进样量：2μL；
流动相A：0.01mM乙酸铵水溶液，流动相B：乙腈；
梯度洗脱程序：流动相A+流动相B＝100％；0～1.00min，流动相B体积百分比维持在20％；1.00～1.5min，流动相B体积百分比由20％增至40％；1.50～1.80min，流动相B体积百分比由40％递增至90％；1.80～1.81min，流动相B体积百分比由90％递减至20％；1.81～3.00min，流动相B保持体积百分比为20％；
质谱参数设定为：离子源：电喷雾离子源，离子模式：正离子模式，监测模式：多反应监测，驻留时间：0.079s，锥孔电压：20V，碰撞能量：30V，定性离子对为cAMP：330.0→119.2，cAMP-IS：359.1→147.8，定量离子对为cAMP：330.0→136.2，cAMP-IS：359.1→164.7；
按此方法对100ng/mL cAMP标准品测定，测定结果如图1所示，测定时间为3min，cAMP出峰时间为0.84min。
实施例2.样品前处理程序
1)上样：向强阴离子交换反相吸附剂固相萃取96孔板中加入50μL样本和10μL0.005nmol/mL的cAMP内标(8-甲基氨基环腺苷酸)工作液，利用正压装置排干；
2)淋洗：向上述96孔固相萃取板的相应位置加50μL纯水，正压装置排干，加50μL L甲醇，正压装置排干；
3)洗脱：向上述96孔固相萃取板的相应位置加50μL 20％甲酸水甲酸水洗脱，用另一96孔板收集洗脱液；
4)中和：向上述含有洗脱液的96孔板相应位置加入1000μL 10％氨水氨水，瞬离后震荡混匀(800rpm,5min)。
按此方法对尿液样本进行测定，与未经净化的尿液样品(图2)相比，经本方法净化处理后的尿液样本(图3)基线平稳，无基质干扰，而未经净化的尿液样品存在极强的干扰成分使目标成分无法检出。
实施例3.基质效应的考察
采用T柱灌注实验考察基质效应，结果如图4所示，无明显可见的离子抑制或增强响应。这表明，本发明前处理方法可有效消除尿液样本中存在的对cAMP检测具有干扰的成分。
实施例4.线性范围的测定
配制一系列浓度梯度的cAMP标准溶液：1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。样品处理方法同实施例2，色谱条件和质谱参数同实施例1，每天测定一次，连续测定5天。按技术方案中所述内标法定量，以理论浓度为横坐标，以测定浓度为纵坐标进行线性回归。结果如图5所示，Slope＝1.0217，R2＝1。
实施例5.分析灵敏度的考察
1)LOB
每天测定重复4个空白水溶液和重复4个标准品溶液C1(1.0ng/mL)，持续5天，计算按表1所示计算LOB值。
表1LOB值
2)LOD
配制4个接近LOB浓度的样本：S1(0.06ng/mL)、S2(0.10ng/mL)、S3(0.22ng/mL)、S4(0.50ng/mL)，每天测定4个重复，同时每天4个测定C1(1.0ng/mL)重复，持续5天，按表2所示计算LOD值。
表2LOD值
3)定量下限(LLMI)
表2中满足CV≤20％，平均偏倚≤15％的最低浓度样本(≥LOD)即为LLMI。如表3所示，本方法定量下限为0.5ng/mL，具有良好的灵敏度。
表3LLMI值
实施例6.批内和批间精密度
在尿液样本中加入相应量的标准品配制一定浓度的质控样本：LQC、MQC、HQC，每个浓度水平测定3个重复，每天3个浓度，连续测定5天，如表4所示，每个浓度水平变异系数(％CV)在15.0％以内，表明本方法具有良好的精密度。
表4批内和批间精密度
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样本前处理：对尿液样本用阴离子交换固相萃取进行前处理，得到供试品溶液；
(2)采用液质联用检测所述供试品溶液：
其中，液相色谱条件为：色谱柱采用反相C18亲水色谱柱；流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为0.005～100mM乙酸盐水溶液，所述乙酸盐选自乙酸铵、乙酸钾、乙酸钠中的一种或多种；流动相B为乙腈、或甲醇、或乙腈与甲醇的混合液；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～1.00min，流动相B体积百分比维持在0％～20％；1.00～1.5min，流动相B体积百分比由0％～20％增至20％～90％；1.50～1.80min，流动相B体积百分比由20％～90％递增至90％～100％；1.80～1.81min，流动相B体积百分比由90％～100％递减至0％～20％；1.81～3.00min，流动相B保持体积百分比为0％～20％；
质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；离子模式为正离子模式；监测模式为多反应监测。
2.一种液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的内标定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)溶液配置和样本前处理：
配制一系列浓度梯度的cAMP标准溶液及一定浓度的cAMP内标溶液；
用阴离子交换固相萃取对添加cAMP内标溶液的尿液样本进行前处理，得到供试品溶液；
用阴离子交换固相萃取对分别添加cAMP内标溶液的一系列浓度梯度的cAMP标准溶液进行前处理，得到一系列的对照品溶液；
(2)采用液质联用检测所述供试品溶液和对照品溶液：
其中，液相色谱条件为：色谱柱采用反相C18亲水色谱柱；流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为0.005～100mM乙酸盐水溶液，所述乙酸盐选自乙酸铵、乙酸钾、乙酸钠中的一种或多种；流动相B为乙腈、或甲醇、或乙腈与甲醇的混合液；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～1.00min，流动相B体积百分比维持在0％～20％；1.00～1.5min，流动相B体积百分比由0％～20％增至20％～90％；1.50～1.80min，流动相B体积百分比由20％～90％递增至90％～100％；1.80～1.81min，流动相B体积百分比由90％～100％递减至0％～20％；1.81～3.00min，流动相B保持体积百分比为0％～20％；
质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；离子模式为正离子模式；监测模式为多反应监测；
(3)定量测定方法：
将所述对照品溶液以及供试品溶液按所述(2)色谱条件依次进样，记录色谱图；将对照品溶液中cAMP对其内标物的峰面积的比值与cAMP浓度进行线性回归产生标准曲线和/或拟合方程，或由质谱软件系统自动生成标准曲线和/或拟合方程；将供试品溶液中cAMP对其内标物的峰面积的比值代入至所述标准曲线和/或拟合方程，计算得到尿液样本中cAMP浓度，或由质谱软件系统给出样本中cAMP浓度。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述尿液样本经上样、淋洗，然后用体积分数10-30％甲酸水溶液洗脱，收集的洗脱液用碱中和后，得到供试品溶液。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，流动相A中乙酸盐水溶液的浓度为0.005～1mM；优选的，所述步骤(2)中，流动相A中乙酸盐水溶液的浓度为0.005～0.5mM；更优选的，所述步骤(2)中，流动相A中乙酸盐水溶液的浓度为0.005～0.05mM。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，梯度洗脱程序为：0～1.00min，流动相B体积百分比维持在20％；1.00～1.5min，流动相B体积百分比由20％递增至40％；1.50～1.80min，流动相B体积百分比由40％递增至90％；1.80～1.81min，流动相B体积百分比由90％递减至20％；1.81～3.00min，流动相B保持体积百分比为20％。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，色谱柱为ACQUITYHSS T3 1.8μm,2.1mm×50mm。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，液相色谱的柱温为20-45℃；优选的，柱温为25～35℃；更优选的，柱温为25℃；液相色谱的进样量为0.5～50μL；优选的，进样量为1～10μL；更优选的，进样量为2～5μL；液相色谱的流动相的流速为0.3～2mL/min。
8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，质谱条件设置，驻留时间为0.079s，锥孔电压为20V，碰撞能量为30V，定性离子对为cAMP：330.0→119.2，cAMP-IS：359.1→147.8，定量离子对为cAMP：330.0→136.2，cAMP-IS：359.1→164.7。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，一系列浓度梯度的cAMP标准溶液的浓度分别为：1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，cAMP内标溶液浓度为0.005～0.5nmol/mL；优选的，cAMP内标溶液浓度为0.005～0.5nmol/mL。
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