CN111896643A - 一种人血浆中儿茶酚胺的液相色谱串联质谱检测方法 - Google Patents

一种人血浆中儿茶酚胺的液相色谱串联质谱检测方法 Download PDF

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CN111896643A CN202010696209.1A CN202010696209A CN111896643A CN 111896643 A CN111896643 A CN 111896643A CN 202010696209 A CN202010696209 A CN 202010696209A CN 111896643 A CN111896643 A CN 111896643A
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李月杰
刘釜均
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Abstract

本发明公开一种人血浆中儿茶酚胺的液相色谱质谱联用的检测方法，包括以下步骤：(1)样本前处理：血浆样本采用离子交换固相萃取进行前处理，得到供试品溶液；(2)液相色谱质谱联用检测所述供试品溶液：色谱柱采用反相五氟苯基色谱柱；流动相A为甲酸水溶液；流动相B为乙腈、或甲醇、或乙腈与甲醇的混合液；采用梯度洗脱。本发明还公开一种人血浆中儿茶酚胺的液相色谱质谱联用的内标定量检测方法。本发明的方法能够有效检出人血浆中儿茶酚胺，具有分离效果好，基线平稳，检测时间短，线性好，准确度高，重现性好，灵敏度高，精密度高的特点。

Description

一种人血浆中儿茶酚胺的液相色谱串联质谱检测方法
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种人血浆中儿茶酚胺(肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺)液相色谱串联质谱检测方法。
背景技术
儿茶酚胺类物质主要包括肾上腺素(Epinephrine,E)、去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)及多巴胺(Dopamine,DA)。儿茶酚胺类物质是由肾上腺髓质、肾上腺神经元以及肾上腺外嗜铬体合成与分泌的单胺类神经递质，具有较强的生理学活性的内源性物质，在大脑和神经信号传导中起着重要的作用。血浆中儿茶酚胺类物质浓度水平与人体多种生理、病理现象有密切关系，检测生物样本中的儿茶酚胺类物质浓度不仅对于嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、神经母细胞瘤、高血压、心肌梗塞、肾上腺髓质增生等疾病的诊断和治疗具有重要的临床意义，并且有助于甲状腺功能异常、充血性心力衰竭、糖尿病、肾功能不全等疾病的诊断。近年来，国内外对儿茶酚胺类物质的分析检测主要为高效液相色谱法、荧光光度法、毛细管电泳法、化学发光分析法、电化学分析法及液质联用法。大多数方法的灵敏度可以满足尿液儿茶酚胺的检测，但是对于血浆样品，目前医院常规采用的是电化学分析法，但是电化学分析法样本处理复杂，分析时间长，对于快速获得诊断结果具有一定的局限性。随着质谱技术的不断发展，我们可以开发出一种检测灵敏度、特异性大大提高的方法，并且能有效减少样品处理和分析时间，快速的得到正确的结果。
现有技术CN106442837A报道了一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法，该方法需要先对样品进行衍生化，前处理繁琐，耗费时间长，检测效率低。现有技术CN107966520A公开了一种用液相色谱串联质谱技术检测儿茶酚胺及代谢产物的方法，该方法检出限较高、灵敏度低，难以满足临床对于疾病的诊断。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种液相色谱质谱联用检测人血浆中儿茶酚胺的方法，该方法具有样品无需衍生化前处理、前处理耗时短、精密度和灵敏度高、重现性好的特点。
为解决上述技术问题，本发明提供一种人血浆中儿茶酚胺的液相色谱质谱联用的内标定量检测方法，包括以下步骤：
(1)溶液配置和样本前处理：
配制一系列浓度梯度的儿茶酚胺标准溶液及一定浓度的儿茶酚胺内标溶液；
用离子交换固相萃取对添加儿茶酚胺内标溶液的血浆样本进行前处理，得到供试品溶液；
用离子交换固相萃取对分别添加儿茶酚胺内标溶液的一系列浓度梯度的儿茶酚胺标准溶液进行前处理，得到一系列的对照品溶液；
所述儿茶酚胺包括肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺；
(2)液相色谱质谱联用检测所述供试品溶液：
其中，液相色谱条件为：色谱柱采用反相五氟苯基色谱柱；流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为体积百分浓度0.01～1.0％的甲酸水溶液；流动相B为甲醇；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～1.0min，流动相B体积百分比维持在0.0％～1.5％；1.0～2.5min，流动相B体积百分比由0.0％～1.5％增至5.0％～8.0％；2.5～3.0min，流动相B体积百分比由5.0％～8.0％递增92.0％～95.0％；3.00～3.5min，流动相B体积百分比维持在92.0％～95.0％；3.5～4.0min，流动相B由92.0％～95.0％递减至0.0％～1.5％。
质谱条件为：离子源为ESI；离子模式为正离子模式；监测模式为MRM；
(3)定量测定方法：
将所述对照品溶液以及供试品溶液按所述(2)色谱条件依次进样，记录色谱图；将对照品溶液中儿茶酚胺对其内标物的峰面积的比值与儿茶酚胺浓度进行线性回归产生标准曲线和/或拟合方程，或由质谱软件系统自动生成标准曲线和/或拟合方程；将供试品溶液中儿茶酚胺对其内标物的峰面积的比值代入至所述标准曲线和/或拟合方程，计算得到血浆样本中儿茶酚胺浓度，或由质谱软件系统给出样本中儿茶酚胺浓度。
具体的，所述步骤(1)中，所述血浆样本加入稀释剂混匀，经上样、淋洗、洗脱，收集的洗脱液浓缩，再加入复溶溶剂，得到供试品溶液。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，所述离子交换固相萃取为弱阳离子交换反相固相萃取。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，所述弱阳离子交换反相固相萃取吸附剂的类型为96孔板。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，所述稀释剂为乙酸铵溶液；更优选，乙酸铵溶液浓度为1.0～500.0mM。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，淋洗操作中，使用乙酸铵溶液作为淋洗液；更优选，乙酸铵溶液浓度为1～500.0mM。更优选，乙酸铵溶液浓度为25～100.0mM。最优选，乙酸铵溶液浓度为50.0mM。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，洗脱操作中，使用甲酸乙腈溶液作为洗脱液；更优选，甲酸乙腈溶液的体积百分浓度为0.1～10.0％；更优选，甲酸乙腈溶液的体积百分浓度为1.0～5.0％。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，浓缩方式为使用氮气吹干。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，所述复溶溶剂为甲酸水溶液；更优选的，所述甲酸水溶液的体积百分浓度为0.01～10.0％；更优选的，所述甲酸水溶液的体积百分浓度为0.01～2.0％。
在一个优选的实施例中，所述步骤(1)中，包括以下步骤：
1)样品预处理：取血浆样本，加入乙酸铵溶液，充分混匀；
2)上样：将预处理过的样本上样至离子交换固相萃取装置，利用正压装置排干；
3)淋洗：用乙酸铵溶液进行淋洗，利用正压装置排干；
4)洗脱：用甲酸乙腈溶液分三次洗脱，收集洗脱液，混匀；
5)氮吹：将收集液全部在氮气吹至近干；
6)复溶：加入甲酸水溶液进行复溶。
在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，流动相A中甲酸水溶液的体积百分浓度为0.01～0.5％。在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，流动相A中甲酸水溶液的体积百分浓度为0.05～0.3％。在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，流动相A中甲酸水溶液的体积百分浓度为0.1～0.2％。
在一个具体的实施例中，所述步骤(2)中，流动相A为体积百分浓度0.1～0.2％甲酸水溶液；流动相B为甲醇。在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，流动相A为体积百分浓度0.1％甲酸水溶液；流动相B为甲醇。
在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～1.0min，流动相B体积百分比维持在0.0％～1.0％；1.0～2.5min，流动相B体积百分比由0.0％～1.0％增至6.0％～7.0％；2.5～3.0min，流动相B体积百分比由6.0％～7.0％递增93.0％～94.0％；3.00～3.5min，流动相B体积百分比维持在93.0％～94.0％；3.5～4.0min，流动相B由93.0％～94.0％递减至0.0％～1.0％。
在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中，色谱柱为ACQUITY UPLC HSS PFPColumn,
Figure BDA0002591101320000041
1.8μm,2.1mm X 100mm。
在一个具体的实施例中，所述步骤(2)中，液相色谱的柱温为25.0～45.0℃。在一个优选的实施例中，柱温为30.0～40.0℃。在一个优选的实施例中，柱温为35.0～40.0℃。
在一个具体的实施例中，所述步骤(2)中，液相色谱的进样量为0.5～50.0μL。在一个优选的实施例中，进样量为1.0～40.0μL。在一个优选的实施例中，进样量为5.0～30.0μL。
在一个具体的实施例中，所述步骤(2)中，液相色谱的流动相的流速为0.2～2.0mL/min。在一个优选的实施例中，流速为0.3～1.0mL/min。
在一些具体实施例中，所述步骤(2)中，质谱条件设置，气帘气为40.0psi，碰撞气为10.0psi，喷雾电压为5000.0V，离子源温度为550.0℃，辅助气为60.0psi，加热气为50.0psi，碰撞室出口电压为10.0V。
在一个具体的实施例中，所述步骤(2)中，质谱条件中化合物参考参数如下：
Figure BDA0002591101320000042
在一个优选的实施例中，一系列浓度梯度的儿茶酚胺标准溶液中，肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺标准品的浓度范围均为0.0～1000.0pg/mL。优选的，一系列浓度梯度的儿茶酚胺标准溶液中，肾上腺素标准品的浓度梯度由低到高分别为：0.0pg/mL、25.0pg/mL、50.0pg/mL、100.0pg/mL、500.0pg/mL、750.0pg/mL、1000.0pg/mL；优选的，一系列浓度梯度的儿茶酚胺标准溶液中，去甲肾上腺素标准品的浓度梯度由低到高分别为：0.0pg/mL、25.0pg/mL、50.0pg/mL、100.0pg/mL、500.0pg/mL、750.0pg/mL、1000.0pg/mL；优选的，一系列浓度梯度的儿茶酚胺标准溶液中，多巴胺标准品的浓度梯度由低到高分别为：0.0pg/mL、25.0pg/mL、50.0pg/mL、100.0pg/mL、500.0pg/mL、750.0pg/mL、1000.0pg/mL。
在一个优选的实施例中，儿茶酚胺内标溶液中各内标浓度为10.0～50.0ng/mL。具体的，各内标包括同位素标记的肾上腺素、同位素标记的去甲肾上腺素和同位素标记的多巴胺。优选的，肾上腺素的内标为肾上腺素-D6，去甲肾上腺素的内标为去甲肾上腺素-D6，多巴胺的内标为多巴胺-D4。
本发明提供一种人血浆中儿茶酚胺的液相色谱质谱联用的检测方法，先对样本采用离子交换固相萃取进行前处理，然后经色谱柱采用梯度洗脱分离，引入质谱进行分析。本发明还提供了采用内标法定量检测尿液中血浆中儿茶酚胺含量的方法。
本发明的有益效果在于：
1)本发明采用的液相色谱串联质谱技术，对样本前处理方法及仪器方法进行了创新，具有检测方法时间短，仅需4.0min，大大提高检测效率，适合样本的高通量筛选。
2)本发明的方法对血浆样本用离子交换固相萃取进行前处理，可有效的消除基质干扰，基线平稳，不发生漂移。而未经净化的血浆样品存在极强的干扰成分使目标成分无法检出。
3)本发明的方法具有良好的线性关系，肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺的相关参数R2均≥0.999，定量检测的准确度高，重现性好。
4)本发明的方法用于血浆样本中儿茶酚胺的定量检测，定量下限分别为肾上腺素20.0pg/mL，去甲肾上腺素25.0pg/mL，多巴胺20.0pg/mL，具有灵敏度高的优点。
5)本发明的方法用于血浆样本中儿茶酚胺的定量检测，经批内和批间精密度的检测，平变异系数(％CV)在15.0％以内，表明本方法具有良好的精密度。
附图说明
图1为儿茶酚胺(肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺)的标准品(A)及其内标(B)的色谱图。
图2A为实施例二中固相萃取后血浆样本儿茶酚胺(肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺)及其内标的色谱图。
图2B为实施例二中使用甲酸铵预处理样本的结果。
图3为本发明实施例3采用T灌注实验的空白基质图谱。
图4为本发明的方法线性范围的测定得到儿茶酚胺(肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺)的标准曲线。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.色谱条件与质谱参数的设定
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS PFP Column,
Figure BDA0002591101320000062
1.8μm,2.1mm X 100mm；
柱温：40.0℃；
进样量：20.0μL；
流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：甲醇；
梯度洗脱程序：
时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(％) 流动相B(％)
initial 0.40 99.0 1.0
1.0 0.40 99.0 1.0
2.5 0.40 94.0 6.0
3.0 0.40 6.0 94.0
3.5 0.40 6.0 94.0
4.0 0.40 99.0 1.0
质谱参数设定为：
CUR 40.0psi
CAD 10.0psi
IS 5000.0V
TEM 550.0℃
GS1 60.0psi
GS2 50.0psi
CXP 10.0V
Figure BDA0002591101320000061
按此方法对100.0ng/mL儿茶酚胺(肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺)标准品测定，测定结果如图1所示，测定时间为4.0min，儿茶酚胺(肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺)出峰时间为分别是0.97、1.30及1.57min。
实施例2.样品前处理程序
1)样品预处理：取1.0mL血浆样本(或取标准品溶液)，加入一定量内标工作液，再加入1.0mL 50mM乙酸铵溶液，充分混匀。
2)活化：向弱阳离子交换反相吸附剂固相萃取96孔板中分别加入1.0mL甲醇，1.0mL水及1.0mL乙酸铵溶液，进行活化
3)上样：向弱阳离子交换反相吸附剂固相萃取96孔板中加入预处理过的样本，利用正压装置排干；
4)淋洗：向上述96孔固相萃取板的相应位置加1.0mL乙酸铵溶液，1.0mL水及1.0mL甲醇正压装置排干；
5)洗脱：向上述96孔固相萃取板的相应位置加900.0μL甲酸乙腈溶液分三次洗脱，用另一96孔板收集洗脱液，混匀；
6)氮吹：将收集液全部在40.0℃下氮气吹至近干；
7)复溶：加入100.0μL甲酸水溶液进行复溶。
按此方法对血浆样本进行测定，经本方法净化处理后的血浆样本基线平稳，无基质干扰(如图2所示)，而未经净化的血浆样品存在极强的干扰成分。
对比试验：采用不同浓度的乙酰胺溶液预处理样品或不经乙酰胺预处理，其他流程不变，考察预处理对洗脱效率的影响。
对比组1：样品预处理中使用1.0mL 50mM甲酸铵处理样本；
对比组2：样品预处理中使用1.0mL 10mM乙酸铵处理样本；
对比组3：样品预处理中使用1.0mL 100mM乙酸铵处理样本；
结果：对比组1的图谱显示存在有很多干扰组分，使用甲酸铵预处理的净化效果差；对比组2和对比组3中肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺的峰面积明显小于使用1.0mL50mM乙酸铵预处理的结果，说明使用50mM乙酸铵溶液的效果最好，能使化合物的提取效率显著提高。
实施例3.基质效应的考察
采用T柱灌注实验考察基质效应，结果如图3所示，无明显可见的离子抑制或增强响应。这表明，本发明前处理方法可有效消除血浆样本中存在的对儿茶酚胺(肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺)检测具有干扰的成分。
实施例4.线性范围的测定
配制一系列浓度梯度的儿茶酚胺(肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺)标准溶液：0.0pg/mL、25.0pg/mL、50.0pg/mL、100.0pg/mL、500.0pg/mL、750.0pg/mL、1000.0pg/mL。样品处理方法同实施例2，色谱条件和质谱参数同实施例1，每天测定一次，连续测定5天。按技术方案中所述内标法定量，以理论浓度为横坐标，以测定浓度为纵坐标进行线性回归。结果如图4所示，肾上腺素：y＝0.9824x+2.7949，Slope＝0.9824，R2＝0.9996；去甲肾上腺素：y＝1.0054x+0.3256，Slope＝1.0054，R2＝0.9996；多巴胺：y＝0.9906x+3.5333，Slope＝0.9906，R2＝0.9991。
实施例5.分析灵敏度的考察
1)LOB
每天重复测定4个空白水溶液和4个标准品溶液C2(25.0pg/mL)，持续5天，计算按表1、2、3所示计算LOB值。
表1肾上腺素LOB值
Figure BDA0002591101320000081
表2去甲肾上腺素LOB值
Figure BDA0002591101320000082
表3多巴胺LOB值
Figure BDA0002591101320000083
Figure BDA0002591101320000091
2)LOD
配制4个接近LOB浓度的样本：S1(25.0pg/mL)、S2(20.0pg/mL)、S3(10.0pg/mL)、S4(5.0pg/mL)，每个样本每天测定4个重复，同时每天测定4个C1(25.0pg/mL)重复，持续5天，按表4、5、6所示计算LOD值。
表4肾上腺素LOD值
Figure BDA0002591101320000092
表5去甲肾上腺素LOD值
Figure BDA0002591101320000093
表6多巴胺LOD值
Figure BDA0002591101320000094
3)定量下限(LLMI)
表4、5、6中满足CV≤20％，平均偏倚≤15％的最低浓度样本(≥LOD)即为LLMI。
如表7、8、9所示，本方法具有良好的灵敏度。
表7肾上腺素LLMI值
Figure BDA0002591101320000101
表8去甲肾上腺素LLMI值
Figure BDA0002591101320000102
表9多巴胺LLMI值
Figure BDA0002591101320000103
实施例6.批内和批间精密度
在空白样本中加入相应量的标准品配制一定浓度的质控样本：LQC、MQC、HQC，每个浓度水平测定3个重复，每天3个浓度，连续测定5天，如表10、11、12所示，每个浓度水平变异系数(％CV)在20.0％以内，表明本方法具有良好的精密度。
表10肾上腺素批内和批间精密度
Figure BDA0002591101320000104
Figure BDA0002591101320000111
表11去甲肾上腺素批内和批间精密度
Figure BDA0002591101320000112
表12多巴胺批内和批间精密度
Figure BDA0002591101320000113
Figure BDA0002591101320000121
实施例7精密度
在空白样本中加入相应量的标准品配制一定浓度的质控样本：LQC、MQC、HQC，每个浓度水平测定3个重复，每天3个浓度，如表13、14、15所示，每个浓度水平变异系数(％CV)在20.0％以内，表明本方法具有良好的精密度。
表13肾上腺素回收率
Figure BDA0002591101320000122
表14去甲肾上腺素回收率
Figure BDA0002591101320000123
表15多巴胺回收率
Figure BDA0002591101320000131
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (14)

1.一种人血浆中儿茶酚胺的液相色谱质谱联用的内标定量检测方法，包括以下步骤：
(1)溶液配置和样本前处理：
配制一系列浓度梯度的儿茶酚胺标准溶液及一定浓度的儿茶酚胺内标溶液；
用离子交换固相萃取对添加儿茶酚胺内标溶液的血浆样本进行前处理，得到供试品溶液；
用离子交换固相萃取对分别添加儿茶酚胺内标溶液的一系列浓度梯度的儿茶酚胺标准溶液进行前处理，得到一系列的对照品溶液；
所述儿茶酚胺包括肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺；
(2)采用液质联用检测所述供试品溶液和对照品溶液：
色谱柱采用反相五氟苯基色谱柱；流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为体积百分浓度0.01～1％的甲酸水溶液；流动相B为甲醇；采用梯度洗脱，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～1.0min，流动相B体积百分比维持在0.0％～1.5％；1.0～2.5min，流动相B体积百分比由0.0％～1.5％增至5.0％～8.0％；2.5～3.0min，流动相B体积百分比由5.0％～8.0％递增92.0％～95.0％；3.00～3.5min，流动相B体积百分比维持在92.0％～95.0％；3.5～4.0min，流动相B由92.0％～95.0％递减至0.0％～1.5％。
质谱条件为：离子源为ESI；离子模式为正离子模式；监测模式为MRM；
(3)定量测定方法：
将所述对照品溶液以及供试品溶液按所述(2)色谱条件依次进样，记录色谱图；将对照品溶液中儿茶酚胺对其内标物的峰面积的比值与儿茶酚胺浓度进行线性回归产生标准曲线和/或拟合方程，或由质谱软件系统自动生成标准曲线和/或拟合方程；将供试品溶液中儿茶酚胺对其内标物的峰面积的比值代入至所述标准曲线和/或拟合方程，计算得到血浆样本中儿茶酚胺浓度，或由质谱软件系统给出样本中儿茶酚胺浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述前处理包括上样、淋洗、洗脱，收集的洗脱液浓缩，再加入复溶溶剂。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述前处理包括以下步骤：
1)样品预处理：取样本，加入乙酸铵溶液，充分混匀；
2)上样：将预处理过的样本上样至离子交换固相萃取装置，利用正压装置排干；
3)淋洗：用乙酸铵溶液进行淋洗，利用正压装置排干；
4)洗脱：用甲酸乙腈溶液分三次洗脱，收集洗脱液，混匀；
5)氮吹：将收集液全部在氮气吹至近干；
6)复溶：加入甲酸水溶液进行复溶。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述离子交换固相萃取为弱阳离子交换反相固相萃取。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述弱阳离子交换反相固相萃取吸附剂的类型为96孔板。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，流动相A中甲酸水溶液的体积百分浓度为0.01～0.5％；优选的，流动相A中甲酸水溶液的体积百分浓度为0.05～0.3％；更有选的，流动相A中甲酸水溶液的体积百分浓度为0.1～0.2％。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，色谱柱为ACQUITY UPLC HSSPFP Column,
Figure FDA0002591101310000021
1.8μm,2.1mm X 100mm。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，液相色谱的柱温为25.0～45.0℃；优选的，液相色谱的柱温为30.0～40.0℃；优选的，液相色谱的柱温为35.0～40.0℃。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，液相色谱的进样量为0.5～50.0μL；优选的，液相色谱的进样量为1.0～40.0μL；优选的，液相色谱的进样量为5.0～30.0μL。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，液相色谱的流动相的流速为0.2～2.0mL/min；优选的，液相色谱的流速为0.3～1.0mL/min。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，质谱条件设置，气帘气为40.0psi，碰撞气为10.0psi，喷雾电压为5000.0V，离子源温度为550.0℃，辅助气为60.0psi，加热气为50.0psi，碰撞室出口电压为10.0V。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一系列浓度梯度的儿茶酚胺标准溶液中，肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺标准品的浓度范围均为0.0～1000.0pg/mL。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述一系列浓度梯度的儿茶酚胺标准溶液中，肾上腺素标准品的浓度梯度由低到高分别为：0.0pg/mL、25.0pg/mL、50.0pg/mL、100.0pg/mL、500.0pg/mL、750.0pg/mL、1000.0pg/mL；去甲肾上腺素标准品的浓度梯度由低到高分别为：0.0pg/mL、25.0pg/mL、50.0pg/mL、100.0pg/mL、500.0pg/mL、750.0pg/mL、1000.0pg/mL；多巴胺标准品的浓度梯度由低到高分别为：0.0pg/mL、25.0pg/mL、50.0pg/mL、100.0pg/mL、500.0pg/mL、750.0pg/mL、1000.0pg/mL。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述儿茶酚胺内标溶液中各内标浓度为10.0～50.0ng/mL。
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