CN113376280A - 一种同时检测尿液样本中94种氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种一次性检测尿液样本中94种氨基酸类物质的方法，所述的方法是利用LC‑MS/MS方法对尿液样本中的氨基酸进行检测，根据氨基酸保留时间和离子对信息，对每种氨基酸在样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。对所样本中氨基酸行定性定量分析，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应氨基酸的相对含量，最终得到样本中氨基酸的定性和定量分析结果。本发明的方法具有前处理简单、检测物质数量多、检测时间短等优点，适用于尿液样本种游离氨基酸类物质的检测和确证。

Description

一种同时检测尿液样本中94种氨基酸的方法
技术领域
本申请设计生物检测领域，具体涉及利用质谱的方法检测生物样本中94种氨基酸含量的方法
背景技术
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，它参与生物的新陈代谢和生理过程，氨基酸分析在农业、食品科学、医学研究中有广泛而重要的作用。因此，对氨基酸分析方法的研究与改进具有重要意义。氨基酸分析方法自1958年实现自动化以后，其检测技术也逐渐发展，灵敏度、准确度和自动化程度都在逐渐提高。由于氨基酸不具有分光检测所需的生色基团，用色谱方法进行检测时需对氨基酸进行柱前或柱后衍生，但衍生化操作步骤繁琐，耗时耗力，而且对衍生化合物的稳定性难以进行直观的评判，某些氨基酸衍生反应的完全程度也难以保证。同时衍生反应还可能生成非目标衍生物，这些都会影响氨基酸的准确测定。全自动氨基酸分析仪也同样存在氨基酸衍生的问题。
而近年来，质谱技术的高速发展在一定程度上满足了氨基酸高灵敏检测的需求。氨基酸容易离子化，在电喷雾源(ESI)正离子模式下能够得到很好的响应，同时由于质谱检测的信号为质荷比(m/z)，即使未能达到基线分离的情况，也可通过不同质荷比进行定量分析，因此在氨基酸的液相色谱质谱联用(LC/MS)分析中，氨基酸在色谱柱上的保留成为关键。目前，氨基酸的LC/MS分析方法多通过衍生化或添加离子对试剂改善其保留行为，但往往衍生试剂的加入又会在一定程度上影响质谱离子源的离子化。
氨基酸的分离检测技术一直是研究者的关注点之一，尽管氨基酸分析方法多种多样，但改进现有方法，使其具有更好的专属性与灵敏度一直是研究的热点和难点问题。在氨基酸的液相分离中，由于氨基酸类物质含有氨基和羧基两种官能团，一方面自身极性很强，难以直接在反相C18色谱柱上得到良好保留，另一方面紫外吸收弱，生命体中常见的20种氨基酸中，除酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸外，均难以在紫外检测器(UV)上得到高灵敏响应。为了改善氨基酸的保留与检测问题，通常使用衍生化试剂在柱前或柱后对氨基酸进行衍生处理再上机检测，但是对于生物类样品分析，衍生化试剂的引入会将原本就复杂的体系进一步复杂化，增加解析的难度。
目前，并未有相关现有技术针对人或动物的尿液样本中的94种氨基酸类物质进行检测的方法。本申请将克服现有技术缺陷，提供一种高效准确的检测方法。
发明内容
针对现有检测技术存在的需要柱前衍生或柱后衍生、检测时间过长、检测误差大的缺陷，本发明的目的在于提供一种超高效液相色谱-串联四级杆质谱检测动物体液中氨基酸的方法，前处理简单，无需衍生，大大缩短检测时间，极大提高了检测的选择性和灵敏度。
本申请提供一种检测94种氨基酸类物质的方法，所述的方法包括：1)尿液样本中氨基酸的提取；2)LC-MS/MS检测；3)数据处理。在一个具体的实施例中，所述的样本为人或动物的尿液样本；其中具体的尿液样本中氨基酸提取方法为：
取50μL尿液样本，加入250μL纯甲醇，涡旋5min，在4℃条件下，12000r/min下离心15min，移取上清液150μL到另一个编好号的离心管中，-20℃冰箱静置30min，4℃，12000r/min下再离心5min，离心后移取全部上清过96孔蛋白沉淀板后，上机分析。
在另外的一个具体实施例中，所述的LC-MS/MS分析的条件为：
仪器参数条件：本发明中LC-MS/MS检测所用的数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(Shimpack UFLC SHIMADZU CBM30A)和串联质谱MS/MS(AppliedBiosystems6500Quadrupole Trap)。
其中，超高效液相色谱条件主要包括：
色谱柱：ACQUITY BEH Amide色谱柱；
流动相A：超纯水(含2mM乙酸铵，0.02-0.05％甲酸)；
流动相B：乙腈(含2mM乙酸铵，0.02-0.05％甲酸)；
洗针液：50％甲醇(超声脱气10min)；
柱温：40℃；流速：0.4mL/min；进样量：2μL；
洗脱梯度：0-9min，90％-60％B；9-10min，60％-40％B；10-11min，40％B；11.01-15min，90％B；
质谱条件如下：
Ion Mode ESI+/- Curtain Gas 35
MRM detection window 120 Temperatμre 550
Ion Source Gas1 50 Ion Source Gas2 60
Collision Gas Medium Scan type sMRM
Entrance Potential 10 Collision Cell Exit Potential 10
在另外的一个具体的实施例中，所述的数据分析为：
利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据。根据氨基酸保留时间和离子对信息，对每种氨基酸在样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。对所样本中氨基酸行定性定量分析，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应氨基酸的相对含量，最终得到样本中氨基酸的定性和定量分析结果。
(1)样本质控分析：通过对不同质控样本质谱检测分析的总离子流图(TIC图)进行重叠展示分析，以判断氨基酸提取和检测的重复性。
(2)标准曲线绘制：配制不同浓度的氨基酸标准品溶液，获取各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据；以标准品浓度(μg/mL)为横坐标，质谱峰的峰面积(PeakArea)为纵坐标，绘制不同氨基酸的标准曲线。
(3)绝对定量：将检测到的所有样本的所有氨基酸的积分峰面积分别代入标准曲线线性方程进行计算，将计算结果进一步代入含量计算公式计算后得到实际样本中每种氨基酸的绝对含量。
本发明的优势效果在于：1.样品前处理简单，可同时快速高效定量组织样本中94种氨基酸类物质。2.质谱检测特异性强，灵敏度高。
附图说明
图1标准品(2ppm)94种氨基酸XIC重叠图；
图2实际尿液样本中的氨基酸类物质的多峰图。
具体实施方式
实施例1组织样本中氨基酸提取方法：
准确移取50μL尿液样本，加入250μL纯甲醇，涡旋5min，在4℃条件下，12000r/min下离心15min，移取上清液150μL到另一个编好号的离心管中，-20℃冰箱静置30min，4℃，12000r/min下再离心5min，离心后移取全部上清过96孔蛋白沉淀板后，上机分析。
实施例2、LC-MS/MS检测
仪器参数条件：本发明中LC-MS/MS检测所用的数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(Shimpack UFLC SHIMADZU CBM30A)和串联质谱MS/MS(AppliedBiosystems6500Quadrupole Trap)。
其中，超高效液相色谱条件主要包括：
色谱柱：ACQUITY BEH Amide色谱柱；
流动相A：超纯水(含2mM乙酸铵，0.04％甲酸)；
流动相B：乙腈(含2mM乙酸铵，0.04％甲酸)；
洗针液：50％甲醇(超声脱气10min)；
柱温：40℃；流速：0.4mL/min；进样量：2μL；
洗脱梯度：0-9min，90％-60％B；9-10min，60％-40％B；10-11min，40％B；11.01-15min，90％B；
质谱条件如下：
Figure BDA0003107932160000051
尿液样本中94种氨基酸的数据处理方法，具体如下：
利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据。根据氨基酸保留时间和离子对信息，对每种氨基酸在样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。对所样本中氨基酸行定性定量分析，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应氨基酸的相对含量，最终得到样本中氨基酸的定性和定量分析结果。
(1)样本质控分析：通过对不同质控样本质谱检测分析的总离子流图(TIC图)进行重叠展示分析，以判断氨基酸提取和检测的重复性。
(2)标准曲线绘制：配制不同浓度的氨基酸标准品溶液，获取各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据；以标准品浓度(μg/mL)为横坐标，质谱峰的峰面积(PeakArea)为纵坐标，绘制不同氨基酸的标准曲线。
(3)绝对定量：将检测到的所有样本的所有氨基酸的积分峰面积分别代入标准曲线线性方程进行计算，将计算结果进一步代入含量计算公式计算后得到实际样本中每种氨基酸的绝对含量。
其中部分物质所述的离子对如下所示：
Figure BDA0003107932160000052
Figure BDA0003107932160000061
实施例3标准曲线获得
通过对标准品的检测，按照如实施例2所述的方法进行检测，获得每种氨基酸的标准曲线，其标准品的XIC图如图1所示。
Figure BDA0003107932160000062
Figure BDA0003107932160000071
Figure BDA0003107932160000081
实施例4：实际尿液样本中的氨基酸类物质的检测
1)利用实施例1所述的方法处理人体获得的尿液样本；
2)利用实施例2所述的方法进行检测，获得实际尿液样本中的氨基酸类物质的多峰图，如图2所示。

Claims (10)

1.一种检测体液样本中94种氨基酸浓度的方法，所述的方法包括：
1)样本处理：
2)上机检测：样本处理后离心获得上清，后移取全部上清过96孔蛋白沉淀板后，上机分析；
3)数据处理；
所述的检测是利用超高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的方法进行检测；
根据氨基酸保留时间和离子对信息，对每种氨基酸在样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确；对所样本中氨基酸行定性定量分析，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应氨基酸的相对含量，最终得到样本中氨基酸的定性和定量分析结果。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤1)样本处理的方法为：
取体液样本，加入3-5倍样本体积的纯甲醇，涡旋，在4℃条件下，8000-12000r/min下离心10-25min，移取上清液到另一个编好号的离心管中，-20℃冰箱静置，4℃，8000-12000r/min下再离心3-8min，备用。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤2)上机检测中的超高效液相色谱的条件的具体为：
色谱柱：ACQUITY BEH Amide色谱柱；
流动相A：超纯水(含2mM乙酸铵，0.02-0.05％甲酸)；
流动相B：乙腈(含2mM乙酸铵，0.02-0.05％甲酸)；
洗针液：50％甲醇(超声脱气10min)；
柱温：40℃；流速：0.4mL/min；进样量：2μL；
洗脱梯度：0-9min，90％-60％B；9-10min，60％-40％B；10-11min，40％B；11.01-15min，90％B。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中步骤2中的串联质谱的条件为：
Ion Mode ESI+/- Curtain Gas 35 MRM detection window 120 Temperatμre 550 Ion Source Gas I 50 Ion Source Gas2 60 Collision Gas Medium Scan tyPe sMRM Entrance Potential 10 Collision Cell Exit Potential 10
。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中步骤3)数据分析的具体方法为：
1)样本质控分析：通过对不同质控样本质谱检测分析的总离子流图(TIC图)进行重叠展示分析，以判断氨基酸提取和检测的重复性；
(2)标准曲线绘制：配制不同浓度的氨基酸标准品溶液，获取各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据；以标准品浓度(μg/mL)为横坐标，质谱峰的峰面积(Peak Area)为纵坐标，绘制不同氨基酸的标准曲线；
(3)绝对定量：将检测到的所有样本的所有氨基酸的积分峰面积分别代入标准曲线线性方程进行计算，将计算结果进一步代入含量计算公式计算后得到实际样本中每种氨基酸的绝对含量。
6.权利要求1-5任一项所述的方法中，其中部分物质离子对信息和保留时间如下所示：
Figure FDA0003107932150000021
Figure FDA0003107932150000031
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述的标准曲线如下所示：
Figure FDA0003107932150000032
Figure FDA0003107932150000041
Figure FDA0003107932150000051
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述的样本来自人或动物，样本是尿液样本。
9.权利要求1-8任一项所述的方法在检测人体中氨基酸浓度中的应用。
10.权利要求1-8任一项所述的方法在检测环境或食品中氨基酸浓度中的应用。
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