CN110455954A - 一种血浆中儿茶酚胺代谢物高效液相色谱串联质谱检测方法 - Google Patents

一种血浆中儿茶酚胺代谢物高效液相色谱串联质谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种血浆中儿茶酚胺代谢物高效液相色谱串联质谱检测方法，包括样品制备、样品处理、样品检测及结果分析步骤，标准品及质控品采用在牛血清白蛋白中加入儿茶酚胺代谢物标准品进行制备，采用弱阳离子交换96孔板进行样品固相萃取，处理样品，处理后的样品进行高效液相色谱质谱检测，本发明检测方法具有灵敏度高、特异性高，受基质影响程度低，单个样本检测时间短，样本用量少，检测成本低等优点。

Description

一种血浆中儿茶酚胺代谢物高效液相色谱串联质谱检测方法
技术领域
本发明涉及疾病分析技术领域，具体而言，涉及一种血浆中儿茶酚胺代谢物高效液相色谱串联质谱检测方法。
背景技术
嗜铬细胞瘤和副神经节瘤为起源于神经外胚层嗜铬组织的肿瘤，主要分泌儿茶酚胺。本病的临床表现个体差异甚大,突然发生恶性高血压、心衰或脑出血等。嗜铬细胞瘤大约10％在肾上腺外，10％呈恶性，10％为家族性，10％出现于儿童，10％瘤体在双侧，10％为多发性。临床症状及体征与儿茶酚胺分泌过量有关，表现有高血压、头痛、心悸、高代谢状态、高血糖、多汗。某些患者可因长期高血压致严重的心、脑、肾损害或因突发严重高血压而导致危象，危及生命，但如能及时、早期获得诊断和治疗，是一种可治愈的继发性高血压病。嗜铬细胞瘤在高血压病人中患病率为0.05％～0.2％，发病高峰为20～50岁。
嗜铬细胞瘤的常规诊疗程序是先进行生化检查定性，再通过影像学进行定位诊断，然后手术治疗。血液和尿液中的儿茶酚胺代谢产物—甲氧基肾上腺素(包括甲氧基肾上腺素MN和甲氧基去甲肾上腺素NMN)是目前公认的最好生物学标志物，特别是血浆中游离MN和NMN的检测时首选的嗜铬细胞瘤检查方法，具有高准确性和特异性，对诊断和发现嗜铬细胞瘤具有极高的临床价值。但目前常用的生化检查项目的敏感性和特异性较低，影响了嗜铬细胞瘤的早期诊断。高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)的灵敏度和特异性高，是国际上测定儿茶酚胺及其代谢物的推荐方法和金标准方法。
实验室应用的儿茶酚胺类物质检测方法主要有高效液相色谱同电化学检测、荧光光度检测相结合和高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS法)。高效液相色谱同电化学检测、荧光光度检测相结合方法不能消除药物干扰，且许多方法在灵敏度、选择性等方面不能达到样品分析要求。LC-MS/MS法大大提高了灵敏度和选择性，但很多方法也存在方法仪器成本高、方法耐用性不佳、基质干扰仍较显著、分析检测时间过长等缺点。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种血浆中儿茶酚胺代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：
(1)样品制备：
标准品制备：以牛血清白蛋白作为空白基质，加入儿茶酚胺代谢物标准溶液，配制系列已知浓度的儿茶酚胺代谢物标准样品；
质控品制备：以牛血清白蛋白作为空白基质，加入儿茶酚胺代谢物标准溶液，配制低、中、高三个已知浓度的儿茶酚胺代谢物质控样品；
(2)样品处理：样品包括待测人血浆样品、标准品、质控品，处理方法均如下：
A)预处理：取500μL样品，加入15μL内标液，涡旋混匀，再加入50mM乙酸铵溶液500μL，涡旋混匀；
B)固相萃取处理：将步骤A)中预处理样品转移入经过活化平衡的弱阳离子交换96孔板中，静置5分钟后，加入平衡淋洗液1mL，负压或正压至干；再加入1mL甲醇，负压或正压至干；最后分2次分别加入250mL洗脱液，在负压或正压下收集到96孔收集板中，用氮气吹干；
C)样品复溶：将100μL复溶液加入到步骤B)经氮气吹干后的96孔收集板中，加覆96孔板封片，涡旋至少5分钟使残渣充分溶解，在4000rpm下离心5min后待测；
(3)样品检测：取步骤(2)获得的样品10～40μL，自动进样，进行高效液相色谱串联质谱检测；
(4)数据处理及分析：绘制标准曲线，计算回收率、基质效应、精密度，及计算待测人血浆样品儿茶酚胺代谢物浓度。
本发明采用牛血清白蛋白配置标准品及质控品，降低了人血浆样品检测时的基质效应，提高了标准曲线的准确性及可靠性；另外样品用量少，有利于多种物质的检测；采用弱阳离子交换96孔板进行样品固相萃取，促进了样品中待测物质的提纯与富集，从而进一步提高检测效率及检测结果的准确性。
优选的，所述儿茶酚胺代谢物为甲氧基肾上腺素和/或甲氧基去甲肾上腺素。
优选的，甲氧基肾上腺素标准品系列浓度为10pg/mL、20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、150pg/mL、200pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、600pg/mL；甲氧基去甲肾上腺素标准品系列浓度为20pg/mL、40pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、300pg/mL、400pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、1200pg/mL。
优选的，甲氧基肾上腺素质控品低、中、高浓度分别为30pg/mL、120pg/mL、300pg/mL，稀释质控品浓度为2000pg/mL；甲氧基去甲肾上腺素质控品低、中、高浓度分别为60pg/mL、240pg/mL、600pg/mL，稀释质控品浓度为4000pg/mL。采用三个不同浓度的质控品，检验了标准曲线的可靠性；另外还采用了稀释质控品，验证了本检测方法具有高灵敏度和更广的可报告范围，提高了儿茶酚胺代谢物检测的可靠性。
优选的，甲氧基肾上腺素内标采用氘代甲氧基肾上腺素；甲氧基去甲肾上腺素内标采用氘代甲氧基去甲肾上腺素。
优选地，所述经过活化平衡的弱阳离子交换96孔板的活化平衡方法为：加入1mL甲醇，静置5分钟，再加入1mL超纯水静置5分钟。
优选的，所述平衡淋洗液为50mM醋酸铵溶液，pH＝7；所述洗脱液为含5％甲酸甲醇；所述复溶液为含0.1％甲酸的10％甲醇水溶液。
优选地，采用梯度洗脱反相色谱法，流动相A为0.1％甲酸-5mM甲酸铵水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液，色谱柱为五氟苯基柱(PFP)，流动相流速0.6ml/min，柱温在40℃。
进一步的，梯度洗脱程序为：
本发明洗脱时间短，降低了单个样本的检测时间，提高了效率，降低检测成本。
优选的，质谱条件为：采用电喷雾离子源(ESI)和正离子多反应监测扫描模式(MRM)，用于检测的MN和NMN及其内标的母离子/子离子对质荷比(m/z)如下所示：MN，180.1/148.1和180.1/120.1；NMN，166.1/134.1和166.1/121.1，MN内标，183.1/151.1，NMN内标169.1/137.1。
有益效果：
1采用牛血清白蛋白作为空白基质，配制标准校准品及质控品，减少了基质影响，提高了标准曲线的可靠性。
2检测时间短，整个检测时间4min左右，大大缩短了单个样本的检测时间，有效降低了分析成本；
3使用弱阳离子交换96孔板，提高了样本处理通量和自动化水平，且最大程度消除了基质效应，提高了分析方法的特异性；
4灵敏度高，使用500μL血浆时，MN和NMN的最低定量限分别为5.0pg/mL和10pg/mL。
5可报告范围更广，MN的可报告范围为5-2000pg/mL，NMN的可报告范围为10-4000pg/mL，可准确分析MN和NMN异常的血浆样本；
6前处理过程较简单，所用试剂为常规化学试剂且成本较低，便于操作；
7样本用量少，为500μL。
附图说明
图1为500μL样本量对应的MN标准曲线图；
图2为500μL样本量对应的NMN标准曲线图；
图3为500μL样本量对应的人血浆样本NMN/NMN-d3色谱图；
图4为500μL样本量对应的人血浆样本MN/MN-d3色谱图；
图5为500μL样本量对应的人血浆低值质控样本NMN/NMN-d3色谱图；
图6为500μL样本量对应的人血浆低值质控样本MN/MN-d3色谱图；
图7为:500μL样本量对应的人血浆中值质控样本NMN/NMN-d3色谱图；
图8为500μL样本量对应的人血浆中值质控样本MN/MN-d3色谱图；
图9为500μL样本量对应的人血浆高值质控样本NMN/NMN-d3色谱图；
图10为500μL样本量对应的人血浆高值质控样本MN/MN-d3色谱图.
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
样品制备
标准品制备：精密称取甲氧基肾上腺素标准品10mg，放置于50ml的容量瓶中，用甲酸溶液定容，获得200ng/ml的甲氧基肾上腺素标准品储备液。甲氧基去甲肾上腺素标准品储备液制备方法同上。分别取适量甲氧基肾上腺素标准品储备液及甲氧基去甲肾上腺素标准品储备液，加入牛血清白蛋白空白基质溶液，配制成系列浓度为10pg/mL、20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、150pg/mL、200pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、600pg/mL的甲氧基肾上腺素标准品及系列浓度为20pg/mL、40pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、300pg/mL、400pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、1200pg/mL的甲氧基去甲肾上腺素标准品。
质控品制备：分别取适量甲氧基肾上腺素标准品储备液及甲氧基去甲肾上腺素标准品储备液，加入牛血清白蛋白空白基质溶液，配制成低、中、高浓度为30pg/mL、120pg/mL、300pg/mL和浓度为2000pg/mL的稀释质控的甲氧基肾上腺素质控品；以及低、中、高浓度为60pg/mL、240pg/mL、600pg/mL的甲氧基去甲肾上腺素质控品和浓度为4000pg/mL的稀释质控的甲氧基去甲肾上腺素质控品。
内标液制备：分别精密称取氘代甲氧基肾上腺素标准品及氘代甲氧基去甲肾上腺素标准品10mg，分别放置于50ml的容量瓶中，用甲酸定容，然后稀释，制备得到100pg/mL的甲氧基肾上腺素内标液及200pg/mL的甲氧基去甲肾上腺素内标液。
样品的处理
待测人血浆样品、标准品、质控品采用如下方法处理：
96孔SPE板活化和平衡：加入1mL甲醇，静置5分钟，再加入1mL超纯水静置5分钟；
预处理：取500μL样品，加入15μL内标液，涡旋混匀，再加入500μL 50mM乙酸铵溶液，涡旋混匀；
固相萃取处理：预处理样品转移入经过活化平衡的弱阳离子交换96孔板中，静置5分钟后，加入平衡淋洗液乙酸铵溶液1mL，乙酸铵溶液pH＝7，负压或正压至干；再加入1mL甲醇，负压或正压至干；在SPE板下放置新的1mL规格96孔收集板，向SPE板各孔加入250μL的含5％甲酸甲醇，正压或负压至干，收集洗脱液至96孔收集板中；再次加入250μL的含5％甲酸甲醇，正压或负压至干，合并收集洗脱液；将96孔收集板置于约40℃的氮气流下吹干收集的洗脱液；
样品复溶：向吹干的96孔收集板各孔加入100μL含0.1％甲酸的10％甲醇水溶液的复溶液，加覆96孔板封片，涡旋至少5min至完全溶解，在4000rpm下离心5min后待测(也可转移至新的96孔进样板中待测)。
样品检测
色谱质谱联用仪型号：AB SCIEX Triple Quad 4500MD
液相色谱条件
色谱柱：五氟苯基(PFP)色谱柱
流动相A：0.1％甲酸-5mM甲酸铵水溶液
流动相B：0.1％甲酸甲醇溶液
流速：0.6mL/min
柱温：40℃
进样量：10-40μL
反相色谱梯度洗脱程序：
时间(min) 0 0.5 2.15 2.20 2.60 2.65 3.0 3.5
％B 10 10 65 90 90 10 10 10
质谱条件：
采用电喷雾离子源(ESI)和正离子多反应监测扫描模式(MRM)，参数设置如下表：
用于检测的MN和NMN及其内标的母离子/子离子对质荷比(m/z)如下表：
待测物/内标 MRM DP EP CE CXP
MNQuant 180.1/148.1 80 8 22 10
MNIonRatio 180.1/120.1 80 8 22 8
NMNQuant 166.1/134.1 70 8 22 7
NMNIonRatio 166.1/121.1 70 8 22 8
MN-d3 183.1/151.1 80 8 22 10
NMN-d3 169.1/137.1 70 8 22 7
检测结果
1)标准曲线建立：以MN、NMN标准品浓度为横坐标，以MN、NMN与其内标峰面积比为纵坐标，进行线性回归，获得标准曲线，标准曲线及相关系数如表1所示。
表1标准曲线回归方程及相关系数
2)人血浆样品中MN/NMN浓度
检测阴性人血浆样品，将血浆样品中待测物与其内标峰面积比，代入建立的MN或NMN标准曲线中，计算得到人血浆样品中MN和NMN浓度。表2为不同人血浆中的MN和NMN的浓度。
表2血浆样本中MN和NMN的浓度
3)准确度&精密度
使用低、中、高浓度质控样品(LQC、MQC、HQC)中待测物与其内标峰面积比，代入建立的MN或NMN标准曲线中，计算得到质控样品中MN和NMN浓度，再计算出至少3个分析批的每种质控样品的准确度和精密度结果，结果如表3所示，其接受标准为测定值均值和理论值间的相对偏差(RE)在±15％之间，且精密度(CV)≤15％。
表3准确度&精密度
本研究表明此方法的准确度&精密度都符合接受标准。
4)基质效应
基质效应通过比较各浓度质控水平的纯溶液样品与其对应添加入基质空白和血浆空白后待测物的响应得到(基质和血浆样品需减去本底响应)(见表4)，基质效应在85％-115％之间时表明该基质对待测物测定的影响可忽略。如存在基质效应，各浓度质控水平的基质效应应接近。
从表4可看出，牛血清白蛋白及血浆对于NMN各质控浓度和MN各质控浓度的基质效应可以用添加内标的方式抵消，认为基质效应可接受。
表4基质效应结果
MN内标归一化的基质因子 NMN内标归一化的基质因子
牛血清白蛋白LQC 97.0％ 102.3％
人血浆LQC 96.3％ 99.5％
牛血清白蛋白MQC 92.0％ 101.4％
人血浆MQC 95.4％ 97.2％
牛血清白蛋白HQC 93.6％ 100.6％
人血浆HQCH 96.5％ 99.0％
均值 95.1％ 100.0％
CV(％) 2.0％ 1.7％
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (10)

1.一种血浆中儿茶酚胺代谢物高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品制备：
标准品制备：以牛血清白蛋白作为空白基质，加入儿茶酚胺代谢物标准溶液，配制系列已知浓度的儿茶酚胺代谢物标准品；
质控品制备：以牛血清白蛋白作为空白基质，加入儿茶酚胺代谢物标准溶液，配制低、中、高三个已知浓度的儿茶酚胺代谢物质控样品；
(2)样品处理：样品包括待测人血浆样品、标准品、质控品，处理方法均如下：
A)预处理：取500μL样品，加入15μL内标液，涡旋混匀，再加入50mM乙酸铵溶液500μL，涡旋混匀；
B)固相萃取处理：将步骤A)中预处理样品转移入经过活化平衡的弱阳离子交换96孔板中，静置5分钟后，加入平衡淋洗液1mL，负压或正压至干；再加入1mL甲醇，负压或正压至干；最后分2次分别加入250mL洗脱液，在负压或正压下收集到96孔收集板中，用氮气吹干；
C)样品复溶：将100μL复溶液加入到步骤B)经氮气吹干后的96孔收集板中，加覆96孔板封膜，涡旋至少5分钟使残渣充分溶解，在4000rpm下离心5min后待测；
(3)样品检测：取步骤(2)处理后得到的样品10～40μL，自动进样，进行高效液相色谱串联质谱检测；
(4)数据处理及分析：建立标准曲线并计算待测人血浆样品儿茶酚胺代谢物浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述儿茶酚胺代谢物为甲氧基肾上腺素和/或甲氧基去甲肾上腺素。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，甲氧基肾上腺素在标准品中的系列浓度为10pg/mL、20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、150pg/mL、200pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、600pg/mL；甲氧基去甲肾上腺素中的系列浓度为20pg/mL、40pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、300pg/mL、400pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、1200pg/mL。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，甲氧基肾上腺素质控品低、中、高浓度分别为30pg/mL、120pg/mL、300pg/mL；甲氧基去甲肾上腺素质控品低、中、高浓度分别为60pg/mL、240pg/mL、600pg/mL。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，甲氧基肾上腺素内标采用氘代甲氧基肾上腺素；甲氧基去甲肾上腺素内标采用氘代甲氧基去甲肾上腺素。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经过活化平衡的弱阳离子交换96孔板的活化平衡方法为：加入1mL甲醇，静置5分钟，再加入1mL超纯水静置5分钟。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述平衡淋洗液为50mM乙酸铵溶液，pH＝7；所述洗脱液为含5％甲酸甲醇；所述复溶液为含0.1％甲酸的10％甲醇水溶液。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，液相色谱条件：采用梯度洗脱反相色谱法，流动相A为0.1％甲酸-5mM甲酸铵水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液，色谱柱为五氟苯基柱(PFP)，流动相流速为0.6mL/min，柱温在40℃。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：
时间(min) 0 0.5 2.15 2.20 2.60 2.65 3.0 3.5 ％B 10 10 65 90 90 10 10 10
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，质谱条件为：采用电喷雾离子源(ESI)和正离子多反应监测扫描模式(MRM)，用于检测的MN和NMN及其内标的母离子/子离子对质荷比(m/z)如下所示：MN，180.1/148.1和180.1/120.1；NMN，166.1/134.1和166.1/121.1，MN内标183.1/151.1，NMN内标169.1/137.1。
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