CN111965369A - 一种血浆中血管紧张素ⅰ检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种血浆中血管紧张素Ⅰ检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括校准品和质控品，所述校准品为含有梯度浓度血管紧张素Ⅰ的牛血清白蛋白，所述质控品为含有血管紧张素Ⅰ的牛血清白蛋白，所述质控品包括第一质控品、第二质控品和第三质控品，且三者中血管紧张素Ⅰ的浓度依次升高。本发明所述的试剂盒和检测方法能够提供校准品、样品前处理所涉及的试剂和质控品，免除实验室检测自配的繁琐步骤和造成的误差，保证检测结果的准确性。
Description
技术领域
本发明属于临床体外检测试剂领域，尤其是涉及一种血浆中血管紧张素Ⅰ检测试剂盒及检测方法。
背景技术
临床上应用人血浆中血管紧张素I产生的速率来评定血浆肾素活性(PRA)。肾素是由肾脏近球体细胞产生的分子量为40000的一种羧基蛋白水解酶。它作用于血管紧张素原产生血管紧张素I。血管紧张素I在转化酶的作用下形成血管紧张素II。
肾素-血管紧张素系统有多种生理功能。在调节人体血压、水和电解质平衡代谢过程中起着重要作用。另外，它与一些肾脏疾病及与肾脏有关的一些疾病密切关系。如肾素瘤、肾动脉狭窄、Bartte,s综合症，Liddle综合症等。
醛固酮和肾素活性比值(Aldosterone to renin ratio，ARR)已成为原发性醛固酮增多症分型诊断、治疗及研究的重要指标。对一些有关肾脏疾病的辅助诊断、治疗以及发病机理的探讨也有着重要意义。
血液中血管紧张素Ⅰ水平非常低，仅为ng/mL级，因此对检测方法的灵敏度要求很高。1970s起使用放射免疫法检测,有些采用化学发光法检测，是如今临床最常用的检测方法。免疫法可实现自动化操作，检测快速、成本低，但单次仅能检测一种靶标激素，特异性差、易出现交叉反应，不同的免疫测试结果不一定统一。随着技术的发展，以色谱作为分离手段、三重四极杆串联质谱作为检测手段的液相色谱-串联质谱技术成为了定量检测生物样品中痕量目标分析物的强有力的手段。现有的基于液相色谱串联质谱技术检测血浆中血管紧张素Ⅰ的定量检测方法多为实验室自建方法，由于每个实验室检测方法和试剂选择不同，会造成室间的检测结果差异大，特别是在面对临床大量的检测样本，很难保证检测结果的一致性。想要解决这些问题，就需要针对检测项目直接提供经过验证的配套试剂盒以及标准的检测流程，提高液相色谱-串联质谱技术在临床检测的推广性，保证检测结果的一致性和准确性。
此外，在检测过程中，对血浆的需求量很小，大大降低了患者的生理负担，并且检测精准。而目前基于液相色谱-串联质谱技术进行血浆中血管紧张素Ⅰ的检测方法及检测试剂盒还鲜有报道。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种血浆中血管紧张素Ⅰ检测试剂盒，以克服现有技术的缺陷，能够提供校准品、样品前处理所涉及的试剂和质控品，免除实验室检测自配的繁琐步骤和造成的误差，保证检测结果的准确性。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种血浆中血管紧张素Ⅰ检测试剂盒，包括校准品和质控品，所述校准品为含有梯度浓度血管紧张素Ⅰ的牛血清白蛋白，所述质控品为含有血管紧张素Ⅰ的牛血清白蛋白，所述质控品包括第一质控品、第二质控品和第三质控品，且三者中血管紧张素Ⅰ的浓度依次升高。
更优选地，所述第一质控品中血管紧张素Ⅰ的含量范围为：0.5-2ng/mL；第二质控品中血管紧张素Ⅰ的含量范围为：40-60ng/mL；第三质控品中血管紧张素Ⅰ的含量范围为：70-100ng/mL。
优选地，所述试剂盒中还包括内标混合液、缓冲液、富集柱、活化液、淋洗液、洗脱液和复溶液。
更优选地，所述内标混合液为含有血管紧张素Ⅰ-13C6,15N4的10％甲酸水溶液。进一步优选地，血管紧张素Ⅰ-13C6,15N4的浓度范围为100-400ng/mL。
优选地，所述缓冲液分为缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D，所述缓冲液A为0.1-0.3M Tris Base溶液；所述缓冲液B为使用缓冲液A配制的0.05％-2.0％BSA(w/v)溶液；所述缓冲液C为1-3M Tris Base和0.1-0.4M EDTA的混合水溶液；所述缓冲液D为使用缓冲液C配置的0.5-3mM PMSF溶液。
优选地，所述活化液包括活化液A和活化液B，所述活化液A为含甲醇的溶液。更优选地，所述活化液B为含有甲酸的溶液。
优选地，所述淋洗液包括淋洗液A和淋洗液B，所述淋洗液A为含甲酸的溶液，所述淋洗液B为含甲醇的溶液。
优选地，所述洗脱液为含甲醇的溶液。
优选地，所述复溶液为含甲醇和水的溶液。
优选地，所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为含甲酸的水溶液，所述流动相B为含甲酸的甲醇溶液。
优选地，所述洗针液为甲醇和水按一定体积比混合的混合溶液。
优选地，所述校准品的制备方法为：先用缓冲液B稀释血管紧张素Ⅰ标准品到梯度浓度，吸取100-300μL的牛血清白蛋白加入10-50μL的相应的标准品，涡旋混匀。最终校准品的浓度范围为0.5-100ng/mL。
优选地，所述质控品的制备方法为：用缓冲液B分别配制具有第一质控品、第二质控品和第三质控品相应浓度的标准品，然后将相应的标准品与牛血清白蛋白混合均匀，即得第一质控品、第二质控品和第三质控品。
相对于现有技术，本发明所述的一种血浆中血管紧张素Ⅰ检测试剂盒具有以下优势：
(1)本发明所述的试剂盒能够提供校准品，用于每个批次样品检测的工作曲线制定，免除实验室检测自配的繁琐步骤和造成的误差。
(2)本发明所述的试剂盒能够提供样品前处理所涉及的试剂以及前处理操作流程，实现血管紧张素Ⅰ从血浆中提取，避免样品中其他物质对待测物的干扰。
(3)本发明所述的试剂盒能够提供质控品，随每个检测批次一起检测，保证检测结果的准确性。
本发明的另一目的在于提出一种应用上述试剂盒进行血浆中血管紧张素Ⅰ的检测方法，该方法利用上述试剂盒与液相色谱-串联质谱联用进行血浆中血管紧张素Ⅰ的检测。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种血浆中血管紧张素Ⅰ的检测方法，包括如下步骤：
(1)样品制备：每个待测样本吸取250μL的血浆冷冻储存备用；
(2)样本处理：将血浆与30-60μL缓冲液D混合涡旋，置于30-50℃水中水浴2-4h后，加入200-500μL内标，密封备用。取500-2000μL活化液A加入到富集柱中，正压下使得活化液A通过富集柱滴下；取500-2000μL活化液B加入到富集柱中，正压下使得活化液B通过富集柱滴下；将处理好的校准品、质控品或待测血浆样品加入富集柱中，正压下使得样品通过富集柱后滴下；取500-2000μL淋洗液A加入富集柱中，正压下使得淋洗液A通过富集柱滴下；取500-2000μL淋洗液B加入富集柱中，正压下使得淋洗液B通过富集柱滴下；取100-400μL洗脱液加入富集柱中，正压下使得洗脱液通过富集柱滴下；取50-200μL洗脱液加入富集柱中，正压下使得洗脱液通过富集柱滴下；收集两次洗脱液，室温下进行氮吹吹干；取50-200μL复溶液对样本进行复溶，用液相色谱-串联质谱检测；
(3)检测结果计算：将标准品出峰面积与对应内标出峰面积的比值作为纵坐标，标准品溶液的浓度作为横坐标，拟合线性方程得到血管紧张素I的标准曲线；再将质控品峰面积与内标峰面积的比值带入标准曲线中计算得到实际的浓度。
优选地，所述步骤(2)中色谱条件为：色谱柱为Kinetex C18，100*3mm，2.6μm；柱温为40-70℃；检测时间为4-7min；进样量为10-20μL；梯度洗脱条件：0-0.1min，10％B，0.1-1.1min，95％B，1.1-3.5min，95％B，3.5-3.6min，10％B，3.6-5min，10％B，流速0.4-1mL/min。
优选地，所述步骤(2)中质谱条件为：正离子模式，采用ESI源，碰撞气6-10psi，气帘气20-40psi，雾化气40-70psi，辅助加热气40-70psi，喷雾电压4500-5500V，雾化温度300-500℃。
本发明所述的血浆中血管紧张素Ⅰ的检测方法具有以下优势：
(1)本发明所述的检测方法所需样本量少，降低了患者的生理负担。
(2)本发明所述的检测方法中前处理过程简单，可尽量避免操作过程带来的实验误差。
附图说明
图1为实施例1实测样品色谱图；
图2为实施例1中血管紧张素Ⅰ的工作曲线图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
一、试剂来源
(1)血管紧张素Ⅰ(Ang I)：上海谱芬生物，CAS号484-42-4，为干粉
试剂，5mg/瓶，临用前用缓冲液B复溶即可使用。
(2)血管紧张素Ⅰ-13C6,15N4(Ang I–13C6,15N4)：上海谱芬生物，CAS号AS-61182，
为干粉试剂，100μg/瓶，临用前用去离子水复溶即可使用。
(3)甲醇：使用Fisher Chemical公司67-56-1号试剂，纯度为LC/MS级，常温密封储存。
(4)甲酸：使用Fisher Chemical公司64-18-6号试剂，纯度为LC/MS级，常温密封储存。
(5)苯甲基磺酰氟(PMSF)：使用Sigma公司329-98-6号试剂，纯度为LC/MS级，常温密封储存。
(6)三羟甲基氨基甲烷(Tris)：使用Sigma公司77-86-1号试剂，纯度为LC/MS级，常温密封储存。
(7)乙二胺四乙酸(EDTA)：使用Sigma公司6381-92-6号试剂，纯度为LC/MS级，常温密封储存。
(8)水：符合国标GB/T 6682-2008的一级水。
二、实施例
本实施例中提供血浆中血管紧张素Ⅰ的检测试剂盒，包括校准品、内标溶液、质控品、缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D、富集柱、活化液A、活化液B、淋洗液A、淋洗液B、洗脱液和复溶液。
配置血管紧张素Ⅰ的校准品溶液，浓度范围分别为0.5-100ng/mL，具体到本实施例，可以采用如表1所示的梯度浓度。
表1血管紧张素Ⅰ的校准品溶液梯度浓度分布
质控品样本：含有血管紧张素Ⅰ低、中、高三个浓度的牛血清白蛋白。低浓度的质控品(也即第一质控品)浓度为2ng/mL，中浓度的质控品(也即第二质控品)浓度为45ng/mL，高浓度的质控品(也即第三质控品)浓度为70ng/mL。
内标溶液：血管紧张素Ⅰ-13C6,15N4浓度为300ng/mL。
缓冲液A：0.2M Tris Base溶液。
缓冲液B：使用缓冲液A配制的1.5％BSA溶液。
缓冲液C：2M Tris Base和0.3M EDTA的混合水溶液。
缓冲液D：使用缓冲液C配置的2.5mM PMSF溶液。
富集柱：柱子中装有弱阳离子交换填料。
活化液A：20％甲醇水溶液。
活化液B：10％甲酸水(v/v)溶液。
淋洗液A：10％甲酸水(v/v)溶液。
淋洗液B：50％甲醇水(v/v)溶液。
洗脱液：20％甲醇水溶液。
复溶液：80％甲醇水(v/v)溶液。
流动相A：1％的甲酸水溶液。
流动相B：1％的甲酸甲醇溶液。
洗针液：甲醇和水按体积比4:1进行混合。
采用上述试剂盒对血浆中血管紧张素Ⅰ的检测方法，包括以下步骤：
(1)样品制备：
每个待测样本吸取250μL的血浆冷冻储存备用；
(2)样本处理：
取出待测样本解冻，与30μL缓冲液D混合涡旋，置于50℃水中水浴2h后，加入400μL内标，密封备用。取2000μL活化液A加入到富集柱中，正压下使得活化液A通过富集柱滴下；取2000μL活化液B加入到富集柱中，正压下使得活化液B通过富集柱滴下；将处理好的校准品、质控品或待测血浆样品加入富集柱中，正压下使得样品通过富集柱后滴下；取2000μL淋洗液A加入富集柱中，正压下使得淋洗液A通过富集柱滴下；取2000μL淋洗液B加入富集柱中，正压下使得淋洗液B通过富集柱滴下；取400μL洗脱液加入富集柱中，正压下使得洗脱液通过富集柱滴下；取300μL洗脱液加入富集柱中，正压下使得洗脱液通过富集柱滴下；收集两次洗脱液，室温下进行氮吹吹干；取50μL复溶液对样本进行复溶，对复溶液使用液相色谱-串联四极杆质谱检测；
(3)检测方法
将复溶液在液相色谱(岛津)-串联质谱(SCIEX)设备中进行检测。采用多反应监测(MRM)扫描方式，色谱测试条件为：流动相A为1％的甲酸水溶液；流动相B为1％的甲酸的甲醇溶液；色谱柱为Kinetex C18，100*3mm，2.6μm；柱温为70℃；检测时间为5min；进样量为20μL；梯度洗脱条件：0-0.1min，10％B，0.1-1.1min，95％B，1.1-3.5min，95％B，3.5-3.6min，10％B，3.6-5min，10％B，流速0.5mL/min。质谱条件为正离子模式，采用ESI源，碰撞气8psi，气帘气30psi，雾化气60psi，辅助加热气60psi，喷雾电压5500V，雾化温度500℃。具体化合物质谱参数如表2所示：
表2化合物质谱参数
(备注：Ang I：血管紧张素Ⅰ；Ang I–13C6,15N4：血管紧张素Ⅰ碳氮内标)
(4)检测结果
将校准品样本的峰面积与内标峰面积比值作为标准曲线的纵坐标，校准品浓度作为横坐标进行线性拟合，拟合线性方程得到血管紧张素Ⅰ的标准曲线，如下：
线性方程为：Y＝0.022x-0.0023(r＝0.9993)
血管紧张素Ⅰ的线性范围为0.5～100ng/mL。
将质控品样本的峰面积带入标准曲线中计算得到实际的浓度，并与理论值比较评估。质控品样品测试谱图如图1所示，线性曲线示例图如图2所示。
三、效果验证
1、试剂盒正确度验证
以实施例所述的试剂盒测试样品，通过加标回收率测定试剂盒的正确度，结果如表3所示：
表3 Ang I正确度
由表3的结果可知，在基质中加入低、中、高浓度的目标分析物，加标回收率为±15％的范围，表明试剂盒检测的正确度符合临床需求。
2、试剂盒精密度验证
以实施例所述的试剂盒测试人血浆样品，分别检测试剂盒的批内、批间和总精密度，结果见表4。
表4试剂盒测试的批内、批间和总精密度
由表4的结果可知，试剂盒样品中血管紧张素Ⅰ的批内、批间、总精密度均小于15％(1.17％～9.67％)，符合临床检测需求。
本发明针对上述的现有检测血管紧张素Ⅰ的问题，所提供的的试剂盒的使用方法涵盖从样本处理到进样检测、数据质控的整体解决方案，此外，本方案所需要的血浆样本量很少，可满足临床试剂检测的需求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种血浆中血管紧张素Ⅰ检测试剂盒，其特征在于：包括校准品和质控品，所述校准品为含有梯度浓度血管紧张素Ⅰ的牛血清白蛋白，所述质控品为含有血管紧张素Ⅰ的牛血清白蛋白，所述质控品包括第一质控品、第二质控品和第三质控品，且三者中血管紧张素Ⅰ的浓度依次升高。
2.如权利要求1所述的血浆中血管紧张素Ⅰ检测试剂盒，其特征在于：所述第一质控品中血管紧张素Ⅰ的含量范围为：0.5-2ng/mL；第二质控品中血管紧张素Ⅰ的含量范围为：40-60ng/mL；第三质控品中血管紧张素Ⅰ的含量范围为：70-100ng/mL。
3.如权利要求1所述的血浆中血管紧张素Ⅰ检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括内标混合液、缓冲液、富集柱、活化液、淋洗液、洗脱液和复溶液。
4.如权利要求1所述的血浆中血管紧张素Ⅰ检测试剂盒，其特征在于：所述内标混合液为含有血管紧张素Ⅰ-13C6,15N4的10％甲酸水溶液；优选地，血管紧张素Ⅰ-13C6,15N4的浓度范围为100-400ng/mL；所述缓冲液分为缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D，所述缓冲液A为0.1-0.3M Tris Base溶液；所述缓冲液B为使用缓冲液A配制的0.05％-2.0％BSA(w/v)溶液；所述缓冲液C为1-3M Tris Base和0.1-0.4M EDTA的混合水溶液；所述缓冲液D为使用缓冲液C配置的0.5-3mM PMSF溶液。
5.如权利要求1所述的血浆中血管紧张素Ⅰ检测试剂盒，其特征在于：所述活化液包括活化液A和活化液B，所述活化液A为含甲醇的溶液，优选地，所述活化液B为含有甲酸的溶液；优选地，所述淋洗液包括淋洗液A和淋洗液B，所述淋洗液A为含有甲酸的溶液，所述淋洗液B为含有甲醇的溶液；优选地，所述洗脱液为含有甲醇的溶液；优选地，所述复溶液为含有甲醇和水的溶液；优选地，所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为含有甲酸的水溶液，所述流动相B为含有甲酸的甲醇溶液；优选地，所述洗针液为甲醇和水按一定比例的混合溶液。
6.如权利要求1所述的血浆中血管紧张素Ⅰ检测试剂盒，其特征在于：所述校准品的制备方法为：先用缓冲液B稀释血管紧张素Ⅰ标准品到梯度浓度，吸取100-300μL的牛血清白蛋白加入10-50μL的相应的标准品，涡旋混匀。最终校准品的浓度范围为0.5-100ng/mL；优选地，所述质控品的制备方法为：用缓冲液B分别配制具有第一质控品、第二质控品和第三质控品相应浓度的标准品，然后将相应的标准品与牛血清白蛋白混合均匀，即得第一质控品、第二质控品和第三质控品。
7.一种血浆中血管紧张素Ⅰ的检测方法，其特征在于：所述检测方法利用权利要求1-6任一所述试剂盒与液相色谱-串联质谱联用进行血浆中血管紧张素Ⅰ的检测。
8.如权利要求7所述的血浆中血管紧张素Ⅰ的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)样品制备：每个待测样本吸取250μL的血浆冷冻储存备用；
(2)样本处理：将血浆与30-60μL缓冲液D混合涡旋，置于30-50℃水中水浴2-4h后，加入200-500μL内标，密封备用。取500-2000μL活化液A加入到富集柱中，正压下使得活化液A通过富集柱滴下；取500-2000μL活化液B加入到富集柱中，正压下使得活化液B通过富集柱滴下；将处理好的校准品、质控品或待测血浆样品加入富集柱中，正压下使得样品通过富集柱后滴下；取500-2000μL淋洗液A加入富集柱中，正压下使得淋洗液A通过富集柱滴下；取500-2000μL淋洗液B加入富集柱中，正压下使得淋洗液B通过富集柱滴下；取100-400μL洗脱液加入富集柱中，正压下使得洗脱液通过富集柱滴下；取50-200μL洗脱液加入富集柱中，正压下使得洗脱液通过富集柱滴下；收集两次洗脱液，室温下进行氮吹吹干；取50-200μL复溶液对样本进行复溶，用液相色谱-串联质谱检测；
(3)检测结果计算：将标准品出峰面积与对应内标出峰面积的比值作为纵坐标，标准品溶液的浓度作为横坐标，拟合线性方程得到血管紧张素I的标准曲线；再将质控品峰面积与内标峰面积的比值带入标准曲线中计算得到实际的浓度。
9.如权利要求8所述的血浆中血管紧张素Ⅰ的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中色谱条件为：色谱柱为Kinetex C18，100*3mm，2.6μm；柱温为40-70℃；检测时间为4-7min；进样量为10-20μL；梯度洗脱条件：0-0.1min，10％B，0.1-1.1min，95％B，1.1-3.5min，95％B，3.5-3.6min，10％B，3.6-5min，10％B，流速0.4-1mL/min。
10.如权利要求8所述的血浆中血管紧张素Ⅰ的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中质谱条件为：正离子模式，采用ESI源，碰撞气6-10psi，气帘气20-40psi，雾化气40-70psi，辅助加热气40-70psi，喷雾电压4500-5500V，雾化温度300-500℃。
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