CN113933422A - 喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测方法及试剂盒 - Google Patents

喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种喹硫平、利培酮及9‑羟基利培酮的检测方法及试剂盒，属于临床检测技术领域，具体检测方法为液相色谱串联质谱法，试剂盒中的检测试剂里的校准品和质控品的基质均使用一定浓度的牛血清白蛋白溶液代替人血清，具有使用简便、成本较低、制备简单、所需样本体积较少、前处理快速、准确度高、灵敏度高、特异性好、干扰小、精密度高、分析时间短等特点。

Description

喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于临床检测技术领域，具体涉及一种基于LC-MS/MS技术对喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的浓度同时定量分析的检测方法及试剂盒。
背景技术
精神分裂症是最常见的精神类疾病之一，世界范围的发病率约为0.3％～0.7％，主要的临床症状包括幻觉、妄想、思维混乱、呓语、狂躁等。近年，我国精神分裂症的发病率呈明显上升趋势。在治疗方面，抗精神分裂药物使用过程中经验用药仍处于主导地位，目前应用于临床的药物有三十余种，其中喹硫平和利培酮为临床常用的第二代抗精神分裂症药物，而且利培酮和喹硫平在药理机制方面也有许多相似的地方，比如在对5-HT2受体上的亲和力都十分的强，是抗精神病治疗中的常见组合药物。
由于不同患者间的个体差异，在相同的服药剂量下，亦可造成截然不同的疗效。为了合理性用药，治疗药物监测(Therapeutic drug monitoring，TDM)显得尤为关键。基于德国神经精神药理学与
药物精神病学协会最新指南，对喹硫平和利培酮进行TDM处于推荐等级(Recommended Level1)。为了更好的了解利培酮和喹硫平联合用药后的药物动力学，需要一种灵敏、特异、准确的测定血清中利培酮和喹硫平及其代谢物的方法，以观察药物的量效关系。
目前NMPA批准的用于喹硫平(湘械注准20192400353)和利培酮及9-羟基利培酮(湘械注准20192400351)药物浓度测定的试剂盒均为胶乳免疫比浊法，仅能检测单一药物浓度，无法同时测定联合用药药物、更无法检测药物原型及其代谢物，且免疫分析法准确度不足，特异性差，易与血液中其它相似结构代谢产物发生交叉反应。
发明内容
基于现有技术中存在上述问题，本发明提供一种喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测方法及试剂盒，具体检测方法为液相色谱串联质谱法，检测试剂中的校准品和质控品的基质均使用一定浓度的牛血清白蛋白溶液代替人血清，具有使用简便、成本较低、制备简单、所需样本体积较少、前处理快速、准确度高、灵敏度高、特异性好、干扰小、精密度高、分析时间短等特点。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测试剂盒，包括盒体、内衬、校准品、质控品、空白质控品及样本萃取液，
所述校准品、质控品、空白质控品及样本萃取液均放置于所述盒体内；
所述校准品为固定有一组含有不同浓度喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮标准品的牛血清白蛋白溶液，数量为至少6个；
所述质控品为固定有一组含有不同浓度喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮标准品的牛血清白蛋白溶液，数量为至少3个；
所述样本萃取液为含有内标的乙腈溶液，所述内标采用同位素取代的喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮。
根据以上方案，所述盒体内设置有海绵内衬，内衬上设有凹槽，所述凹槽呈圆形，所述校准品、质控品、空白质控品及样本萃取液放入所述凹槽中；所述海绵内衬为可拆卸地固定在所述盒体的内部；所述盒盖与盒体是相连接的或相互独立的；所述盒盖与盒体配合关闭时，使所述试剂盒保持密封状态。
根据以上方案，所述的校准品和质控品使用0.1％-5％牛血清蛋溶液作为基质。
一种喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测方法，采用如权利要求1或2所述的试剂盒对待测人血清样本进行样本前处理，经前处理后的各样本分别进行液相色谱串联质谱检测，同时准确定量分析喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮；所述的液相色谱串联质谱检测中，质谱采用多反应监测，化合物MRM参数如下：
Figure BDA0003294589400000021
Dwell Time是扫描时间，CE是碰撞电压，DP是去簇电压，EP是入口电压，CXP是碰撞室出口电压；子离子中带*的是定量离子对。
根据以上方案，所述的喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测方法包括以下详细步骤：
步骤S1，配制系列浓度的校准品溶液、质控品溶液和样本萃取液；
步骤S2，向待测人血清样本加入样本萃取液，充分振荡混合均匀；
步骤S3，取步骤S2中混合均匀后的各样本进行离心，离心后取上清液加入0.1％甲酸水溶液进行稀释，充分振荡混合均匀；
步骤S4，取步骤S3中混合均匀后的各样本进行离心，离心后取上清液进行LC-MS/MS分析。
根据以上方案，所述的液相色谱条件如下：
分析柱：Kinetex C18,2.6μm,3.0*50mm；
流动相A：为含2mM甲酸铵的0.1％甲酸水溶液；流动相B：含0.1％甲酸的甲醇溶液；
洗脱梯度：流动相A+流动相B＝100％；0～0.5min，流动相A体积保持80％；0.5～1.2min，流动相A体积由80％递减至5％；1.20～2.50min，流动相A体积保持5％；2.50～2.51min，流动相A体积由5％升高至80％；2.51～3.0min，流动相A体积保持80％；
流速：0.5mL/min；柱温：40℃。
根据以上方案，所述的质谱条件如下：
离子源：ESI+；喷雾毛细管电压：5500V；离子源温度：450℃；离子源雾化气：35psi；离子源加热辅助气：35psi；碰撞气：9psi；气帘气：10psi。
本发明的有益效果是：
1、本发明提供了一种全新的同时测定喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮药物浓度的检测方法及试剂盒，操作方便，检测耗时短，有助于提高分析检测的效率，且具有精密度高、准确度好、抗感染能力强的优点。同时，前处理方法相对比较简单，仅需要一步蛋白沉淀，耗时大大缩短，使前处理过程更加方便，且样品所需量较少并便于储存运输，前处理快速，分析周期短，成本较低等优点，适合在临床常规检测中推广。
2、采用牛血清白蛋白溶液作为替代基质用于配制校准品和质控品，解决了现有临床实验室自建项目(LDT)中血药浓度监测多以全血、血浆、血清为校准品和质控品基质来源，具有成本高、不稳定性、致病性及职业暴露的可能性较高等诸多缺陷。
附图说明
图1是本发明的试剂盒中总色谱图。
图2是本发明的试剂盒中喹硫平及内标(喹硫平-d8)的色谱图。
图3是本发明的试剂盒中利培酮及内标(利培酮-d4)的色谱图。
图4是本发明的试剂盒中9-羟基利培酮及内标(9-羟基利培酮-d4)的色谱图。
图5是本发明的试剂盒检测喹硫平的线性方程。
图6是本发明的试剂盒检测利培酮的线性方程。
图7是本发明的试剂盒检测9-羟基利培酮的线性方程。
图8是实施例中喹硫平准确度验证实验结果。
图9是实施例中利培酮准确度验证实验结果。
图10是实施例中9-羟基利培酮准确度验证实验结果。
图11是实施例中喹硫平干扰验证实验结果。
图12是实施例中利培酮干扰验证实验结果。
图13是实施例中9-羟基利培酮干扰验证实验结果。
附图1-7均为LC-MS/MS检测分析结果图，为实施例中的结果展示，图中文字均为结果展示，会根据每一次检测分析的结果发生变化，即图中文字与能否重复实施本发明提供的检测方法无关，图中文字不清晰不影响本领域技术人员重复实施本发明提供的检测方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行说明。
实施例一：一种喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测试剂盒。
一种喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测试剂盒，包括盒体、内衬、校准品、质控品、空白质控品及样本萃取液，
所述校准品、质控品、空白质控品及样本萃取液均放置于所述盒体内；
所述校准品为固定有一组含有不同浓度喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮标准品的牛血清白蛋白溶液，数量为至少6个，牛血清白蛋白溶液中含有0.1％-1％的牛血清蛋白，6个校准品的喹硫平浓度由低至高分别为35、70、175、350、700、1050ng/mL；6个校准品的利培酮和6个校准品的9-羟基利培酮浓度由低至高分别为4、8、20、40、80、120ng/mL；
所述质控品为固定有一组含有不同浓度喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮标准品的牛血清白蛋白溶液，数量为至少3个，牛血清白蛋白溶液中含有0.1％-1％的牛血清蛋白，低浓度质控点中喹硫平的浓度是35-175ng/mL，低浓度质控点中的利培酮及9-羟基利培酮浓度是4-20ng/mL；中浓度质控点中喹硫平的浓度是280-560ng/mL，低浓度质控点中的利培酮及9-羟基利培酮浓度是32-64ng/mL；高浓度质控点中喹硫平的浓度是700-945ng/mL，低浓度质控点中的利培酮及9-羟基利培酮浓度是80-108g/mL；所述空白质控品为不含有喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮标准品的空白牛血清白蛋白溶液；
所述的样本萃取液是同时含有12ng/mL喹硫平-d8、10ng/mL利培酮-d4和10ng/mL9-羟基利培酮-d4的乙腈溶液；
所述盒体内设置有海绵内衬，内衬上设有凹槽，所述凹槽呈圆形，所述校准品、质控品、空白质控品及样本萃取液放入所述凹槽中；所述海绵内衬为可拆卸地固定在所述盒体的内部；所述盒盖与盒体是相连接的或相互独立的；所述盒盖与盒体配合关闭时，使所述试剂盒保持密封状态；所述的校准品和质控品使用0.1％-5％牛血清蛋溶液作为基质。
实施例二：一种喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测方法。
一种喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测方法，先对待测样本进行液相色谱串联质谱检测的前处理，前处理后的各样本分别进行液相色谱串联质谱检测，同时准确定量分析喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮；包括以下详细步骤：
步骤S1，配制系列浓度的校准品溶液、质控品溶液和样本萃取液(实施例一的试剂盒中各试剂制备方法)；
步骤S11标准品储备液的配制:
分别精确称量10mg喹硫平、利培酮和9-羟基利培酮，置于5mL容量瓶，用纯甲醇进行充分溶解，定容至5mL，得到喹硫平、利培酮和9-羟基利培酮分别为2mg/mL的储备液。
步骤S12内标储备液配制：
分别精确称量1mg喹硫平-d8、利培酮-d4和9-羟基利培酮-d4，用纯甲醇进行充分溶解，得到喹硫平-d8、利培酮-d4和9-羟基利培酮-d4分别为1mg/mL的内标储备液。
步骤S13混合标准品次级储备液的配制：
准确移取适量步骤S11配制的喹硫平、利培酮和9-羟基利培酮标准品储备液，混合均匀，用甲醇作为稀释液，得到混合标准品次级储备液，其中含105μg/mL喹硫平、12μg/mL利培酮和12μg/mL 9-羟基利培酮。
步骤S14混合内标次级储备液的配制：
准确移取适量步骤S12配制的喹硫平-d8、利培酮-d4和9-羟基利培酮-d4内标储备液，混合均匀，用甲醇作为稀释液，得到混合内标次级储备液，其中含12μg/mL喹硫平-d8、10μg/mL利培酮-d4和10μg/mL 9-羟基利培酮-d4。
步骤S15校准品C6配制
准确移取适量步骤S13配制的混合标准品次级储备液，置于10mL容量瓶，用牛血清白蛋白溶液作为稀释液，定容至10mL，得到含105μg/mL喹硫平、12μg/mL利培酮和12μg/mL9-羟基利培酮的校准品C6。
步骤S16校准品C1～C5及质控品(LQC～HQC)配制：
Figure BDA0003294589400000061
步骤S17样本萃取液的配制：
准确移取适量步骤S14配制的混合内标次级储备液，置于200mL容量瓶，用乙腈溶液作为稀释液，定容至200mL，得到含12ng/mL喹硫平-d8、10ng/mL利培酮-d4和10ng/mL 9-羟基利培酮-d4的样本萃取液。
步骤S2，向待测样本加入样本萃取液，震荡混合均匀；
步骤S21，在室温条件下，取50.0μL校准品、质控品、空白质控品、待检测的人血清样本于96孔板中；
步骤S22，向空白质控品中加入200.0μL乙腈溶液，在待检测的人血清样中加入200.0μL样本萃取液；震荡台上震荡混合5.0min；
步骤S3，将充分混匀后的96孔板置于4℃条件下，4000rpm，离心5min，离心后转移上清液60.0μL置于新的96孔板中，加入300.0μL的0.1％甲酸水溶液，振荡5min；
步骤S4，将充分混匀后的96孔板置于4℃条件下，4000rpm，离心5min，离心后取10.0μL上清液进行LC-MS/MS分析。
所述的液相色谱的条件如下：
分析柱：Kinetex C18,2.6um,3.0*50mm；
流动相A：为含2mM甲酸铵的0.1％甲酸水溶液；流动相B：含0.1％甲酸的甲醇溶液；
洗脱梯度：流动相A+流动相B＝100％；0～0.5min，流动相A体积保持80％；0.5～1.2min，流动相A体积由80％递减至5％；1.20～2.50min，流动相A体积保持5％；2.50～2.51min，流动相A体积由5％升高至80％；2.51～3.0min，流动相A体积保持80％；
流速：0.5mL/min；柱温：40℃。
所述的质谱条件如下：
离子源：ESI+；喷雾毛细管电压(IonSpray Voltage)：5500V；离子源温度(Temperature)：450℃；离子源雾化气(Ion Source Gas1)：35psi；离子源加热辅助气(IonSource Gas2)：35psi；碰撞气(Collision Gas)：9psi；气帘气(Curtain Gas)：10psi；质谱采用多反应监测，化合物MRM参数如下：
表中，Dwell Time是扫描时间，CE是碰撞电压，DP是去簇电压，EP是入口电压，CXP是碰撞室出口电压；子离子中带*的是定量离子对。
Figure BDA0003294589400000071
通过各校准品标示浓度(参考靶值表)(X)，各校准品中喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮与其相应同位素内标的峰面积比值(Y)，绘制校准曲线并拟合校准曲线方程；再分别将待检测人血清样本中喹硫平与喹硫平同位素内标、利培酮与利培酮同位素内标、9-羟基利培酮与9-羟基利培酮同位素内标的峰面积比值，代入校准曲线方程，即可定量计算待检测样本人血清样本中喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的浓度，结果图1-7所示。
对本发明提供的检测方法作进一步的可行性检测，过程和结果如下：
线性验证实验结果(如下表所示)：
结果表明本发明提供的检测方法的人血清中喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的浓度，具有良好的线性，线性均符合产品技术要求(技术要求：r＞0.99)。
Figure BDA0003294589400000072
Figure BDA0003294589400000081
Figure BDA0003294589400000082
Figure BDA0003294589400000091
Figure BDA0003294589400000092
Figure BDA0003294589400000101
精密度验证实验结果：
批内精密度：通过检测高中低水平质控品计算得到；每个浓度水平平行制备6份平行样本，测定1批。
批间精密度：通过检测高中低水平质控品计算得到；每个浓度水平平行制备6份平行样本，连续测定3批。
Figure BDA0003294589400000102
Figure BDA0003294589400000103
Figure BDA0003294589400000104
从上表可知检测结果是：喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的批内变异系数(CV％)均＜15％，符合产品技术要求检测；喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的批间变异系数(CV％)均＜15％，符合产品技术要求。
残留验证实验结果：
本发明通过在注射校准品C6后，连续注射5针空白样品来评价；连续测定3天，检测结果如下表所示，喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的校准品C6后的空白样品中的残留均小于20％C1，符合产品技术要求。
Figure BDA0003294589400000111
Figure BDA0003294589400000121
Figure BDA0003294589400000122
Figure BDA0003294589400000131
准确度验证实验结果：
本发明参考《体外诊断试剂分析性能评估指导原则》，利用回收试验对本试剂盒进行准确度评估。选择混合人血清为常规样本，向常规样本(混合人血清)中加入与回收样本等量的无被测物质的溶剂，制成基础样本；向常规样本(混合人血清)中加入与加入不同量的待测物标准品，制成3个不同加入浓度的回收样本(低、中、高浓度)，用本发明对回收样本和基础样本进行测定，对样本进行3次重复分析，取其均值进行计算，检测结果如图8-10所示，喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的回收率均在85％～115％范围内，符合产品技术要求。
干扰验证实验结果：
本发明对常见内源性干扰物质(血红蛋白、甘油三酯、胆红素等)和外源性干扰物质(常用精神类联合用药药物，如氯氮平、阿立哌唑、氨磺必利、氟西汀、艾司西酞普兰、度洛西汀、氟哌啶醇、奥氮平)进行筛选，检测结果如图11-13所示，结果表明常见内源性干扰物质(血红蛋白、甘油三酯、胆红素等)和外源性干扰物质(常用精神类联合用药药物，如氯氮平、阿立哌唑、氨磺必利、氟西汀、艾司西酞普兰、度洛西汀、氟哌啶醇、奥氮平)对发明中喹硫平、利培酮和9-羟基利培酮的检测结果无明显干扰，符合产品技术要求。
基质效应验证实验结果：
本发明采用6批来自不同供体的空白人血清基质考察本方法下待测分析物在低浓度和高浓度下的基质效应。对于每批基质，通过计算基质存在下的峰面积(由空白人血清基质提取后加入混合标准品工作液和稳定同位素内标测得)，与不含人血清基质的相应峰面积(分析物和稳定同位素内标的纯溶液)比值，计算每一分析物和稳定同位素内标的基质因子；并进一步通过分析物的基质因子除以对应稳定同位素内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子，检测结果如下表所示，喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮从6批基质计算的稳定同位素内标归一化的基质因子的变异系数均＜15％，说明本发明不存在明显的基质效应，符合产品技术要求。
Figure BDA0003294589400000141
Figure BDA0003294589400000151
Figure BDA0003294589400000152
Figure BDA0003294589400000153
Figure BDA0003294589400000161
稳定性验证实验结果：
在比日常操作更加严格的环境中在温度37℃，湿度75％的恒温恒湿箱环境下密封保存试剂盒校准品C1和C6，分别在0，在0，3，7天时检测校准品C1和C6中喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮含量，结果如下表所示，加速7天后，本试剂盒依然稳定，符合产品技术要求，预估本发明在2-8℃可保存12个月。
Figure BDA0003294589400000162
Figure BDA0003294589400000163
Figure BDA0003294589400000171
Figure BDA0003294589400000172
本发明提供以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (7)

1.一种喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测试剂盒，其特征在于，包括盒体、内衬、校准品、质控品、空白质控品及样本萃取液，
所述校准品、质控品、空白质控品及样本萃取液均放置于所述盒体内；
所述校准品为固定有一组含有不同浓度喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮标准品的牛血清白蛋白溶液，数量为至少6个；
所述质控品为固定有一组含有不同浓度喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮标准品的牛血清白蛋白溶液，数量为至少3个；
所述样本萃取液为含有内标的乙腈溶液，所述内标采用同位素取代的喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮。
2.根据权利要求1所述的喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测试剂盒，其特征在于，所述盒体内设置有海绵内衬，内衬上设有凹槽，所述凹槽呈圆形，所述校准品、质控品、空白质控品及样本萃取液放入所述凹槽中；所述海绵内衬为可拆卸地固定在所述盒体的内部；所述盒盖与盒体是相连接的或相互独立的；所述盒盖与盒体配合关闭时，使所述试剂盒保持密封状态。
3.根据权利要求1或2所述的喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测试剂盒，其特征在于，所述的校准品和质控品使用0.1％-5％牛血清白蛋白溶液作为基质。
4.一种喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的试剂盒对待测人血清样本进行样本前处理，经前处理后的各样本分别进行液相色谱串联质谱检测，同时准确定量分析喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮；所述的液相色谱串联质谱检测中，质谱采用多反应监测，化合物MRM参数如下：
Figure FDA0003294589390000011
Figure FDA0003294589390000021
Dwell Time是扫描时间，CE是碰撞电压，DP是去簇电压，EP是入口电压，CXP是碰撞室出口电压；子离子中带*的是定量离子对。
5.根据权利要求4所述的喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测方法，其特征在于，其包括以下详细步骤：
步骤S1，配制系列浓度的校准品溶液、质控品溶液和样本萃取液；
步骤S2，向待测人血清样本加入样本萃取液，充分振荡混合均匀；
步骤S3，取步骤S2中混合均匀后的各样本进行离心，离心后取上清液加入0.1％甲酸水溶液进行稀释，充分振荡混合均匀；
步骤S4，取步骤S3中混合均匀后的各样本进行离心，离心后取上清液进行LC-MS/MS分析。
6.根据权利要求5所述的喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测方法，其特征在于，所述的液相色谱条件如下：
分析柱：Kinetex C18,2.6μm,3.0*50mm；
流动相A：为含2mM甲酸铵的0.1％甲酸水溶液；流动相B：含0.1％甲酸的甲醇溶液；
洗脱梯度：流动相A+流动相B＝100％；0～0.5min，流动相A体积保持80％；0.5～1.2min，流动相A体积由80％递减至5％；1.20～2.50min，流动相A体积保持5％；2.50～2.51min，流动相A体积由5％升高至80％；2.51～3.0min，流动相A体积保持80％；
流速：0.5mL/min；柱温：40℃。
7.根据权利要求5所述的喹硫平、利培酮及9-羟基利培酮的检测方法，其特征在于，所述的质谱条件如下：
离子源：ESI+；喷雾毛细管电压：5500V；离子源温度：450℃；离子源雾化气：35psi；离子源加热辅助气：35psi；碰撞气：9psi；气帘气：10psi。
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