CN114755348B - 一种同时检测20种药物及其代谢物含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种同时检测20种药物及其代谢物含量的方法；本发明提供的检测方法能够同时测得26种物质（20种药物及其代谢物）的含量，检测时间短，在6.0 min以内出结果，1 h能够分析10组样本，分析时间短，准确度高。

Description

一种同时检测20种药物及其代谢物含量的方法
技术领域
本发明涉及药品检测技术领域，尤其涉及一种同时检测20种药物及其代谢物含量的方法，特别是一种同时检测血液中20种血药及其代谢物含量的方法。
背景技术
治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，简称TDM）是一门研究个体化药物治疗机制、技术、方法和临床标准，并将研究结果转化应用于临床治疗以达到最大化合理用药的药学临床学科。通过测定患者体内的药物暴露、药理标志物或药效指标，利用定量药理模型，以药物治疗窗为基准，制订适合的个体化给药方案，其核心是个体化药物治疗，TDM的临床意义在于能够优化药物治疗方案，提高药物疗效、降低毒副作用，同时通过合理用药最大化应该能节省药物治疗费用。
需要进行TDM监测的药物种类有很多，为了更好的对药物浓度进行监测，目前一般都采用一针多测的检测方法，由于对同一种疾病同时服用多种不同药物的情况较少，因此大部分一针多测都是将同一类药物放在一个方法包中。但是对于同时服用不同种类药物的情况而言，目前并没有较好的一针多测的方法。除此之外，对于TDM药物来说，部分TDM药物的原型药物并没有活性，真正具有活性的是其活性代谢产物，部分TDM药物是原型及其代谢产物均具有活性，然而目前大部分方法包并没有完全考虑到上述问题。
抗精神病药、抗焦虑药、抗抑郁、强心苷、抗癫痫药、血小板聚集抑制剂、降血糖药等药物，往往会同时服用，不同药物针对不同疾病发挥作用，以上药物均需要进行血药浓度监测，个别药物还存在危急值，超过特定浓度之后会造成中毒。
因此，需要提供一种能够同时检测不同种类药物所有活性物质的一针多测的方法，从而能够更好地指导用药方案。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种同时检测20种药物及其代谢物含量的方法。本发明提供的检测方法能够一针测得26种物质（20种药物及其代谢物）的含量，检测时间短，在6.0 min以内出结果，1 h能够分析10组样本，分析时间短，准确度高。
第一方面，本发明提供了一种同时检测20种药物及其代谢物含量的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）制备至少三种不同浓度的标准溶液，并分别建立下述20种药物及其代谢物的标准曲线；
其中，所述20种药物及其代谢物包括左乙拉西坦、拉莫三嗪、奥卡西平代谢物、苯妥英、曲唑酮、米那普伦、多塞平、去甲多塞平、氟西汀、去甲氟西汀、氯米帕明、去甲氯米帕明、度洛西汀、氯氮平、氟哌啶醇、还原氟哌啶醇、还原氟哌啶醇、阿立哌唑、去氢阿立哌唑、氯丙嗪、喹硫平、脱烷基喹硫平、卡马西平、丙戊酸、伏立康唑、华法林和氯美扎酮；
（2）利用LC-MS/MS对待测样品进行检测，同时利用步骤（1）建立的标准曲线确定待测样品中上述20种药物及其代谢物各自的含量；
其中，在所述LC-MS/MS中，使用的分析色谱柱为SHIMADZU Shim-pack Velox C18，（2.1×100mm，2.7 μm）、Phenomenex kinetex EVO C18（2.1×100mm，2.6 μm）、PhenomenexKinetex XB- C18（3.0×100 mm，2.6 μm）、Poroshell 120 EC-C18（3.0×100 mm，2.7 μm）或Phenomenex Kinetex Polar C18（2.1×100 mm，2.6 μm）。
考虑到不同种类的药物极性存在较大差异，若采用一针多测，极容易出现药物无法成功分离，即药物对应的色谱峰相互重叠，导致无法实现药物浓度的检测，因此，目前采用的一针多测的检测方法通常是检测同一类药物。本发明通过选用特定的分析色谱柱，同时配合特定的检测条件，能够实现20种药物及其代谢物（共26种药物）的成功检测，相互不存在干扰，检测时间短，且准确度和精密度较高。
在本发明中，所述20种药物及其代谢物使用的内标物包括D6-茶碱或D6-左乙拉西坦、D4-奥卡西平代谢物、D10-苯妥英、D5-米那普伦、D3-多塞平、D3-去甲多塞平、D5-氟西汀、D3-氯米帕明、D5-去甲氯米帕明、D3-度洛西汀、D4-氯氮平、D4-氟哌啶醇、D8-阿立哌唑、D8-去氢阿立哌唑、D6-氯丙嗪、D8-喹硫平、D2,15N-卡马西平、D6-丙戊酸、D3-伏立康唑和D5-华法林。
本发明提供的20种药物及其代谢物（共26种药物），几种药物之间可以共用同一内标，具体见表9，能够减少内标用量，降低成本，并且能够简化内标的配制过程，同时内标的简化还能够尽量降低干扰。
本发明提供的液相色谱质谱联用检测参数包括如下：
所使用的分析色谱柱流动相为：A相：水（0.05~0.1%甲酸+4~8 mmol/L甲酸铵/乙酸铵），B相：甲醇（0.05~0.1%+4~8 mmol/L甲酸铵/乙酸铵），分析色谱柱采用梯度洗脱方式，色谱条件参数见表1-2：
表1（正离子参数）
Figure 972497DEST_PATH_IMAGE001
表2（负离子参数）
Figure 741869DEST_PATH_IMAGE002
质谱检测仪的检测模式为ESI（+）或ESI（-）检测模式，质谱参数见表3：
表3
Figure 246800DEST_PATH_IMAGE003
在本发明中，所述液相色谱质谱联用仪为AB SCIEX，所述液相色谱质谱联用仪使用的参数包括：
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack Velox C18，2.1×100 mm，2.7 μm；
正离子参数对应的流动相：A为含有0.1v/v%甲酸和5 mM甲酸铵的水溶液，B为含有0.1v/v%甲酸和5 mM甲酸铵的甲醇；
正离子参数对应的梯度洗脱：
0-0.5 min：A 70%，B 30%；0.51-2.50 min：A 40%，B 60%；2.51-4.00 min：A 0%，B100%；4.01-5.5 min：A 70%，B 30%；
正离子参数对应的质谱参数为：离子源温度：500℃；离子源高压：5500V；气帘气：35 L/min；碰撞气：7 L/min；干燥气1：50 L/min；干燥气2：50 L/min；
负离子参数对应的流动相：A为纯水，B为甲醇；梯度洗脱为：0-1.5 min：A 2%，B98%；
负离子参数对应的质谱参数为：离子源温度：500℃；离子源高压：4500V；气帘气：20 L/min；碰撞气：7 L/min；干燥气1：50 L/min；干燥气2：50 L/min。
在本发明中，当所述液相色谱质谱联用仪为AB SCIEX时，其进样量为2 μL，能够在进样量较低的情况下保证检测结果的准确性，且避免了进样量大可能会导致高点信号响应饱和等问题；正离子参数的分析时间为5.50 min，负离子参数的分析时间为1.5 min，分析时间短。
在本发明中，所述液相色谱质谱联用仪为Waters TQD，所述液相色谱质谱联用仪使用的参数包括：
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack Velox C18，2.1×100 mm，2.7 μm；
正离子参数对应的流动相：A为含有0.1v/v%甲酸和5 mM甲酸铵的水溶液，B为含有0.1v/v%甲酸和5 mM甲酸铵的甲醇；
正离子参数对应的梯度洗脱：
0-0.5 min：A 70%，B 30%；0.60-1.50 min：A 55%，B 45%；1.51-3.00 min：A 45%，B55%；3.01-4.50 min：A 0%，B 100%；4.60-5.50 min：A 70%，B 30%；
正离子参数对应的质谱参数为：毛细管电压：1.0 kV；锥孔电压：18 V；脱溶剂温度：400℃；脱溶剂气大小：1000 L/Hr；锥孔气大小：50 L/Hr；
负离子参数对应的流动相：A为纯水，B为甲醇；梯度洗脱为：0-1.2 min：A 25%，B75%；1.21-2.10 min：A 10%，B 90%；2.20-3.00 min：A 25%，B 75%；
负离子参数对应的质谱参数为：毛细管电压：1.0 kV；锥孔电压：34 V；脱溶剂温度：400℃；脱溶剂气大小：1000 L/Hr；锥孔气大小： 0 L/Hr。
在本发明中，对于正离子参数的进样量，L1-L6浓度级别进样10μL，L7-L8进样2μL，为了保证待测样本检测准确性，待测样本进样10μL，分析时间为5.5 min；对于负离子参数的进样量为5μL，分析时间为3 min。
在本发明中，所述液相色谱质谱联用仪为安捷伦LC1260/MS6410B，所述液相色谱质谱联用仪使用的参数包括：
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack Velox C18，2.1×100 mm，2.7 μm；
正离子参数对应的流动相：A为含有0.1v/v%甲酸和5 mM甲酸铵的水溶液，B为含有0.1v/v%甲酸和5 mM甲酸铵的甲醇；
正离子参数对应的梯度洗脱：
0-0.5 min：A 70%，B 30%；0.51-2.50 min：A 40%，B 60%；2.51-4.00 min：A 0%，B100%；4.01-6.00 min：A 70%，B 30%；
正离子参数对应的质谱参数为：雾化气温度：350℃；雾化气气流：6 L/min；喷雾器：55 psi；毛细管电压：4000 V；电子倍增器电压值：200 V；
负离子参数对应的流动相：A为纯水，B为甲醇；梯度洗脱为：0-3.5 min：A 25%，B75%；
负离子参数对应的质谱参数为：雾化气温度：350℃；雾化气气流：6 L/min；喷雾器：55 psi；毛细管电压：3500 V；电子倍增器电压值：0 V。
在本发明中，对于正离子参数的进样量为20μL，分析时间为6.00 min；对于负离子参数的进样量为5μL，分析时间为3.5 min。
作为本发明的一种优选技术方案，所述待测样品为血液样品或血清样品，优选将血液样品或血清样品离心取血浆或血清。
作为本发明的一种优选技术方案，所述待测样品的制备方法包括：将血浆或血清、内标工作液和蛋白沉淀剂进行混合，取上清液进行稀释，得到所述待测样品。
作为本发明的一种优选技术方案，所述待测样品的制备方法包括：将血浆或血清、内标工作液和蛋白沉淀剂利用涡旋振荡5-10 min，离心5-15 min，取上清液加入纯水涡旋振荡1-5 min，离心5-10 min，得到所述待测样品。
作为本发明的一种优选技术方案，所述蛋白沉淀剂选自甲醇或者乙腈。
作为本发明的一种优选技术方案，所述血浆或血清与蛋白沉淀剂的体积比为1:(1-50)，优选1:(5-10)。
作为本发明的一种优选技术方案，所述血浆或血清与内标工作液的体积比为(2-10):1。
作为本发明的一种优选技术方案，所述上清液与纯水的体积比为1:(1.5-6)，优选1:(2-3)。
作为本发明的一种具体实施方式，所述检测样品的制备方法包括如下步骤：
取待检测血清管/EDTA采血管血液至少2 mL，在离心速度为3500 rpm下离心10min，取上清液得血清/血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。
用移液枪移取中所述内标工作液10 μL于1.5 mL离心管中，然后加入所述血清/血浆20~100 μL，加入100~1000 µL甲醇：乙腈1:0-0:1，在1500~2000 rpm的转速下涡旋震荡混合5~10min，12000~14000 r/min高速离心5~15 min，移取50~100 µL上清液至1.5 mL塑料离心管，加入150~300 µL稀释液（水），1500~2500 r/min涡旋混匀1~5 min，12000~14000 r/min高速离心5~10 min，得到待测样品。
本发明通过选择特定的内标同时配合特定的样品前处理条件，能够最大程度的降低基质的干扰，并且结合本发明提供的检测条件能够进一步规避血液样品中的其他杂质的干扰，因此，本发明在建立标曲时，能够不添加空白基质，简化了制备标准溶液的方法且能够保证检测准确性。
在本发明中，所述标准溶液的制备方法包括：将内标工作液与含有20种药物及其代谢物的标准工作液混合后，依次与甲醇、去离子水混合，得到所述标准溶液。
作为本发明的一种优选技术方案，所述标准工作液包括8个级别浓度。
利用LC-MS/MS对上述标准溶液进行检测，能够得到至少三种标准溶液中包括的不同浓度的20种药物及其代谢物的内标色谱图，利用内标色谱图建立20种药物及其代谢物的标准曲线。
作为本发明的一种优选技术方案，所述标准溶液的制备方法包括：
用移液器将至少三种不同浓度的标准工作液20~100 μL、10 μL内标工作液分别置于1.5 mL离心管中混合制成至少三种标准溶液，向上述溶液中加入100 μL~1000μL甲醇：乙腈1:0-0:1，上述标准溶液分别在转速为1500~2000 rpm下涡旋混匀1~3 min，分别取50~100μL上述混合标准溶液，再加入150~300 μL水，在转速为1500~2000 rpm下涡旋混匀30 ~1min。
作为本发明的一种优选技术方案，各所述级别浓度的标准工作液均利用稀释剂由中间液稀释得到，所述中间液利用稀释剂由母液稀释得到，所述母液利用溶剂溶解所述20种药物及其代谢物各自的标准品得到。
在本发明中，所述内标工作液的制备方法包括：将20种药物及其代谢物使用的内标物储备液利用稀释剂稀释，混合，得到所述内标工作液。
作为本发明的一种优选技术方案，所述稀释剂为甲醇和水的体积比为1:(0-1)的甲醇水溶液，优选甲醇和水的体积比为7:3。
本发明优选体积比为7:3的稀释剂，能够使标曲工作稳定性至少达到9个月以上，并且，在中间液存储期间，中间液能够被反复使用多次且浓度基本保持不变，因此，本发明选用上述特定的稀释剂能够避免每次检测前均需要现场制备标准中间液，简化了检测方法且缩短了检测时间。
作为本发明的一种优选技术方案，在制备标准储备液的过程中，所述米那普仑、氯美扎酮、氯氮平、喹硫平、脱烷基喹硫平、氯丙嗪、氟西汀、伏立康唑、华法林和度洛西汀使用的溶剂为甲醇，或者乙腈，或者甲醇水溶液（甲醇:水=1:0~7:3）。所述左乙拉西坦、拉莫三嗪和曲唑酮先使用甲醇溶解，在加入与甲醇体积相同的甲醇和水的体积比为7:3的甲醇水溶液混合。所述奥卡西平代谢物使用的溶剂为乙腈，所述阿立哌唑使用的溶剂为含有0.1%甲酸的乙腈。所述多塞平、去甲多塞平、氟哌啶醇和还原氟哌啶醇使用的溶剂为甲醇和水的体积比为7:3的甲醇水溶液。所述苯妥英和卡马西平先使用甲醇溶解，在加入与甲醇体积相同的甲醇和水的体积比为1:1的甲醇水溶液混合。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
（1）本发明提供的前处理方法对待测血样进行前处理，能够使得得到的待测样品中同时含有本发明想要检测的26种物质（20种药物及其代谢物），不再需要单独分别制备含有不同目标物的待测样品；
（2）利用本发明提供的方法能够同时检测26种物质（20种药物及其代谢物）的含量，虽然对于丙戊酸含量的检测需要单独进样，但是并不需要单独制备含有丙戊酸的待测样品，能够节省前处理时间，降低检测成本；
（3）本发明提供的检测方法能够同时测得26种物质（20种药物及其代谢物）的含量，检测时间短，在6.0 min以内出结果，1 h能够分析10组样本，分析时间短，准确度高。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明利用实施例5对血样的检测色谱图一；
图2为本发明利用实施例5对血样的检测色谱图二；
图3为本发明利用实施例8对血样的检测色谱图一；
图4为本发明利用实施例8对血样的检测色谱图二。
对于实施例5、8的检测色谱图，在图中，从上到下依次为：左乙拉西坦、拉莫三嗪、曲唑酮、米那普伦、氯美扎酮、奥卡西平代谢物、还原氟哌啶醇、氯氮平、多塞平、氟哌啶醇、去甲多塞平、喹硫平、脱烷基喹硫平、去氢阿立哌唑、苯妥英、阿立哌唑、度洛西汀、卡马西平、氟西汀、去甲氟西汀、氯丙嗪、伏立康唑、氯米帕明、去甲氯米帕明、华法林。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
在下述实施例中，LC-MS/MS使用的检测仪器包括如下3款：
高效液相色谱质谱联用仪为AB SCIEX；型号规格为：AB SCIEX Jasper HPLC MSTRIPLE QUAD 4500MD；
高效液相色谱质谱联用仪为Waters TQD；型号规格为：ACQUITY UPLC I -ClassIVD Xevo TQD IVD；
高效液相色谱质谱联用仪为安捷伦；型号规格为：安捷伦LC1260/MS6410B。
实施例1
本实施例提供了一种标准溶液的制备方法，包括制备标准储备液、制备标准工作液、制备内标储备液、制备内标工作液和制备标准溶液，具体步骤如下：
（1）制备标准储备液
左乙拉西坦：精确称取标准品19.904 mg，置于2 mL冻存管，加入1 mL甲醇再加入1mL（甲醇:水=7:3）溶解，得到浓度为9892 μg/mL标准储备液。
拉莫三嗪：精确称取标准品8.834 mg，置于2 mL冻存管，加入1mL甲醇再加入1 mL（甲醇:水=7:3）溶解，得到浓度为4404μg/mL标准储备液。
曲唑酮：精确称取标准品4.008 mg，置于2 mL冻存管，加入1 mL甲醇再加入1 mL（甲醇:水=7:3）溶解，得到浓度为1819 μg/mL标准储备液。
米那普仑：精确称取盐酸米那普仑1.790 mg标准品，置于2 mL冻存管中，加入1 mL甲醇溶解，得到浓度为1528 μg/mL标准储备液。
氯美扎酮：将10 mg氯美扎酮标准品，加入4 mL甲醇全部溶解，得到浓度为2493 μg/mL标准储备液。
奥卡西平代谢物MHD：精确称取标准品18.16 mg，置于2 mL冻存管，加入2 mL乙腈溶解，得到浓度为9000 μg/mL标准储备液。
氯氮平：精确称取标准品2.50 mg，置于2 mL冻存管，加入1.389mL甲醇溶解，得到浓度为1800 μg/mL标准储备液。
多塞平：精确称取标准品4.68 mg，置于2 mL冻存管，加入2 mL甲醇:水=7:3溶解，得到浓度为2058.966 μg/mL标准储备液。
去甲多塞平：精确称取标准品3.40 mg，置于2 mL冻存管，加入2mL甲醇:水=7:3溶解，得到浓度为1464.52 μg/mL标准储备液。
氟哌啶醇：精确称取标准品5.00 mg，置于15 mL冻存管，加入4.9 mL甲醇:水=7:3溶解，得到浓度为1000 μg/mL标准储备液。
还原氟哌啶醇：精确称取标准品5.00 mg，置于15 mL冻存管，加入4.9 mL甲醇:水=7:3溶解，得到浓度为1000 μg/mL标准储备液。
喹硫平：精确称取标准品1.42 mg，置于2 mL冻存管，加入1.506mL甲醇溶解，得到浓度为800 μg/mL标准储备液。
N脱烷基喹硫平：精确称取标准品2.67 mg，置于2 mL冻存管，加入1.190mL甲醇溶解，得到浓度为1800μg/mL标准储备液。
阿立哌唑：精确称取标准品3.61 mg，置于2 mL冻存管，加入2.000mL乙腈（含0.1%甲酸）溶解，得到浓度为1800 μg/mL标准储备液。
去氢阿立哌唑：标准储备液浓度为1000 μg/mL。
苯妥英：精确称取标准品3.561 mg，置于2 mL冻存管，加入1 mL甲醇溶液，再加入1mL甲醇:水=1:1溶解，得到浓度为1745 μg/mL标准储备液。
卡马西平：精确称取标准品6.504 mg，置于2 mL冻存管，加入1mL甲醇溶液，再加入1 mL甲醇:水=1:1溶解，得到浓度为3242 μg/mL标准储备液。
氯丙嗪：精确称取标准品1.05 mg，置于2 mL冻存管，加入1.047mL甲醇溶解，得到浓度为900 μg/mL标准储备液。
氟西汀：精确称取标准品5.51 mg，置于2 mL冻存管，加入1 mL甲醇溶解，得到浓度为4918 μg/mL标准储备液。
去甲氟西汀：去甲氟西汀标准品直接转移至2 mL冻存管，纯度为99.6%，得到浓度为996 μg/mL标准储备液。
氯米帕明：氯米帕明标准品直接转移至2 mL冻存管，纯度为100%，得到浓度为1000μg/mL标准储备液。
去甲氯米帕明：去甲氯米帕明标准品直接转移至2 mL冻存管，纯度为100%，得到浓度为1000 μg/mL标准储备液。
伏立康唑：精确称取标准品16.498 mg，置于2 mL冻存管，加入2mL甲醇溶解，得到浓度为8233 μg/mL标准储备液。
华法林：精确称取标准品3.112 mg，置于2 mL冻存管，加入2 mL甲醇溶解，得到浓度为1525 μg/mL标准储备液。
度洛西汀：精确称取标准品2.00 mg，置于2 mL冻存管，加入1777μL甲醇溶解，得到浓度为1000 μg/mL标准储备液。
（2）制备标准工作液
标准储备液利用稀释剂进行稀释，得到中间液，中间液混合，再次稀释，得到标准工作液，其中，使用的稀释剂为甲醇和水的体积比为7:3的甲醇水溶液；
本实施例提供了8种不同浓度的标准工作液，标准工作液中的20种药物及其代谢物的浓度见表4-5：
表4：AB4500MD/Waters TQD使用的标准工作液
Figure 325483DEST_PATH_IMAGE004
表5：安捷伦使用的标准工作液
Figure 915865DEST_PATH_IMAGE005
（3）制备内标储备液
所述内标物储备液部分为市售品，部分可以自己制备，具体制备方法包括：
D8-阿立哌唑：标准储备液浓度为100 μg/mL。
D8-去氢阿立哌唑：标准品规格为1.00 mg，直接向瓶中加入1.00 mL乙腈（含0.1%甲酸）溶解，得到浓度为1000 μg/mL标准储备液。
D8-喹硫平：标准储备液浓度为100 μg/mL。
D4-氯氮平：标准储备液浓度为100 μg/mL。
D4-MHD：标准品规格为1.00 mg，直接向瓶中加入1 mL乙腈，振荡溶解，转移到2 mL冻存管中，得到浓度为1000 μg/mL的内标储备液。
D3-度洛西汀：标准储备液浓度为100 μg/mL。
D2,15N-卡马西平：标准品规格为1.00 mg，直接向瓶中加入1 mL稀释液，振荡溶解，转移到2 mL冻存管中，得到浓度为1000 μg/mL的内标储备液。
D6-氯丙嗪：精确称取标准品3.00 mg，置于15 mL冻存管，加入9 mL甲醇溶解，得到浓度为300 μg/mL标准储备液。
D6-茶碱：精确称取标准品5.00 mg，置于2 mL冻存管，加入1998 μL甲醇:水=1:1溶解，得到浓度为2500 μg/mL标准储备液。
D6-左乙拉西坦：标准品规格为1.00 mg，直接向瓶中加入0.5 mL甲醇，振荡溶解，转移到2 mL冻存管中，再加入0.5 mL稀释剂，得到浓度为992 μg/mL的内标储备液。
D3-伏立康唑：标准品规格5 mg，用甲醇:水=1:1溶解并定容至10mL，得内标浓度为500 μg/mL。
D10-苯妥英：标准品规格为1.00 mg，直接向瓶中加入1 mL稀释液，振荡溶解，转移到2 mL冻存管中，得到浓度为1000 μg/mL的内标储备液。
D5-米那普仑：精确称取标准品1.05 mg，置于2 mL冻存管，加入1 mL甲醇溶解，得到浓度为914 μg/mL标准储备液。
D4-氟哌啶醇：标准品为浓度为100 μg/mL溶液。
D3-多塞平：标准品为浓度为100 μg/mL溶液。
D3-去甲多塞平：标准品为浓度为100 μg/mL溶液。
D5-华法林：标准品规格1 mg，用1 mL甲醇溶解，得内标浓度为1000 μg/mL。
D3-氯米帕明：标准品为浓度为100 μg/mL溶液。
D5-去甲氯米帕明：标准品规格1 mg，用1 mL甲醇溶解，得内标浓度为1000 μg/mL。
D5-氟西汀：标准品为浓度为1000 μg/mL溶液。
D6-丙戊酸：标准储备液浓度为1000 μg/mL；
（4）制备内标工作液
内标储备液利用稀释剂稀释，得到内标工作液，制备得到的内标工作液的浓度见表6。
表6：使用的内标及内标工作液浓度
Figure 488929DEST_PATH_IMAGE006
待测物和对应的内标物具体见表7：
表7
Figure 366142DEST_PATH_IMAGE007
（5）制备标准溶液
用移液器将标准工作液20 μL、10 μL内标工作液分别置于1.5 mL离心管中混合制成至少三种标准溶液，向上述溶液中加入100 μL甲醇，上述标准溶液分别在转速为2000rpm下涡旋混匀1 min，分别取50 μL上述混合标准溶液，再加入150 μL水，在转速为2000rpm下涡旋混匀30 s，得到8种不同浓度的标准溶液。
实施例2
本实施例提供了利用仪器AB SCIEX；型号规格为：AB SCIEX Jasper HPLC MSTRIPLE QUAD 4500MD对样品检测的方法；
所使用的色谱柱为SHIMADZU Shim-pack Velox C18 2.1*100mm, 2.7μm，柱温为50℃，进样量为2 μL，分析时间为5.5 min，洗针液为甲醇（0.1%甲酸），洗针方式为进样前后各洗3 s。所使用的分析色谱柱流动相为：A相：水（0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸铵），B相：甲醇（0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸铵），分析色谱柱采用梯度洗脱方式，色谱条件参数见表8：
表8：正离子参数-液相色谱
Figure 366459DEST_PATH_IMAGE008
对于质谱条件，参数见表9-10：
表9
Figure 178557DEST_PATH_IMAGE009
表10
Figure 70159DEST_PATH_IMAGE010
Figure 284103DEST_PATH_IMAGE011
注：1、20种药物及其代谢物（共26种药物）对应的内标物见表9。
2、由于物质种类比较多，采集模式为分段采集，Scan Type: Dynamic MRM。
3、对于丙戊酸的检测，提供负离子参数，具体见表11-13：
表11：负离子参数-液相色谱
Figure 720900DEST_PATH_IMAGE012
表12：负离子参数-质谱条件
Figure 535141DEST_PATH_IMAGE013
表13：负离子参数-质谱条件
Figure 184428DEST_PATH_IMAGE014
实施例3
本实施例提供了利用仪器Waters TQD；型号规格为：ACQUITY UPLC I -Class IVDXevo TQD IVD对样品检测的方法。
所使用的色谱柱为SHIMADZU Shim-pack Velox C18 2.1*100mm, 2.7μm，柱温为50℃，所使用的分析色谱柱流动相为：A相：水（0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸铵），B相：甲醇（0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸铵），分析色谱柱采用梯度洗脱方式，色谱条件参数见表14：
表14：正离子参数-液相色谱
Figure 518458DEST_PATH_IMAGE015
对于质谱条件，参数见表15：
表15
Figure 375424DEST_PATH_IMAGE016
MS File设置为3个MRM，见表16-18：
表16
Figure 427694DEST_PATH_IMAGE017
表17
Figure 146251DEST_PATH_IMAGE018
表18
Figure 334787DEST_PATH_IMAGE019
注：1、20种药物及其代谢物（共26种药物）对应的内标物见表9。
2、由于物质种类比较多，采集模式为分段采集，Scan Type: Dynamic MRM。
3、对于丙戊酸的检测，提供负离子参数，具体见表19-21：
表19：负离子参数-液相色谱
Figure 359725DEST_PATH_IMAGE020
表20：负离子参数-质谱条件
Figure 633712DEST_PATH_IMAGE021
表21：负离子参数-质谱条件
Figure 155960DEST_PATH_IMAGE022
实施例4
本实施例提供了利用仪器安捷伦LC1260/MS6410B对样品检测的方法。
所使用的色谱柱为SHIMADZU Shim-pack Velox C18 2.1*100mm, 2.7μm，柱温为50℃，所使用的分析色谱柱流动相为：A相：水（0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸铵），B相：甲醇（0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸铵），分析色谱柱采用梯度洗脱方式，色谱条件参数见表22：
表22：正离子参数-液相色谱
Figure 713849DEST_PATH_IMAGE023
对于质谱条件，采集模式为ESI(＋)；Scan Type: Dynamic MRM，参数见表23-24：
表23
Figure 663350DEST_PATH_IMAGE024
表24
Figure 424633DEST_PATH_IMAGE025
Figure 484993DEST_PATH_IMAGE026
注：1、20种药物及其代谢物（共26种药物）对应的内标物见表9；
2、由于物质种类比较多，采集模式为分段采集，Scan Type: Dynamic MRM。
3、对于丙戊酸的检测，提供负离子参数，具体见表25-27：
表25：负离子参数-液相色谱
Figure 897389DEST_PATH_IMAGE027
表26：负离子参数-质谱条件
Figure 17791DEST_PATH_IMAGE028
表27：负离子参数-质谱条件
Figure 531949DEST_PATH_IMAGE029
实施例5
本实施例提供了利用仪器AB SCIEX；型号规格为：AB SCIEX Jasper HPLC MSTRIPLE QUAD 4500MD对样品检测的方法。
所使用的分析色谱柱为Poroshell 120 EC-C18（3.0×100 mm，2.7 μm），流速为0.4mL/min，其余参数与实施例2相同。
将实施例5对待测样本检测得到的色谱图依据质谱结果以及对应的目标物进行拆分，得到的色谱图如图1-2所示。
实施例6
本实施例提供了利用仪器AB SCIEX；型号规格为：AB SCIEX Jasper HPLC MSTRIPLE QUAD 4500MD对样品检测的方法。
所使用的分析色谱柱为Phenomenex Kinetex XB- C18（3.0×100 mm，2.6 μm），流速为0.4 mL/min，其余参数与实施例2相同。
实施例7
本实施例提供了利用仪器AB SCIEX；型号规格为：AB SCIEX Jasper HPLC MSTRIPLE QUAD 4500MD对样品检测的方法。
所使用的分析色谱柱为Phenomenex Kinetex Polar C18（2.1×100 mm，2.6 μm），其余参数与实施例2相同。
实施例8
本实施例提供了利用仪器AB SCIEX；型号规格为：AB SCIEX Jasper HPLC MSTRIPLE QUAD 4500MD对样品检测的方法。
与实施例2的区别如下：
流动相流速为：0.5 mL/min；
梯度洗脱条件为：0.00-0.50 min：A 80%，B 20%；0.51-2.50 min：A 35%，B 65%；2.51-4.00 min：A 0%，B 100%；4.01-5.5 min：A 80%，B 20%。
实施例8对待测样本检测得到的色谱图如图3-4所示
实施例9
本实施例提供了利用仪器AB SCIEX；型号规格为：AB SCIEX Jasper HPLC MSTRIPLE QUAD 4500MD对样品检测的方法。
与实施例2的区别如下：
流动相流速为：0.50 mL/min；
梯度洗脱条件为：0.00-0.50 min：A 65%，B 35%；0.51-2.50 min：A 55%，B 45%；2.51-4.00 min：A 0%，B 100%；4.01-5.5 min：A 65%，B 35%。
实施例10
本实施例提供了利用仪器AB SCIEX；型号规格为：AB SCIEX Jasper HPLC MSTRIPLE QUAD 4500MD对样品检测的方法。
与实施例2的区别如下：
流动相流速为：0.50 mL/min；
梯度洗脱条件为：0.00-0.50 min：A 80%，B 20%；0.51-2.50 min：A 55%，B 45%；2.51-4.00 min：A 10%，B 90%；4.01-5.5 min：A 80%，B 20%。
实施例6-10得到的色谱图的出峰时间见表28：
表28
Figure 379689DEST_PATH_IMAGE030
由表28和图1-4可知，利用本发明提供的色谱柱和本发明提供的液相色谱条件，同时配合其他检测条件和样品前处理条件，能够成功地将20种血药及其代谢物分离，进而实现待测样品的准确检测。
实施例11
本实施例提供了一种由待检测血清管/EDTA采血管血液制备待测样品的方法，如下：
（1）取待检测血清管/EDTA采血管血液至少2 mL，在离心速度为3500 rpm下离心10min，取上清液得血清/血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
（2）用移液枪移取实施例1提供的内标工作液10 μL于1.5 mL离心管中，然后加入步骤（1）中所述血清/血浆20 μL，加入100 µL甲醇，在2000 rpm的转速下涡旋震荡混合5min，14000 r/min高速离心10 min，移取50 µL上清液至1.5 mL塑料离心管，加入150 µL稀释液（水），2500 r/min涡旋混匀1 min，14000 r/min高速离心5 min，得到待测样品。
参照上述样品前处理方法，同时，将150µL稀释液（水），替换为100/200µL稀释液（水），对待测样品进行检测，发现检测结果并没有明显误差，因此，本发明提供的检测方法能够消除内标物浓度不同的影响，使得待测样品中的内标浓度并不一定必须与标准液中的内标浓度相同即可完成检测，本申请提供的检测方法可以简化分析步骤，简短分析时间，提高效率。
实施例12
本实施例提供了一种检测待测样品中20种药物及其代谢物含量的方法。
（1）移取待测样品参照实施例2-4对待测样品进行检测，进样量为2 μL，得出待测样品中20种药物及其代谢物的内标色谱图；
（2）将得到的色谱图中的目标物的色谱峰面积与目标物对应内标物的峰面积的比值带入目标物对应的标准曲线方程中，计算得到目标物的浓度与目标物对应内标物的浓度比，进而计算得到待测样品中目标物的浓度值，以此类推，分别计算得到20种药物及其代谢物的浓度。
性能测试1：标准中间液的稳定性
按照实施例1提供的方法制备标准中间液，同时利用甲醇作为稀释剂制备标准中间液，制备得到的两种标准中间液均放在-20℃下进行存储，利用AB SCIEX仪器测试反复使用10次之后标准中间液中各物质的浓度，结果见表29：
表29
Figure 397323DEST_PATH_IMAGE031
由表29可知，本申请特异性的限定稀释液可以使仅制备一次标准中间液就能够多次使用，避免了每次确定标曲时，都需要现场配制的时间，简化了检测方法且缩短了检测时间。
性能测试2：对本发明提供的方法进行评价
（1）检测限和定量限：
将上述配制的20 μL的含20种药物其代谢物空白血清/血浆，加入10 μL内标工作液，按实施例2-4提供的测定条件浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，确定检测限和定量限，结果见表30：
表30
Figure 954206DEST_PATH_IMAGE032
（2）取20种药物及其代谢物标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别如下表31-33。
表31：HPLC MS TRIPLE QUAD 4500MD
Figure 424502DEST_PATH_IMAGE033
表32：Waters ACQUITY UPLC I -Class IVD Xevo TQD IVD
Figure 813282DEST_PATH_IMAGE034
表33：安捷伦LC1260/MS6410B
Figure 951003DEST_PATH_IMAGE035
综上，本发明提供的检测方法的检测限、回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中20种药物及其代谢物浓度，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种同时检测20种药物及6种代谢物含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）制备至少三种含有不同浓度的20种药物及6种代谢物的标准溶液，并分别建立所述20种药物及6种代谢物的标准曲线；
其中，所述20种药物及6种代谢物包括左乙拉西坦、拉莫三嗪、10,11-二氢-10-羟基卡马西平、苯妥英、曲唑酮、米那普伦、多塞平、去甲多塞平、氟西汀、去甲氟西汀、氯米帕明、去甲氯米帕明、度洛西汀、氯氮平、氟哌啶醇、还原氟哌啶醇、阿立哌唑、去氢阿立哌唑、氯丙嗪、喹硫平、脱烷基喹硫平、卡马西平、丙戊酸、伏立康唑、华法林和氯美扎酮；
（2）利用液相色谱-质谱对待测样品进行检测，同时利用步骤（1）建立的标准曲线确定待测样品中上述20种药物及6种代谢物各自的含量；
其中，在所述液相色谱-质谱中，使用的分析色谱柱为SHIMADZU Shim-pack VeloxC18，2.1×100 mm，2.7 μm；Phenomenex Kinetex XB- C18，3.0×100 mm，2.6 μm；Poroshell 120 EC-C18，3.0×100 mm，2.7 μm；Phenomenex Kinetex Polar C18，2.1×100mm，2.6 μm；
在所述液相色谱-质谱中，液相色谱参数包括：
进样量为1-10 μL；
正离子参数对应的流动相：A为含有0.05-0.1v/v%甲酸和4-8 mM甲酸铵的水溶液，B为含有0.05-0.1v/v%甲酸和4-8 mM甲酸铵的甲醇；
正离子参数对应的洗针液为含有0.1-0.5 v/v%甲酸的甲醇溶液；
负离子参数对应的流动相：A为含有0-0.5mmol/L氟化铵的纯水，B为含有0-0.5mmol/L氟化铵的甲醇；
质谱检测仪的检测模式为ESI+或ESI-的MRM检测模式，正离子参数对应ESI+检测模式，负离子参数对应ESI-检测模式，所述丙戊酸利用负离子参数进行检测，其余待测物利用正离子参数进行检测；
所述液相色谱-质谱使用的检测仪器包括AB SCIEX、Waters TQD或安捷伦LC1260/MS6410B；
所述检测仪器为AB SCIEX时：
正离子参数对应的梯度洗脱为：0 min：A 80-65%，B 20-35%；0.5 min：A 80-65%，B 20-35%；0.51 min：A 55-35%，B 45-65%；2.5 min：A 55-35%，B 45-65%；2.51 min：A 0-10%，B90-100%；4.00 min：A 0-10%，B 90-100%；4.01 min：A 80-65%，B 20-35%；5.5 min：A 80-65%，B 20-35%；
负离子参数对应的等度洗脱为：0 min：A 25-2%，B 75-98%；1.5 min：A 25-2%，B 75-98%；
质谱参数包括：离子源温度：450-500℃；干燥气1：45-65 L/min；干燥气2：45-65 L/min；
所述检测仪器为Waters TQD时：
正离子参数对应的梯度洗脱为：0-0.5 min：A 70%，B 30%；0.60-1.50 min：A 55%，B45%；1.51-3.00 min：A 45%，B 55%；3.01-4.50 min：A 0%，B 100%；4.60-5.50 min：A 70%，B30%；
负离子参数对应的梯度洗脱为：0.00 min：A 25%，B 75%；1.20 min：A 25%，B 75%；1.21min：A 10%，B 90%；2.10 min：A 10%，B 90%；2.20 min：A 25%，B 75%；3.00 min：A 25%，B75%；
质谱参数包括：脱溶剂温度：350-450℃；脱溶剂气大小：800-1000 L/Hr；锥孔气大小：0-50 L/Hr；
所述检测仪器为安捷伦LC1260/MS6410B时：
正离子参数对应的梯度洗脱为：0-0.5 min：A 70%，B 30%；0.51-2.50 min：A 40%，B60%；2.51-4.00 min：A 0%，B 100%；4.01-6.00 min：A 70%，B 30%；
负离子参数对应的等度洗脱为：0 min：A 25%，B 75%；3.5 min：A 25%，B 75%；
质谱参数包括：雾化气温度：300-350℃；雾化气气流：5-8 L/min；喷雾器：45-60 psi；
所述20种药物及6种代谢物使用的内标物包括D6-茶碱、D6-左乙拉西坦、D4-10,11-二氢-10-羟基卡马西平、D10-苯妥英、D5-米那普伦、D3-多塞平、D3-去甲多塞平、D5-氟西汀、D3-氯米帕明、D5-去甲氯米帕明、D3-度洛西汀、D4-氯氮平、D4-氟哌啶醇、D8-阿立哌唑、D8-去氢阿立哌唑、D6-氯丙嗪、D8-喹硫平、D2,15N-卡马西平、D6-丙戊酸、D3-伏立康唑和D5-华法林，其中，所述D6-茶碱和D6-左乙拉西坦不同时使用；
所述待测样品为血液样品或血清样品，将所述血液样品或血清样品离心得到血浆或血清；
所述待测样品的制备方法包括：将血浆或血清、内标工作液和蛋白沉淀剂进行混合，取上清液进行稀释，得到所述待测样品，所述蛋白沉淀剂选自甲醇或者乙腈，所述血浆或血清与蛋白沉淀剂的体积比为1:1-50。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱质谱联用仪为AB SCIEX，所述液相色谱质谱联用仪使用的参数包括：
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack Velox C18，2.1×100 mm，2.7 μm；
正离子参数对应的流动相：A为含有0.1v/v%甲酸和5 mM甲酸铵的水溶液，B为含有0.1v/v%甲酸和5 mM甲酸铵的甲醇；
正离子参数对应的梯度洗脱：
0-0.5 min：A 70%，B 30%；0.51-2.50 min：A 40%，B 60%；2.51-4.00 min：A 0%，B100%；4.01-5.5 min：A 70%，B 30%；
正离子参数对应的质谱参数为：离子源温度：500℃；离子源高压：5500V；气帘气：35 L/min；碰撞气：7 L/min；干燥气1：50 L/min；干燥气2：50 L/min；
负离子参数对应的流动相：A为纯水，B为甲醇；等度洗脱为：0-1.5 min：A 2%，B 98%；
负离子参数对应的质谱参数为：离子源温度：500℃；离子源高压：4500V；气帘气：20 L/min；碰撞气：7 L/min；干燥气1：50 L/min；干燥气2：50 L/min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱质谱联用仪为Waters TQD，所述液相色谱质谱联用仪使用的参数包括：
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack Velox C18，2.1×100 mm，2.7 μm；
正离子参数对应的流动相：A为含有0.1v/v%甲酸和5 mM甲酸铵的水溶液，B为含有0.1v/v%甲酸和5 mM甲酸铵的甲醇；
正离子参数对应的梯度洗脱：
0-0.5 min：A 70%，B 30%；0.60-1.50 min：A 55%，B 45%；1.51-3.00 min：A 45%，B55%；3.01-4.50 min：A 0%，B 100%；4.60-5.50 min：A 70%，B 30%；
正离子参数对应的质谱参数为：毛细管电压：1.0 kV；锥孔电压：18 V；脱溶剂温度：400℃；脱溶剂气大小：1000 L/Hr；锥孔气大小：50 L/Hr；
负离子参数对应的流动相：A为纯水，B为甲醇；梯度洗脱为：0-1.2 min：A 25%，B 75%；1.21-2.10 min：A 10%，B 90%；2.20-3.00 min：A 25%，B 75%；
负离子参数对应的质谱参数为：毛细管电压：1.0 kV；锥孔电压：34 V；脱溶剂温度：400℃；脱溶剂气大小：1000 L/Hr；锥孔气大小：0 L/Hr。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱质谱联用仪为安捷伦LC1260/MS6410B，所述液相色谱质谱联用仪使用的参数包括：
色谱柱：SHIMADZU Shim-pack Velox C18，2.1×100 mm，2.7 μm；
正离子参数对应的流动相：A为含有0.1v/v%甲酸和5 mM甲酸铵的水溶液，B为含有0.1v/v%甲酸和5 mM甲酸铵的甲醇；
正离子参数对应的梯度洗脱：
0-0.5 min：A 70%，B 30%；0.51-2.50 min：A 40%，B 60%；2.51-4.00 min：A 0%，B100%；4.01-6.00 min：A 70%，B 30%；
正离子参数对应的质谱参数为：雾化气温度：350℃；雾化气气流：6 L/min；喷雾器：55psi；毛细管电压：4000 V；电子倍增器电压值：200 V；
负离子参数对应的流动相：A为纯水，B为甲醇；等度洗脱为：0-3.5 min：A 25%，B 75%；
负离子参数对应的质谱参数为：雾化气温度：350℃；雾化气气流：6 L/min；喷雾器：55psi；毛细管电压：3500 V；电子倍增器电压值：0 V。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品的制备方法包括：将血浆或血清、内标工作液和蛋白沉淀剂利用涡旋振荡5-10 min，离心5-15 min，取上清液加入纯水涡旋振荡1-5 min，离心5-10 min，得到所述待测样品；
和/或，所述血浆或血清与内标工作液的体积比为2-10:1；
和/或，所述上清液与纯水的体积比为1:1.5-6。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准溶液的制备方法包括：将内标工作液与含有20种药物及6种代谢物的标准工作液混合后，依次与甲醇、去离子水混合，得到所述标准溶液，所述标准工作液包括8个级别浓度；
各所述级别浓度的标准工作液均利用稀释剂由中间液稀释得到，所述中间液利用稀释剂由母液稀释得到，所述母液利用溶剂溶解所述20种药物及6种代谢物各自的标准品得到。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述稀释剂为甲醇和水的体积比为1:0-1的甲醇水溶液。
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