CN109655568B - 高效液质联用同时测定35种精神药物的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开一高效液质联用同时测定35种精神药物的方法及试剂盒，通过优化色谱条件和质谱条件实现35种精神药物的同时处理，且精神药物的前处理步骤简单，仅仅通过简单的甲醇进行蛋白沉淀，该试剂盒及对应的检测方法相较现有技术极大地降低成本，极大地缩短分析时长，提高灵敏度以及通量，满足临床检测的需求。

Description

高效液质联用同时测定35种精神药物的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及精神药物检测领域，特别涉及一种高效液质联用同时测定35种精神药物的方法及试剂盒。

背景技术

迄今为止，开发并用于临床的精神类药物已经超过200多种，这些精神类药物产生了巨大的医学价值与经济效益，但是因为患者个体存在代谢差异的问题，这些药物对于许多患者的治疗效果并不尽如人意，因此，治疗药物监测(TDM)越来越受到关注,TDM是通过定量测定血浆或者血清中药物的浓度来进行患者个体的剂量滴定，以便获得更佳的疗效、更好的耐受性，同时还可以降低中毒的风险。目前在TDM的化学检测方法当中，LC-MS/MS法具有特异性强、准确度高、分析时间短、灵敏度高、高通量等特点，逐渐成为药物浓度分析中的主力军。

现有技术中也存在基于LS-MC的检测精神药物方法的方法，比如：中国专利CN106168610B公开了一种：“高效液相质谱联用测定血浆中氯氮平浓度的方法”，其提供了一种利用高效液相质谱联用方法，并采用利培酮做内标检测氯氮平精神药物的方法，其是专门针对特定的精神药物-氯氮平药物的方法，不适用于多种精神药物的同时测量，且其利用利培酮作为内标，采用内标法进行药物的检测，增大了检测过程的成本；再如中国专利CN109085264A公开了一种：“液相色谱串联质谱法检测血清血浆中抗抑郁药物的试剂盒及其应用”，且可同时检测多种精神药物，但是其还是采用的是内标法进行检测，并且，其对样品的前处理较为复杂，影响检测效率。

综上所述，现有技术中关于精神药物检测的过程主要缺陷在于：

第一，成本高，目前大多数LC-MS/MS的方法都采用氘代等内标用来校正基质效应等影响，此类内标成本较高，会直接导致整个检测过程的成本较高；

第二，通量低，现有方法多为一种或几种药物同时测定，但是极少涉及到几十种，影响了检测的效率；

第三，分析时间长，现有技术的测量方法当中LC部分分析时间占绝大部分比例，导致药品检测时间长，一般分析时长都大于5分钟；

第四，灵敏度低下，在同时检测多种药物的过程中，存在多种目标物灵敏度相对较低的问题，影响检测的准确度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效液质联用同时测定35种精神药物的方法及试剂盒，可对多达35种精神药物同时进行检测，并且其检测方法相较现有技术极大地降低成本，极大地缩短分析时长，提高灵敏度以及通量，满足临床检测的需求。

为了实现以上任一发明目的，本发明提供一高效液质联用同时测定35种精神药物的方法，所述35种精神药物的中文名及对应的英文名如下表一：

表一：

本方案采用高效液相色谱串联质谱技术同时检测经过预处理的血清中的35种精神药物，且鉴于该35种精神药物为外服药物，外服药物的服用量较大，故使得血清内中的精神药物的含量较多，故本方案采取简单的外标法进行定量检测，以此方式减少昂贵的内标物的使用，并且通过优化液相色谱和质谱的条件，同时检测35种精神药物及其含量，使得每个药物都达到较高的灵敏度。

(1)色谱条件：

流动相A液：0.05-0.3％甲酸，1-6mM乙酸铵水溶液；

即，甲酸浓度可选择为0.05，0.1,0.15，0.18,0.2,0.22,0.25，0.28等任意数值。

乙酸铵水溶液的浓度可选择为1，1.1,1.2,2,2.5,3,3.5,4,4.5,5,5.5,6等任意数值。

流动相B液：0.05-0.3％甲酸，1-6mM乙酸铵甲醇溶液；

即，甲酸浓度可选择为0.06，0.8,0.14，0.17,0.21,0.25,0.28，0.3等任意数值。

乙酸铵甲醇溶液的浓度可选择为1，1.3,1.4,2.1,2.2,2.8,3,3.2,3.5,4,4.1.4.5,5等任意数值。

色谱柱型号：C18,C8,PFP柱(三者选其一)；柱规格(2.1mm x 100mm,2.6μm或者2.1mm x 150mm,3μm)；

采用梯度洗脱的方式，见表二，为其中一具体的试验条件：

流速：0.1-0.4mL/min，柱温为25-40℃，进样1-10μL；

即，流速选择为：0.1,0.15,0.2,0.3,0.4等任意数值。

柱温选择为25,26,30，32,35,40等任意数值。

进样选择为1,2,3,4,5,6,7，8,9,10等任意数值。

表二：流动相梯度洗脱参数：

时间(min)	流速(mL/min)	％A	％B
				00：00	0.2	25	75
0.2	0.2	25	75
				1.8	0.2	5	95
2.5	0.2	5	95
				3	0.2	25	75
4	0.2	25	75

所用洗脱梯度：0-0.2min,35-80％B液；在0.2-1.8min,B液升高到50-100％；1.8-2.5min,B液维持50-100％；2.5-3.0min,B液降到40-90％；3.0-4.0min,B液维持40-90％。

(2)质谱条件：

离子源：电喷雾离子源(ESI)，正负离子模式；

喷雾毛细管电压(Capliary)：5500V；

离子源温度：550℃；

离子源雾化气(Gas1)：50psi；

离子源加热辅助气(Gas2)：55psi；

气帘气(CUR)：25psi；

碰撞气(CAD)：4psi；

扫描模式：多反应监测

各个目标物的质谱参数如表三：

表三：

样品前处理步骤如下：

精准量取标准品溶液，质控样品，或人血清置于洁净离心管中；加入一定比例的甲醇，涡旋震荡混匀，并离心，进行简单的蛋白沉淀，得到上清液；吸取上清液与水混合，或者和甲醇水溶液混合后，转移至孔板；该前处理步骤简单，成本低下。

具体而言，精密量取标准溶液(血清基质)，质控样品，或人血清5-500μL置于洁净离心管中；加入100-2000μL的甲醇，涡旋震荡混匀4min(简单的沉淀蛋白)，4℃条件12000rpm离心5min；吸取适量上清液用水或者流动相适当稀释，转移80μL至96孔板，即可进样。

标准品储备液和标准品溶液的制备：

称取对应35种精神药物的标准品，用甲醇配置为标准品母液，取标准品母液得到标准储备液W1，逐级稀释得到另外8个浓度点的标准品储备液W2-W9；

分别取标准品储备液W1-W9以1:19的比例加入阴性血清，振荡混匀后，得到不同溶液的标准品溶液，此时标准品溶液为含有容置于血清基质的标准品。

外标标准曲线的制作：

以血清基质中标准品的浓度为X轴，以每一浓度对应峰面积为Y轴，进行线性回归分析，得到对应35中精神药物的外标曲线。

待测药物的测定：

测定待测药物的峰面积，对应外标曲线得到待测药物的浓度。

相较现有技术，本发明具有以下的有益效果：

1)采用简单的外标法定量检测精神药物浓度：避免使用昂贵的内标物，采用简单的外标法定量，极大程度地降低了检测成本；另外，标准曲线可被重复被使用，提高检测的效率；

2)同时测定35种常见精神药物浓度：通过设置液相色谱以及质谱条件，完成同时检测35中精神药物的效果，极大地提高整个测定过程的通量；

3)极大缩短分析时间：通过优化液相条件，极大地优化整个分析时间，缩短分析时间至4-5min，可快速高效地获取多种精神药物浓度，提高检测效率；

4)前处理简单：该方案对检测药品的前处理简单，通过优化选择仪器以及测试条件来实现高效高通量同时检测的效果，简化操作步骤，提高检测效率。

5)检测灵敏度高：通过不断优化前处理与仪器方法，实现每种药物都达到较高的灵敏度，满足临床检测的需求。

附图说明

图1是根据本发明的一实施例的35种精神药物标准品的MRM提取离子色谱图。

图2到图8是根据本发明的一实施例的35种精神药物的标准品加血清基质的MRM提取离子色谱图。

图9是根据本发明的一实施例的35种精神药物的定量标准工作曲线。

图10到图13是本发明的一实施例的检测色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。

实施例1：

一、材料：

1.1方法学研究实验的样本来自于杭州度安医学检验实验室；

1.2仪器：

1.2.1 Sciex 4500MD三重四级杆质谱仪(美国，Sciex公司),岛津高效液相色谱系统(日本，Shimadzu Scientific公司)；

1.2.2 KQ-500E超声波清洗器；

1.2.3 H1650R台式高速冷冻离心机(中国，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；

1.2.4 G560E涡旋混合器(美国，Scientific Industries公司)；

1.2.5屈臣氏蒸馏水，购自广州屈臣氏食品饮料有限公司(中国)；

1.2.6 BT125D电子天平(德国，赛多利斯股份公司)；

1.2.7移液器(EPPENDORF，德国)。

1.3试剂耗材：

1.3.1乙腈、甲醇(Merck，美国)

1.3.2高纯水(娃哈哈)

1.3.3甲酸(SIGMA Aldrich,美国)

1.3.4乙酸铵(SIGMA Aldrich,美国)

1.3.5色谱柱(ACE，英国)

1.4标准品：

1.5质控样品：

质控样品是已知浓度含量的样品,用来鉴定本方法测量结果是否准确，购于Bio-Rad Laboratories。

二、方法：

2.1色谱质谱条件如上发明内容所示，通过色谱和质谱条件的控制，使其可同时检测获取35种精神药物。且通过该色谱和质谱条件的优选选择，以提高样品检测的灵敏度，以及对应配置简单的前处理即可，提高检测效率和质量。

在本实施例中，选择色谱条件和质谱条件具体如下，但值得注意的是，上述色谱质谱条件中提及的其他参数选择也在可操作范围之内：

色谱条件：

色谱柱：ACE Excel-2 C18-PFP(2.1mm x 100mm,2.6μm)；流动相：A液：0.1％甲酸，5mM乙酸铵水溶液，B液:0.1％甲酸，5mM乙酸铵甲醇溶液；流速：0.2mL/min，柱温为35℃，进样2μL；所用洗脱梯度：0-0.2min,75％B液；在0.2-1.8min,B液升高到95％；1.8-2.5min,B液维持95％；2.5-3.0min,B液降到75％；3.0-4.0min,B液维持75％。

质谱参考条件：

离子源：电喷雾离子源(ESI)，正负离子模式；喷雾毛细管电压(Capliary)：5500V；离子源温度：550℃；离子源雾化气(Gas1)：50psi；离子源加热辅助气(Gas2)：55psi；气帘气(CUR)：25psi；碰撞气(CAD)：4psi；扫描模式：多反应监测(见表1)。

2.2标准品母液的制备：

称取50mg氯氮平标准品(纯度98％)，用甲醇定容至25mL，得到母液(1960μg/mL)。

其他标准品母液的制备过程同上，得到35种精神药品对应的标准品母液。

2.3标准品储备液(甲醇基质)配制

取用氯氮平母液102μL，用甲醇稀释至10mL得到氯氮平标准储备溶液W1(20000ng/mL)，再分别用甲醇稀释得到氯氮平标准储备溶液各曲线点W2-W9，浓度范围为400-20000。

其他标准品储备液的制备过程同上，得到35种精神药品对应的标准品储备液。

2.4标准品溶液的制备(血清基质)：

分别选择10μL的各个浓度的氯氮平标准储备液，依次加入190μL的阴性血清，振荡混匀，得到对应浓度的氯氮平标准品溶液。在本方案当中，以阴性血清为基质，以模拟人体的真实环境。

同理，其他标准品溶液也如上制备，标准品储备液及标准品溶液的浓度如下表四：

表四：

2.5质控品的制备：

配制一定浓度的质控品储备液(甲醇基质)，取10μL质控品储备液(甲醇基质)，加入190μL阴性人血清，混匀，得质控品。

2.6样品处理：

测试样品的处理：取20uL置于洁净离心管中；加入1000μL的甲醇，涡旋震荡混匀4min(简单的沉淀蛋白)，4℃条件12000rpm离心5min；吸取上清液100μL与相同体积水混合后(方法一)，或者取20μL上清液与180μL甲醇：水(1：1)混合(方法二)，转移80μL至96孔板，即可进样；

质控品的处理：同于样品溶液的处理；

标准品溶液(血清基质)的处理：同于样品溶液的处理。

3、数据处理：

实验采用MRM模式监测35种精神药物的离子对(Q1/Q3)，选择不同离子对的DP/CE/CXP等进行优化，从优化色谱图中即可看到离子最高信号强度所对应的最佳结果，其他的参数可根据仪器提供的参考值范围选择合适的数值，以保证较强的信号强度。

3.1获取标准品的离子色谱图：

将标准品储备液(甲醇基质)进样获取其离子色谱图，如图1所示。

35种精神药物的标准品，在目标峰出峰时间±1min内基本没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1是35种精神药物MRM提取离子色谱图。

3.2获取标准品溶液(血清基质)的离子色谱图：

获取不同浓度的标准品溶液(血清基质)对应的谱图，并得到不同标准品溶液的峰面积。如图2到图8所示。

3.3获取外标曲线：

采用外标定量法，以标准品(血清基质)的浓度为X轴，以标准品溶液的峰面积为Y轴，建立外标标准曲线，35种精神药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数基本都在0.99以上，极个别标准品(拉莫三嗪和10-羟基卡马西平)的相关系数未达到0.99，满足定量要求，具体参数如表五所示：

表五：35种精神药物线性回归方程及线性相关系数：

35种药物的定量标准工作曲线如图9所示。

图9中，标准曲线从右到左依次如表六：

表六：

3.4获取质控品对应的离子色谱图：

质控品是已知的浓度含量,用来鉴定该方法的测定结果是否准确。

用当天的标准曲线校准质控品的浓度，记录校准浓度与已知浓度的偏差，累积到一定数量后计算均值与CV值，并作出相关的质控图，参考相关标准判定方法是否受控。

3.5待测样品的检测：

待测样品1检测得到的色谱，如图7和图8所示，可知，测定的数据如下氯氮平浓度分别为164ng/mL，去甲氯氮平浓度75ng/mL，苯妥因钠浓度为45μg/mL，左乙拉西坦浓度为1.77μg/mL，均在线性范围内，检测结果为临床医生提供很好的指导。

待测样品2检测得到的色谱，如图10到图13所示，可知，测定的数据如下：

测定的数据如下氯氮平浓度分别为98ng/mL，去甲氯氮平浓度61ng/mL，苯妥因钠浓度为45μg/mL，左乙拉西坦浓度为1.77μg/mL，均在线性范围内，检测结果为临床医生提供很好的指导。

3.6准确度验证

准确度实验：组间准确度，通过分析至少三天两个不同浓度样品(每个浓度点做6个平行样品)来得到，合格的标准要求平均测量的每一个水平的浓度在15％理论值以内，即准确度的范围在85％-115％之间。

表七：质控样检测三天的准确度数据

3.7精密度验证

精密度：一次测定三个不同浓度的QC，每个浓度的样本数量要求不小于5个(n＝6)，合格的标准要求每一个水平的浓度QC样品的CV≤15％，如表八：表八：

质控：LQC低浓度质控；HQC高浓度质控

四、高效液质联用同时测定35种精神药物的试剂盒：

五、讨论：

本研究采用HPLC-MS方法同时测定了人体血清内35种精神药物的存在及含量。且，鉴于精神药物为外服药物，且血清内的含量较大，故本研究采用外标法的方法进行定量测量，即，不需要昂贵的内标物降低检测成本。且本研究优化色谱和质谱条件，以在短时间(4min)内即可高通量高灵敏度地同时检测到35种精神药物，且对样品的前处理步骤简单。

鉴于考察本实验的结果精准度和可重复性，比对精密度与准确度数据，可知该方法的精准度且可重复性均很高。

总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理步骤简单，在4-5min之内可同时完成35种精神药物的分离和检测，且采用外标法的方式简单地实现精神药物的定量，可重复性高且成本低下，精密度和可重复性均符合基本要求，可用于临床上精神类药物的定量分析，为临床医学提供一种可靠的检测方法。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.高效液质联用同时测定35种精神药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

35种精神药物分别为：氯氮平CLZ、去甲氯氮平NDMC、喹硫平Qtp、氯丙嗪Chpma、齐拉西酮Zisd、阿立哌唑Arpz、脱氢阿立哌唑Dehy-arpz、舒必利Supr、氟西汀Flxt、去甲氟西汀Nor-Flxt、曲唑酮Trzd、文拉法辛Vlfx、去甲-O-文拉法辛O-Dm-Vlfx、氨磺必利(Asp)、氟伏沙明Fvxm、奥氮平Ozp、利培酮Rpd、9-羟利培酮Papd、度洛西汀Duxt、米氮平Mitp、舍曲林Stl、多奈哌齐Dnpz、艾司西酞普兰S-citpm、西酞普兰Citpm、帕罗西汀Paxt、奋乃静Perz、氟哌啶醇Hlpd、丙戊酸Vpa、拉莫三嗪Lmtg、左乙拉西坦Lvtc、奥卡西平Ox-CBZ、10-羟基卡马西平10-OH-CBZ、卡马西平10,11-环氧化物Eo-CBZ、卡马西平CBZ、苯妥英钠PHT；

获取35种精神药物的外标标准曲线，采用外标定量法以及高效液质联用法同时测定35种精神药物的浓度；

样品前处理：称取人体血清置于洁净离心管中，加入甲醇，涡旋震荡混匀，并离心，得到上清液；吸取上清液与水混合，或与甲醇水溶液混合后，转移至孔板；

进样检测：

色谱条件为：

(1)色谱条件：

流动相A液：0.1％甲酸，5mM乙酸铵水溶液；

流动相B液：0.1％甲酸，5mM乙酸铵甲醇溶液；

色谱柱型号：ACE Excel-2 C18-PFP-；柱规格：2.1mm x 100mm,2.6μm流速：0.2mL/min，柱温为35℃，进样2μL；

所用洗脱梯度：0-0.2min,75％B液；在0.2-1.8min,B液升高到95％；1.8-2.5min,B液维持95％；2.5-3.0min,B液降到75％；3.0-4.0min,B液维持75％；

(2)质谱条件：

离子源：电喷雾离子源(ESI)，正负离子模式；喷雾毛细管电压(Capliary)：5500V；离子源温度：550℃；离子源雾化气(Gas1)：50psi；离子源加热辅助气(Gas2)：55psi；气帘气(CUR)：25psi；碰撞气(CAD)：4psi；扫描模式：多反应监测；各个目标物的质谱参数如下表：

称取对应35种精神药物的标准品，用甲醇配置为标准品母液，取标准品母液得到至少两不同浓度标准品储备液；分别取标准品储备液以1:19的比例加入阴性血清基质，振荡混匀后，得到不同溶液的标准品溶液；选择和测试样品同样的前处理以及进样检测条件，得到标准品溶液的峰面积，以阴性血清基础中标准品的浓度为X轴，以每一浓度对应峰面积为Y轴，进行线性回归分析，得到对应35中精神药物的外标曲线。

2.根据权利要求1所述的高效液质联用同时测定35种精神药物的方法，其特征在于，35种精神药物标准品溶液的参考浓度：氯氮平在20-1000ng/mL之内，去甲氯氮平在20-1000ng/mL之内、喹硫平在20-980ng/mL之内、氯丙嗪在20-1000ng/mL之内、齐拉西酮在10-490ng/mL之内、阿立哌唑、脱氢阿立哌唑在20-1000ng/mL之内、舒必利在30-1500ng/mL之内、氟西汀在20-1000ng/mL之内、去甲氟西汀在20-1000ng/mL之内、曲唑酮在30-1500ng/mL之内、文拉法辛在20-1000ng/mL之内、去甲-O-文拉法辛在20-1000ng/mL之内、氨磺必利在20-1000ng/mL之内、氟伏沙明在10-500ng/mL之内、奥氮平在8-400ng/mL之内、利培酮在8-386ng/mL之内、9-羟利培酮在4-200ng/mL之内、度洛西汀在8-400ng/mL之内、米氮平在8-400ng/mL之内、舍曲林在8-400ng/mL之内、多奈哌齐在8-400ng/mL之内、艾司西酞普兰在8-400ng/mL之内、西酞普兰在8-400ng/mL之内、帕罗西汀在8-400ng/mL之内、奋乃静在0.2-10ng/mL之内、氟哌啶醇在0.4-20ng/mL之内、丙戊酸在3-150ng/mL之内、拉莫三嗪在1-50ng/mL之内、左乙拉西坦在1-50ng/mL之内、奥卡西平在0.02-1ng/mL之内、10-羟基卡马西平在1-50ng/mL之内、卡马西平10,11-环氧化物在0.1-4.85ng/mL之内、卡马西平在0.4-20ng/mL之内、苯妥英钠在1-50ng/mL之内。

3.根据权利要求1到2中任一所述的高效液质联用同时测定35种精神药物的方法，其特征在于，测试前人体血清和/或标准品溶液的前处理步骤中，取人体血清和/或标准品溶液5-500μL置于洁净离心管中；加入100-2000μL的甲醇，涡旋震荡混匀4min，4℃条件12000rpm离心5min；吸取适量上清液用水或者流动相稀释，转移80μL至96孔板。

4.根据权利要求1到2任一所述的高效液质联用同时测定35种精神药物的方法，其特征在于，选择质控品溶液进行质控测试，其中质控品为已知浓度含量的35种精神药物，质控品以1：19的比例加入阴性血清，得到质控品溶液。

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