CN110455945B - 一种检测血液中5种精神药物及其主要代谢产物的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物检测领域，具体涉及一种检测血液中5种精神药物及其主要代谢产物的方法及试剂盒。所述5种精神药物及其主要代谢产物为：奥氮平和去甲奥氮平、利培酮和9‑羟基利培酮、阿立哌唑和脱氢阿立哌唑、艾司西酞普兰和去甲西酞普兰、舍曲林和N‑去甲基舍曲林。本发明针对每一检测物质，分别选择一对定量离子对，以其相对保留时间作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量；并且应用低、中、高三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真；同时采用内标工作液用于校正，可以避免基质效应，准确定量。本发明操作简单快速，通量高成本低，可应用于精神科临床工作对精神药物进行治疗药物监测。

Description

一种检测血液中5种精神药物及其主要代谢产物的方法及试 剂盒

技术领域

本发明属于药物检测领域，具体涉及一种检测血液中5种精神药物及其主要代谢产物的方法及试剂盒。

背景技术

精神疾病多属慢性病，目前精神疾病的治疗仍以药物治疗为主，多数患者需要长期甚至终身服药。如何选好、用好精神药物，达到疗效最好、不良反应最少目的，是精神疾病药物治疗所面临的一个重要问题。因此对精神药物进行治疗药物监测是调整用药剂量，优化治疗方案，实现精准治疗的重要手段。本发明提供一种能准确、便捷、快速测定血液样品中奥氮平、利培酮、阿立哌唑、艾司西酞普兰和舍曲林及其主要代谢产物的方法及试剂盒，且这五种药物是目前临床应用较为广泛的药物，且代谢物与疗效或副作用有关，对五种药物的同时检测可以满足临床工作对精神药物进行治疗药物监测的实际需求。

现有技术中也存在基于LC-MS/MS的检测精神药物方法的方法，例如：中国专利申请(申请号201910058868)公开了一种“高效液质联用同时测定35种精神药物的方法及试剂盒”，其提供了一种利用高效液相色谱串联质谱方法同时测定35种精神药物，并采用外标方法。该方法的缺陷包括：1)其中35种药物并非都是临床常用药物，而且精神疾病患者一般使用1种药物治疗或2种药物联合治疗，35种药物同时检测造成不必要的浪费，2)该法利用外标法进行药物的检测，外标法不可以消除检测过程中的基质效应，不利于精准定量，目前公开的文献和专利大部分已经用内标法代替外标法。再如中国专利申请(申请号：201810878811.X，公开号：CN109085264A)公开了一种：“液相色谱串联质谱法检测血清血浆中抗抑郁药物的试剂盒及其应用”，且可同时检测12种抗抑郁药物，但是也存在一些缺陷，包括：1)12种药物同时检测造成不必要的浪费，2)仅有文拉法辛和氟西汀同时检测了原形药物和代谢产物，不能准确评价药物的整体作用，3)2种物质以及2个代谢物的线性范围均一致，不符合临床实际情况，因临床样本参考范围不同，还需根据实际情况对不同药物的参考范围进行调整。中国专利(专利号：201610730994.1，公开号CN106168610B)公开了一种：“高效液相质谱联用测定血浆中氯氮平浓度的方法”，其提供了一种利用高效液相色谱串联质谱方法，并采用利培酮做内标检测氯氮平精神药物的方法，但是该方法是专门针对特定的精神药物-氯氮平药物的方法，不适用于多种精神药物的同时测量，且其利用利培酮作为内标，并非同位素做内标，无法完全消除基质效应，不利于精准定量。

综上所述，现有技术中关于精神药物检测的过程主要缺陷在于：

第一，存在基质效应，部分方法仍采用外标法进行药物浓度检测，存在基质效应，不能精准定量，目前大多数LC-MS/MS的方法都采用同位素代替等内标用来校正基质效应等影响，外标法已经被逐渐淘汰。

第二.检测药物种类不适用临床，检测药物种类单一或过多，由于精神疾病患者一般使用1种药物治疗或2种药物联合治疗，检测药物种类单一，通量低，不利于开展更多检测项目；检测药物种类过多，造成成本过高，形成资源浪费，都不易于大批量临床检测，因此要结合临床需求，开发合理的方法。

第三，线性范围不适宜，现有技术的测量方法中多种药物的线性范围不合理，未经过临床样本的验证，不适合临床检验。

第四，灵敏度低下，在同时检测多种药物的过程中，存在多种目标物难以完全色谱分离，共流出等问题，导致灵敏度相对较低，影响检测的准确度。

因此，目前的科研和试验中，需要一种测试结果精准、适用于临床、线性范围合适、灵敏度高的精神药物及其主要代谢产物的检测方法。

发明内容

本发明提供一种检测血液中5种精神药物及其主要代谢产物的方法，该方法采用高效液相色谱-质谱检测；所述5种精神药物为：奥氮平、利培酮、阿立哌唑、艾司西酞普兰、舍曲林。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测血液中5种精神药物及其主要代谢产物的方法，所述方法采用高效液相色谱-质谱检测；所述5种精神药物为：奥氮平、利培酮、阿立哌唑、艾司西酞普兰、舍曲林；所述奥氮平的主要代谢产物为去甲奥氮平，所述利培酮的主要代谢产物为9-羟基利培酮，所述阿立哌唑的主要代谢产物为脱氢阿立哌唑，所述艾司西酞普兰的主要代谢产物为去甲西酞普兰，所述舍曲林的主要代谢产物为N-去甲基舍曲林。

作为优选的实施方式，所述方法包括：工作溶液配制步骤，高效液相色谱-质谱检测步骤；所述工作溶液包括：待测样品，内标工作液，混合标准品工作液，质控工作液。

作为优选的实施方式，所述工作溶液配制步骤中，所述待测样品的配制方法包括：将试验样品与内标工作液按体积比1：(2-4)，优选为1：3混匀，离心后取上清，得到待测样品。

作为优选的实施方式，所述内标工作液的配制方法包括：先分别将奥氮平-d8、利培酮-d4、阿立哌唑-d8、艾司西酞普兰-d6、舍曲林-d3配制为质量浓度为1mg/mL的内标物储备液溶液；再将所述内标物储备液溶液稀释为质量浓度为1μg/mL的内标中间工作液；再将所述内标中间工作液配制为所述内标工作液；所述内标工作液中，所述奥氮平-d8的浓度为10-20ng/mL、利培酮-d4的浓度为5-15ng/mL、阿立哌唑-d8的浓度为25-75ng/mL、艾司西酞普兰-d6的浓度为5-15ng/mL、舍曲林-d3的浓度为30-90ng/mL；优选地，所述奥氮平-d8的浓度为15ng/mL、利培酮-d4的浓度为10ng/mL、阿立哌唑-d8的浓度为50ng/mL、艾司西酞普兰-d6的浓度为10ng/mL、舍曲林-d3的浓度为60ng/mL。

作为优选的实施方式，所述工作液的配制步骤中，所述混合标准品工作液的配制方法包括：先将所述5种精神药物及其主要代谢产物的标准品配置成质量浓度为1mg/mL的标准品储备液溶液；再将所述标准品储备液溶液分别配制成标准品中间工作液；所述中间工作液中，所述奥氮平、利培酮、阿立哌唑、艾司西酞普兰、舍曲林、N-去甲奥氮平、9-羟基利培酮、脱氢阿立哌唑、N-去甲西酞普兰和N-去甲基舍曲林的浓度分别为16、6、100、20、32、8、16、100、36、6μg/mL；再将所述标准品中间工作液分别配制成所述混合标准品工作液；所述混合标准品工作液中，奥氮平的浓度为32，64，160，320，800，1600ng/mL，利培酮的浓度为12，24，60，120，300，600ng/mL，阿立哌唑的浓度为200，400，1000，2000，5000，10000ng/mL，艾司西酞普兰的浓度为40，80，200，400，1000，2000ng/mL，舍曲林的浓度为32，64，160，320，800，1600ng/mL，N-去甲奥氮平的浓度为16，32，80，160，400，800ng/mL，9-羟基利培酮的浓度为32，64，160，320，800，1600ng/mL，脱氢阿立哌唑的浓度为200，400，1000，2000，5000，10000ng/mL，N-去甲西酞普兰的浓度为12，24，60，120，300，600ng/mL，N-去甲基舍曲林的浓度为72，144，360，720，1800，3600ng/mL。

作为优选的实施方式，所述工作溶液配制步骤中，所述质控工作液的配制方法包括：所述5种精神药物及其主要代谢产物的标准品用稀释液配制为所述质控工作液；所述质控工作液中，所述奥氮平的浓度为80，400，1200ng/mL，利培酮的浓度为30，150，450ng/mL，阿立哌唑的浓度为500，2500，7500ng/mL，艾司西酞普兰的浓度为100，500，1500ng/mL，舍曲林的浓度为160，800，2400ng/mL，N-去甲奥氮平的浓度为40，200，600ng/mL，9-羟基利培酮的浓度为80，400，1200ng/mL，脱氢阿立哌唑的浓度为500，2500，7500ng/mL，N-去甲西酞普兰的浓度为30，150，450ng/mL，N-去甲基舍曲林的浓度为180，900，2700ng/mL。

作为优选的实施方式，高效液相色谱-质谱检测步骤中，色谱条件为：色谱柱：Phenomenex Phenyl-Hexyl柱(50×4.6mm，2.6m)；柱温：50℃；流动相A：含0.1％的甲酸的HPLC级水；流动相B:含0.1％甲酸的乙腈；采用梯度洗脱，洗脱条件为0-3min，7％-80％；B相；3-4min，80％；B相；4.1-5min，7％B相；流速：0.6mL/min；进样体积：2μL。

作为优选的实施方式，高效液相色谱-质谱检测步骤中，质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描模式：MRM；

作为优选的实施方式，所述试验样品为血浆或血清。

上述用于检测血液中5种精神药物及其主要代谢产物的试剂盒，包括：所述混合标准品工作液，所述质控工作液，所述内标工作液；每个所述混合标准品工作液、每个所述质控液、所述内标工作液的体积比为4：5：600。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明通过对样本前处理方法和高效液相色谱-质谱(HPLC-MS/MS)条件的优化，建立了一种检测血液样品中奥氮平、利培酮、阿立哌唑、艾司西酞普兰和舍曲林及其主要代谢产物的方法。本发明中的前处理方法为采用甲醇/乙腈混合溶剂进行蛋白沉淀，操作简单快捷，基本消除基质效应。

2、本发明针对每一检测物质，分别选择一对定量离子对，以其相对保留时间作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本发明应用低、中、高三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真。同时，本发明采用内标工作液用于校正，可以避免基质效应，准确定量。

3、本发明采用高效液相色谱-质谱检测，能够快速、准确、客观，可以对精神药物进行治疗药物监测提供有效依据。

4、本发明首次实现了应用高效液相色谱-质谱方法精确检测血液样品中奥氮平、利培酮、阿立哌唑、艾司西酞普兰和舍曲林及其主要代谢产物含量，用特征离子对进行定性和定量，保证了检测物质的特异性和准确性，降低了干扰物影响。

5、本发明操作简单快速，通量高成本低，可应用于精神科临床工作对精神药物进行治疗药物监测。

附图说明

图1为实施例1总色谱图。

图2-图16为实施例1的5种精神药物、每种药物的代谢物、每种药物的内标物的色谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而且非意图限制根据本发明的示例性实施方法。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或他们的组合。

第一方面，本发明提供一种检测血液中5种精神药物及其主要代谢产物的方法。

本发明采用高效液相色谱-质谱的检测方法；检测5种精神药物(母药)为：奥氮平(Olanzapine)、利培酮(Risperidone)、阿立哌唑(Aripiprazole)、艾司西酞普兰(Escitalopram)、舍曲林(Sertraline)；上述5种精神药物的主要代谢产物分别为：N-去甲奥氮平(N-Demethyl olanzapine)，9-羟基利培酮(9-hydroxy risperidone)，脱氢阿立哌唑(dehydroaripiprazole)，N-去甲西酞普兰(N-Demethyl escitalopram)，N-去甲基舍曲林(N-demethyl sertraline)。

本发明的检测优势之一就是在检测结果的色谱图中能将上述母药和代谢物在色谱柱上分开，使它们之间互相不影响，保证检测结果准确、清楚地呈现。

本发明的检测方法包括以下步骤：

步骤一、用于HPLC-MS/MS的工作溶液的配制，包括待测样品、标准工作液、质控液的配制。

(一)待测样品的配制，即血液样品预处理：将血浆样品和内标工作液混匀，离心后取上清液，得到待测样品。

优选地，上述血浆样品和内标工作液的体积比为1：(2-4)(例如1：2、1：2.5、1：3.5、1：4)，优选为1：3。

上述内标工作液的配制方法包括：

S1：分别准确称量适量的奥氮平-d8(Olanzapine-d8)、利培酮-d4(Risperidone-d4)、阿立哌唑-d8(Aripiprazole-d8)、艾司西酞普兰-d6(Escitalopram-d6)、舍曲林-d3(Sertraline-d3)的标准品，优选用甲醇溶液分别配置成质量浓度为1mg/mL的内标物储备液溶液(又名内标储备液)。

上述每个内标物对应一个母药和一个代谢物(母药和代谢物结构很接近)，这样最符合检测的实际需求，无需采用过多种内标物造成浪费。

S2：准确移取适量的上述内标储备液，优选用50vol％的甲醇水溶液分别稀释成质量浓度为1μg/mL的内标中间工作液。

S3：分别精密移取适量的上述内标中间工作液，采用体积比为(0-50)：(50-100)(例如：10：100，20：50，30：80，40：60，5：90等)，优选为20：80的甲醇：乙腈混合溶液，配制得到内标工作液；该内标工作液中同时包括以下5种物质，奥氮平-d8的浓度为10-20ng/mL、利培酮-d4的浓度为5-15ng/mL、阿立哌唑-d8的浓度为25-75ng/mL、艾司西酞普兰-d6的浓度为5-15ng/mL、舍曲林-d3的浓度为30-90ng/mL；在优选的实施方式中，奥氮平-d8的浓度为15ng/mL、利培酮-d4的浓度为10ng/mL、阿立哌唑-d8的浓度为50ng/mL、艾司西酞普兰-d6的浓度为10ng/mL、舍曲林-d3的浓度为60ng/mL。

将该内标工作液分装于30ml棕色瓶中，于-20℃储存备用。

本步骤中采用上述浓度的内标物的信号强度适中，能被准确检测到且信号不会远超被检测物质。

(二)混合标准品工作液(即：标准溶液、混合标准品工作溶液)的配制：

S1：分别准确称量适量的奥氮平、利培酮、阿立哌唑、艾司西酞普兰、舍曲林、N-去甲奥氮平、9-羟基利培酮、脱氢阿立哌唑、N-去甲西酞普兰和N-去甲基舍曲林标准品，优选用甲醇溶液分别配置成质量浓度为1mg/mL的标准品储备液溶液。

S2：准确移取适量的上述各个标准品储备液，使用50vol％的甲醇水溶液作为稀释剂，分别配制成标准品中间工作液；在各个中间工作液中，奥氮平、利培酮、阿立哌唑、艾司西酞普兰、舍曲林、N-去甲奥氮平、9-羟基利培酮、脱氢阿立哌唑、N-去甲西酞普兰和N-去甲基舍曲林的浓度分别为16、6、100、20、32、8、16、100、36、6μg/mL。

S3：准确吸取一定体积的上述标准品中间工作液，使用50vol％的甲醇水溶液作为稀释剂，分别配制成6个梯度的混合标准品工作溶液(其中包含上述5种精神药物及其5种相应代谢物)，在6个梯度的混合标准品工作溶液中，自梯度1至梯度6的混合标准品工作溶液的奥氮平的浓度分别为32，64，160，320，800，1600ng/mL，自梯度1至梯度6的混合标准品工作溶液的利培酮的浓度分别为12，24，60，120，300，600ng/mL，自梯度1至梯度6的混合标准品工作溶液的阿立哌唑的浓度分别为200，400，1000，2000，5000，10000ng/mL，自梯度1至梯度6的混合标准品工作溶液的艾司西酞普兰的浓度分别为40，80，200，400，1000，2000ng/mL，自梯度1至梯度6的混合标准品工作溶液的舍曲林的浓度分别为32，64，160，320，800，1600ng/mL，自梯度1至梯度6的混合标准品工作溶液的N-去甲奥氮平的浓度分别为16，32，80，160，400，800ng/mL，自梯度1至梯度6的混合标准品工作溶液的9-羟基利培酮的浓度分别为32，64，160，320，800，1600ng/mL，自梯度1至梯度6的混合标准品工作溶液的脱氢阿立哌唑的浓度分别为200，400，1000，2000，5000，10000ng/mL，自梯度1至梯度6的混合标准品工作溶液的N-去甲西酞普兰的浓度分别为12，24，60，120，300，600ng/mL，自梯度1至梯度6的混合标准品工作溶液的N-去甲基舍曲林的浓度分别为72，144，360，720，1800，3600ng/mL。该混合标准品工作溶液按浓度分为6个梯度(如表1)，每个梯度的溶液分别置于不同容器中。将上述各个标准工作液分装于30mL棕色瓶中，于-20℃储存备用。

表1：混合标准工作液的6个浓度梯度

上述每种母药及其代谢产物在样本中的含量均不同，上述梯度1-6的设置方式能够保证大部分临床样本浓度都能在线性之内。

(三)质控工作液(即：质控溶液、质控液)的配制：

准确称取一定质量的上述5种精神药物和主要代谢产物的标准品，用稀释液(优选为50vol％的甲醇水溶液)逐级稀释，配制成高、中、低3个浓度梯度的质控溶液(每个梯度的质控溶液中均包含上述5种精神药物和5种相应的代谢产物)。

从低到高浓度梯度的3种质控溶液中，奥氮平的浓度分别为80，400，1200ng/mL，利培酮的浓度分别为30，150，450ng/mL，阿立哌唑的浓度分别为500，2500，7500ng/mL，艾司西酞普兰的浓度分别为100，500，1500ng/mL，舍曲林的浓度分别为160，800，2400ng/mL，N-去甲奥氮平的浓度分别为40，200，600ng/mL，9-羟基利培酮的浓度分别为80，400，1200ng/mL，脱氢阿立哌唑的浓度分别为500，2500，7500ng/mL，N-去甲西酞普兰的浓度分别为30，150，450ng/mL，N-去甲基舍曲林的浓度分别为180，900，2700ng/mL。该质控溶液按浓度分为3个梯度，如表2，每个梯度的溶液分别置于不同容器中。将上述各个质控工作液分装于1.5mL棕色小瓶中，于-20℃储存备用。

表2：混合工作液的低、中、高三个梯度

步骤二、高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测：

本步骤采用的仪器为：Sciex 4500MD三重四级杆质谱仪(美国，Sciex公司)，岛津高效液相色谱系统(日本，Shimadzu Scientific公司)。

上述HPLC-MS/MS的条件为：

A、色谱条件：色谱柱：Phenomenex Phenyl-Hexyl柱(50×4.6mm，2.6m)；

柱温：50℃；

流动相A：含0.1％的甲酸的HPLC级水；流动相B:含0.1％甲酸的乙腈；采用梯度洗脱，洗脱条件为0-3min，7％-80％；B相；3-4min，80％；B相；4.1-5min，7％B相；

流速：0.6mL/min；

进样体积：2μL。

上述色谱条件适用于检测上述5种母药及其主要代谢产物，能够保证色谱峰分离效果好，且在适宜时间出峰。

B、质谱条件：离子源：电喷雾离子源；

扫描模式：MRM；

上述质谱参数能够保证检测中信号的强度。

第二方面，本发明提供第一方面所述的5种精神药物及其主要代谢产物的HPLC-MS/MS检测方法所采用的试剂盒。

该试剂盒包括：上述6个不同浓度梯度的混合标准品工作液，上述高、中、低3个浓度梯度质控溶液，上述混合内标溶液。其中，每个浓度梯度的混合标准品工作液的体积优选相同，每个高、中、低浓度梯度质控溶液的体积优选相同，某一浓度梯度的混合标准品工作液、某一浓度梯度的质控溶液与混合内标溶液的体积比优选为4：5：600，例如：每个浓度梯度的混合标准溶液200μL、每个浓度梯度的高、中、低质控溶液250μL、混合内标溶液30mL。

下面结合实例对本发明作进一步的说明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。对外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

本实施例为检测血液中5种精神药物及其主要代谢产物的方法，包括以下步骤：

1、血液样品预处理：

精密移取血浆或血清样品100μL于1.5mL EP管中，再加入300μL内标工作液，涡旋混匀1min。于4℃，14000rpm离心10min，取100-200μL上清液到进样管中，获得待测样本。

2、混合标准品工作液的配置：

(1)分别准确称量适量的奥氮平、利培酮、阿立哌唑、艾司西酞普兰、舍曲林、N-去甲奥氮平、9-羟基利培酮、脱氢阿立哌唑、N-去甲西酞普兰和N-去甲基舍曲林，用甲醇溶液分别配置成质量浓度为1mg/mL的标准品储备液溶液。

(2)准确移取适量的标准品储备液，分别配制成标准品中间工作液，在中间工作液中，奥氮平、利培酮、阿立哌唑、艾司西酞普兰、舍曲林、N-去甲奥氮平、9-羟基利培酮、脱氢阿立哌唑、N-去甲西酞普兰和N-去甲基舍曲林的浓度分别为16、6、100、20、32、8、16、100、36、6μg/mL。

(3)准确吸取一定体积的标准品中间工作液，配制成6个浓度的混合标准品工作溶液，在混合标准品工作溶液中，奥氮平的浓度为32，64，160，320，800，1600ng/mL，利培酮的浓度为12，24，60，120，300，600ng/mL，阿立哌唑的浓度为200，400，1000，2000，5000，10000ng/mL，艾司西酞普兰的浓度为40，80，200，400，1000，2000ng/ml，舍曲林的浓度为32，64，160，320，800，1600ng/mL，N-去甲奥氮平的浓度为16，32，80，160，400，800ng/mL，9-羟基利培酮的浓度为32，64，160，320，800，1600ng/mL，脱氢阿立哌唑的浓度为200，400，1000，2000，5000，10000ng/mL，N-去甲西酞普兰的浓度为12，24，60，120，300，600ng/mL，N-去甲基舍曲林的浓度为72，144，360，720，1800，3600ng/mL；标准工作液分装于1.5mL棕色小瓶中，-20℃备用。

3、内标工作液的配制方法：

(1)分别准确称量适量的奥氮平-d8、利培酮-d4、阿立哌唑-d8、艾司西酞普兰-d6、舍曲林-d3，用甲醇溶液分别配置成质量浓度为1mg/mL的内标物储备液溶液。

(2)准确移取适量的内标储备液，用甲醇溶液分别稀释成质量浓度为10μg/mL的内标中间工作液。

(3)分别精密移取适量的上述内标中间工作液，用甲醇：乙腈配制混合内标溶液，在混合内标溶液中，奥氮平-d8、利培酮-d4、阿立哌唑-d8、艾司西酞普兰-d6、舍曲林-d3的浓度分别为15,10,50,10,60ng/mL；内标工作液分装于30mL棕色瓶中，-20℃备用。

4、质控工作液的配制方法：

准确称取一定质量的上述5种精神药物和主要代谢产物的标准品，用50％的甲醇水溶液逐级稀释，配制成高、中、低3个浓度的质控溶液。其中，奥氮平的浓度为80，400，1200ng/mL，利培酮的浓度为30，150，450ng/mL，阿立哌唑的浓度为500，2500，7500ng/mL，艾司西酞普兰的浓度为100，500，1500ng/mL，舍曲林的浓度为160，800，2400ng/mL，N-去甲奥氮平的浓度为40，200，600ng/mL，9-羟基利培酮的浓度为80，400，1200ng/mL，脱氢阿立哌唑的浓度为500，2500，7500ng/mL，N-去甲西酞普兰的浓度为30，150，450ng/mL，N-去甲基舍曲林的浓度为180，900，2700ng/mL。将上述各个质控工作液分装于1.5mL棕色小瓶中，于-20℃储存备用。

5、HPLC-MS/MS检测：

色谱条件：流动相A为含0.1％甲酸水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱程序为0-3min，7％-80％的B相梯度洗脱；3-4min，80％的B相等度洗脱；4.1-5min，7％的B相等度洗脱。色谱柱为phenomenex Phenyl-Hexyl柱(50×4.6mm，2.6μm)，柱温为50℃，进样体积为2μL，流速为0.6mL/min，总的分析时间为5min。表3为梯度洗脱条件时间表。此流动相梯度可以使所有化合物在色谱柱上保留的同时进行完全分离。其中0-3min随着有机相浓度逐渐增加，可以根据化合物极性不同，将化合物逐一分离，根据时间先后，分别洗脱出N-去甲奥氮平(1.75min)、奥氮平(1.77min)、9-羟基利培酮(2.37min)、利培酮(2.39min)、N-去甲西酞普兰(2.59min)、艾司西酞普兰(2.63min)、脱氢阿立哌唑(2.75min)、阿立哌唑(2.82min)、N-去甲基舍曲林(2.84min)、舍曲林(2.88min)；3-4min为高浓度有机相，可以将样本中残留在色谱柱中的杂质洗脱；4.1-5min为平衡时间，使流动相恢复初始状态，为下一次分析做准备。

表3：梯度洗脱条件时间表

时间(min)	B项比例(％)
		0	7％
3	80％
		4	80％
4.1	7％
		5.	Stop

质谱条件：离子源为ESI源，正离子方式检测，扫描模式为MRM。

各个离子对具体扫描参数如下表2：

表2：10种待测物质与5种内标物质的MRM扫描参数

上述MRM扫描参数特别适用于检测本实施例的5种母药及其代谢产物。

5计算结果

(1)采用Analyst软件采集数据，采用Multiquant对色谱峰进行积分，计算，处理；以待测物和内标峰面积比为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x)，用加权进行曲线回归运算，回归方程为：y＝ax+b。将相应待测物和内标峰面积比代入标准曲线方程，计算血浆样品中各种物质的浓度。

本实施例的10种待测物质的线性范围，回归方程，线性系数，检出限和定量限如表4。

表4：10种待测物质的计算结果

(2)本实验连续检测了3批待测样品，精密度(precision)和准确度(accuracy)数据较好，精密度控制在15％以内，准确度控制在100％±15％以内，所以建立的方法比较稳定。本实验连续3批待测样品，其精密度与准确度的数据如表5。

表5：3批待测样品的精密度和准确度

图1为总色谱图，图2为N-去甲基舍曲林的色谱图，图3为N-去甲奥氮平的色谱图，图4为舍曲林的色谱图，图5为舍曲林-d3同位素内标的色谱图，图6为奥氮平的色谱图，图7为N-去甲西酞普兰的色谱图，图8为奥氮平-d8同位素内标的色谱图，图9为艾司西酞普兰的色谱图，图10为艾司西酞普兰-d6同位素内标的色谱图，图11为利培酮的色谱图，图12为利培酮-d4同位素内标的色谱图，图13为9-羟基利培酮的色谱图，图14为脱氢阿立哌唑的色谱图，图15为阿立哌唑的色谱图，图16为阿立哌唑-d8同位素内标的色谱图。

Claims (6)

1.一种检测血液中5种精神药物及其主要代谢产物的方法，其特征在于，所述方法采用高效液相色谱-质谱检测；所述5种精神药物为：奥氮平、利培酮、阿立哌唑、艾司西酞普兰、舍曲林；

所述奥氮平的主要代谢产物为去甲奥氮平，所述利培酮的主要代谢产物为9-羟基利培酮，所述阿立哌唑的主要代谢产物为脱氢阿立哌唑，所述艾司西酞普兰的主要代谢产物为去甲西酞普兰，所述舍曲林的主要代谢产物为N-去甲基舍曲林；

所述方法包括：工作溶液配制步骤，高效液相色谱-质谱检测步骤；

所述工作溶液包括：待测样品，内标工作液，混合标准品工作液，质控工作液；

所述工作溶液配制步骤中，所述待测样品的配制方法包括：将试验样品与内标工作液按体积比1：(2-4)混匀，离心后取上清，得到待测样品；

高效液相色谱-质谱检测步骤中，色谱条件为：色谱柱：Phenomenex Phenyl-Hexyl柱，50×4.6mm，2.6m；

柱温：50℃；

流动相A：含0.1％的甲酸的HPLC级水；流动相B:含0.1％甲酸的乙腈；采用梯度洗脱，洗脱条件为0-3min，7％-80％流动相B，流动相B浓度逐渐增加；3-4min，80％流动相B；4.1-5min，7％流动相B；

流速：0.6mL/min；

进样体积：2μL；

高效液相色谱-质谱检测步骤中，质谱条件为：

离子源：电喷雾离子源；

扫描模式：正离子多反应监测MRM；

质谱参数：

气帘气35psi，离子化电压5500V，离子化温度500℃，喷雾气50psi，辅助加热气50psi，碰撞气8psi；

所述内标工作液的配制方法包括：先分别将奥氮平-d8、利培酮-d4、阿立哌唑-d8、艾司西酞普兰-d6、舍曲林-d3配制为质量浓度为1mg/mL的内标物储备液溶液；再将所述内标物储备液溶液稀释为质量浓度为1μg/mL的内标中间工作液；再将所述内标中间工作液配制为所述内标工作液；

所述内标工作液中，所述奥氮平-d8的浓度为10-20ng/mL、利培酮-d4的浓度为5-15ng/mL、阿立哌唑-d8的浓度为25-75ng/mL、艾司西酞普兰-d6的浓度为5-15ng/mL、舍曲林-d3的浓度为30-90ng/mL；

5种精神药物及其主要代谢产物与5种内标物质质谱检测过程中MRM扫描参数Q1/Q3如下：

奥氮平：313.2/256.2，去甲奥氮平：299.2/256.2，奥氮平-d8：313.2/256.2；

利培酮；411.3/191.1，9-羟基利培酮：427.3/207.1，利培酮-d4：415.3/195.1；

阿立哌唑：448.2./285.1，脱氢阿立哌唑：446.2/285.1，阿立哌唑-d8：456.2/293.1；

艾司西酞普兰：325.2/262.1，去甲西酞普兰：311.2/262.1，艾司西酞普兰-d6：331.2/262.1；

舍曲林：306.2/159.0，N-去甲基舍曲林：292.2/159.0，舍曲林-d3：309.1/159.0。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，试验样品与内标工作液按体积比为1：3。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述奥氮平-d8的浓度为15ng/mL、利培酮-d4的浓度为10ng/mL、阿立哌唑-d8的浓度为50ng/mL、艾司西酞普兰-d6的浓度为10ng/mL、舍曲林-d3的浓度为60ng/mL。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述工作液的配制步骤中，所述混合标准品工作液的配制方法包括：

先将所述5种精神药物及其主要代谢产物的标准品配置成质量浓度为1mg/mL的标准品储备液溶液；

再将所述标准品储备液溶液分别配制成标准品中间工作液；所述中间工作液中，所述奥氮平、利培酮、阿立哌唑、艾司西酞普兰、舍曲林、N-去甲奥氮平、9-羟基利培酮、脱氢阿立哌唑、N-去甲西酞普兰和N-去甲基舍曲林的浓度分别为16、6、100、20、32、8、16、100、36、6μg/mL；

再使用50vol%的甲醇水溶液作为稀释剂将所述标准品中间工作液分别配制成6个梯度的所述混合标准品工作液；自梯度1至梯度6的混合标准品工作溶液中，奥氮平的浓度为32，64，160，320，800，1600ng/mL，利培酮的浓度为12，24，60，120，300，600ng/mL，阿立哌唑的浓度为200，400，1000，2000，5000，10000ng/mL，艾司西酞普兰的浓度为40，80，200，400，1000，2000ng/mL，舍曲林的浓度为32，64，160，320，800，1600ng/mL，N-去甲奥氮平的浓度为16，32，80，160，400，800ng/mL，9-羟基利培酮的浓度为32，64，160，320，800，1600ng/mL，脱氢阿立哌唑的浓度为200，400，1000，2000，5000，10000ng/mL，N-去甲西酞普兰的浓度为12，24，60，120，300，600ng/mL，N-去甲基舍曲林的浓度为72，144，360，720，1800，3600ng/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述工作溶液配制步骤中，所述质控工作液的配制方法包括：所述5种精神药物及其主要代谢产物的标准品用稀释液配制为高、中、低3个浓度梯度的所述质控工作液；从低到高浓度梯度的3种质控工作液中，所述奥氮平的浓度为80，400，1200ng/mL，利培酮的浓度为30，150，450ng/mL，阿立哌唑的浓度为500，2500，7500ng/mL，艾司西酞普兰的浓度为100，500，1500ng/mL，舍曲林的浓度为160，800，2400ng/mL，N-去甲奥氮平的浓度为40，200，600ng/mL，9-羟基利培酮的浓度为80，400，1200ng/mL，脱氢阿立哌唑的浓度为500，2500，7500ng/mL，N-去甲西酞普兰的浓度为30，150，450ng/mL，N-去甲基舍曲林的浓度为180，900，2700ng/mL。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述试验样品为血浆或血清。

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