CN112578059A - 氟西汀和去甲氟西汀的检测方法 - Google Patents

氟西汀和去甲氟西汀的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了氟西汀及去甲氟西汀的检测方法，包括：制备至少三种浓度具有氟西汀、去甲氟西汀和内标物的标准溶液；利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每种标准溶液，获得第一检测结果；根据第一检测结果、标准溶液中的氟西汀、去甲氟西汀和内标物的浓度，拟合氟西汀的第一标准曲线方程和去甲氟西汀的第二标准曲线方程；对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；向第一上清液内加入内标物和萃取剂，涡旋混匀后进行萃取，得到待测样品；利用液相色谱仪在检测条件下检测待测样品，获得第二检测结果；基于第一标准曲线方程、第二标准曲线方程和第二检测结果，得到待测样品中氟西汀和去甲氟西汀的浓度。本方案能够缩短样品检测时间。

Description

氟西汀和去甲氟西汀的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及氟西汀和去甲氟西汀的检测方法。
背景技术
氟西汀为选择性5-HT再摄取抑制剂，白色或类白色结晶性粉末，易溶于甲醇或乙醇，溶于乙腈、丙酮或氯仿，微溶于乙酸乙酯、二氯甲烷或水。去甲氟西汀又称诺氟西汀，为黄色固体。
目前，检测样品中氟西汀和去甲氟西汀含量通常采用的方法为高效液相色谱法。而现有的高效液相色谱法检测氟西汀和去甲氟西汀通常需要对待测样品进行较复杂的前处理，使用的有机溶剂多，耗费时间较多，同时需要长时间的色谱分离以及清洗再平衡过程从而导致样品检测时间较长。
发明内容
本发明提供了氟西汀和去甲氟西汀的检测方法，能够缩短样品检测时间。
为了解决上述问题，本发明实施例提供了氟西汀和去甲氟西汀的检测方法，包括：
制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有氟西汀、去甲氟西汀和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；
利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中的氟西汀的浓度和内标物的浓度，拟合氟西汀的第一标准曲线方程；根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中的去甲氟西汀的浓度和内标物的浓度，拟合去甲氟西汀的第二标准曲线方程；
对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
向所述第一上清液内加入内标物，顺次加入萃取剂，涡旋混匀，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品；
利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
基于所述第一标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中氟西汀的浓度；基于所述第二标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中去甲氟西汀的浓度。
具体地，为了降低氟西汀、去甲氟西汀的标准曲线方程的计算难度，同时，为了降低标准溶液的制备难度，各种浓度的标准溶液中的内标物的量相同。
优选地，为了更准确地检测出待测样品中氟西汀、去甲氟西汀的浓度，标准溶液和待测样品中的内标物均为环庚米特。
需要说明的是，第一上清液包括血清或血浆，萃取后选择为上层有机相。
具体地，可以通过下述步骤制备标准溶液：
(1)标准工作液的配制
精确称取氟西汀标准品置于容量瓶，用甲醇溶液进行溶解，并定容于容量瓶的标线，得到标准储备液A。
精确称取去甲氟西汀标准品置于容量瓶，用甲醇溶液进行溶解，并定容于容量瓶的标线，得到标准储备液B。
混合标准储备液A和标准储备液B，用含有60-70％甲醇的水溶液作为稀释液进行稀释，得到至少三种不同浓度的含有氟西汀和去甲氟西汀的标准工作液，并于-80℃保存，其中同一标准工作液中氟西汀和去甲氟西汀的浓度相同。
(2)内标工作液的配制
将内标物环庚米特溶于甲醇溶液中，得到标准内标储备液，并于-80℃保存。移取适量标准内标储备液，用稀释液进行稀释得到内标工作液，并于-80℃保存。
(3)标准溶液的标定
移取步骤(1)中的至少三种标准工作液和步骤(2)中的内标工作液以及稀释液，并置于离心管中制成至少三种混合溶液，向上述混合溶液中分别加入萃取剂，并在转速1000-2500rpm下涡旋混匀5-10min后，得到至少三种标准溶液。
为了降低氟西汀、去甲氟西汀和环庚米特的工作溶液的挥发性，所以稀释液为含有60-70％甲醇的水溶液。
优选地，所述检测条件中的液相条件包括：洗脱流动相中的水相包括：含有磷酸二氢钠和磷酸的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；
柱温包括25-40℃；流速包括0.5-1.5mL/min。
针对柱温来说，25-40℃是指25℃至40℃范围内的任意值，比如，25℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃以及40℃。
针对流速来说，0.5-1.5mL/min是指0.5mL/min至1.5mL/min范围内的任意值，比如，0.5mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min、1.3mL/min、1.4mL/min以及1.5mL/min。
具体地，水相中的缓冲盐浓度过大且在对目标物进行检测过程时，可能存在缓冲盐在色谱柱中析出的情况，已析出的缓冲盐会堵塞色谱柱，影响待测样品的测试。因此，洗脱流动相中的水相包括：含有5-20mM磷酸二氢钠和0.01-0.02％磷酸。
针对水相中的磷酸二氢钠来说，5-20mM是指5mM至20mM范围内的任一值，比如，水相中含有5mM、10mM、15mM以及20mM的磷酸二氢钠；针对水相中的磷酸来说，0.01-0.02％是指0.01至0.02％范围内的任一值，比如，水相中含有0.01％、0.013％、0.015％、0.018％以及0.02％的磷酸。
优选地，所述检测条件中的液相条件，包括：
采用双泵双柱检测模式，其中，
所述双泵双柱检测模式包括：主泵、副泵和两个色谱柱；
所述主泵和所述两个色谱柱中的一个色谱柱在对待测样品进行检测时，采用等度洗脱，洗脱流动相中的有机相与水相的体积比包括：40％:60％-45％:55％；
所述副泵用于对待测样品检测后的色谱柱进行清洗时采用梯度洗脱，洗脱流动相中的有机相与水相的体积比包括：
0.00min：95％:5％-100％:0％；
1.00min：95％:5％-100％:0％；
1.01min：40％:60％-45％:55％；
4.00min：40％:60％-45％:55％。
针对主泵采用等度洗脱时洗脱流动相中的有机相与水相的体积比来说，40％:60％-45％:55％是指40％:60％至45％:55％范围内的任一比例，比如，40％:60％、41％:59％、42％:58％、43％:57％、44％:56％以及45％:55％。
比如，有机相的体积占洗脱流动相体积的42％，水相的体积占洗脱流动相体积的58％；有机相的体积占洗脱流动相体积的44％，水相的体积占洗脱流动相体积的56％。
具体地，在主泵采用等度洗脱进行检测时，当有机相在洗脱流动相中体积占比小于40％时，氟西汀的色谱峰受杂质干扰在峰尾处出现驼峰，氟西汀、去甲氟西汀和内标物的保留时间增大，会增大待测样品的检测时间；当有机相在洗脱流动相中体积占比大于45％时，去甲氟西汀的色谱峰受杂质干扰在峰前出现驼峰，影响待测样品的检测准确性。因此，洗脱流动相中的有机相与水相的体积比为40％:60％-45％:55％。
针对副泵采用梯度洗脱时洗脱流动相中的有机相与水相在0.00min和1.00min的体积比，95％:5％-100％:0％是指95％:5％至100％:0％范围内的任一比例，比如，95％:5％、96％:4％、97％:3％、98％:2％、99％:1％以及100％:0％。
针对副泵采用梯度洗脱时洗脱流动相中的有机相与水相在1.01min和4.00min的体积比，40％:60％-45％:55％是指40％:60％至45％:55％范围内的任一比例，比如，40％:60％、41％:59％、42％:58％、43％:57％、44％:56％以及45％:55％。
具体地，在副泵采用梯度洗脱进行清洗时，为了保证去除残留的目标物杂质，在0.00min和1.00min时选择洗脱流动相中有机相与水相的体积比包括：95％:5％-100％:0％；为了平衡色谱柱，在1.01min和4.00min时选择洗脱流动相中有机相与水相的体积比包括：40％:60％-45％:55％。
例如，在副泵采用梯度洗脱进行清洗时，当1.00min有机相与水相的比例为100％:0％，1.01min有机相与水相的比例为42％:58％时，那么在1.00min至1.01min时间段内，有机相由占比100％逐渐降低至42％，水相则由占比0％逐渐增加至58％。
由于有机相与水相在洗脱流动相中占比的总和为1，因此，当有机相在洗脱流动相中的占比增加，水相在洗脱流动相中的占比则相应降低。
优选地，所述检测条件中的荧光检测条件，包括：
激发波长：215-235nm；发射波长：270-290nm。
针对荧光检测条件中的激发波长来说，215-235nm是指215nm至235nm范围内的任意值，比如，激发波长可以为215nm、220nm、225nm、230nm以及235nm。
针对荧光检测条件中的发射波长来说，270-290nm是指270nm至290nm范围内的任意值，比如，激发波长可以为270nm、275nm、280nm、285nm以及290nm。
具体地，当荧光检测条件中的激发波长低于215nm、发射波长低于270nm时，氟西汀、去甲氟西汀的响应值下降，会影响对待检测样品的检测灵敏度；同样在荧光检测条件中的激发波长大于235nm、发射波长大于290nm时，氟西汀、去甲氟西汀的响应值也会下降，影响对待测样品的检测灵敏度。因此，激发波长：215-235nm；发射波长：270-290nm。
优选地，所述第一标准曲线方程的两个变量分别为：氟西汀的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及氟西汀的浓度与内标物的浓度的比值；
所述第二标准曲线方程的两个变量分别为：去甲氟西汀的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及去甲氟西汀的浓度与内标物的浓度的比值。
可以理解的是，当第一检测结果中的氟西汀的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为第一标准曲线方程的纵坐标Y1(即因变量)时，标准溶液中的氟西汀的浓度与所述标准溶液中的内标物的浓度的比值作为第一标准曲线方程的横坐标X1(即自变量)。当第一检测结果中的去甲氟西汀的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为第二标准曲线方程的纵坐标Y2(即因变量)时，标准溶液中的去甲氟西汀的浓度与所述标准溶液中的内标物的浓度的比值作为第二标准曲线方程的横坐标X2(即自变量)。
若第一检测结果中的氟西汀的色谱峰面积与第一检测结果中的内标物的色谱峰面积的比值作为第一标准曲线方程的横坐标X1(即自变量)时，标准溶液中氟西汀的浓度与标准溶液中的内标物的浓度的比值作为第一标准曲线方程的纵坐标Y1(即因变量)。若第一检测结果中的去甲氟西汀的色谱峰面积与第一检测结果中的内标物的色谱峰面积的比值作为第二标准曲线方程的横坐标X2(即自变量)时，标准溶液中去甲氟西汀的浓度与标准溶液中的内标物的浓度的比值作为第二标准曲线方程的纵坐标Y2(即因变量)。
优选地，为了更好地去除杂质，对目标物进行提纯，所述萃取剂包括：甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和正己烷中的至少一种。
优选地，为了更好地去除杂质，所述萃取剂与所述第一上清液的体积比包括5:1-20:1。
针对萃取剂与第一上清液的体积比来说，5:1-20:1是指5:1至20：1范围内的任意比值，比如，5:1、8:1、10:1、12:1、15:1、18:1以及20:1。
比如，第一上清液的体积为100μL时，萃取剂可以是500μL至2000μL范围内的任一体积。
优选地，所述向所述第一上清液内加入内标物，顺次加入萃取剂，涡旋混匀，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品，包括：
向所述第一上清液内加入内标物，顺次加入萃取剂，在1000-2500rpm的转速下涡旋混合5-10min，并在10000-14000rpm的转速下高速离心5-10min，移取离心后的第二上清液；
利用氮气将移取的所述第二上清液吹干，顺次加入复溶液，在1000-2500rpm的转速下涡旋混合0.5-1.5min，并在10000-14000rpm的转速高速下离心5-10min，取第三上清液作为待测样品。
具体地，在向第一上清液内加入内标物后，为了使得两者混合更均匀，可以涡旋混合，再向混合后的第一上清液内加入萃取剂，并涡旋混匀，进行萃取，以通过萃取剂对混合后的第一上清液进行提纯，然后进行离心，取离心后的第二上清液，实现将杂质和目标物分离的目的。由于利用萃取剂萃取后目标物的含量较低，因此为了便于检测，可利用氮气进行吹干，以对第二上清液进行浓缩，浓缩后再加入复溶液，并进行涡旋以使复溶液中的目标物分布均匀。
需要说明的是，萃取后选择为上层有机相。
针对涡旋的转速来说，1000-2500rpm是指1000rpm至2500rpm范围内的任意值，比如，1000rpm、1200rpm、1400rpm、1600rpm、1800rpm、2000rpm、2200rpm、2400rpm以及2500rpm。
针对加入萃取剂之后的涡旋时间来说，5-10min是指，5min至10min范围内的任一时间，比如，5min、6min、7min、8min、9min以及10min。
针对离心的转速来说，10000-14000rpm是指10000rpm至14000rpm范围内的任意值，比如，10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm以及14000rpm。
针对离心的时间来说，5-10min是指，5min至10min范围内的任一时间，比如，5min、6min、7min、8min、9min以及10min。
针对加入复溶液之后的涡旋时间来说，0.5-1.5min是指，0.5min至1.5min范围内的任一时间，比如，0.5min、0.8min、1.0min、1.2min、1.4min以及1.5min。
优选地，所述复溶液包括含有60-70％甲醇的水溶液。
针对复溶液来说，60-70％是指60％至70％范围内的任一值，比如，复溶液为含有60％、62％、64％、66％、68％以及70％的甲醇的水溶液。
本发明提供了氟西汀和去甲氟西汀的检测方法，通过液相色谱仪对含有不同浓度的氟西汀和去甲氟西汀的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，然后基于各种浓度标准溶液中的氟西汀的浓度、去甲氟西汀的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合分别得到对应氟西汀和去甲氟西汀的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理，即可得到离心后的血清或血浆，顺次加入内标物和萃取剂进行萃取，进行提纯，降低杂质对待测样品的干扰，得到能够进行检测的待测样品。利用液相色谱仪在与标准溶液相同的检测条件下对待测样品进行检测，得到第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中氟西汀和去甲氟西汀的含量。而且无需较复杂的前处理过程，耗费时间较少，从而可以实现缩短样品检测时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的氟西汀和去甲氟西汀的检测方法的流程图；
图2是本发明一实施例提供的标准溶液中的氟西汀和去甲氟西汀的色谱图；
图3是本发明一实施例提供的待测样品中的氟西汀和去甲氟西汀的色谱图；
图4是本发明一实施例提供的流速0.5mL/min、柱温35℃下待测样品的色谱图；
图5是本发明一实施例提供的流速1.0mL/min、柱温35℃下待测样品的色谱图；
图6是本发明一实施例提供的流速1.5mL/min、柱温35℃下待测样品的色谱图；
图7是本发明一实施例提供的流速1.0mL/min、柱温25℃下待测样品的色谱图；
图8是本发明一实施例提供的流速1.0mL/min、柱温45℃下待测样品的色谱图；
图9是本发明一实施例提供的萃取剂为乙酸乙酯时的色谱图；
图10是本发明一实施例提供的萃取剂为正己烷时的色谱图；
图11是本发明一实施例提供的洗脱流动相中有机相与水相的体积比为37％:63％时的色谱图；
图12是本发明一实施例提供的洗脱流动相中有机相与水相的体积比为47％:53％时的色谱图；
图13是本发明一实施例提供的色谱柱为Kinetex F5的色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前，检测待测样品中氟西汀和去甲氟西汀通常采用高效液相色谱法，待测样品采用多塞平作为内标物，但是多塞平与待测样品中的目标物联合使用可能会出现相互作用，导致定量不准，影响待测样品检测的准确性；
并且待测样品的前处理通常使用含有2％异丙醇的正庚烷提取液5mL进行提取，而提取液是由多组分配置的，这样就增加了萃取剂的配置难度；而且萃取剂的用量较多，这会增加目标物的检测成本，同时导致前处理过程所需时间较长，并且现有对比分析方法的分析时间约为15min，这就增加了待测样品中氟西汀和去甲氟西汀整体的检测时长；
并且，待测样品采用紫外检测器，检测灵敏度较低。
基于上述问题，本发明实施例提供了氟西汀和去甲氟西汀的检测方法，如图1所示，包括：
步骤101：制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有氟西汀、去甲氟西汀和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；
步骤102：利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
步骤103：根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中的氟西汀的浓度和内标物的浓度，拟合氟西汀的第一标准曲线方程；根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中的去甲氟西汀的浓度和内标物的浓度，拟合去甲氟西汀的第二标准曲线方程；
步骤104：对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
步骤105：向所述第一上清液内加入内标物，顺次加入萃取剂，涡旋混匀，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品；
步骤106：利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
步骤107：基于所述第一标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中氟西汀的浓度；基于所述第二标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中去甲氟西汀的浓度。
在本发明实施例中，通过液相色谱仪对含有不同浓度的氟西汀和去甲氟西汀的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，然后基于各种浓度标准溶液中的氟西汀的浓度、去甲氟西汀的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合分别得到对应氟西汀和去甲氟西汀的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理，即可得到离心后的血清或血浆，顺次加入内标物和萃取剂进行萃取，进行提纯，降低杂质对待测样品的干扰，得到能够进行检测的待测样品。利用液相色谱仪在与标准溶液相同的检测条件下对待测样品进行检测，得到第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中氟西汀和去甲氟西汀的含量。而且无需较复杂的前处理过程，耗费时间较少，从而可以实现缩短样品检测时间。
下面通过几个实施例对氟西汀和去甲氟西汀的检测方法进行详细说明。
实施例1：制备系列浓度的标准溶液
(a)标准工作液的配制
精确称取氟西汀标准品0.5mg置于5mL容量瓶，用甲醇溶液进行溶解，并定容于容量瓶的标线，得到100μg/mL的标准储备液A。
精确称取去甲氟西汀标准品0.5mg置于5mL容量瓶，用甲醇溶液进行溶解，并定容于容量瓶的标线，得到100μg/mL的标准储备液B。
混合标准储备液A和标准储备液B，用含有70％甲醇的水溶液作为稀释液进行稀释，得到不同浓度的含有氟西汀和去甲氟西汀的系列标准工作液，并于-80℃保存；
其中，同一标准工作液中的氟西汀的浓度和去甲氟西汀的浓度均相同。比如，不同浓度的系列标准工作液中的氟西汀的浓度为0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1.6μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL、5.0μg/mL；不同浓度的系列标准工作液中的去甲氟西汀的浓度为0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1.6μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL、5.0μg/mL。比如，标准工作液1中氟西汀的浓度和去甲氟西汀的浓度均为0.2μg/mL；标准工作液2中氟西汀的浓度和去甲氟西汀的浓度均为0.4μg/mL。
(b)内标工作液的配制：
精确称取环庚米特标准品0.5mg置于5mL容量瓶，用甲醇溶液进行溶解，并定容于容量瓶的标线，得到100μg/mL的标准内标储备液。移取适量标准内标储备液，用稀释液进行稀释得到3μg/mL的内标工作液，并于-80℃保存。
(c)标准溶液的标定
分别移取上述步骤(a)中七种不同浓度的标准工作液10μL分别置于1.5mL离心管中，向离心管中分别加入步骤(b)中的内标工作液10μL和90μL空白样本，混合制成七种不同浓度的混合溶液，向上述混合溶液中分别加入萃取剂，并在转速2500rpm下涡旋混匀10min后，得到七种不同浓度的标准溶液。
需要说明的是，可按照处理待测样品时的前处理操作，对不同浓度的标准溶液进行前处理，即，标准溶液中的涡旋转速时间、萃取剂、加入萃取剂后的涡旋时间和转速、复溶液、加入复溶液后的涡旋时间和转速、离心转速和时间均与待测样品的前处理保持一致，以消除系统误差，提高检测结果的准确度。
需要说明的是，空白样本为未含有氟西汀和去甲氟西汀的血清或血浆。
实施例2：拟合标准曲线方程
利用液相色谱仪对实施例1中七种浓度的标准溶液分别进行检测，得到七种不同浓度的氟西汀和去甲氟西汀的标准溶液的色谱图。
从上述氟西汀和去甲氟西汀的标准溶液色谱图中分别得到七种标准溶液中氟西汀的色谱峰面积、去甲氟西汀的色谱峰面积和内标物的色谱峰面积，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的氟西汀的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为第一标准曲线方程的纵坐标y1，以上述标准溶液中的氟西汀的浓度与内标物的浓度的比值作为第一标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的七种不同浓度的数据进行线性归回，拟合得到第一标准曲线方程y1＝a*x1+b，其中，a和b为权重系数，a为第一标准曲线方程的斜率，b为第一标准曲线方程的截距；
以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的去甲氟西汀的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为第二标准曲线方程的纵坐标y2，以上述标准溶液中的去甲氟西汀的浓度与内标物的浓度的比值作为第二标准曲线方程的横坐标x2，将以上检测所得的七种不同浓度的数据进行线性归回，拟合得到第二标准曲线方程y2＝c*x2+d，其中，c和d为权重系数，c为第二标准曲线方程的斜率，d为第二标准曲线方程的截距。
上述检测条件包括：
色谱柱：Poroshell 120，SB-C18，(色谱柱内径4.6mm×柱长100mm、填料粒径2.7μm)。
洗脱流动相中的水相包括含有10mM磷酸二氢钠和0.015％磷酸的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；
采用双泵双柱检测模式，主泵和两个色谱柱中的一个色谱柱在对待测样品进行检测时，采用等度洗脱，洗脱流动相中的有机相与水相的体积比为42％:58％；副泵用于对待测样品检测后的色谱柱进行清洗时采用梯度洗脱，洗脱流动相中有机相与水相的体积比包括：0.00min：100％:0％；1.00min：100％:0％；1.01min：42％:58％；4.00min：42％:58％。
柱温为35℃，流速为1.0mL/min，待测样品的进样量为15μL，分析时间为4min。
检测条件中的荧光检测条件：
激发波长：225nm；发射波长：280nm。
本实施例中采用的液相色谱仪包括主泵、副泵、自动进样器、柱温箱、检测器和两个相同型号的色谱柱，其中，柱温箱中包括两个切换阀：左阀和右阀，主泵用于对待测样品进行检测，副泵用于在待测样品检测后清洗色谱柱。主泵与自动进样器相连接，左阀连接自动进样器与副泵，右阀连接检测器和废液管，两个色谱柱接在左阀和右阀之间，通过左阀和右阀的协同工作可以实现交替地选择一个色谱柱与自动进样器和检测器相连接，另一个色谱柱与副泵和废液管相连接。如此当采用双泵双柱检测模式时，可以交替实现利用两个色谱柱进行待测样品的检测，即主泵对一个色谱柱进行分析检测时，副泵对另一个色谱柱进行清洗，既保证了对色谱柱进行充分的清洗，去除色谱柱内残留的弱极性杂质，又能有效缩短待测样品整体的分析检测时间。
具体地，针对两个相同型号的色谱柱：色谱柱1和色谱柱2，当色谱柱1与自动进样器和检测器连接，色谱柱2与副泵和废液管相连接时，由主泵对色谱柱1中的待测样品进行检测，由副泵对已完成待测样品检测的色谱柱2进行清洗；在色谱柱1完成待测样品的检测，色谱柱2完成清洗后，由色谱柱2与自动进样器和检测器连接，色谱柱1与副泵和废液管相连接，再由主泵对色谱柱2中的待测样品进行检测，由副泵对已完成待测样品检测的色谱柱1进行清洗，从而交替实现利用两个色谱柱进行待测样品的检测。
实施例3：待测样品的前处理
3.1取待处理样品2mL，在离心速度为3500rpm的转速下离心10min，取上清液血清或血浆为第一上清液，将上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。
3.2用移液枪移取10μL实施例1步骤(b)的内标工作液于1.5mL的离心管中，然后加入100μL步骤3.1中的第一上清液，顺次加入1000μL甲基叔丁基醚萃取剂，在2500rpm的转速下涡旋混合10min，并在14000rpm的转速下高速离心5min，移取离心后的第二上清液(上层有机相)900μL，利用氮气将移取的第二上清液吹干，顺次加入100μL含有70％甲醇的水溶液作为复溶液，在2500rpm的转速下涡旋混合1.0min，并在14000rpm的转速下高速离心5min，取第三上清液作为待测样品。
实施例4：待测样品的检测
利用液相色谱仪采用实施例2中的检测条件对待测样品进行检测，得到待测样品的色谱图。
从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中氟西汀的色谱峰面积、去甲氟西汀的色谱峰面积和内标物的色谱峰面积，将待测样品中的氟西汀的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为纵坐标y1'，代入到实施例2的第一标准曲线方程为y1＝a*x1+b中，由于权重系数a和b已知，所以可以得出待测样品中的氟西汀的浓度与内标物的浓度的比值，由于待测样品中的内标物的浓度已知，由此可以计算得到待测样品中的氟西汀的浓度。
从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中氟西汀的色谱峰面积、去甲氟西汀的色谱峰面积和内标物的色谱峰面积，将待测样品中的去甲氟西汀的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为纵坐标y2'，代入到实施例2的第二标准曲线方程为y2＝c*x2+d中，由于权重系数c和d已知，所以可以得出待测样品中的去甲氟西汀的浓度与内标物的浓度的比值，由于待测样品中的内标物的浓度已知，由此可以计算得到待测样品中的去甲氟西汀的浓度。
实施例5：针对样品前处理的说明
本申请例1：
(1)10μL内标工作液+100μL血清或血浆，得到混合液；
(2)加入1000μL甲基叔丁基醚混合10min进行萃取，离心，得到第二上清液；
(3)向第二上清液中加入100μL含有70％甲醇的水溶液复溶，涡旋混合并离心，得第三上清液为待测样品。
对比例1：(高效液相色谱法检测抑郁症患者血清中氟西汀的浓度[J].中国药学杂志,2002,037(011):855-857.)
(1)10μL内标工作液+500μL血清+500μLNaOH溶液(1M)，混合得到混合液；
(2)加入5000μL提取液(含有2％异丙醇的正庚烷)进行提取，离心，得到上清液；
(3)取上清液，再加入100μL H2SO4(0.05M)混合，移取下层溶液为待测样品。
从本申请例1和对比例1可以看出，本发明的样品使用量仅为对比例样本使用量的20％，更加符合科学伦理道德标准，使得待测人员依从性更高；采用血液样本先经离心处理，加甲基叔丁基醚进行萃取，再加入复溶液进行复溶的前处理方式，相较于对比例1中加NaOH溶液和自行配置的萃取剂，本申请节省了萃取剂的配置时间，减少了试剂配制过程的误差，同时本申请使用溶剂的用量更少，且避免使用氢氧化钠溶液和硫酸，对环境更友好。
实施例6：针对检测条件的说明
本申请例2：
(1)色谱柱：Poroshell 120，SB-C18；
(2)采用双泵双柱检测模式，对待测样品进行检测时采用等度洗脱，其中洗脱流动相中的水相包括：含有10mM磷酸二氢钠和0.015％磷酸的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；在待测样品检测后清洗色谱柱时采用梯度洗脱；
(3)流速：1.0mL/min，进样量15μL，分析时间4min。
对比例2：(高效液相色谱法检测抑郁症患者血清中氟西汀的浓度[J].中国药学杂志,2002,037(011):855-857.)
(1)色谱柱：Narva Pak C18色谱柱；
(2)流动相甲醇-磷酸氢二胺缓冲液(体积比为70％:30％)；
(3)流速：0.6mL/min，进样量50μL，分析时间15min。
从图3、本申请例2和对比例2可以看出，本申请的样本分析时间为4min，相较于对比例2的分析时间短。而且本申请采用双泵双柱检测模式，在对多个待测样品进行检测时，两个色谱柱交替对待测样品进行检测，节约了色谱柱在一次检测完成后的清洗等待时间，从整体上极大地缩短了待测样品的检测时间。而且所需进样量为对比例2的30％，综上可见本申请例2极大地减少了分析时间成本，更有利于大批量待测样品的检测。
本发明在简化前处理方式，节省分析时间的前提下，得到的测定结果达到了相同甚至更好的结果。
实施例7：氟西汀和去甲氟西汀的检测方法的线性关系和定量限
分别移取步骤(a)中七种不同浓度的标准工作液10μL，分别向移取的每种浓度的标准工作液中加入10μL步骤(b)中的内标工作液和90μL空白样本，混匀后利用液相色谱仪按照实施例2中的检测条件进行检测，其中，本实施例中按照浓度由低至高的顺序进行检测，避免检测时浓度高的混合液对浓度低的混合液产生影响。然后以定量色谱峰面积-浓度作图，得到对应氟西汀的第一标准曲线以及对应去甲氟西汀的第二标准曲线，结果表明氟西汀和去甲氟西汀的线性范围和定量限分别如下：
氟西汀：
(1)检测限(LOD)：5.7ng/mL，信噪比(S/N)为3；
(2)定量限(LOQ)：19.2ng/mL，信噪比(S/N)为10；
(3)线性范围：氟西汀在20ng/mL到500ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.995。
去甲氟西汀：
(1)检测限(LOD)：5.5ng/mL，信噪比(S/N)为3；
(2)定量限(LOQ)：18.5ng/mL，信噪比(S/N)为10；
(3)线性范围：去甲氟西汀在20ng/mL到500ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.995。
由本实施例可知，氟西汀和去甲氟西汀的检测方法灵敏度较高，对氟西汀和去甲氟西汀含量低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。
实施例8：氟西汀和去甲氟西汀的检测方法的回收率和精密度
移取步骤(a)中的标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按实施例2中的检测条件进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度如下述表1所示：
表1
Figure BDA0002833707310000161
综合上述验证试验，本实施例的回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，利用本发明提供的方法检测待测样品中的氟西汀和去甲氟西汀的浓度，重现性良好，且加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
图2为实施例2中的标准溶液中的氟西汀和去甲氟西汀的色谱图，图3为实施例3中的待测样品中的氟西汀和去甲氟西汀的色谱图，其中，图2和图3中的氟西汀、去甲氟西汀和内标物的保留时间一致。图2和图3中的横坐标的单位长度均为0.1，纵坐标的单位长度均为0.2×10。
由图2和图3可知，本实施例方法中的氟西汀的保留时间约为2.8min，去甲氟西汀的保留时间约为2.5min，内标物的保留时间约为3.6min，分析时间短、目标物识别准确、干扰小，特异性强。
实施例9：针对柱温和流速的说明
图4至图8分别对应的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，区别为流速和柱温不同。
图4为流速0.5mL/min、柱温35℃时的色谱图，图4的横坐标的单位长度为0.2，纵坐标的单位长度为0.05×102；图4中保留时间约为6.8min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为5.2min的色谱峰为氟西汀的色谱峰，保留时间约为4.6min的色谱峰为去甲氟西汀的色谱峰；
图5为流速1.0mL/min、柱温35℃时的色谱图，图5的横坐标的单位长度为0.1，纵坐标的单位长度为0.05×102；图5中保留时间约为3.6min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为2.8min的色谱峰为氟西汀的色谱峰，保留时间约为2.5min的色谱峰为去甲氟西汀的色谱峰；
图6为流速1.5mL/min、柱温35℃时的色谱图，图6的横坐标的单位长度为0.05，纵坐标的单位长度为0.05×102；图6中保留时间约为2.45min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为1.9min的色谱峰为氟西汀的色谱峰，保留时间约为1.7min的色谱峰为去甲氟西汀的色谱峰；
图7为流速1.0mL/min、柱温25℃时的色谱图，图7的横坐标的单位长度为0.1，纵坐标的单位长度为0.2×10；图7中保留时间约为3.8min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为2.9min的色谱峰为氟西汀的色谱峰，保留时间约为2.55min的色谱峰为去甲氟西汀的色谱峰；
图8为流速1.0mL/min、柱温45℃时的色谱图，图8的横坐标的单位长度为0.1，纵坐标的单位长度为0.2×10；图8中保留时间约为3.35min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为2.7min的色谱峰为氟西汀的色谱峰，保留时间约为2.4min的色谱峰为去甲氟西汀的色谱峰。
通过图4至图8可见，当流速低于0.5mL/min时，氟西汀、去甲氟西汀和内标物的保留时间均大于4min，这样会使得待测样品的整体检测时间过长，影响待测样品检测的时效性；而流速高于1.5mL/min时会使柱压升高，超过色谱柱所能承受的压力，对色谱柱造成不可逆的损伤，同时耗费的溶剂较多，成本较高。
流速为1.0mL/min，柱温在25℃至40℃范围内时，柱温对氟西汀和去甲氟西汀的保留时间影响较小，但是柱温较低会导致内标物的保留时间增加，从而增加了待测样品的检测时间，而在流速为1.0mL/min，柱温为45℃时，在内标物的色谱峰之后出现了杂质干扰峰，影响待测样品的检测，而且柱温过高还会对色谱柱中的填料造成不可逆的损伤，影响色谱柱的寿命。
综上，本发明对待测样品检测的流速在0.5-1.5mL/min区间，柱温在25-40℃区间，可以使得氟西汀、去甲氟西汀和内标物的保留时间均在4.0min之内，缩短待测样品的整体检测时间，提高样品检测的时效性。
实施例10：针对萃取剂的说明
图9和图10对应的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，区别为萃取剂的不同。其中，图9和图10的横坐标的单位长度均为0.1，纵坐标的单位长度均为0.2×10。图9和图10中保留时间约为3.6min的色谱峰均为内标物的色谱峰，保留时间约为2.85min的色谱峰均为氟西汀的色谱峰，保留时间约为2.5min的色谱峰均为去甲氟西汀的色谱峰。
图9是萃取剂为乙酸乙酯时的色谱图；
图10是萃取剂为正己烷时的色谱图。
通过图3、图9和图10可知，由甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和正己烷中的至少一种作为对第一上清液进行萃取的萃取剂，得到的待测样品的色谱峰均不是前沿峰、拖尾峰，并且色谱峰的峰宽没有出现过宽的情况，因此甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和正己烷均可以用于本实施例中的萃取剂。
实施例11：针对洗脱流动相的说明
图11和图12分别对应的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，区别为洗脱流动相中有机相与水相的体积比不同。
图11为洗脱流动相中有机相与水相的体积比为37％:63％时的色谱图，图11的横坐标的单位长度为0.1，纵坐标的单位长度为0.1×10，图11中保留时间约为5.1min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为4.6min的色谱峰为氟西汀的色谱峰，保留时间约为4.0min的色谱峰为去甲氟西汀的色谱峰；
图12为洗脱流动相中有机相与水相的体积比为47％:53％时的色谱图，图12的横坐标的单位长度为0.1，纵坐标的单位长度为0.2×10，图12中保留时间约为2.8min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为2.0min的色谱峰为氟西汀的色谱峰，保留时间约为1.85min的色谱峰为去甲氟西汀的色谱峰。
通过图3、图11和图12可见，有机相在洗脱流动相中体积占比小于40％时，氟西汀的色谱峰受杂质干扰在峰尾处出现驼峰，氟西汀、去甲氟西汀和内标物的保留时间增大，导致目标物检测时间过长，影响待测样品的检测时效性；而有机相在洗脱流动相中体积占比大于45％时，去甲氟西汀的色谱峰受杂质干扰在峰前出现驼峰，影响待测样品的检测准确性。
实施例12：针对色谱柱的说明
图13是对应的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，区别为所使用的色谱柱不同。
图13是色谱柱为Kinetex F5的色谱图，其中，色谱柱内径为4.6mm、色谱柱柱长为100mm、填料粒径为2.7μm，图13的横坐标的单位长度为0.1，纵坐标的单位长度为0.2×10，图13中保留时间约为2.35min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为2.5min的色谱峰为氟西汀的色谱峰，保留时间约为2.2min的色谱峰为去甲氟西汀的色谱峰；
通过图13可见，利用Kinetex F5色谱柱对待测样品进行检测得到的目标物的色谱峰未得到良好的分离，影响色谱峰面积测量的准确度，从而直接影响待测样品定量分析的准确度。
需要说明的是，图2至图13的横坐标均为采集时间(min)，纵坐标均为信号强度(mV)，且色谱图中缺失的图形不影响本方案的技术内容。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.氟西汀和去甲氟西汀的检测方法，其特征在于，包括：
制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有氟西汀、去甲氟西汀和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；
利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中的氟西汀的浓度和内标物的浓度，拟合氟西汀的第一标准曲线方程；根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中的去甲氟西汀的浓度和内标物的浓度，拟合去甲氟西汀的第二标准曲线方程；
对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
向所述第一上清液内加入内标物，顺次加入萃取剂，涡旋混匀，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品；
利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
基于所述第一标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中氟西汀的浓度；基于所述第二标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中去甲氟西汀的浓度。
2.根据权利要求1所述的氟西汀和去甲氟西汀的检测方法，其特征在于，
所述检测条件中的液相条件，包括：
洗脱流动相中的水相包括：含有磷酸二氢钠和磷酸的水溶液；
洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；
柱温包括25-40℃；
流速包括0.5-1.5mL/min。
3.根据权利要求1所述的氟西汀和去甲氟西汀的检测方法，其特征在于，
所述检测条件中的液相条件，包括：
采用双泵双柱检测模式，其中，
所述双泵双柱检测模式包括：主泵、副泵和两个色谱柱；
所述主泵和所述两个色谱柱中的一个色谱柱在对待测样品进行检测时，采用等度洗脱，洗脱流动相中的有机相与水相的体积比包括：40％:60％-45％:55％；
所述副泵用于对待测样品检测后的色谱柱进行清洗时采用梯度洗脱，洗脱流动相中的有机相与水相的体积比包括：
0.00min：95％:5％-100％:0％；
1.00min：95％:5％-100％:0％；
1.01min：40％:60％-45％:55％；
4.00min：40％:60％-45％:55％。
4.根据权利要求1所述的氟西汀和去甲氟西汀的检测方法，其特征在于，
所述检测条件中的荧光检测条件，包括：
激发波长：215-235nm；发射波长：270-290nm。
5.根据权利要求1所述的氟西汀和去甲氟西汀的检测方法，其特征在于，
所述第一标准曲线方程的两个变量分别为：氟西汀的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及氟西汀的浓度与内标物的浓度的比值；
所述第二标准曲线方程的两个变量分别为：去甲氟西汀的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及去甲氟西汀的浓度与内标物的浓度的比值。
6.根据权利要求1所述的氟西汀和去甲氟西汀的检测方法，其特征在于，
所述萃取剂包括：甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和正己烷中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的氟西汀和去甲氟西汀的检测方法，其特征在于，
所述萃取剂与所述第一上清液的体积比包括5:1-20:1。
8.根据权利要求1所述的氟西汀和去甲氟西汀的检测方法，其特征在于，
所述向所述第一上清液内加入内标物，顺次加入萃取剂，涡旋混匀，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品，包括：
向所述第一上清液内加入内标物，顺次加入萃取剂，在1000-2500rpm的转速下涡旋混合5-10min，并在10000-14000rpm的转速下高速离心5-10min，移取离心后的第二上清液；
利用氮气将移取的所述第二上清液吹干，顺次加入复溶液，在1000-2500rpm的转速下涡旋混合0.5-1.5min，并在10000-14000rpm的转速下高速离心5-10min，取第三上清液作为待测样品。
9.根据权利要求8中所述的氟西汀和去甲氟西汀的检测方法，其特征在于，
所述复溶液包括含有60-70％甲醇的水溶液。
10.根据权利要求1至9中任一所述的氟西汀和去甲氟西汀的检测方法，其特征在于，
所述内标物包括环庚米特。
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