CN106442754A - 一种同时检测血液中维生素a和维生素e含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测血液中(视黄醇)和维生素E(a‑生育酚)含量的方法，包括以下步骤：(一)将全血样本离心，取上清液得血清或血浆，备用；(二)标准溶液的标定；(三)样品前处理；(四)取步骤(三)中上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱法或液相色谱串联质谱进行分析，同时定量检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α‑生育酚)的含量。本发明所述的同时检测血液中(视黄醇)和维生素E(a‑生育酚)含量的方法，特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短。
Description
技术领域
本发明涉及维生素检测技术领域，尤其涉及一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法。
背景技术
维生素A(VA)是脂溶性的醇类物质，有多种分子形式，是最早被发现的维生素，其中维生素A1(VA1)主要存在于动物肝脏、血液和眼球的视网膜中，又叫视黄醇，熔点64℃，分子式C20H30O，维生素A1(视黄醇)的化学结构式如结构式(1)所示；维生素A1(VA2)主要在淡水鱼中存在，熔点只有17～19℃，分子式C20H28O，又称视黄醛。维生素A是构成视觉细胞中感受弱光的视紫红质的组成成分，人体缺乏维生素A，影响暗适应能力，如儿童发育不良、皮肤干燥、干眼病、夜盲症，老年斑等。
维生素E(Vitamin E)是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是最主要的抗氧化剂之一，多溶于脂肪和乙醇等有机溶剂中，不溶于水，对热、酸稳定，对碱不稳定，对氧敏感，对热不敏感，但油炸时维生素E活性明显降低。生育酚主要有四种衍生物，按甲基位置分为α、β、γ和δ四种。与生育酚相关的化合物生育三烯酚在取代基不同时活性是一定的，但生育酚的活性会明显降低。生育酚能促进性激素分泌，使男子精子活力和数量增加；使女子雌性激素浓度增高，提高生育能力，预防流产，还可用于防治男性不育症、烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容等方面。近来还发现维生素E可抑制眼睛晶状体内的过氧化脂反应，使末梢血管扩张，改善血液循环，预防近视眼发生和发展，维生素E(α-生育酚)的化学结构式如结构式(2)所示。
目前，国内外有关血清和血浆中维生素A和维生素E的测定方法报道很多，测定维生素的方法有很多种，其中常见的方法有：层析法、分光光度法、气相色谱法、液相色谱法，在众多的方法中，液相色谱法或液相串联质谱法为测定维生素的首选方法。以往方法存在前处理复杂、干扰因素多、分析时间长、灵敏度不高、定性定量不够准确的问题。
发明内容
针对上述技术问题，本发明目的是提供一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法(液相色谱法或液相串联质谱方法)，该方法特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短，且能同时检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)含量。
本发明采用的技术方案是：
一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，采用液相色谱法进行检测，包括如下步骤：
(一)将全血样本离心，取上清液得血清或血浆，备用；
(二)标准溶液的标定
三个以上浓度的标准品的混合标准工作液90ul分别和10ul内标工作液涡旋混混匀，制作标准曲线系列溶液；标准曲线系列溶液在检测前必须进行紫外分光光度计重新标定浓度；所述标准品为视黄醇和α-生育酚，所述内标工作液为维生素A乙酸酯醇溶液和维生E乙酸酯醇溶液；
(三)样品前处理
(1)精密移取步骤(二)中所述内标工作液于离心管中，加入到步骤(一)中所述血清或血浆；
(2)再加入纯水或甲酸水稀释后加入乙醇、甲醇或乙腈溶液，涡旋混匀后高速离心去除蛋白；
(3)再加入正己烷萃取，涡旋混匀后离心；
(4)然后取上清液后常温N2吹干；
(5)加复溶液，涡旋混匀，超声，高速离心，得到上清液样品待测；
(四)取步骤(三)中所述上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱法进行分析，使用荧光检测器检测，同时定量检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)的含量，所述液相色谱测定条件如下：
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8，5um，2.1mm×50mm(Agilent公司)
柱温：25℃；
流动相：纯水-甲醇，采用等度或梯度洗脱程序；
流速：1.0mL/min；
进样量：5μL。
本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其中，步骤(四)中所述梯度洗脱程序包括：
| 时间(min) | A(V％) | B(V％) |
| 0.00 | 14 | 86 |
| 0.5 | 14 | 86 |
| 0.51 | 9 | 91 |
| 3.0 | 9 | 91 |
| 3.51 | 14 | 86 |
| 4.20 | 14 | 86 |
本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其中，步骤(三)中所述血清、纯水、乙醇和正己烷的体积比为1：1：2：4。
本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其中，步骤(二)中标准溶液的标定，包括以下步骤：(a)标准储备液的配制；(b)标准校正液的配制；(c)标准工作液的配制，制备浓度分别为0.0625μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL和4.0μg/mL的维生素A标准工作液和浓度分别0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL的维生素E标准工作液；(d)标准内标储备液的配制；(e)内标工作液的配制，所述内标工作液中维生素A乙酸酯浓度为7.5μg/mL和维生素E乙酸酯浓度为7500μg/mL。
一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，采用液相色谱串联质谱进行检测，包括如下步骤：
(一)将全血样本离心，取上清液得血清或血浆，备用；
(二)标准溶液的标定
三个以上浓度的标准品的混合标准工作液90ul分别和10ul内标工作液涡旋混混匀，制作标准曲线系列溶液；标准曲线系列溶液在检测前必须进行紫外分光光度计重新标定浓度；所述标准品为视黄醇和α-生育酚，所述内标工作液为三氘代视黄醇和六氘代α-生育酚混合液；
(三)样品前处理
(1)精密移取步骤(e)中所述内标工作液于离心管中，加入到步骤(一)中所述血清或血浆；
(2)再加入纯水或甲酸水稀释后加入乙醇、甲醇或乙腈溶液，涡旋混匀后高速离心去除蛋白；
(3)再加入正己烷萃取，涡旋混匀后离心；
(4)然后取上清液后常温N2吹干；
(5)加复溶液，涡旋混匀，超声，高速离心，得到上清液样品待测；
(四)取步骤(三)中所述上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱串联质谱分析，同时定量检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)的含量，所述液相色谱串联质谱测定条件如下：
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8，5um，2.1mm×50mm(Agilent公司)
柱温：28℃；
流动相：A为含体积比为0.1％甲酸的甲醇-B为含体积比为0.1％甲酸的水，采用等度或梯度洗脱程序；
流速：0.4mL/min；
进样量：5μL；
串联质谱条件：数据采集方式：多反应监测模式(MRM)；雾化气温度：350℃；雾化气气流：10L/min；雾化气压：28psi；毛细管电压：4000V；离子源：电喷雾离子源；正离子模式。
本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其中，步骤(四)中所述梯度洗脱程序包括：
| 时间(min) | A(V,％) | B(V,％) |
| 0.00 | 85 | 15 |
| 0.30 | 85 | 15 |
| 0.31 | 95 | 5 |
| 2.00 | 95 | 5 |
| 2.01 | 85 | 15 |
| 4.00 | 85 | 15 |
本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其中，步骤(三)中所述血浆、纯水、乙醇和正己烷的体积比为0.1：1：2：4。
本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其中，步骤(二)中标准溶液的标定，包括以下步骤：(a)标准储备液的配制；(b)标准校正液的配制；(c)标准工作液的配制，制备浓度分别为0.014μg/mL、0.028μg/mL、0.056μg/mL、0.113μg/mL、0.225μg/mL、0.45μg/mL和0.90μg/mL的维生素A标准工作液和浓度分别0.14μg/mL、0.28μg/mL、0.56μg/mL、1.13μg/mL、2.25μg/mL、4.50μg/mL和9.00μg/mL的维生素E标准工作液；(d)标准内标储备液的配制；(e)内标工作液的配制，所述内标工作液中三氘代视黄醇浓度为0.1125μg/mL，六氘代α-生育酚浓度为1.125μg/mL。
本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其中，所述步骤(5)中所述复溶液为甲醇、乙醇或乙腈。
本发明有益效果：
本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短，为临床上诊断血液中维生素A和维生素E的缺乏或过量提供了可靠的实验依据，为干眼病、儿童反复呼吸道感染、产前诊断及优生优育提供了可靠的临床数据。本发明所述的同时检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)含量的检测方法能够大幅度提高加样回收率，从而大大提高检测结果的准确度，消除系统误差；以维生素A乙酸酯、维生素E乙酸酯或同位素标记物为内标，使得目标化合物的识别更为准确，简单经济，定量结果准确。
附图说明
图1为实施例1中血清样本中维生素A和维生素E及其内标工作液的色谱图；其中，1-维生素A；2-维生素A乙酸酯；3-维生素E；4-维生素E乙酸酯；
图2为实施例1中标准溶液中维生素A和维生素E及其内标工作液的色谱图；其中，1-维生素A；2-维生素A乙酸酯；3-维生素E；4-维生素E乙酸酯；
图3为实施例2中血清样本中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)的选择离子流图；其中，1-维生素A；2-维生素E；
图4为实施例2中血清样本中维生素A(视黄醇)的选择离子流图；
图5为实施例2中血清样本中维生素A(视黄醇)的特征质谱图；
图6为实施例2中血清样本中维生素A同位素内标的选择离子流图；
图7为实施例2中血清样本中维生素A同位素内标的特征质谱图；
图8为实施例2中血清样本中维生素E同位素内标的选择离子流图；
图9为实施例2中血清样本中维生素E同位素内标的特征质谱图。
图10为实施例2中血清样本中维生素E的选择离子流图；
图11为实施例2中血清样本中维生素E的特征质谱图。
下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
具体实施方式
实施例1
一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，采用液相色谱法进行检测，包括如下步骤：
(一)将全血离心，离心速度为3500r/min，离心时间为10min，取上清液得血清，所述血清置于4℃-8℃冷藏避光条件下保存(24h内)至分析前备用，或置于-20℃冷冻避光条件下(避免反复冻融)保存(72h内)至分析前备用，或置于-80℃冷冻避光条件下(避免反复冻融)保存(30天内)至分析前备用；
(二)标准溶液的标定
六种不同浓度的标准品的混合标准工作液90ul分别和10ul混合内标工作液以1400r/min涡旋混匀30秒，充分混匀，制作标准曲线系列溶液；标准曲线系列溶液在检测前必须进行紫外分光光度计重新标定浓度；所述标准品为视黄醇和α-生育酚，所述混合内标工作液为维生素A乙酸酯醇溶液和维生E乙酸酯醇溶液，所述标准曲线系列溶液经液相色谱法分析，绘制标准曲线。
(a)标准储备液的配制：
精确称取视黄醇标准品10mg，置于10ml容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月；精确称取α-生育酚标准品10mg，置于10ml容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10ml，得到标准储备液B，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。
(b)标准校正液的配制：
维生素A：从步骤(a)中标准储备液A吸取20μl，置5ml容量瓶中，用无水乙醇定容，混匀；用紫外分光光度计重新标定浓度，在325nm波长下测定其紫外吸光值，结合标准比吸光系数，按照公式(1)和(2)计算出标准储备液A的实际浓度值，视黄醇的1％比吸光系数为1835。整个过程避光操作。
维生素E：从步骤(a)中储备液B吸取20μl，置5ml容量瓶中，用无水乙醇定容，混匀；用紫外分光光度计重新标定浓度，在294nm波长下测定其紫外吸光值，结合标准比吸光系数，按照公式(1)和(2)计算出标准储备液B的实际浓度值，维生素E的1％比吸光系数为71。整个过程避光操作。
稀释倍数＝10000*5ml/20μl……………………(2)
式中：CX—待标定的标准溶液的实际浓度值；g/100mL
A—给定波长处测定的待标定标准溶液的吸光度平均值；
E—待标定标准溶液的1％比吸光系数。
(c)标准工作液的配制：
维生素A和维生素E混合标准工作液的制备：将步骤(2)中标准储备液A稀释得到8ppm的溶液与标准储备液B稀释得到80ppm的溶液等体积混合，再依次用乙醇等比稀释，得到浓度为0.0625μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL和4.0μg/mL的维生素A标准工作液，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月，得到浓度为0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL的标准工作液，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。
(d)标准内标储备液的配制：
精确称取维生素A乙酸酯标准品10mg，置于10mL容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10mL，得到标准储备液C，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。
精确称取维生素E乙酸酯标准品150mg，置于10mL容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10mL，得到标准储备液D，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。
(e)内标工作液的配制
从标准储备液C稀释得到15μg/mL的储备液，稀释液为乙醇，与标准储备液D等比混合，得到含维生素A乙酸酯7.5μg/mL和维生素E乙酸酯7500μg/mL的内标工作液，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。
(三)样品前处理
(1)用移液枪移取10ul步骤(e)中所述内标工作液于1.5ml塑料离心管中，加入100ul步骤(一)中所述血清；
(2)再加入100ul纯水，2000r/min涡旋混匀30秒，再移取200ul乙醇于上述离心管中，2000转/分钟涡旋混匀60秒；
(3)用移液抢移取400μL正己烷，2000r/min涡旋混匀5分钟，以达到充分萃取的目的，然后12000r/min高速离心10分钟；
(4)移取350μL上清液到1.5ml塑料离心管中，常温下N2缓慢吹干；
(5)向上述吹干的离心管中加入100μL复溶液，所述复溶液为甲醇、乙醇或乙腈，2000r/min涡旋混匀1分钟，12000r/min高速离心5分钟，得到处理后的上清液样品待测；
(四)取步骤(三)中处理后的上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱法进行分析，使用荧光检测器检测，同时定量检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)的含量，所述液相色谱测定条件如下：
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8，5um，2.1mm×50mm(Agilent公司)
柱温：25℃；
流动相：纯水-甲醇，采用梯度洗脱程序；
表1液相色谱梯度洗脱程序
| 时间(min) | A(V,％) | B(V,％) |
| 0.00 | 14 | 86 |
| 0.5 | 14 | 86 |
| 0.51 | 9 | 91 |
| 3.0 | 9 | 91 |
| 3.51 | 14 | 86 |
| 4.20 | 14 | 86 |
流速：1.0mL/min；
进样量：5μL；
表2荧光检测器设置
| 时间(min) | 激发波长(nm) | 发射波长(nm) |
| 0～1.30 | 325 | 470 |
| 1.3-4.2 | 295 | 330 |
血清样本中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)及其内标的色谱图见图1，标准溶液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)及其内标的色谱图见图2，维生素A、维生素A乙酸酯、维生素E和维生素E乙酸酯的保留时间分别为0.57min、0.90min、2.25min和2.90min，由图1和图2可知本实施例方法以维生素A乙酸酯、维生素E乙酸酯为内标，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。
实施例2
一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，采用液相色谱串联质谱进行检测，包括如下步骤：
(一)将全血离心，离心速度为3500r/min，离心时间为10min，取上清液得血清，所述血清置于4℃-8℃冷藏避光条件下保存(24h内)至分析前备用，或置于-20℃冷冻避光条件下(避免反复冻融)保存(72h内)至分析前备用，或置于-80℃冷冻避光条件下(避免反复冻融)保存(30天内)至分析前备用；
(二)标准溶液的标定
六种不同浓度的标准品的混合标准工作液90ul分别和10ul混合内标工作液以1400r/min涡旋混匀30秒，充分混匀，制作标准曲线系列溶液；标准曲线系列溶液在检测前必须进行紫外分光光度计重新标定浓度；所述标准品为视黄醇和α-生育酚，所述混合内标工作液为三氘代视黄醇和六氘代α-生育酚混合液，所述标准曲线系列溶液经液相色谱法分析，绘制标准曲线；
(a)标准储备液的配制
精确称取视黄醇标准品10mg，置于10ml容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月；精确称取α-生育酚标准品10mg，置于10ml容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10ml，得到标准储备液B，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。
(b)标准校正液的配制
维生素A：从步骤(a)中标准储备液A吸取20μl，置5ml容量瓶中，用无水乙醇定容，混匀；用紫外分光光度计重新标定浓度，在325nm波长下测定其紫外吸光值，结合标准比吸光系数，按照公式(1)和(2)计算出标准储备液A的实际浓度，维生素A的1％比吸光系数为1835。整个过程避光操作。
维生素E：从步骤(a)中标准储备液B吸取20μl，置5ml容量瓶中，用无水乙醇定容，混匀；用紫外分光光度计重新标定浓度，在294nm波长下测定其紫外吸光值，结合标准比吸光系数，按照公式(1)和(2)计算出标准储备液B的实际浓度，维生素E的1％比吸光系数为71。整个过程避光操作。
稀释倍数＝10000*5ml/20μl……………………………(2)
式中：CX—待标定的标准溶液的实际浓度值；g/100ml
A—294nm处测定的待标定标准溶液的吸光度平均值；
E—维生素E的1％比吸光系数；
(c)标准工作液的配制
维生素A和维生素E混合标准工作液的制备：标准储备液A稀释得到1.8μg/mL的溶液与标准储备液B稀释得到18μg/mL的溶液等比混合，再依次用乙醇等比稀释，得到浓度分别0.014μg/mL、0.028μg/mL、0.056μg/mL、0.113μg/mL、0.225μg/mL、0.45μg/mL和0.90μg/mL的维生素A标准工作液，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月；得到浓度分别0.14μg/mL、0.28μg/mL、0.56μg/mL、1.13μg/mL、2.25μg/mL、4.50μg/mL和9.00μg/mL的维生素E标准工作液，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。
(d)标准内标储备液的配制
精确称取维生素A同位素内标三氘代视黄醇2mg，置于10mL容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10mL，得到标准储备液C(200μg/mL)，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。
用2mL无水乙醇溶解维生素E同位素内标六氘代α-生育酚1mg，得到标准储备液D(500μg/mL)，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。
(e)内标工作液的配制
将步骤(d)中标准储备液C稀释得到0.225μg/mL的储备液，标准储备液D稀释得到2.25μg/mL的储备液，稀释液为乙醇，两者等比混合，得到含维生素A同位素内标三氘代视黄醇0.1125μg/mL和维生素E同位素六氘代α-生育酚1.125μg/mL的内标工作液，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。
(三)样品前处理
(1)用移液枪移取10ul步骤(e)中所述内标工作液于1.5ml塑料离心管中，加入10ul血浆；
(b)再加入100ul纯水，2000r/min涡旋混匀30s，再移取200ul乙醇于上述离心管中，2000转/分钟涡旋混匀60秒；
(c)用移液抢移取400μL正己烷，2000r/min涡旋混匀5分钟，以达到充分萃取的目的，然后12000r/min高速离心10分钟；
(d)移取350μL上清液到1.5ml塑料离心管中，常温下N2缓慢吹干；
(e)向上述吹干的离心管中加入100μL复溶液，所述复溶液为甲醇、乙醇或乙腈，2000r/min涡旋混匀1分钟，12000r/min高速离心5分钟，得到处理后的上清液样品待测；
(四)取步骤(三)中处理后的上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱串联质谱法进行分析，同时定量检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)的含量，所述液相色谱串联质谱测定条件如下：
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8，5um，2.1mm×50mm(Agilent公司)
柱温：28℃；
流动相：A甲醇(含体积比为0.1％的甲酸)：B水(含体积比为0.1％的甲酸)，采用梯度洗脱程序；
表3液相色谱串联质谱梯度洗脱程序
| 时间(min) | A(V,％) | B(V,％) |
| 0.00 | 85 | 15 |
| 0.30 | 85 | 15 |
| 0.31 | 95 | 5 |
| 2.00 | 95 | 5 |
| 2.01 | 85 | 15 |
| 4.00 | 85 | 15 |
流速：0.4mL/min；
进样量：5μL；
表4串联质谱条件
数据采集方式：(多反应监测模式)MRM；
雾化气温度：350℃；
雾化气气流：10L/min；
雾化气压：28psi；
毛细管电压：4000V；
离子源：电喷雾离子源；
离子化模式：正离子模式。
本实施例中技术方法论证如下：
一、该方法的线性关系和定量限
将上述配制的90μl的各个浓度的维生素A标准工作液和维生素E标准工作液进行混合，再加10μl混合内标工作液，混匀进样50μl，按本实施例测定条件浓度由低到高进行测定，以定量离子峰面积一浓度作图，得到标准曲线，结果表明维生素A和维生素E的线性范围和定量限如下：
(1)检测限(LOD)：VA为0.02mg/L；VE为0.20mg/L。
(2)定量限(LOQ):VA为0.06mg/L；VE为0.60mg/L。
(3)线性范围：
维生素A在0.1mg/L到4.0mg/L范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.995；维生素E在0.9mg/L到30.0mg/L范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.995。
二、该方法的回收率和精密度
分别取维生素A和维生素E标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定6批次，维生素A和维生素E的回收率和精密度分别如表5和表6。维生素A在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为90.3％～94.0％，相对标准偏差为1.02％～4.35％，结果见表5。维生素E在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为104.9％～112.4％，相对标准偏差为0.07％～1.88％，结果见表6。
表5.维生素A加样回收率和精密度
| 加标量 | 0.60mg/L | 2.38mg/L | 4.76mg/L |
| 平均回收率 | 92.1％ | 94.0％ | 90.3％ |
| 精密度RSD | 1.02％ | 2.74％ | 4.35％ |
表6.维生素E加样回收率和精密度
| 加标量 | 1.07mg/L | 5.34mg/L | 10.67mg/L |
| 平均回收率 | 104.9％ | 105.4％ | 112.4％ |
| 精密度RSD | 1.88％ | 0.07％ | 1.73％ |
综合上述验证试验，本实施例2的回收率，检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，该方法同时检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)，重现性良好，且能够大幅度提高加样回收率，从而大大提高检测结果的准确度，消除系统误差。
本实施例中血清样本中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)的选择离子流图如图3所示，维生素A的维生素E保留时间分别为1.40min和3.00min。血清样本中维生素A(视黄醇)选择离子流图和特征质谱图分别如图4和图5所示；血清样本中维生素A同位素内标的选择离子流图和特征质谱图分别如图6和图7所示；血清样本中维生素E同位素内标的选择离子流图和特征质谱图分别如图8和图9所示；血清样本中维生素E同位素内标的选择离子流图和特征质谱图分别如图10和图11所示。由图3-11可见，维生素A(视黄醇)和维生素E的保留时间和相对丰度均与其标准工作溶液一致，该方法以同位素标记物为内标，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，采用液相色谱法进行检测，其特征在于：包括如下步骤：
(一)将全血样本离心，取上清液得血清，备用；
(二)标准溶液的标定
三个以上浓度的标准品的混合标准工作液90ul分别和10ul内标工作液涡旋混混匀，制作标准曲线系列溶液；标准曲线系列溶液在检测前必须进行紫外分光光度计重新标定浓度；所述标准品为视黄醇和α-生育酚，所述内标工作液为维生素A乙酸酯醇溶液和维生E乙酸酯醇溶液；
(三)样品前处理
(1)精密移取步骤(二)中所述内标工作液于离心管中，加入到步骤(一)中所述血清；
(2)再加入纯水或甲酸水稀释后加入乙醇、甲醇或乙腈溶液，涡旋混匀后高速离心去除蛋白；
(3)再加入正己烷萃取，涡旋混匀后离心；
(4)然后取上清液后常温N2吹干；
(5)加复溶液，涡旋混匀，超声，高速离心，得到上清液样品待测；
(四)取步骤(三)中所述上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱法进行分析，使用荧光检测器检测，同时定量检测血液中维生素A和维生素E的含量，所述液相色谱测定条件如下：
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8，5um，2.1mm×50mm
柱温：25℃；
流动相：纯水-甲醇，采用等度或梯度洗脱程序；
流速：1.0mL/min；
进样量：5μL。
2.根据权利要求1所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其特征在于：步骤(四)中所述梯度洗脱程序包括：
3.根据权利要求1所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其特征在于：步骤(三)中所述血清、纯水、乙醇和正己烷的体积比为1：1：2：4。
4.根据权利要求1所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其特征在于：步骤(二)中标准溶液的标定，包括以下步骤：(a)标准储备液的配制；(b)标准校正液的配制；(c)标准工作液的配制，制备浓度分别为0.0625μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL和4.0μg/mL的维生素A标准工作液和浓度分别0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL的维生素E标准工作液；(d)标准内标储备液的配制；(e)内标工作液的配制，所述内标工作液中维生素A乙酸酯浓度为7.5μg/mL和维生素E乙酸酯浓度为7500μg/mL。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其特征在于：所述步骤(5)中所述复溶液为甲醇、乙醇或乙腈。
6.一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，采用液相色谱串联质谱进行检测，其特征在于：包括如下步骤：
(一)将全血样本离心，取上清液得血清，备用；
(二)标准溶液的标定
三个以上浓度的标准品的混合标准工作液90ul分别和10ul内标工作液涡旋混混匀，制作标准曲线系列溶液；标准曲线系列溶液在检测前必须进行紫外分光光度计重新标定浓度；所述标准品为视黄醇和α-生育酚，所述内标工作液为三氘代视黄醇和六氘代α-生育酚混合液；
(三)样品前处理
(1)精密移取步骤(e)中所述内标工作液于离心管中，加入到步骤(一)中所述血清；
(2)再加入纯水或甲酸水稀释后加入乙醇、甲醇或乙腈溶液，涡旋混匀后高速离心去除蛋白；
(3)再加入正己烷萃取，涡旋混匀后离心；
(4)然后取上清液后常温N2吹干；
(5)加复溶液，涡旋混匀，超声，高速离心，得到上清液样品待测；
(四)取步骤(2)中所述上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱串联质谱分析，同时定量检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)的含量，所述液相色谱串联质谱测定条件如下：
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8，5um，2.1mm×50mm
柱温：28℃；
流动相：A为含体积比为0.1％甲酸的甲醇-B为含体积比为0.1％甲酸的水，采用等度或梯度洗脱程序；
流速：0.4mL/min；
进样量：5μL；
串联质谱条件：多反应监测模式(MRM)；雾化气温度：350℃；雾化气气流：10L/min；雾化气压：28psi；毛细管电压：4000V；离子源：电喷雾离子源；正离子模式。
7.根据权利要求6所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其特征在于：步骤(四)中所述梯度洗脱程序包括：
8.根据权利要求1所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其特征在于：步骤(三)中所述血浆、纯水、乙醇和正己烷的体积比为0.1：1：2：4。
9.根据权利要求1所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其特征在于：步骤(二)中标准溶液的标定，包括以下步骤：(a)标准储备液的配制；(b)标准校正液的配制；(c)标准工作液的配制，制备浓度分别为0.014μg/mL、0.028μg/mL、0.056μg/mL、0.113μg/mL、0.225μg/mL、0.45μg/mL和0.90μg/mL的维生素A标准工作液和浓度分别0.14μg/mL、0.28μg/mL、0.56μg/mL、1.13μg/mL、2.25μg/mL、4.50μg/mL和9.00μg/mL的维生素E标准工作液；(d)标准内标储备液的配制；(e)内标工作液的配制，所述内标工作液中三氘代视黄醇浓度为0.1125μg/mL，六氘代α-生育酚浓度为1.125μg/mL。
10.根据权利要求6-9任意一项所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其特征在于：所述步骤(5)中所述复溶液为甲醇、乙醇或乙腈。
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Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106645500A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-05-10 | 广州市丰华生物工程有限公司 | 一种同时检测血清/血浆中多种维生素的方法和试剂盒 |
| CN107917976A (zh) * | 2017-11-20 | 2018-04-17 | 国药控股星鲨制药（厦门）有限公司 | 一种检测复方三维右旋泛酸钙糖浆4种b族维生素的方法 |
| CN108107133A (zh) * | 2018-01-17 | 2018-06-01 | 中国医学科学院北京协和医院 | 液相色谱串联质谱测定血清中维生素a和e的方法 |
| CN108802221A (zh) * | 2018-06-12 | 2018-11-13 | 杭州度安医学检验实验室有限公司 | 末梢血中维生素a和维生素e的微量检测方法 |
| CN108828087A (zh) * | 2018-04-26 | 2018-11-16 | 美林美邦（厦门）生物科技有限公司 | 血液中维生素a、e的提取检测方法 |
| CN109358122A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-02-19 | 杭州和合医学检验实验室有限公司 | 血液中维生素e的检测方法 |
| CN110887924A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-03-17 | 济南和合医学检验有限公司 | 同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法 |
| CN110907577A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-03-24 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法 |
| CN111426774A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-07-17 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种口含烟中维生素e和维生素e醋酸酯的同时测定方法 |
| CN111929391A (zh) * | 2020-03-05 | 2020-11-13 | 美康生物科技股份有限公司 | 用于准确测定人血清中维生素a和e浓度的试剂盒及检测方法 |
| CN111948300A (zh) * | 2019-05-16 | 2020-11-17 | 株式会社岛津制作所 | 同时检测生物样品中多种生物小分子的方法及用于其的多维液相色谱分析装置 |
| CN112578059A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-03-30 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 氟西汀和去甲氟西汀的检测方法 |
| CN113960211A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-01-21 | 青岛市食品药品检验研究院（青岛市药品不良反应监测中心、青岛市实验动物和动物实验中心） | 一种血清中维生素k的测定方法 |
| CN114755323A (zh) * | 2022-03-24 | 2022-07-15 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 干血纸片中脂溶性维生素含量的检测方法及试剂盒 |
| CN114778719A (zh) * | 2022-03-29 | 2022-07-22 | 天津国科医工科技发展有限公司 | 基于电喷雾电离源的维生素k1的液相色谱串联质谱检测方法 |
| CN114965725A (zh) * | 2021-07-22 | 2022-08-30 | 上海微谱化工技术服务有限公司 | 一种皮肤生理学检测方法及其应用 |
| CN115166118A (zh) * | 2022-08-08 | 2022-10-11 | 江苏格诺生物科技有限公司 | 一种检测人血清中多种维生素的预处理试剂盒及其使用方法 |
| CN115236254A (zh) * | 2022-07-22 | 2022-10-25 | 北京豪思生物科技股份有限公司 | 维生素a和维生素e的检测试剂盒、检测方法及应用 |
| CN115343379A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-11-15 | 杭州谱聚医疗科技有限公司 | 空白血基质和标准品的制备方法、维生素的检测方法 |
-
2016
- 2016-08-30 CN CN201610772145.2A patent/CN106442754B/zh active Active
Cited By (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106645500A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-05-10 | 广州市丰华生物工程有限公司 | 一种同时检测血清/血浆中多种维生素的方法和试剂盒 |
| CN107917976B (zh) * | 2017-11-20 | 2020-06-09 | 国药控股星鲨制药（厦门）有限公司 | 一种检测复方三维右旋泛酸钙糖浆4种b族维生素的方法 |
| CN107917976A (zh) * | 2017-11-20 | 2018-04-17 | 国药控股星鲨制药（厦门）有限公司 | 一种检测复方三维右旋泛酸钙糖浆4种b族维生素的方法 |
| CN108107133A (zh) * | 2018-01-17 | 2018-06-01 | 中国医学科学院北京协和医院 | 液相色谱串联质谱测定血清中维生素a和e的方法 |
| CN108107133B (zh) * | 2018-01-17 | 2020-08-21 | 中国医学科学院北京协和医院 | 液相色谱串联质谱测定血清中维生素a和e的方法 |
| CN108828087B (zh) * | 2018-04-26 | 2021-07-27 | 美林美邦（厦门）生物科技有限公司 | 血液中维生素a、e的提取检测方法 |
| CN108828087A (zh) * | 2018-04-26 | 2018-11-16 | 美林美邦（厦门）生物科技有限公司 | 血液中维生素a、e的提取检测方法 |
| CN108802221A (zh) * | 2018-06-12 | 2018-11-13 | 杭州度安医学检验实验室有限公司 | 末梢血中维生素a和维生素e的微量检测方法 |
| CN109358122A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-02-19 | 杭州和合医学检验实验室有限公司 | 血液中维生素e的检测方法 |
| CN111948300B (zh) * | 2019-05-16 | 2023-09-26 | 株式会社岛津制作所 | 同时检测生物样品中多种生物小分子的方法及用于其的多维液相色谱分析装置 |
| WO2020230354A1 (ja) * | 2019-05-16 | 2020-11-19 | 株式会社島津製作所 | 生体試料からの複数種の生体低分子の一斉検出方法、及びそれに用いた多次元液体クロマトグラフィー分析装置 |
| CN111948300A (zh) * | 2019-05-16 | 2020-11-17 | 株式会社岛津制作所 | 同时检测生物样品中多种生物小分子的方法及用于其的多维液相色谱分析装置 |
| CN110907577A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-03-24 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法 |
| CN110887924A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-03-17 | 济南和合医学检验有限公司 | 同时检测血液中视黄醇和α-生育酚含量的方法 |
| CN111929391A (zh) * | 2020-03-05 | 2020-11-13 | 美康生物科技股份有限公司 | 用于准确测定人血清中维生素a和e浓度的试剂盒及检测方法 |
| CN111426774A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-07-17 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种口含烟中维生素e和维生素e醋酸酯的同时测定方法 |
| CN112578059A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-03-30 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 氟西汀和去甲氟西汀的检测方法 |
| CN114965725A (zh) * | 2021-07-22 | 2022-08-30 | 上海微谱化工技术服务有限公司 | 一种皮肤生理学检测方法及其应用 |
| CN113960211A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-01-21 | 青岛市食品药品检验研究院（青岛市药品不良反应监测中心、青岛市实验动物和动物实验中心） | 一种血清中维生素k的测定方法 |
| CN114755323A (zh) * | 2022-03-24 | 2022-07-15 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 干血纸片中脂溶性维生素含量的检测方法及试剂盒 |
| CN114778719A (zh) * | 2022-03-29 | 2022-07-22 | 天津国科医工科技发展有限公司 | 基于电喷雾电离源的维生素k1的液相色谱串联质谱检测方法 |
| CN115343379A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-11-15 | 杭州谱聚医疗科技有限公司 | 空白血基质和标准品的制备方法、维生素的检测方法 |
| CN115236254A (zh) * | 2022-07-22 | 2022-10-25 | 北京豪思生物科技股份有限公司 | 维生素a和维生素e的检测试剂盒、检测方法及应用 |
| CN115166118A (zh) * | 2022-08-08 | 2022-10-11 | 江苏格诺生物科技有限公司 | 一种检测人血清中多种维生素的预处理试剂盒及其使用方法 |
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