CN107664664A - 一种同时检测人全血中4类乙醇非氧化代谢物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属司法鉴定及分析化学技术领域，涉及检测人全血中乙醇非氧化代谢物的方法，尤其涉及一种同时测定人全血中4类共计10种乙醇的非氧化代谢物的方法。本方法建立了同时定性和定量分析4类性质差异大的乙醇非氧化代谢物的方法，灵敏度高、特异性强、线性范围宽，可用于50μL人全血少量检材中4类共10种乙醇非氧化代谢物的定性和定量，并且操作简单、快速、提取溶剂用量少，能够满足司法鉴定任务紧迫、对检测时间要求高的需求，可大范围推广应用。
Description
技术领域
本发明属司法鉴定及分析化学技术领域，涉及检测人全血中乙醇非氧化代谢物的方法，尤其涉及一种同时测定人全血中4类共计10种乙醇的非氧化代谢物的方法。
背景技术
乙醇，俗称酒精，是世界性的一大滥用物质。司法鉴定实践中，在交通事故、怀疑中毒的自杀、他杀案件，尤其是涉及死亡的案件中，需要对血液中的酒精的浓度(BloodAlcohol Concentration,BAC)进行分析和阐述，其检测结果往往是判定当事人责任的关键性证据。
目前，BAC检测的“金标准”是采用顶空气相色谱法测定乙醇。然而，该方法无法应对以下两种情况，(1)情况一：自2011.5.1醉驾入刑后，出于逃避刑罚的侥幸心理，一些醉驾人员选择逃逸，造成逃逸案件频繁发生。由于肇事方逃逸，伤者往往得不到及时的送医救治甚至最终死亡，常造成非常严重的后果和恶劣的社会影响。而在当事人逃逸一段时间后自首或被警方抓获，由于乙醇在体内代谢和排泄已较为充分，此时测到的BAC往往已经远低于肇事时的BAC，甚至数值为0，导致相关部门缺乏直接证据而不能评定事故发生时当事人是否处于醉驾状态；(2)情况二：对于部分死亡案件，即使生前未摄入乙醇，但伴随尸体腐败的进程，体内的细菌、酵母和真菌会生成一定量的乙醇。如何区分尸体血液中测得的乙醇是死者生前摄入还是死后产生，将直接关系到死因的调查、交通事故等事件责任的认定及后续保险赔偿。
研究显示，乙醇入体后，会生成4类非氧化代谢物，包括乙基葡萄糖醛酸酯(EtG)、乙基硫酸酯(EtS)、脂肪酸乙酯(FAEE)和磷脂酰乙醇(PEth)，它们具有极高的专属性和特异性，被认为是乙醇摄入的重要生物标志物。而通过检测全血中乙醇的这些非氧化代谢物将有望解决上述两个难题(酒后逃逸案件BAC的检测和尸体血液中乙醇的来源问题)。
由于乙醇的4类非氧化代谢物的理化性质差别大，目前已有报道的分析方法，仅仅针对于一类或两类代谢物的检测。事实上，乙醇的4类非氧化代谢物具有不同的检测时限，且在尸体检材中的稳定性也有所差异，如EtG和EtS是目前受到关注最多的两类代谢物，它们在血液中的检测时限大于18h，其作为酒精标志物具有很高的灵敏度和专属性；FAEE具有细胞毒性，检测时限长达24h，研究认为酒精中毒及酒精引起的相关疾病均与其含量及毒性密切相关；PEth为乙醇存在情况下细胞膜合成时产生的特异性物质，饮酒后一周仍可检测到PEth，且对于长期饮酒者其检测时限更长，并且，根据其含量可对单次饮酒与长期饮酒进行区分。
基于现有技术的现状，本申请的发明人认为，有必要建立一种分析方法，可以用于少量全血检材中乙醇的四类非氧化代谢物的同时测定，以实现一次检测得到4类代谢物的全部信息。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，提供一种灵敏、简便、快速，准确的能同时测定人全血中4类共10种乙醇非氧化代谢物的方法，所述的代谢物包括乙基葡萄糖醛酸酯(EtG)、乙基硫酸酯(EtS)、十四酸乙酯(E14：0)、十六酸乙酯(E16：0)、十八酸乙酯(E18：0)、油酸乙酯(E18：1)、亚油酸乙酯(E18：2)、花生四烯酸乙酯(E20：4)、2种磷脂酰乙醇(16：0/18：1和18：1/18：1)。
本发明方可实现10种代谢物的同时测定，且样品用量少，样品处理操作简单、快速，检测方法灵敏度高。
具体的，本发明的同时检测人全血中4类乙醇非氧化代谢物的方法，采用液相色谱－质谱联用法对上述人全血中4类共10种乙醇非氧化代谢物进行定性和定量分析，其主要包括下述步骤：
(1)血液样品预处理
取人全血检材50μL于2mL微量离心管中，加入内标混合溶液10μL，再加入混合提取溶剂(冰80/20丙酮-乙腈)400μL，涡旋混合5min，12000rpm离心10min，转移上清液100μL于进样小瓶中，进样5μL；
(2)采用液相色谱－质谱联用法测定全血中4类共10种乙醇非氧化代谢物的浓度。采用的色谱柱为Thermo Hypersil Gold C18柱(2.1mm×100mm,1.9μm)，柱温47℃。
本方法中，所述的全血样品用量为50μL，显著地减少了已报道方法中采用的检材量；前处理简单、快速，易于操作和推广；本方法采用高效液相(HPLC)色谱以及三重四级杆质谱检测器，测定全血中4类共10种乙醇非氧化代谢物的含量，检测的灵敏度高、准确度好，在检材量小的情况下，定量限仍等于或低于已报道方法。
本方法中，同时进行4类共10种性质差异大的乙醇非氧化代谢物的定性和定量分析，准确度和精密度均符合要求。检测目标物的色谱保留时间和质谱特征峰如表1所示。
本发明方法对人全血中4类共10种乙醇非氧化代谢物进行定性和定量分析，结果准确、可靠，各化合物检测限、定量限及线性范围如表2所示，提取回收率在22-103％范围内，准确度在89-113％范围内，批内精密度的RSD值不超过15％，批间精密度的RSD值不超过14％。
本发明方法与现有技术相比较，具有以下明显效果和优势：
(1)本方法首次建立了乙醇的4类共10种非氧化代谢物的同时定性及定量分析方法。乙醇的4类非氧化代谢物性质差异大，同时分析的难度高，目前尚未有同时检测的相关报道。
(2)以往的方法均未涉及到FAEE在人全血中的测定，本方法的提取方法及分析条件能够准确对人全血中6种FAEE进行定性和定量分析，灵敏度和线性范围能够满足司法鉴定的要求。
(3)本方法对大多数代谢物的灵敏度超过已报道的其他方法，能够满足司法鉴定的需求。目前已有的分析全血中乙醇非氧化代谢物的方法中，EtG的定量限为10-100ng/mL；EtS的定量限为20-50ng/mL；FAEE的定量限(针对血斑的检测)为15-37ng/mL；PEth的定量限为2.2-100ng/mL。本方法的灵敏度高，EtG的定量限为20ng/mL；EtS和PEth的定量限为2ng/mL；6种FAEE中，除E14：0的定量限为50ng/mL外，其余5种的定量限均为2ng/mL或5ng/mL。
(4)本方法使用的生物检材(全血)量少，采用50μL全血作为检材，与以往的报道中检材用量相比，用量最少，在实际检案中，尤其是涉及到死亡的案例中，本方法可以应对检材量非常有限的情况。
(5)本方法的前处理过程快速简便，已有的文献报道中，多用固相萃取或液液萃取对FAEE及PEth进行前处理。本法的建立过程对比了包含固相萃取及液液萃取在内的多种前处理方法，最终选定合适的溶剂进行蛋白质沉淀后将上清液直接进样分析。该前处理方法操作简便，有机溶剂用量少(400μL)，无需吹干，提取时间短，极大地节省了测定时间且对环境友好。
表1检测目标物的色谱保留时间和质谱参数
注：粗体为定量离子对。
表2 检测目标物的检测限、定量限及线性范围
附图说明
图1-a是空白人全血的提取后进样的标准色谱图，
图1-b是4类共10种乙醇非氧化代谢物标准品(定量限浓度)添加(从左至右分别为：EtG、EtS、E14：0、E16：0、E18：2、E18：1、E18：0、E20：4、PEth16：0/18：1、PEth18：1/18：1)提取后进样的标准色谱图。
图1-c是实际样本提取后进样的标准色谱图，从左至右分别为：EtG、EtS、E14：0、E16：0、E18：2、E18：1、E18：0、E20：4、PEth16：0/18：1、PEth18：1/18：1；除一种FAEE(E14：0)外，其余9种代谢物均被检出。
具体实施方式
实施例1 检测人全血中4类乙醇非氧化代谢物
色谱条件如下：
色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18柱(2.1mm×100mm,1.9μm)；柱温：47℃
流动相：5％乙腈-水(A相)；90％甲醇-水(0.1％甲酸)(B相)；甲醇(0.1％甲酸)(C相)；异丙醇(5mM醋酸铵)(D相)梯度洗脱(如表3所示)，流速0.2mL/min。
进样量：5μL
表3 梯度洗脱条件
质谱条件如下：
ESI；喷雾电压：3.6kV(+)/2.8kV(-)；鞘气：35Arb；辅助气：10Arb；离子传输管温度：350℃；脱溶剂温度：300℃。
扫描方式：多反应监测(MRM)
检测目标物的色谱保留时间和质谱数据如表1所示。
样品处理：
取人全血检材50μL于2mL微量离心管中，加入内标混合溶液10μL，再加入混合提取溶剂(冰80/20丙酮-乙腈)400μL，涡旋混合5min，12000rpm离心10min，转移上清液100μL于进样小瓶中，进样5μL。
线性试验：
取混合标准系列工作液，加入空白人全血，涡旋混匀，配成含待测物浓度分别为2、5、20、50、100、500、1000、2000、5000、10000、16000、20000ng/ml的全血样品，按“样品处理”项下操作，制备标准曲线，并同时制备空白样品，记录色谱图。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标的峰面积比值为纵坐标，用加权(W＝1/X2)最小二乘法进行回归运算，绘制标准曲线。
精密度和准确度试验：
分别取定量限浓度的混合标准溶液和低、中、高浓度的质控工作液，加入空白人全血，涡旋混匀，配成含待测物浓度分别为定量限浓度及3个质控浓度的全血样品。每批每个浓度配制5份，共做3批。按“样品处理“项下操作。根据每批的线性回归方程计算其实测浓度，计算每个浓度的准确度、批内和批间精密度，精密度以相对标准偏差(RSD)表示。
提取回收率试验：
配制含待测物浓度分别为低、中、高质控浓度的全血样品各5份，按“样品制备”项下操作，记录样品及内标峰面积并计算均值AS1。另以空白全血按“样品制备”项下操作所得空白基质液，加入混合标准工作液，配制成3个相同浓度，每个浓度平行配制5份，记录样品及内标峰面积并计算均值AS2，以AS1/AS2×100％计算提取回收率。
表4是人全血中待测物的批内和批间精密度、准确度及提取回收率的数据。
表4 人全血中待测物的批内和批间精密度、准确度及提取回收率的数据
Claims (3)
1.一种同时检测人全血中4类乙醇非氧化代谢物的方法，其特征在于，采用液相色谱－质谱联用法对人全血中4类共10种乙醇非氧化代谢物进行定性和定量分析，其主要包括下述步骤：
(1)血液样品预处理
取人全血检材50μL于微量离心管中，加入内标混合溶液，再加入混合提取溶剂，涡旋混合，离心，转移上清液于进样小瓶中，进样5μL；
(2)采用液相色谱－质谱联用法测定全血中4类共10种乙醇非氧化代谢物的浓度，采用的色谱柱为Thermo Hypersil Gold C18柱(2.1mm×100mm,1.9μm)，柱温47℃；
所述的人全血4类共10种乙醇非氧化代谢物为乙基葡萄糖醛酸酯(EtG)、乙基硫酸酯(EtS)、十四酸乙酯(E14：0)、十六酸乙酯(E16：0)、十八酸乙酯(E18：0)、油酸乙酯(E18：1)、亚油酸乙酯(E18：2)、花生四烯酸乙酯(E20：4)、2种磷脂酰乙醇(16：0/18：1和18：1/18：1)。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，取人全血检材50μL于2mL微量离心管中，加入内标混合溶液10μL，再加入混合提取溶剂冰80/20丙酮-乙腈400μL，涡旋混合5min，12000rpm离心10min，转移上清液100μL于进样小瓶中，进样5μL。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，
色谱条件为：
色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18柱(2.1mm×100mm,1.9μm)；柱温：47℃；
流动相：5％乙腈-水(A相)；90％甲醇-水(0.1％甲酸)(B相)；甲醇(0.1％甲酸)(C相)；异丙醇(5mM醋酸铵)(D相)梯度洗脱(如表3所示)，流速0.2mL/min；
质谱条件为：
ESI；喷雾电压：3.6kV(+)/2.8kV(-)；鞘气：35Arb；辅助气：10Arb；离子传输管温度：350℃；脱溶剂温度：300℃；
扫描方式：多反应监测(MRM)；
检测目标物的色谱保留时间和质谱数据如表1所示，
表1
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