CN115236254A - 维生素a和维生素e的检测试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种维生素A和维生素E的检测试剂盒、检测方法及应用，涉及维生素检测技术领域，本发明提供的试剂盒包括用于高效液相色谱分析的校准品、质控品、样本萃取液和稀释液，能同时检测维生素A和维生素E，达到单样本多指标同步检测功能。其中选用维生素A乙酸酯和维生素E乙酸酯作为样本萃取液，无需进行氮吹等操作，且所需要样本量少，具有操作简单、成本可控的优点。并且样本萃取液中的维生素A乙酸酯和维生素E乙酸酯作为高效液相色谱分析中的内标物质使用，可以排除内源性干扰，减少误差。该试剂盒能满足相关法规对试剂盒的线性、重复性、批间差、准确度、稳定性等的要求，对监测人体维生素AE有重要作用。

Description

维生素A和维生素E的检测试剂盒、检测方法及应用
技术领域
本发明涉及维生素检测技术领域，尤其是涉及一种维生素A和维生素E的检测试剂盒、检测方法及应用。
背景技术
维生素A和维生素E属于常见的脂溶性维生素，是人体所必需的微量营养成分，对新陈代谢起调节作用。维生素A(vitaminA)又称视黄醇，是一个具有脂环的不饱和一元醇。母体VA水平影响胎儿VA水平，缺乏或过量可造成胎儿先天畸形，如唇裂、腭裂、小头畸形等。妊娠期间补充维生素A能够提高血红蛋白水平并且能降低贫血的发生率；VA活性物质在心脏的发育中有着重要的作用，孕妇早期缺乏会影响后代心脏发育而造成先天性心脏发育异常。维生素E(Vitamin E)是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，溶于脂肪和乙醇等有机溶剂，是最主要的抗氧化剂之一。生育酚能促进性激素分泌，使男子精子活力和数量增加；使女子雌性激素浓度增高，提高生育能力，预防流产；还可用于防治男性不育症、烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容等方面。妊娠期妇女身体代谢旺盛，自由基产生增加，脂质过氧化反应增强，如果孕妇体内维生素E含量低下，会导致过量自由基的寄居，从而引发胎盘老化、血管内皮损伤，增加妊娠期高血压疾病的发生风险和不良妊娠结局，带来胎膜细胞膜的损伤，增加胎膜早破的发生风险。因此，监测人体血清中维生素A和维生素E水平的检测，以辅助临床指导有效合理的补充维生素，对人体基本营养需求具有重大意义。
目前市场仅有一款诊断人体血清中维生素AE高效液相色谱法试剂盒，但前处理涉及氮吹等操作，前处理操作复杂且时间较长。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种维生素A和维生素E的检测试剂盒，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的目的之二在于提供上述试剂盒在非诊断和治疗目的的检测血清中维生素A和维生素E中的应用。
本发明的目的之三在于提供应用上述试剂盒对维生素A和维生素E的检测方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种维生素A和维生素E的检测试剂盒，包括：
用于高效液相色谱分析的校准品、质控品、样本萃取液和稀释液；
所述校准品包括6个浓度稀释梯度的含有维生素A和维生素E的混合液；
所述质控品包括2个浓度稀释梯度的含有维生素A和维生素E的混合液；
所述样本萃取液包括维生素A乙酸酯和维生素E乙酸酯；
所述稀释液为含有牛血清蛋白的溶液。
进一步的，所述校准品包括校准品S1、校准品S2、校准品S3、校准品S4、校准品S5和校准品S6；
校准品S1～S6中维生素A的浓度依次为0.6μg/mL、1.2μg/mL、2.4μg/mL、6μg/mL、12μg/mL和30μg/mL；维生素E的浓度依次为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL。
优选地，所述校准品以甲醇为溶剂。
进一步的，所述质控品包括低值质控品和高值质控品；
优选地，所述低值质控品和高值质控品均以甲醇为溶剂。
进一步的，所述低值质控品中维生素A的浓度为2μg/mL，维生素E的浓度为33.3μg/mL；
所述高值质控品中维生素A的浓度为12μg/mL，维生素E的浓度为200μg/mL。
进一步的，所述样本萃取液的溶剂为甲醇；
优选地，所述样本萃取液中维生素A乙酸酯的浓度为0.30～0.50μg/mL，维生素E乙酸酯的浓度为45～55μg/mL。
进一步的，所述稀释液为含有牛血清蛋白的生理盐水溶液；
优选地，所述稀释液为含有3～8％w/v牛血清蛋白的生理盐水溶液，优选含有5％w/v牛血清蛋白。
第二方面，本发明提供了上述的检测试剂盒在非诊断和治疗目的的检测血清中维生素A和维生素E中的应用。
第三方面，本发明提供了一种维生素A和维生素E的检测方法，对上述的检测试剂盒中的校准品、质控品和待测样本进行处理后，采用高效液相色谱方法对待测样本中的维生素A和维生素E进行检测。
进一步的，所述处理包括如下(A)-(C)中的至少一种：
(A)分别将校准品和质控品与稀释液混合，所述校准品和质控品与稀释液的体积比分别独立地为1:9；
(B)将待测样本与样本萃取液混合，所述待测样本与样本萃取液的体积比为1:5；
(C)将处理后的校准品、质控品和待测样本进行震荡并离心后，进行高效液相色谱检测；
优选地，所述待测样本包括血清。
进一步的，所述高效液相色谱的条件包括如下(a)-(e)中的至少一项：
(a)色谱柱为C18色谱柱；
优选地，色谱柱的规格为5μm粒径，4.6×100mm；
(b)色谱柱的温度为35～45℃，优选为40℃；
(c)进样量为45～55μL，优选为50μL；
(d)流动相为100％甲醇；
(e)流速为0.5～1.5mL/min，优选1mL/min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的试剂盒包括用于高效液相色谱分析的校准品、质控品、样本萃取液和稀释液，能同时检测维生素A和维生素E，达到单样本多指标同步检测功能。其中选用维生素A乙酸酯和维生素E乙酸酯作为样本萃取液，能够通过简单的一步萃取简单震荡即可快速完成对待测样本的萃取，无需进行氮吹等操作，且所需要样本量少，只需100μL即可，具有操作简单、成本可控的优点。并且样本萃取液中的维生素A乙酸酯和维生素E乙酸酯作为高效液相色谱分析中的内标物质使用，可以排除内源性干扰，减少误差。该试剂盒能满足相关法规对试剂盒的线性、重复性、批间差、准确度、稳定性等的要求，对监测人体维生素AE有重要作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的校准品色谱图；
图2为本发明实施例提供的人血清空白色谱图；
图3为本发明实施例提供的在人血清中添加低值质控色谱图；
图4为本发明实施例提供的在人血清中添加高值质控色谱图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的发明人针对市场上诊断人体血清中维生素AE高效液相色谱法试剂盒的问题与不足，研究了一种能准确、高效地评价人血清中维生素A和维生素E的检测试剂盒，包括：
用于高效液相色谱分析的校准品、质控品、样本萃取液和稀释液；
所述校准品包括6个浓度稀释梯度的含有维生素A和维生素E的混合液；
所述质控品包括2个浓度稀释梯度的含有维生素A和维生素E的混合液；
所述样本萃取液包括维生素A乙酸酯和维生素E乙酸酯；
所述稀释液为含有牛血清蛋白的溶液。
为便于标准曲线的建立，在一些优选的实施方式中，本发明提供的检测试剂盒中的校准品优选设置六个浓度点，包括校准品S1、校准品S2、校准品S3、校准品S4、校准品S5和校准品S6；在校准品S1～S6中，维生素A的浓度依次为0.6μg/mL、1.2μg/mL、2.4μg/mL、6μg/mL、12μg/mL和30μg/mL；维生素E的浓度依次为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL。
在一些优选的实施方式中，本发明提供的检测试剂盒中的质控品能够对检测结果进行质量控制，为了更全面的对检测结果进行评价，设置2个浓度梯度，分别为低值质控品和高值质控品。
其中，所述低值质控品中维生素A的浓度为2μg/mL，维生素E的浓度为33.3μg/mL；所述高值质控品中维生素A的浓度为12μg/mL，维生素E的浓度为200μg/mL。
在一些优选的实施方式中，本发明提供的样本萃取液中维生素A乙酸酯的浓度为0.30～0.50μg/mL，例如可以为，但不限于0.3μg/mL、0.35μg/mL、0.4μg/mL、0.45μg/mL或0.5μg/mL，优选为0.4μg/mL。维生素E乙酸酯的浓度为45～55μg/mL，例如可以为，但不限于45μg/mL、48μg/mL、50μg/mL、52μg/mL或55μg/mL，优选为40μg/mL。
选用特定浓度的维生素A乙酸酯和维生素E乙酸酯作为样本萃取液，能够通过简单的一步萃取简单震荡即可快速完成对待测样本的萃取，无需进行氮吹等操作，且所需要样本量少，只需100μL即可，具有操作简单、成本可控的优点。
本发明提供的稀释液可用于稀释校准品和质控品，在一些优选的实施方式中，所述稀释液为含有牛血清蛋白的生理盐水溶液，采用牛血清蛋白作为血清样本的替代基质，与临床血清样本基质相似，更能应用于临床样本的检验，具有易于获得、成本低、质量易于控制等优点。其中，以质量百分比计算，牛血清蛋白的含量为3～8％，例如可以为，但不限于3％、4％、5％、6％、7％或8％，优选为5％。
本试剂盒采用液相色谱法测定人体血清中维生素A和维生素E的含量。该试剂盒维生素A线性范围为0.06～3μg/mL、维生素E线性范围为1～50μg/mL，相关系数均r≥0.990；低值质控品重复性的变异系数(CV)≤20％，高值质控品重复性的变异系数(CV)≤15％；低值质控品的批间相对极差(R)≤20％，高值质控品的批间相对极差(R)≤15％；准确度的相对偏差(B)≤±15％。
基于本发明提供的检测试剂盒的有益效果，本发明还提供了上述检测试剂盒在非诊断和治疗目的的检测血清中维生素A和维生素E中的应用，具有检测准确度高，稳定性好，操作简单和检测用时短等优点。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种维生素A和维生素E的检测方法，包括对本发明提供的检测试剂盒中的校准品、质控品和待测样本进行处理后，采用高效液相色谱方法对待测样本中的维生素A和维生素E进行检测。
作为优选，所述处理包括如下(A)-(C)中的至少一种：
(A)分别将校准品和质控品与稀释液混合，所述校准品和质控品与稀释液的体积比分别独立地为1:9；
(B)将待测样本与样本萃取液混合，所述待测样本与样本萃取液的体积比为1:5；
(C)将处理后的校准品、质控品和待测样本进行震荡并离心后，进行高效液相色谱检测；
需要说明的是，当使用本发明提供的检测试剂盒进行检测时，对校准品和质控品的处理可以采用任一方式，考虑精密度和准确度优选采用(A)提供的方式，对待测样本的处理可以采用任一方式，考虑精密度和准确度优选采用(B)提供的方式，对处理后的校准品、质控品和待测样本的处理可以采用任一方式，考虑操作简便优选采用(C)提供的方式。上述(A)、(B)和(C)可以择一、择二采用，也可以全部采用。当全部采用上述(A)-(C)时，结果准确度更高。
作为优选，所述高效液相色谱的条件包括如下(a)-(e)中的至少一项：
(a)色谱柱为C18色谱柱；
优选地，色谱柱的规格为5μm粒径，4.6×100mm；
(b)色谱柱的温度为35～45℃，优选为40℃；
(c)进样量为45～55μL，优选为50μL；
(d)流动相为100％甲醇；
(e)流速为0.5～1.5mL/min，优选1mL/min。
需要说明的是，可以选择上述(a)-(e)中的一种、两种或多种作为高效液相色谱的条件，当全部采用上述(a)-(e)时，结果准确度更高。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
1.试剂、标准品、质控品、重要耗材信息
Figure BDA0003760584300000051
2.仪器
2.1分析仪器
仪器名称 型号 品牌 仪器编号
液相色谱分析仪 LC 2300 睦仪 MY20201216-A005
2.2其他仪器
仪器名称 型号 品牌
旋涡混匀仪 G560E VORT
高速冷冻离心机 D3024R 大龙兴创
100μL移液器 10-100μL eppendorf
1000μL移液器 100-1000μL eppendorf
实施例1
(一)试剂盒组成：
本实施例提供的试剂盒组成如下：
Figure BDA0003760584300000061
(二)试剂配制
1.工作校准品及质控品配制
(1)维生素A/E校准品G6的配制
精密移取维生素A和E标准品适量，置于合适的离心管中，加入甲醇混匀。
校准品G6配制：
Figure BDA0003760584300000062
(2)维生素A/E工作校准品G1～G5及工作质控品GQCL～GQCH的配制
校准品G1～G5及工作质控品GQCL～GQCH的配制是分别将校准品G6用甲醇稀释得到，稀释比例见下表。(注意校准品G6取样量不同)。
Figure BDA0003760584300000063
Figure BDA0003760584300000071
2.产品校准品及质控品配制
(1)维生素A(SSC-A)、维生素E(SSC-E)储备液配制
以配制1mg/mL维生素A储备液，5mg/mL维生素E储备液为例：
精确称取10mg左右维生素A(sigma，R7632)，在实际称量时需要对标准物质的纯度、所带的结晶水或者盐进行折算，转移至10.00mL的容量瓶中，加一定量甲醇，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒至维生素A完全溶解后，加甲醇定容至10.00mL，得1.00mg/mL的维生素A储备液(SSC-A)，转移至10mL棕色玻璃瓶中，贴标签，-20℃保存；
精确称取50mg左右维生素E(sigma，T3251-5G)，在实际称量时需要对标准物质的纯度、所带的结晶水或者盐进行折算，转移至10.00mL的容量瓶中，加一定量甲醇，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒至维生素E完全溶解后，加甲醇定容至10.00mL，得5.00mg/mL的维生素E储备液(SSC-E)，转移至10mL棕色玻璃瓶中，贴标签，-20℃保存。
(2)校准品S6配制(定容稀释法)
以配制25.00mL校准品S6为例：
使用移液器量取SSC-A溶液0.75mL，量取SSC-E溶液2.50mL，加入空白液H0(甲醇)定容至25.00mL，配制比例参考下表，配好后转移至30mL棕色玻璃瓶中，贴标签，-20℃保存。
Figure BDA0003760584300000072
(3)校准品S1～S5配制
Figure BDA0003760584300000073
(4)质控品配制
Figure BDA0003760584300000074
3.样本萃取液配制
(1)根据样本萃取液生产量，建议维生素A乙酸酯储备液浓度配制为约1.00mg/mL，精确称取10mg左右维生素A乙酸酯(Supelco，PHR1236)，在实际称量时需要对标准物质的纯度、所带的结晶水或者盐进行折算，转移至10.00mL的容量瓶中，加一定量甲醇，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒至维生素A乙酸酯完全溶解后，加甲醇定容至10.00mL，得1.00mg/mL的维生素A乙酸酯储备液(ISSC-A)，转移至10mL棕色玻璃瓶中，贴标签，-20℃保存；
(2)以生产4L样本萃取液为例，移取1.6mL ISSC-A和精确称取200.00mg维生素E乙酸酯(Supelco，PHR1030)(在实际称量时需要对标准物质的纯度、所带的结晶水或者盐进行折算)至4000mL容量瓶或其它容器中，HPLC级甲醇定容至刻度，上下颠倒15次以彻底混匀，配制成样本萃取液，其中维生素A乙酸酯含量为0.4g/mL，维生素E乙酸酯量为50g/mL，配制方法参考下表。
Figure BDA0003760584300000081
4.稀释液配制
以生产70盒试剂盒产品的稀释液的量为例，称取34.65g BSA放入一1L的玻璃容器中，用量筒量取693mL生理盐水放入上述1L的玻璃容器中，盖上瓶盖，上下振荡至BSA完全溶解。
(三)试剂盒使用
1.样品处理方法
1)加校准品、质控品溶液：精密移取10μL校准品、质控品溶液，分别加入到2mL离心管中；
2)加稀释液：精密移取90μL稀释液，分别加入到以上对应的离心管中；
3)加血清样本：精密移取100μL的血清样本，分别加入到2mL离心管中；
4)加样本萃取液：精密移取500μL样本萃取液，分别加入到以上对应的2mL离心管中；
5)震荡：盖上离心管盖，置于2mL涡旋混匀仪上，1500rpm充分震荡5min；
6)离心：于4℃、10000rpm离心10min。取200μL的上清液置于96孔U型板中；
7)检测：将96孔板置于LC中，进行检测。
2.液相分析
色谱条件：
Figure BDA0003760584300000082
Figure BDA0003760584300000091
效果例1试剂盒外观
1.外观
1)验证方法：随机取试剂盒中校准品各1瓶，在自然光下以矫正视力目视观察。
2)接受标准：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物。
2.实验结果：
(a)试剂盒的各组份应齐全、完整、无破损。
(b)最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏。
(c)液体组分应澄清、透明，无沉淀、颗粒或絮状物。
3.结论：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分澄清，无沉淀、颗粒或絮状物，满足接受标准。
效果例2试剂盒装量
1.装量
1)验证方法：随机取1试剂盒，用通用量具测量各液体组分的净含量。
2)接受标准：试剂盒中各液体试剂的净含量应不少于标示值。
2.实验结果：
Figure BDA0003760584300000092
3.结论：试剂盒中各液体试剂的净含量不少于标示值，满足接受标准。
效果例3试剂盒线性范围
1.线性范围
1)验证方法：按样品处理方法处理待测产品校准品S1～S6溶液，每个浓度重复测试3次。可参考公式计算线性回归的相关系数r，相关系数r应≥0.990。
Figure BDA0003760584300000101
r：线性回归相关系数
xi：S1～S6的浓度
yi：对应浓度溶液中校准品与其内标的峰面积比值均值
2)接受标准：维生素A和E线性回归的相关系数r均≥0.990。
2.实验结果
线性范围：维生素A:0.06ug/mL～3ug/mL；维生素E：1ug/mL～50ug/mL
Figure BDA0003760584300000102
3.结论：维生素A和维生素E线性回归的相关系数r均≥0.990，满足接受标准。
效果例4试剂盒重复性
1.重复性
1)验证方法：在重复性条件下，按照检验方法使用试剂盒测试质控品，重复测试10次。可参考公式计算重复性的变异系数(CV)，低值质控品CV≤20％，高值质控品CV≤15％。
Figure BDA0003760584300000103
CV：重复性的变异系数
Figure BDA0003760584300000104
10次测量结果的平均值
S：10次测量结果的标准差
2)接受标准：低值质控品的变异系数CV≤20％，高值质控品的变异系数CV≤15％。
2.实验结果
Figure BDA0003760584300000105
Figure BDA0003760584300000111
3.结论：低值质控品的变异系数CV≤20％，高值质控品的变异系数CV≤15％，满足接受标准。
效果例5试剂盒批间差
1.批间差
1)验证方法：按照检验方法使用三个不同批号的试剂盒测试质控品，重复测试3次。可参考公式计算批间相对极差(R)，低值质控品的批间相对极差R≤20％，高值质控品的批间相对极差R≤15％。
Figure BDA0003760584300000112
Figure BDA0003760584300000113
R：批间相对极差；
Figure BDA0003760584300000114
每批3次测量结果的平均值；
Figure BDA0003760584300000115
中的最大值；
Figure BDA0003760584300000116
中的最小值；
Figure BDA0003760584300000117
3批检测均值。
2)接受标准：低值质控品的批间相对极差R≤20％，高值质控品的批间相对极差R≤15％。
2.实验结果
Figure BDA0003760584300000118
Figure BDA0003760584300000121
3.结论：低值质控品的批间相对极差R≤20％，高值质控品的批间相对极差R≤15％，满足接受标准。
效果例6试剂盒准确度
1.准确度
1)验证方法：按照实施例1检验方法使用本试剂盒测试标准参考物质SRM2972a，重复测量3次。可参考公式计算准确度的相对偏差(B)，相对偏差应在[85％，115％]。
B＝(M-T)/T×100％；
B：相对偏差；M：测试结果均值；T：标示值。
2)接受标准：准确度的相对偏差B应≤±15％。
2.实验结果
Figure BDA0003760584300000122
3.结论：准确度的相对偏差B应≤±15％，满足接受标准。
效果例7试剂盒效期稳定性
1.效期稳定性
1)验证方法：取在正常储存温度条件下(-18℃±8℃)避光保存超过有效期(6个月)后1个月内试剂盒，按照效果例1～4、效果例6进行检测，结果符合其相应要求。
2)接受标准：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物；试剂盒中各液体试剂的净含量应不少于标示值；25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3线性回归的相关系数r均≥0.990；低值质控品的变异系数CV≤20％，高值质控品的变异系数CV≤15％；准确度的相对偏差B应≤±15％。
2.实验结果
1)外观
(a)试剂盒的各组份应齐全、完整、无破损。
(b)最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏。
(c)液体组分应澄清、透明，无沉淀、颗粒或絮状物。
2)装量
Figure BDA0003760584300000131
3)线性范围
线性范围：维生素A:0.06ug/mL～3ug/mL；维生素E：1ug/mL～50ug/mL
Figure BDA0003760584300000132
4)重复性
Figure BDA0003760584300000133
Figure BDA0003760584300000141
5)准确度
Figure BDA0003760584300000142
3.结论：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分澄清，无沉淀、颗粒或絮状物；试剂盒中各液体试剂的净含量不少1于标示值；维生素A和维生素E线性回归的相关系数r均≥0.990；低值质控品的变异系数CV≤20％，高值质控品的变异系数CV≤15％；准确度的相对偏差B应≤±15％，满足接受标准。
效果例8试剂盒校准品
1.外观
1)验证方法：随机取试剂盒中校准品各1瓶，在自然光下以矫正视力目视观察。
2)接受标准：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物。
3)实验结果：
(a)各校准品组份应包装完整、无破损。
(b)各校准品组份包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏。
(c)各校准品组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物。
4)结论：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物，满足接受标准。
2.装量
1)验证方法：随机取试剂盒中校准品各1瓶，使用通用量具检测体积。
2)接受标准：试剂盒中校准品的净含量应不少于标示值。
3)实验结果
Figure BDA0003760584300000143
Figure BDA0003760584300000151
4)结论：试剂盒中校准品的净含量不少于标示值，满足接受标准。
3.准确度
1)验证方法：按照检测方法以工作校准品定标，测试试剂盒的各校准品，重复检测3次。可参考公式计算准确度的相对偏差(B)，相对偏差应在[85％，115％]。
B＝(M-T)/T×100％
B：相对偏差；M：测试结果均值；T：标示值。
2)接受标准：准确度的相对偏差B应≤±15％。
3)实验结果
Figure BDA0003760584300000152
4)结论：准确度的相对偏差B≤±15％，满足接受标准。
4.均一性
1)验证方法：按照检测方法测试同一批号的10瓶校准品，根据公式(1)和(2)计算10个测量值的平均值
Figure BDA0003760584300000153
和标准差(S1)。再对该批号中的1瓶重复测试10次，计算结果平均值
Figure BDA0003760584300000154
和标准差(S2)。按照公式(3)、公式(4)计算出变异系数(CV)，S1～S3校准品的变异系数CV≤20％，S4～S6校准品的变异系数CV≤15％。
Figure BDA0003760584300000155
Figure BDA0003760584300000156
Figure BDA0003760584300000157
Figure BDA0003760584300000158
当S1＜S2时，令CV＝0。
2)接受标准：S1～S3校准品的变异系数CV≤20％，S4～S6校准品的变异系数CV≤15％。
3)实验结果
Figure BDA0003760584300000161
Figure BDA0003760584300000162
Figure BDA0003760584300000171
4)结论：S1～S3校准品的变异系数CV≤20％，S4～S6校准品的变异系数CV≤15％，满足接受标准。
5.稳定性
a)开瓶稳定性
1)验证方法：开封后，在正常储存温度条件下(-18℃±8℃)避光保存超过开瓶有效期(15天)后1周内的试剂盒校准品，按照效果例8第2部分(装量)～第4部分(准确度)进行检测，结果符合其相应要求。
2)接受标准：试剂盒中校准品的净含量不少于标示值；准确度的相对偏差B应≤±15％；S1～S3校准品的变异系数CV≤20％，S4～S6校准品的变异系数CV≤15％。
3)实验结果：
A)装量
Figure BDA0003760584300000172
Figure BDA0003760584300000181
B)准确度
Figure BDA0003760584300000182
C)均一性
Figure BDA0003760584300000183
Figure BDA0003760584300000191
Figure BDA0003760584300000192
4)结论：试剂盒中校准品的净含量不少于标示值；校准品准确度的相对偏差B≤±15％；S1～S3校准品的变异系数CV≤20％，S4～S6校准品的变异系数CV≤15％，满足接受标准。
b)效期稳定性
1)验证方法：取在正常储存温度条件下(-18℃±8℃)避光保存超过有效期(6个月)后1个月内试剂盒校准品，按照效果例8第1部分(外观)～第4部分(均一性)进行检测，结果符合其相应要求。
2)接受标准：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物；试剂盒中校准品的净含量应不少于标示值；准确度的相对偏差B应≤±15％；S1～S3校准品的变异系数CV≤20％，S4～S6校准品的变异系数CV≤15％。
3)实验结果：
A)外观：
(a)各校准品组份应包装完整、无破损。
(b)各校准品组份包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏。
(c)各校准品组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物。
B)装量：
装量 实测 standard 判定
S1 120μL ≥120μL 合格
S2 120μL ≥120μL 合格
S3 120μL ≥120μL 合格
S4 120μL ≥120μL 合格
S5 120μL ≥120μL 合格
S6 120μL ≥120μL 合格
C)准确度
Figure BDA0003760584300000201
D)均一性
Figure BDA0003760584300000202
Figure BDA0003760584300000211
Figure BDA0003760584300000212
4)结论：校准品包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分澄清，无沉淀、颗粒或絮状物；试剂盒中校准品的净含量不少于标示值；准确度的相对偏差B≤±15％；S1～S3校准品均一性的变异系数CV≤20％，S4～S6校准品均一性的变异系数CV≤15％，满足接受标准。
效果例9试剂盒质控品
1.外观
1)验证方法：随机取试剂盒中质控品各1瓶，在自然光下以矫正视力目视观察。
2)接受标准：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物。
3)实验结果：
(a)各质控品组份包装完整、无破损。
(b)各质控品组份包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏。
(c)各质控品组分澄清，无沉淀、颗粒或絮状物。
4)结论：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物，满足接受标准。
2.装量：
1)验证方法：随机取试剂盒中质控品各1瓶，使用通用量具检测体积。
2)接受标准：试剂盒中质控品的净含量应不少于标示值。
3)实验结果
装量 实测 standard 判定
QCL 120μL ≥120μL 合格
QCH 120μL ≥120μL 合格
4)结论：试剂盒中质控品的净含量不少于标示值，满足接受标准。
3.预期结果：
1)验证方法：按照检测方法进行操作，以产品校准品定标，测试试剂盒中的各质控品，重复测试3次。质控品的检测结果应在该质控品的可接受范围内。
2)接受标准：质控品的检测结果应在该质控品的可接受范围内。
3)实验结果
Figure BDA0003760584300000221
4)结论：质控品的检测结果在该质控品的可接受范围内，满足接受标准。
4.均一性
1)验证方法：按照检测方法测试测试同一批号试剂盒内质控品各10瓶，每个浓度水平的质控品随机编号1～10，每瓶重复测试3次。
3次测试按照以下顺序进行：1、3、5、7、9、2、4、6、8、10、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、2、4、6、8、10、1、3、5、7、9。
记录检测结果，按照式(5～14)计算F、Sbb、Sr、和CV瓶间。
Figure BDA0003760584300000231
Figure BDA0003760584300000232
SS瓶内＝SS总和-SS瓶间…………………………………………公式(7)
Figure BDA0003760584300000233
Figure BDA0003760584300000234
Figure BDA0003760584300000235
Figure BDA0003760584300000236
Figure BDA0003760584300000237
Figure BDA0003760584300000238
Figure BDA0003760584300000239
CV：变异系数；SS：方差；V：自由度；MS：均方；F：F检验值；n0：有效测量次数；sbb：瓶间标准差；sr：重复性标准差；X：测量或计算结果；
Figure BDA00037605843000002310
总平均值。
当F≤1时，以sr代替sbb计算CV瓶间，结果应符合其相应的要求。
当F≤F0.05(v1，v2)时，检验结果显示瓶间均匀性无显著性差异，计算结果CV瓶间，结果应符合其相应的要求。
当F＞F0.05(v1，v2)、sbb≤0.3δ时，认为瓶间均匀性良好，计算结果CV瓶间，结果应符合其相应的要求。
当F＞F0.05(v1，v2)、sbb＞0.3δ时，认为瓶间均匀性较差，不符合其相应的要求。
注：δ为目标标准偏差。
2)接受标准：低值质控品的变异系数CV≤20％，高值质控品的变异系数CV≤15％。
3)实验结果
Figure BDA00037605843000002311
Figure BDA0003760584300000241
维生素A：F0.05＝2.39，QCL：0.3δ＝0.15*靶值＝0.15*0.21＝0.003
维生素E：F0.05＝2.39，QCL：0.3δ＝0.15*靶值＝0.15*3.37＝0.05
Figure BDA0003760584300000242
Figure BDA0003760584300000251
维生素A：F0.05＝2.39，QCH：0.3δ＝0.15*靶值＝0.15*1.22＝0.02
维生素E：F0.05＝2.39，QCH：0.3δ＝0.15*靶值＝0.15*20.18＝0.3
4)结论：低值质控品的变异系数CV≤20％，高值质控品的变异系数CV≤15％，满足接受标准。
5.稳定性
a)开瓶稳定性
1)验证方法：开封后，取在正常储存温度条件下(-18±8℃)避光保存超过开瓶有效期(15天)的试剂盒质控品，各质控品分别取3支，每支重复测定2次。可参考公式进行差异显著性检验，差异应不显著。
Figure BDA0003760584300000252
Figure BDA0003760584300000253
开瓶稳定期末的测定均值；
Figure BDA0003760584300000254
新开瓶的测定均值；n1：新开瓶的测定次数；n2：开瓶稳定期末的测定次数；s1：新开瓶的测定标准差；s2：开瓶稳定器末的测定标准差。
当t＜显著性水平a(a＝0.05)自由度为(n1+n2-2)的临界值ta(n1+n2-2)，则两个平均值之间无显著差异。
2)接受标准：t＜显著性水平a(a＝0.05)自由度为(n1+n2-2)的临界值ta(n1+n2-2)。
3)实验结果
Figure BDA0003760584300000255
Figure BDA0003760584300000261
4)结论：t＜显著性水平a(a＝0.05)自由度为(n1+n2-2)的临界值ta(n1+n2-2)，满足接受标准。
b)效期稳定性：
1)验证方法：对稳定性研究数据进行统计处理，可根参考公式进行趋势显著性检验，趋势应不显著。
Figure BDA0003760584300000262
Figure BDA0003760584300000263
Figure BDA0003760584300000264
t0.05，n-2＝TINV(0.05，n-2)…………………………………………公式(18)
当|b1|＜t0.05，n-2·s(b1)时，表示趋势不显著，否则趋势显著。
2)接受标准：|b1|＜t0.05，n-2·s(b1)
3)实验结果：
QCL
Figure BDA0003760584300000265
QCH
Figure BDA0003760584300000271
4)结论：|b1|＜t0.05，n-2·s(b1)，满足接受标准。
效果例10人血清中加标回收测试
1.加标回收率
1)加标样本配置：分别为空白样本和两个水平的加标样本。取90μL的人血清样本，加入10μL甲醇，得空白样本；取90μL的人血清样本，加入10μL维生素A浓度为2μg/mL，维生素E浓度为33.3μg/mL的标准溶液，得低水平加标样本；取90μL的人血清样本，加入10μL维生素A浓度为12μg/mL，维生素E浓度为200μg/mL的标准溶液,得高水平加标样本。
2)验证方法：将上述加标样本经前处理后，应用本发明实施例1提供的方法进行上机测试，每个浓度平行处理3份，计算加标回收率，连续做三天，共三个分析批。加标回收率在[85％，115％]。
B＝(M加标-M空白)/T×100％
B：加标回收率；M加标：加标样本的测试值；M空白：空白样本的测量值；T：加标浓度值。
2)接受标准：加标回收率在[85％，115％]。
2.实验结果
Figure BDA0003760584300000272
Figure BDA0003760584300000281
3.结论：加标回收率在[85％，115％]，满足接受标准。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种维生素A和维生素E的检测试剂盒，其特征在于，包括：
用于高效液相色谱分析的校准品、质控品、样本萃取液和稀释液；
所述校准品包括6个浓度稀释梯度的含有维生素A和维生素E的混合液；
所述质控品包括2个浓度稀释梯度的含有维生素A和维生素E的混合液；
所述样本萃取液包括维生素A乙酸酯和维生素E乙酸酯；
所述稀释液为含有牛血清蛋白的溶液。
2.据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述校准品包括校准品S1、校准品S2、校准品S3、校准品S4、校准品S5和校准品S6；
校准品S1～S6中维生素A的浓度依次为0.6μg/mL、1.2μg/mL、2.4μg/mL、6μg/mL、12μg/mL和30μg/mL；维生素E的浓度依次为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL；
优选地，所述校准品以甲醇为溶剂。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述质控品包括低值质控品和高值质控品；
优选地，所述低值质控品和高值质控品均以甲醇为溶剂。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述低值质控品中维生素A的浓度为2μg/mL，维生素E的浓度为33.3μg/mL；
所述高值质控品中维生素A的浓度为12μg/mL，维生素E的浓度为200μg/mL。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述样本萃取液的溶剂为甲醇；
优选地，所述样本萃取液中维生素A乙酸酯的浓度为0.30～0.50μg/mL，维生素E乙酸酯的浓度为45～55μg/mL。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液为含有牛血清蛋白的生理盐水溶液；
优选地，所述稀释液为含有3～8％w/v牛血清蛋白的生理盐水溶液，优选含有5％w/v牛血清蛋白。
7.权利要求1-6任一项所述的检测试剂盒在非诊断和治疗目的的检测血清中维生素A和维生素E中的应用。
8.一种维生素A和维生素E的检测方法，其特征在于，对权利要求1-6任一项所述的检测试剂盒中的校准品、质控品和待测样本进行处理后，采用高效液相色谱方法对待测样本中的维生素A和维生素E进行检测。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述处理包括如下(A)-(C)中的至少一种：
(A)分别将校准品和质控品与稀释液混合，所述校准品和质控品与稀释液的体积比分别独立地为1:9；
(B)将待测样本与样本萃取液混合，所述待测样本与样本萃取液的体积比为1:5；
(C)将处理后的校准品、质控品和待测样本进行震荡并离心后，进行高效液相色谱检测；
优选地，所述待测样本包括血清。
10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的条件包括如下(a)-(e)中的至少一项：
(a)色谱柱为C18色谱柱；
优选地，色谱柱的规格为5μm粒径，4.6×100mm；
(b)色谱柱的温度为35～45℃，优选为40℃；
(c)进样量为45～55μL，优选为50μL；
(d)流动相为100％甲醇；
(e)流速为0.5～1.5mL/min，优选1mL/min。
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