CN111929391A - 用于准确测定人血清中维生素a和e浓度的试剂盒及检测方法 - Google Patents
用于准确测定人血清中维生素a和e浓度的试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒及检测方法，包括：校准品母液：含2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚无水乙醇为稀释液，2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚浓度为0.1‑1.0mg/mL，配6个浓度点的校准品母液；内标：内标溶液为视黄醇乙酸酯和维生素E醋酸酯的混合溶液；质控品：包括质控品1和质控品2；稀释液：为牛蛋白血清的空白基质溶液，牛蛋白血清的质量百分比含量为1‑10％；萃取液：萃取液为含2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚的正己烷溶液；复溶液：复溶液为体积百分比为93％‑100％的甲醇水溶液；流动相：流动相A为水溶液，流动相B为甲醇溶液，且流动相A和流动相B中含有体积百分比浓度为0‑0.2％的甲酸。准确率高、检测时间短、试剂耗用量少、操作方便和成本低廉的优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒及检测方法。
背景技术
维生素A和维生素E是人体维持正常代谢和机能所必需的脂溶性维生素，不能在人体自行合成，需从食物中摄取。维生素A主要存在于动物肝脏、血液和眼球的视网膜中，又称为视黄醇，具有维持正常视觉、调节人体生长发育、增加机体免疫力等作用，缺乏时将增加机体被细菌感染的机会，引起呼吸道、消化道等感染性疾病及眼部病变等疾病的发生。维生素E在抗氧化、抗自由基、提高免疫功能抗衰老、抗癌变等过程中发挥重要作用；它能促进性激素分泌，使男子精子活力和数量增加；使女子雌性激素浓度增高，提高生育能力，预防流产。维生素E缺乏时会出现睾丸萎缩和上皮细胞变性，孕育异常。在临床上常用维生素E治疗先兆流产和习惯性流产。由于维生素A和E具有广泛而重要的生物学作用以及缺乏时明显增加各种疾病的风险，加之中国人群维生素A和E普遍缺乏的现状，因此开展维生素A和E水平的常规检测工作具有非常重要的临床意义。
目前，用于血清中维生素A和E的常规检测，主要有免疫法、荧光法、HPLC法和LC-MS/MS法。其中免疫法分析周期短，自动化程度高，操作简便，但试剂需依赖进口，价格昂贵，效期短，不能多种药物同时测定，对于病源不多的基层医院，成本相对较高，不利于基层医院开展。而且，当某些抗原具有与待测物相同的抗原表面标志或抗体有多个抗原结合位点时，可导致抗体与抗原结构相近的母体代谢产物、内源性物质产生交叉反应，使得测定结果不够准确，测定结果往往高于专一性更强的色谱法。荧光法有诸多不足，正相HPLC因溶剂纯度要求高、价格贵、且要接触较多对人体有害的有机溶剂，一般尽量避免使用；HPLC法和LC-MS/MS法特异性强，灵敏度高，通过调整合适的色谱条件其代谢产物不会干扰到分析物的测定，并可同时测定多种药物及其代谢产物，结果准确，且线性范围相对较宽，能够满足临床病人的检测，但所用样品需进行预处理，且测定周期相对免疫法较长，而LC-MS/MS相较于HPLC，其仪器价格和维护成本也相应较高，用不同的质谱仪器测量，依旧会有差异，对于操作人员的要求较高，所花时间和成本不扉，对于临床使用来讲还有不少距离。目前报道的反相HPLC测定法前处理多采用固相萃取、液液萃取、浊点萃取、分散液相微萃取等等，采用固相萃取技术处理血液标本的方法可以去除更多杂质，但固相萃取小柱比较昂贵，用于常规临检项目成本较高，而其他前处理技术有的繁琐耗时、需要较多有机溶剂，且血清量需要量较大，整个样品分析过程中，前处理过程所需的时间占整个分析时间的2/3，并可能产生1/3以上的误差。而且，液相临床检验方法均为实验室自行建立的方法，采用的试剂多为非试剂盒产品，因此，迫切需要商品化的液相检测试剂盒。
发明内容
本发明针对上述现有技术的不足，提供一种无需进行复杂的净化提纯步骤，而且所需样本量小，可与液相色谱仪配套使用，采用牛蛋白血清的空白基质溶液作为模拟血清，与临床血清样本基质相似，更能应用于临床样本的检验；同时，该产品能同时检测维生素A和维生素E，达到单样本多指标同步检测功能，具有准确率高、检测时间短、试剂耗用量少、操作方便和成本低廉等特点的用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒，该试剂盒主要包括：
(1)校准品母液：使用含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的无水乙醇为稀释液，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.1-1.0mg/mL，配制包括6个浓度点的校准品母液，校准品母液的6个浓度点依次为：
视黄醇：0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.50μg/mL、7.50μg/mL、15.00μg/mL；
±α-生育酚((±)-α-生育酚，CAS#：10191-41-0)：5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、50.00μg/mL、150.00μg/mL、300.00μg/mL；
上述校准品母液均为视黄醇和±α-生育酚的混合溶液；六个点的浓度为视黄醇和±α-生育酚各自在总的混合溶液中的浓度；校准品工作液的浓度＝校准品母液浓度×20/100；
(2)内标：内标溶液为视黄醇乙酸酯和维生素E醋酸酯的混合溶液，使用含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的无水乙醇为稀释液，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.1-1.0mg/mL(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚在稀释液中的浓度)，且视黄醇乙酸酯在内标溶液中的浓度范围为0.05-1.25μg/mL，维生素E醋酸酯在内标溶液中的浓度范围为5-75μg/mL；
(3)质控品：包括质控品1和质控品2，其中
质控品1的浓度范围和成分包括：视黄醇：0.3-0.7μg/mL；±α-生育酚：7-13μg/mL；
质控品2的浓度范围和成分包括：视黄醇：1.0-1.5μg/mL；±α-生育酚：15-25μg/mL；
质控品1和质控品2均为视黄醇和±α-生育酚的混合物；各个成分的浓度为在质控品1或质控品2的混合物中的各自浓度；
(4)稀释液：稀释液为牛蛋白血清(BSA)的空白基质溶液，牛蛋白血清的质量百分比含量为1-10％。
(5)萃取液：萃取液为含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.1-1.5mg/mL；
(6)复溶液：复溶液为体积百分比为93％-100％的甲醇水溶液；
(7)流动相：流动相A为水溶液，流动相B为甲醇溶液，且流动相A和流动相B中均含有体积百分比浓度为0-0.2％的甲酸。
优选的，本发明上述步骤(1)和步骤(2)中2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.5mg/mL。
优选的，本发明上述步骤(3)中的质控品1和质控品2均为视黄醇和±α-生育酚的混合物，形式为冻干粉、血清基质或乙醇溶液基质。
优选的，本发明上述步骤(4)稀释液中空白基质溶液为含BSA的水溶液，BSA的质量百分比为5％。
优选的，本发明上述步骤(5)萃取液中2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为1.0mg/mL。
优选的，本发明上述步骤(6)复溶液的体积百分比为95％的甲醇水溶液。
优选的，本发明上述步骤(7)流动相A和流动相B中甲酸的体积百分比浓度为0％。
本发明上述试剂盒中还包括操作说明书。
本发明还提供一种用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒的检测方法，包括：向人血清中加入含有视黄醇乙酸酯和维生素E醋酸酯的混合内标，混合，然后加入萃取液，混合离心，移取上清液氮气吹干后加入复溶液复溶，混合离心，取上清液使用液相色谱仪-PDA检测器进行检测，采用内标标准曲线法进行定量。
本发明用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒的检测方法，其具体的方法步骤为：
(1)检测样本处理
(1.1)校准品：在室温下，吸取20μL校准品母液于离心管中，再加入80μL稀释液，漩涡混合后，再加入200μL含有已知浓度的混合内标，漩涡混合1min后加入800μL萃取液，漩涡混合5min以使其完全混匀，8000r/min离心5min，取上清液氮气吹干；再加入100μL复溶液复溶，漩涡混合后，15000r/min离心5min，取上清80μL加入到进样瓶中用于色谱分析；
(1.2)质控品/血清样本：在室温下，准确吸取100μL质控品/血清样本于离心管中，再加入200μL含有已知浓度的混合内标，漩涡混合1min后加入800μL萃取液，漩涡混合5min以使其完全混匀，8000r/min离心5min，取上清液氮气吹干；再加入100μL复溶液复溶，漩涡混合后，15000r/min离心5min，取上清80μL加入到进样瓶中用于色谱分析；
(2)样本检测分析
(2.1)色谱条件
·色谱柱：C18柱或者相当；
·流动相：流动相A和流动相B；
·检测波长：视黄醇(325nm)；±α-生育酚(291nm)；
·流速：0.5mL/min；
·梯度洗脱：按下表1所示；
表1
上表中的梯度洗脱过程，流动相中流动相A和流动相B体积比例随时间不断调整变化，以流动相B的占比变化为体现。
·柱温：30℃；
·进样器温度：8℃；
·进样量：20μL；
(2.2)取处理好的校准品、质控品和样本各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图；
(2.3)检测结果的计算
(2.3.1)校准曲线的绘制与拟合：一般液相色谱分析软件可根据校准结果自动绘制校准曲线，以6个校准品工作液与内标的浓度比为横坐标(x)，以6个校准品工作液的实际测定峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，用最小二乘法进行线性回归，自动绘制标准曲线，可获得回归方程：y＝ax+b，其中y为纵坐标，x为横坐标，a为斜率，b为截距，并计算r(相关系数)值，r值≥0.9900；
(2.3.2)回收率的计算：质控品各分析物的测定浓度可根据质控品中各分析物及对应内标的峰面积的比值由校准曲线获得，其回收率的计算公式为：回收率(％)＝测定浓度/标示浓度×100，回收率(％)应在85％-115％范围内；
(2.3.3)样本结果的计算：样本中的各分析物测定浓度可根据样本中各分析物及对应内标的峰面积的比值由校准曲线获得。
本发明上述步骤(1.1)中加入萃取液的体积为800μL，确保待测物质能够从样本中完全提取出来；复溶液的体积为100μL，确保待测物质能够从样本中完全复溶出来。
本发明上述步骤(1.1)中加入萃取液混合离心为低温离心，即在5-10℃、优选8℃下8000rpm离心；加入复溶液混合离心为低温高速离心，即在5-10℃、优选8℃下15000rpm离心。离心过程优选在低温下进行以保证样本物质稳定，低速、高速配合离心满足将待测物质提取出来的目的。
本发明上述步骤(1.1)中上清液在室温下氮气吹干，以氮气作为保护气且不加热来确保样品中待测物质的稳定。
本发明的优点和有益效果：
1.采用本发明试剂盒来处理血清样本，通过简单的液液萃取(一步萃取)前处理方法，无需进行复杂的净化提纯步骤就可以获得非常干净的处理液，而且所需样本量小，可与液相色谱仪配套使用，采用牛蛋白血清的空白基质溶液作为模拟血清，与临床血清样本基质相似，更能应用于临床样本的检验；同时，该产品能同时检测维生素A和维生素E，达到单样本多指标同步检测功能，具有准确率高、检测时间短、试剂耗用量少、操作方便和成本低廉等特点。
2.本申请使用的检测仪器是液相色谱-PDA检测器，而现有技术采用的荧光检测器和质谱检测器，在成本和使用上其仪器价格和维护成本也相应较高，对于操作人员的要求较高，所花时间和成本不扉，相较于本专利使用的液相色谱-PDA检测器更多更高，且质谱使用的同位素内标价格都比结构类似物的内标贵。
3.现有技术的前处理过程中在加入内标后又用纯水或甲酸水稀释后再加入乙醇、甲醇或乙腈溶液，以去除蛋白，最后加入萃取剂萃取；也有现有技术的前处理采用在加入内标后又加入甲醇和硫酸锌溶液，最后加入萃取剂萃取；而本专利在加入内标后直接加入萃取剂进行萃取(一步萃取)，样本前处理方法简单，不需要复杂的步骤就可以获得非常干净的处理液。
4.同样的使用液相色谱仪进行分析，现有技术标准曲线系列溶液在检测前必须进行紫外分光光度计重新标定浓度，来计算出标准储备液的实际浓度值，操作繁琐；而本专利用稀释液(牛蛋白血清的空白基质溶液)来模拟血清基质可直接进行校正，就可以准确定量血清样本中的维生素A和E浓度。且在溶液中加入抗氧化剂，使操作过程中不需避光即可完成，比现有技术的上述方法更为准确。
5.本专利使用的流动相只需甲醇和水，无需添加酸溶液，而现有技术使用的流动相是正相有机溶剂，且萃取剂直接进样，溶剂纯度要求高、价格贵、且接触较多对人体有害，一般尽量避免使用；而本申请使用的血清样本少，更能应用于临床检验。
附图说明
图1为本发明维生素A和维生素E标准溶液的色谱图。
图2为本发明维生素A和维生素E实测样品的色谱图。
图3为维生素A标准曲线，线性范围：(0.50～3.00)μg/mL。
图4为维生素E标准曲线，线性范围：(1.00～60.00)μg/mL。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
实施例1：
1.校准品母液：使用含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的无水乙醇为稀释液，稀释液中BHT的浓度为0.5mg/mL，然后配制包括6个浓度点的校准品母液，校准品母液的6个浓度点依次为：
视黄醇：0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.50μg/mL、7.50μg/mL、15.00μg/mL；
±α-生育酚：5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、50.00μg/mL、150.00μg/mL、300.00μg/mL；
上述校准品母液均为视黄醇和±α-生育酚的混合溶液(即母液中同时含有视黄醇和±α-生育酚，含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的无水乙醇为稀释液)；六个点的浓度为视黄醇和±α-生育酚各个成分在总的混合溶液中的各自浓度；校准品工作液的浓度＝校准品母液浓度×20/100；
2.内标：视黄醇乙酸酯和维生素E醋酸酯的混合溶液，使用含BHT的无水乙醇为稀释液，BHT的浓度为0.5mg/mL，且视黄醇乙酸酯在内标溶液中的浓度为0.25μg/mL，维生素E醋酸酯在内标溶液中的浓度为25μg/mL；
3.质控品：质控品1包括：视黄醇：0.4μg/mL；±α-生育酚：11μg/mL；质控品2，包括：视黄醇：1.1μg/mL；±α-生育酚：20μg/mL；质控品1和质控品2均为视黄醇和±α-生育酚的混合物；各个成分的浓度为在混合物中的各自浓度；
4.稀释液：牛蛋白血清(BSA)的水溶液，BSA的质量百分比为5％；
5.萃取液：含BHT的正己烷溶液，BHT的浓度为1.0mg/mL；
6.复溶液：体积百分比为95％的甲醇水溶液；
7.流动相：流动相A为水溶液，流动相B为甲醇溶液，且流动相A和流动相B中甲酸的体积百分比浓度为0％。
利用上述试剂盒进行检测，步骤如下：
(1)检测样本处理
①校准品：在室温下，吸取20μL校准品母液于离心管中，再加入80μL稀释液，漩涡混合后，再加入200μL含有已知浓度的混合内标，漩涡混合1min后加入800μL萃取液，漩涡混合5min以使其完全混匀，8000r/min离心5min，取上清液氮气吹干，再加入100μL复溶液复溶，漩涡混合后，15000r/min离心5min，取上清80μL加入到进样瓶中用于色谱分析。
②质控品/血清样本：在室温下，准确吸取100μL质控品/血清样本于离心管中，再加入200μL含有已知浓度的混合内标，漩涡混合1min后加入800μL萃取液，漩涡混合5min以使其完全混匀，8000r/min离心5min，取上清液氮气吹干，再加入100μL复溶液复溶，漩涡混合后，15000r/min离心5min，取上清80μL加入到进样瓶中用于色谱分析。
(2)样本检测分析
色谱条件
·色谱柱：C18柱或者相当；
·流动相：流动相A和流动相B；
·检测波长：视黄醇(325nm)；±α-生育酚(291nm)；
·流速：0.5mL/min；
·梯度洗脱：按下表1所示；
表1
上表中的梯度洗脱过程，流动相中流动相A和流动相B体积比例随时间不断调整变化，
以流动相B的占比变化为体现。
·柱温：30℃；
·进样器温度：8℃；
·进样量：20μL；
实施例2：
1.校准品母液：使用含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的无水乙醇为稀释液，BHT的浓度为0.5mg/mL，配制包括6个浓度点的校准品母液，校准品母液的6个浓度点依次为：
视黄醇：0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.50μg/mL、7.50μg/mL、15.00μg/mL；
±α-生育酚：5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、50.00μg/mL、150.00μg/mL、300.00μg/mL；
上述校准品母液均为视黄醇和±α-生育酚的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；校准品工作液的浓度＝校准品母液浓度×20/100；
2.内标：视黄醇乙酸酯和维生素E醋酸酯的混合溶液，使用含BHT的无水乙醇为稀释液，BHT的浓度为0.5mg/mL，且视黄醇乙酸酯在内标溶液中的浓度为0.25μg/mL，维生素E醋酸酯在内标溶液中的浓度为25μg/mL；
3.质控品：质控品1包括：视黄醇：0.4μg/mL；±α-生育酚：11μg/mL；质控品2，包括：视黄醇：1.1μg/mL；±α-生育酚：20μg/mL；质控品1和质控品2均为视黄醇和±α-生育酚的混合物；各个组成的浓度为在混合物中的各自浓度；
4.稀释液：牛蛋白血清(BSA)的水溶液，BSA的质量百分比为10％；
5.萃取液：含BHT的正己烷溶液，BHT的浓度为1.0mg/mL；
6.复溶液：体积百分比为95％的甲醇水溶液；
7.流动相：流动相A为水溶液，流动相B为甲醇溶液，且流动相A和流动相B中甲酸的体积百分比浓度为0％。
利用上述试剂盒进行检测，方法同实施例1。
实施例3：
1.校准品母液：使用含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的无水乙醇为稀释液，BHT的浓度为0.5mg/mL，配制包括6个浓度点的校准品母液，校准品母液的6个浓度点依次为：
视黄醇：0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.50μg/mL、7.50μg/mL、15.00μg/mL；
±α-生育酚：5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、50.00μg/mL、150.00μg/mL、300.00μg/mL；
上述校准品母液均为视黄醇和±α-生育酚的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；校准品工作液的浓度＝校准品母液浓度×20/100；
2.内标：视黄醇乙酸酯和维生素E醋酸酯的混合溶液，使用含BHT的无水乙醇为稀释液，BHT的浓度为0.5mg/mL，且视黄醇乙酸酯在内标溶液中的浓度为0.25μg/mL，维生素E醋酸酯在内标溶液中的浓度为25μg/mL；
3.质控品：质控品1包括：视黄醇：0.4μg/mL；±α-生育酚：11μg/mL；质控品2，包括：视黄醇：1.1μg/mL；±α-生育酚：20μg/mL；质控品1和质控品2均为视黄醇和±α-生育酚的混合物；各个成分的浓度为在混合物中的各自浓度；
4.稀释液：牛蛋白血清(BSA)的水溶液，BSA的质量百分比为5％；
5.萃取液：含BHT的正己烷溶液，BHT的浓度为1.0mg/mL；
6.复溶液：体积百分比为100％的甲醇水溶液；
7.流动相：流动相A为水溶液，流动相B为甲醇溶液，且流动相A和流动相B中甲酸的体积百分比浓度为0％。
利用上述试剂盒进行检测，方法同实施例1。
实施例4：
1.校准品母液：使用含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的无水乙醇为稀释液，BHT的浓度为0.5mg/mL，配制包括6个浓度点的校准品母液，校准品目标的6个浓度点依次为：
视黄醇：0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.50μg/mL、7.50μg/mL、15.00μg/mL；
±α-生育酚：5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、50.00μg/mL、150.00μg/mL、300.00μg/mL；
上述校准品母液均为视黄醇和±α-生育酚的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；校准品工作液的浓度＝校准品母液浓度×20/100；
2.内标：视黄醇乙酸酯和维生素E醋酸酯的混合溶液，使用含BHT的无水乙醇为稀释液，BHT的浓度为0.5mg/mL，且视黄醇乙酸酯在内标溶液中的浓度为0.25μg/mL，维生素E醋酸酯在内标溶液中的浓度为25μg/mL；
3.质控品：质控品1包括：视黄醇：0.4μg/mL；±α-生育酚：11μg/mL；质控品2，包括：视黄醇：1.1μg/mL；±α-生育酚：20μg/mL；质控品1和质控品2均为视黄醇和±α-生育酚的混合物；各个成分的浓度为在混合物中的各自浓度；
4.稀释液：牛蛋白血清(BSA)的水溶液，BSA的质量百分比为5％；
5.萃取液：含BHT的正己烷溶液，BHT的浓度为1.0mg/mL；
6.复溶液：体积百分比为95％的甲醇水溶液；
7.流动相：流动相A为水溶液，流动相B为甲醇溶液，且流动相A和流动相B中甲酸的体积百分比浓度为0％。
利用上述试剂盒进行检测，检测样本处理过程中加入复溶液的体积改为150μL，其他同实施例1。
实施例5：
1.校准品母液：使用含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的无水乙醇为稀释液，BHT的浓度为0.5mg/mL，配制包括6个浓度点的校准品母液，校准品目标的6个浓度点依次为：
视黄醇：0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.50μg/mL、7.50μg/mL、15.00μg/mL；
±α-生育酚：5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、50.00μg/mL、150.00μg/mL、300.00μg/mL；
上述校准品母液均为视黄醇和±α-生育酚的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；校准品工作液的浓度＝校准品母液浓度×20/100；
2.内标：视黄醇乙酸酯和维生素E醋酸酯的混合溶液，使用含BHT的无水乙醇为稀释液，BHT的浓度为0.5mg/mL，且视黄醇乙酸酯在内标溶液中的浓度为0.25μg/mL，维生素E醋酸酯在内标溶液中的浓度为25μg/mL；
3.质控品：质控品1包括：视黄醇：0.4μg/mL；±α-生育酚：11μg/mL；质控品2，包括：视黄醇：1.1μg/mL；±α-生育酚：20μg/mL；质控品1和质控品2均为视黄醇和±α-生育酚的混合物；各个成分的浓度为在混合物中的各自浓度；
4.稀释液：牛蛋白血清(BSA)的水溶液，BSA的质量百分比为5％；
5.萃取液：含BHT的正己烷溶液，BHT的浓度为1.0mg/mL；
6.复溶液：体积百分比为95％的甲醇水溶液；
7.流动相：流动相A为水溶液，流动相B为甲醇溶液，且流动相A和流动相B中甲酸的体积百分比浓度均为0.1％。
利用上述试剂盒进行检测，其他同实施例1。
对实施例1-5得到的处理好的校准品、质控品和样本各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按照如下步骤进行检测结果的计算：
(1)校准曲线的绘制与拟合：一般液相色谱分析软件可根据校准结果自动绘制校准曲线，以6个校准品工作液与内标的浓度比为横坐标(x)，以6个校准品工作液的实际测定峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，用最小二乘法进行线性回归，自动绘制标准曲线，可获得回归方程：y＝ax+b，其中y为纵坐标，x为横坐标，a为斜率，b为截距，并计算r(相关系数)值，r值≥0.9900；
(2)回收率的计算：质控品各分析物的测定浓度可根据质控品中各分析物及对应内标的峰面积的比值由校准曲线获得，其回收率的计算公式为：回收率(％)＝测定浓度/标示浓度×100，回收率(％)应在85％-115％范围内；
(3)样本结果的计算：样本中的各分析物测定浓度可根据样本中各分析物及对应内标的峰面积的比值由校准曲线获得。
图1为本发明维生素A和维生素E标准溶液的色谱图，图2为本发明维生素A和维生素E实测样品的色谱图。
实施例1-5的检测结果基本一致，下面结合相关附图对实施例1试剂盒分析性能进行说明：
1.标准曲线与线性：图3维生素A标准曲线线性范围：(0.05～3.00)μg/mL。
图4维生素E标准曲线线性范围：(1.00～60.00)μg/mL。由图可知，维生素A和维生素E的相关系数r都大于0.99，线性良好。
2.准确度和精密度
分别对质控品1和质控品2进行测定，结果如下表2所示：
表2质控品1和质控品2测定结果
从上述检测结果可知，本发明试剂盒及液相色谱检测方法具有良好的准确度、精密度和线性，能完全满足临床检测要求，同时采用本发明试剂盒来处理血清样本，无需进行复杂的净化提纯步骤，而且所需样本量小，可与液相色谱仪配套使用，采用牛蛋白血清的空白基质溶液作为模拟血清，与临床血清样本基质相似，更能应用于临床样本的检验；同时，该产品能同时检测维生素A和维生素E，达到单样本多指标同步检测功能，具有准确率高、检测时间短、试剂耗用量少、操作方便和成本低廉等特点。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合检验检疫领域的市售产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (10)
1.一种用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒，其特征在于，主要包括：
(1)校准品母液：使用含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的无水乙醇为稀释液，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚在稀释液中的浓度为0.1-1.0mg/mL，配制包括6个浓度点的校准品母液，校准品母液的6个浓度点依次为：
视黄醇：0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.50μg/mL、7.50μg/mL、15.00μg/mL；
±α-生育酚：5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、50.00μg/mL、150.00μg/mL、300.00μg/mL；
上述校准品母液均为视黄醇和±α-生育酚的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；校准品工作液的浓度＝校准品母液浓度×20/100；
(2)内标：内标溶液为视黄醇乙酸酯和维生素E醋酸酯的混合溶液，使用含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的无水乙醇为稀释液，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.1-1.0mg/mL，且视黄醇乙酸酯在内标溶液中的浓度范围为0.05-1.25μg/mL，维生素E醋酸酯在内标溶液中的浓度范围为5-75μg/mL；
(3)质控品：包括质控品1和质控品2，其中
质控品1的浓度范围和成分包括：视黄醇：0.3-0.7μg/mL；±α-生育酚：7-13μg/mL；
质控品2的浓度范围和成分包括：视黄醇：1.0-1.5μg/mL；±α-生育酚：15-25μg/mL；
质控品1和质控品2均为视黄醇和±α-生育酚的混合物；各个成分的浓度为在混合物中各自浓度；
(4)稀释液：稀释液为牛蛋白血清的空白基质溶液，牛蛋白血清的质量百分比含量为1-10％；
(5)萃取液：萃取液为含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.1-1.5mg/mL；
(6)复溶液：复溶液为体积百分比为93％-100％的甲醇水溶液；
(7)流动相：流动相A为水溶液，流动相B为甲醇溶液，且流动相A和流动相B中含有体积百分比浓度为0-0.2％的甲酸。
2.如权利要求1所述的用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒，其特征在于，所述步骤(1)或(2)中的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.5mg/mL。
3.如权利要求1所述的用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒，其特征在于，所述步骤(3)中的质控品1和质控品2均为视黄醇和±α-生育酚的混合物，形式为冻干粉、血清基质或乙醇溶液基质。
4.如权利要求1所述的用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒，其特征在于，所述步骤(4)稀释液中的空白基质溶液为含牛蛋白血清的水溶液，牛蛋白血清的质量百分比为5％。
5.如权利要求1所述的用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒，其特征在于，所述步骤(5)萃取液中的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为1.0mg/mL。
6.如权利要求1所述的用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒，其特征在于，所述步骤(6)复溶液的体积百分比为95％的甲醇水溶液。
7.如权利要求1所述的用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒，其特征在于，所述步骤(7)流动相A和流动相B中甲酸的体积百分比浓度为0％。
8.一种用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括：向人血清中加入含有视黄醇乙酸酯和维生素E醋酸酯的混合内标，混合，然后加入萃取液，混合离心，移取上清液氮气吹干后加入复溶液复溶，混合离心，取上清液使用液相色谱仪-PDA检测器进行检测，采用内标标准曲线法进行定量。
9.根据权利要求8所述的用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒的检测方法，其特征在于，其具体的方法步骤为：
(1)检测样本处理
(1.1)校准品：在室温下，吸取20μL校准品母液于离心管中，再加入80μL稀释液，漩涡混合后，再加入200μL含有已知浓度的混合内标，漩涡混合1min后加入800μL萃取液，漩涡混合5min以使其完全混匀，8000r/min离心5min，取上清液氮气吹干；再加入100μL复溶液复溶，漩涡混合后，15000r/min离心5min，取上清80μL加入到进样瓶中用于色谱分析；
(1.2)质控品/血清样本：在室温下，准确吸取100μL质控品/血清样本于离心管中，再加入200μL含有已知浓度的混合内标，漩涡混合1min后加入800μL萃取液，漩涡混合5min以使其完全混匀，8000r/min离心5min，取上清液氮气吹干；再加入100μL复溶液复溶，漩涡混合后，15000r/min离心5min，取上清80μL加入到进样瓶中用于色谱分析；
(2)样本检测分析
(2.1)色谱条件
·色谱柱：C18柱或者相当；
·流动相：流动相A和流动相B；
·检测波长：视黄醇(325nm)；±α-生育酚(291nm)；
·流速：0.5mL/min；
·梯度洗脱：按下所示；
上表中的梯度洗脱过程，流动相中流动相A和流动相B体积比例随时间不断调整变化，
以流动相B的占比变化为体现；
·柱温：30℃；
·进样器温度：8℃；
·进样量：20μL；
(2.2)取处理好的校准品、质控品和样本各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图；
(2.3)检测结果的计算；
(2.3.1)校准曲线的绘制与拟合：一般液相色谱分析软件可根据校准结果自动绘制校准曲线，以6个校准品工作液与内标的浓度比为横坐标(x)，以6个校准品工作液的实际测定峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，用最小二乘法进行线性回归，自动绘制标准曲线，可获得回归方程：y＝ax+b，其中y为纵坐标，x为横坐标，a为斜率，b为截距，并计算r值，r值≥0.9900；
(2.3.2)回收率的计算：质控品各分析物的测定浓度可根据质控品中各分析物及对应内标的峰面积的比值由校准曲线获得，其回收率的计算公式为：回收率(％)＝测定浓度/标示浓度×100，回收率应在85％-115％范围内；
(2.3.3)样本结果的计算：样本中的各分析物测定浓度可根据样本中各分析物及对应内标的峰面积的比值由校准曲线获得。
10.根据权利要求9所述的用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤(1.1)中加入萃取液的体积为800μL，复溶液的体积为100μL；步骤(1.1)中加入萃取液混合离心为5-10℃的低温离心，优选8℃下8000rpm离心；加入复溶液混合离心为5-10℃的低温高速离心，优选8℃下15000rpm离心；步骤(1.1)中上清液在室温下氮气吹干，以氮气作为保护气且不加热来确保样品中待测物质的稳定。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112798708A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-14 | 合肥和合医疗科技有限公司 | 用于检测脂溶性维生素的试剂盒 |
| CN112834638A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-25 | 合肥和合医疗科技有限公司 | 用于检测脂溶性维生素的试剂盒和检测方法 |
| CN114910592A (zh) * | 2022-06-13 | 2022-08-16 | 苏州帕诺米克生物科技有限公司 | 一种制备脂溶性维生素阴性血清的方法和试剂盒 |
| CN115184482A (zh) * | 2022-06-06 | 2022-10-14 | 广东太稳生物工程有限公司 | 一种lc-ms/ms检测脂溶性维生素的试剂盒 |
| CN115236254A (zh) * | 2022-07-22 | 2022-10-25 | 北京豪思生物科技股份有限公司 | 维生素a和维生素e的检测试剂盒、检测方法及应用 |
| CN115372511A (zh) * | 2022-08-17 | 2022-11-22 | 湖南新大陆生物技术有限公司 | 一种脂溶性维生素的检测试剂盒及检测方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57211057A (en) * | 1981-06-22 | 1982-12-24 | Meiji Milk Prod Co Ltd | Measuring method for fat soluble vitamins |
| CN104155385A (zh) * | 2014-09-01 | 2014-11-19 | 上海迪安医学检验所有限公司 | 超高效液相色谱法检测血清中9种脂溶性维生素的分析试剂盒 |
| CN106442754A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-22 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 一种同时检测血液中维生素a和维生素e含量的方法 |
-
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- 2020-03-05 CN CN202010147018.XA patent/CN111929391A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57211057A (en) * | 1981-06-22 | 1982-12-24 | Meiji Milk Prod Co Ltd | Measuring method for fat soluble vitamins |
| CN104155385A (zh) * | 2014-09-01 | 2014-11-19 | 上海迪安医学检验所有限公司 | 超高效液相色谱法检测血清中9种脂溶性维生素的分析试剂盒 |
| CN106442754A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-22 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 一种同时检测血液中维生素a和维生素e含量的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ROMAN KANDAR 等: "Determination of Retinol, ɑ-Tocopherol, Lycopene, and β-Carotene in Human Plasma Using HPLC with UV-Vis Detection: Application to a Clinical Study", 《JOURNAL OF CHEMISTRY》 * |
| 郑妹凤等: "反相高效液相色谱法同时测定儿童血清中维生素A、E含量的研究", 《安徽预防医学杂志》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112798708A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-14 | 合肥和合医疗科技有限公司 | 用于检测脂溶性维生素的试剂盒 |
| CN112834638A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-25 | 合肥和合医疗科技有限公司 | 用于检测脂溶性维生素的试剂盒和检测方法 |
| CN115184482A (zh) * | 2022-06-06 | 2022-10-14 | 广东太稳生物工程有限公司 | 一种lc-ms/ms检测脂溶性维生素的试剂盒 |
| CN114910592A (zh) * | 2022-06-13 | 2022-08-16 | 苏州帕诺米克生物科技有限公司 | 一种制备脂溶性维生素阴性血清的方法和试剂盒 |
| CN115236254A (zh) * | 2022-07-22 | 2022-10-25 | 北京豪思生物科技股份有限公司 | 维生素a和维生素e的检测试剂盒、检测方法及应用 |
| CN115372511A (zh) * | 2022-08-17 | 2022-11-22 | 湖南新大陆生物技术有限公司 | 一种脂溶性维生素的检测试剂盒及检测方法 |
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