CN113917010B

CN113917010B - 一种检测八宝丹胶囊中有效成分的方法及其应用

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Publication number: CN113917010B
Application number: CN202111107643.2A
Authority: CN
Inventors: 刘艳; 刘艳萍; 刘安; 陈莎; 章军; 赖志成; 关斌; 阳丽华
Original assignee: Xiamen Traditional Chinese Medicine Co ltd; Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Xiamen Traditional Chinese Medicine Co ltd; Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2021-09-22
Filing date: 2021-09-22
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2041-09-22
Also published as: CN113917010A

Abstract

本发明涉及中药组合物检测领域，具体涉及一种检测八宝丹胶囊中有效成分的方法及其应用。本发明中的方法包括：使用提取溶剂对八宝丹胶囊内容物进行提取，以得到含有有效成分的提取物；所述提取溶剂为体积比为(0.8‑1.2)：(0.8‑1.2)：(1.8‑2.2)的二甲基亚砜(DMSO)、氯仿和甲醇的混合液。本发明的方法可以实现对八宝丹胶囊中由牛黄、蛇胆、三七、麝香等名贵原料所带来的14种有效成分的高效检测。同时，本发明建立的检测方法具有良好的精密度、稳定性、重复性和提取回收率。与现有的检测方法相比具有明显优势，提升对八宝丹胶囊质量控制水平，可在其实际检测工作进行推广应用。

Description

一种检测八宝丹胶囊中有效成分的方法及其应用

技术领域

本发明涉及中药组合物检测领域，具体涉及一种检测八宝丹胶囊中有效成分的方法及其应用。

背景技术

八宝丹是由牛黄、蛇胆、羚羊角、珍珠、三七、麝香等味中药组成的复方制剂，具有清利湿热，活血解毒，去黄之痛的功效。适用于湿热蕴结所致发热，黄疸，小便黄赤，恶心呕吐，纳呆，胁痛腹胀，舌苔黄腻或厚腻干白，或湿热下注所致尿道灼热刺痛，小腹胀痛，临床上可用于治疗各种肝胆疾病，泌尿系统疾病。

目前对八宝丹胶囊的临床研究相对较多，临床疗效显著，但是对其化学成分研究的相关报导较少，其物质基础尚不明确，因此对八宝丹胶囊的多种化学成分进行含量测定能够有效对其进行质量控制，从而保证其临床用药的安全性和有效性。

在现有技术中，对于本品的质量为单一指标的含量测定。以药典中规定的八宝丹胶囊的含量测定方法为例，其为高效液相色谱法，包括对胶囊内容物中胆红素的含量测定方法及对原料药的含量测定，其中，原料药的含量测定包括麝香中麝香酮的含量测定方法和三七项下的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、分别制备人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的含量测定方法。此外，CN106483260A中也公开了一种八宝丹胶囊质量标准控制方法，通过对珍珠、麝香和三七药材中的有效成分进行检测，以提高八宝丹胶囊的质量标准。该方法与药典中的方法类似，仍然通过对原料药的测定来控制八宝丹胶囊的质量，而复方发挥疗效多是多种成分协同作用的结果，因此仅单一指标的含量往往不能准确的反映复方的质量，难以达到真正意义上的质量控制。同时，牛黄作为八宝丹胶囊中的君药，其中的指标成分并未在上述方法中得到足够地控制，也会为八宝丹胶囊的质量带来隐患。此外，上述方法步骤繁琐、耗时较长，也给实际检测工作带来了许多不便。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便高效地检测八宝丹胶囊中有效成分的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种检测八宝丹胶囊中有效成分的方法，其包括：

使用提取溶剂对八宝丹胶囊内容物进行提取，以得到含有有效成分的提取物；

所述提取溶剂为体积比为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(1.8-2.2)的二甲基亚砜(DMSO)、氯仿和甲醇的混合液。

本发明发现，八宝丹胶囊中有效成分的极性差异较大，难以同时对其进行高效提取，尤其是胆红素和皂苷类成分的提取率难以兼顾。而在使用上述提取溶剂进行提取时，则可以保证对八宝丹胶囊中有效成分(至少包含胆红素和皂苷类成分)的高效提取。

优选地，所述提取溶剂为体积比为(0.9-1.1)：(0.9-1.1)：(1.9-2.1)的二甲基亚砜、氯仿和甲醇的混合液。

作为本发明的优选实施方式，所述提取溶剂为体积比为1：1：2的二甲基亚砜、氯仿和甲醇的混合液。

本领域人员可依照常识选择具体的提取方式，在本发明中，超声和回流两种提取方式均可以获得较好的提取效果，其中，超声在兼顾提取效果的同时，操作相对简便且环保，故优选超声作为提取的方式。

作为优选，所述超声提取在40±5KHZ，600±50W下进行。

通过上述方案提取时，对各有效成分的提取效果更优。

优选在超声提取时间为40-50min时，更有利于对各有效成分的充分提取。

优选的，在提取时的料液比为1g：1800-2200mL时，所得到的供试品溶液的浓度更有利于后续的检测效果。

作为进一步优选方案，所述超声在40KHZ，600W下进行，超声提取时间为45min。

作为进一步优选方案，提取时的料液比为为1g：2000mL。

高效液相色谱-三重串联四极杆质谱法(HPLC-QQQ/MS)具有快速、灵敏度高的特点，并且可以有效应对复方中多组分共流出的问题，采用动态多反应检测扫描模式可以提高定量的灵敏度和准确性。

因此，在本发明中，优选所述方法还包括：通过HPLC-QQQ/MS法对有效成分进行检测；

更优选的，在HPLC-QQQ/MS法中，色谱柱的柱温为45±2℃(更优选为45℃)，流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为0.1±0.02％(更优选为0.1％)甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，

在第0-2.5min，所述流动相B的体积由5％递增为35％；

在第2.5-3min，所述流动相B的体积由35％递增为50％；

在第3-10min，所述流动相B的体积由50％递增为80％；

在第10-20min，所述流动相B的体积由80％递增为95％。

本发明进一步发现，通过上述的色谱条件，更有利于八宝丹胶囊中有效成分的有效分离。尤其是鹅去氧胆酸和去氧胆酸，其作为同分异构体，在质谱中很难分离，但通过本发明的色谱条件，其分离效果可以得到大幅改善。

本领域人员在具体实施时，可根据常识来设置其他的色谱条件或参数，其在本发明中均可获得上述的效果。

作为一种优选的实施方案，本发明的色谱条件如下：

采用C18色谱柱，填料粒径为1.7-2.5μm；如waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；

色谱柱的柱温为45±2℃；

流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为0.1±0.02％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，

在第0-2.5min，所述流动相B的体积由5％递增为35％；

在第2.5-3min，所述流动相B的体积由35％递增为50％；

在第3-10min，所述流动相B的体积由50％递增为80％；

在第10-20min，所述流动相B的体积由80％递增为95％；

每次进样预平衡3±0.5min；

流速为0.3±0.05mL·min^-1；

进样量3±0.5μL。

作为优选，本发明中的所述有效成分包括胆红素和皂苷类成分。

更优选所述有效成分包括八宝丹胶囊中由牛黄、蛇胆、三七、麝香等原料所带来的14种有效成分，具体包括胆酸、甘氨脱氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、甘氨胆酸、牛黄胆酸、胆红素、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、麝香酮中的一种或几种。

上述有效成分均可通过本发明的提取试剂高效提取得到，并能在本发明方法中得到较好地检测。

进一步优选地，所述有效成分至少包括鹅去氧胆酸和去氧胆酸。

本发明还对上述各有效成分进行质谱Scan全扫描，选择在全扫描模式下质谱响应较强的加和离子作为相应化合物定量的母离子，同时确定化合物最佳离子模式。然后采用SIM模式，得到化合物母离子响应较强时的最佳fragmentor值，并对各化合物采用质谱product模式，已知母离子和fragmentor值，通过设置不同的CE值，选择在product模式下质谱响应较强的碎裂离子作为该化合物的子离子，同时优化得到最佳的CE值。首先分别采用MRM模式，得到各化合物的保留时间，然后将其导入dMRM的采集方法下，获得各化合物的色谱峰。各有效成分及内标物质的质谱检测参数见表1，各有效成分的质谱图见图1-13。

表1有效成分及内标物质的质谱检测参数

本领域人员在具体实施时，可根据常识来设置其他的质谱条件或参数，其在本发明中均可获得上述的效果。

作为一种优选的实施方案，质谱条件如下：

电喷雾离子源(AJS-ESI)采用动态多反应监测模式(dMRM)，干燥气温度350±10℃，干燥气流速8±1L·min^-1，喷嘴电压45±2psi(1psi＝6.895kPa)，鞘气温度300±10℃，鞘气流速11±1L·min^-1，正离子扫描模式。

作为优选，采用内标法进行检测，内标物质为黄柏酮。

采用内标法可以进一步提高本发明检测的准确度。

关于内标物质，本发明对大量的化合物进行了考察，发现黄柏酮在质谱中能被电离和碎裂，且保留时间与本发明中有效成分的保留时间相近，同时在八宝丹胶囊中不存在，并能与八宝丹胶囊中的有效成分稳定共存，而其他化合物(如麦角甾醇、利血平、灵芝酸a、黄芪甲苷、柚皮苷等)则不能同时兼顾上述效果。

作为优选，黄柏酮在本发明方法中的质谱参数见表1。

作为优选，供试品溶液的配置方法包括：

用微孔滤膜过滤所述提取物，取滤液作为供试品溶液1；所述供试品溶液1被用于麝香酮和鹅去氧胆酸的检测；

将所述供试品溶液1稀释9-11倍(优选为10倍)，以获得供试品溶液2；所述供试品溶液2被用于其他有效成分的检测。

作为一种优选的实施方案，所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。

作为优选，对照品溶液的配置方法包括：用所述提取溶剂稀释对照品，以得到对照品溶液；

所述对照品包括胆酸、甘氨脱氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、甘氨胆酸、牛黄胆酸、胆红素、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、麝香酮中的一种或几种。

本领域人员可依照常识和检测目的对上述的方案进行组合，得到有关于本发明方法的较优实施例。

本发明进一步提供所述的检测八宝丹胶囊中有效成分的方法在以下任一方面的应用：

(1)在八宝丹胶囊的质量控制中的应用；

(2)在八宝丹胶囊的品质评价中的应用。

基于上述技术方案，本发明的有益效果包括：

(1)本发明的方法可以实现对八宝丹胶囊中由牛黄、蛇胆、三七、麝香等原料所带来的14种有效成分的高效检测。而且，根据本发明所选择的指标成分，能够客观表征其内在质量，使中药复方的药效基础更加明确，可为八宝丹胶囊的质量控制提供参考。

(2)本发明采用了动态多反应监测模式，并对质谱和色谱条件进行优化，可以使互为同分异构体的去氧胆酸和鹅去氧胆酸达到基线分离，最终建立了20min内对八宝丹胶囊中14种成分快速定量的方法。

(3)本发明提供了一种准确、简便、快速的八宝丹胶囊多指标的含量测定方法。经验证结果表明，本发明建立的检测方法具有良好的精密度(日内精密度RSD范围为2.0-4.1％)、稳定性(12h内各成分的RSD范围为1.9-4.8％)、重复性(RSD范围为0.7-5.3％)和提取回收率(各成分的平均回收率范围为93.1-108.8％，RSD为1.8-3.9％)。与现有的检测方法相比具有明显优势，可在八宝丹胶囊的实际检测工作进行推广应用。

附图说明

图1为胆酸的product模式质谱图。

图2为甘氨脱氧胆酸的product模式质谱图。

图3为鹅去氧胆酸的product模式质谱图。

图4为去氧胆酸的product模式质谱图。

图5为甘氨胆酸的product模式质谱图。

图6为牛黄胆酸的product模式质谱图。

图7为胆红素的product模式质谱图。

图8为人参皂苷Rb1的product模式质谱图。

图9为人参皂苷Re的product模式质谱图。

图10为人参皂苷Rd的product模式质谱图。

图11为人参皂苷Rg1的product模式质谱图。

图12为三七皂苷R1的product模式质谱图。

图13为麝香酮的product模式质谱图。

图14为专属性验证结果；图中，A：空白溶剂的动态多反应监测离子流图；B：混合系统适用性溶液中八宝丹胶囊14种有效成分和内标物动态多反应监测离子流图(正离子模式)；C：八宝丹胶囊提取物中14种有效成分和内标物动态多反应监测离子流图(正离子模式)。

图15为八宝丹胶囊14种有效成分和内标物DMRM的提取离子流图；图中：1-CA；2-GDCA；3-HDCA；4-CDCA；5-DCA；6-GCA；7-TCA；8-BIL；9-人参皂苷Rb1；10-人参皂苷Re；11-人参皂苷Rd；12-人参皂苷Rg1；13-三七皂苷R1；14-麝香酮；15-黄柏酮。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1

1实验材料

1.1仪器信息(见表2)

表2仪器信息

1.2试剂信息(见表3)

表3试剂信息

1.3样品及对照品信息(见表4-5)

表4样品信息

表5对照品信息

1.2实验方法及结果

1.2.1对照品溶液的配制

取甘氨胆酸、胆酸、去氧胆酸、牛黄胆酸、熊去氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、人参皂苷Re、三七皂苷R1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、麝香酮的对照品适量，精密称定，加入甲醇制成浓度分别为0.05、0.25、0.06、0.15、0.05、0.025、0.025、0.05、0.1、0.1、0.5、0.5、0.01mg/ml的单一对照品储备液，取胆红素对照品适量，精密称定，加入氯仿：乙醇＝7：3溶解，制成浓度为0.1mg/ml的对照品储备液。分别精密量取适量的上述对照品储备液，置同一量瓶中，加入溶剂(氯仿：二甲基亚砜：甲醇＝1：1：2)，稀释后定容，摇匀，即得14种化合物浓度分别约为2.0、5.0、2.5、4.5、1.5、1.0、1.0、2.0、4.0、2.5、4.5、8.5、0.5、3.0μg/ml的对照品混合溶液，逐级稀释，即得。

1.2.2样品溶液的制备

取八宝丹胶囊内容物研细混匀，取粉末50mg，加入100mL提取溶剂(氯仿：DMSO:甲醇＝1：1：2)，在40KHZ，600W下超声处理45min，放冷后补足重量，摇匀，取上清液，用0.22μm微孔滤膜滤过，该样品作为供试品溶液1，将供试品溶液1稀释5倍，得到供试品溶液2。供试品溶液1与供试品溶液2在测定前均与内标溶液以10：1比例混合。其中供试品溶液1用于麝香酮和鹅去氧胆酸的检测，供试品溶液2用于其他成分的检测。

1.2.3质谱条件

电喷雾离子源(AJS-ESI)采用动态多反应监测模式(dMRM)，干燥气温度350℃，干燥气流速8L·min^-1，喷嘴电压45psi(1psi＝6.895kPa)，鞘气温度300℃，鞘气流速11L·min^-1，正离子扫描模式，内标为黄柏酮，待测化合物质谱检测参数见表1，待测化合物离子流色谱图见图1-13。

1.2.4色谱条件

采用waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；

色谱柱的柱温为45℃；

流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，

在第0-2.5min，所述流动相B的体积由5％递增为35％；

在第2.5-3min，所述流动相B的体积由35％递增为50％；

在第3-10min，所述流动相B的体积由50％递增为80％；

在第10-20min，所述流动相B的体积由80％递增为95％；

每次进样预平衡3min；

流速为0.3mL·min^-1；

进样量3μL。

1.2.5方法学验证

1.2.5.1专属性

按照“1.2.1”和“1.2.2”项下的对照品溶液和供试品溶液制备方法，制备对照品混合溶液和供试品溶液。采用本研究的液质条件对其进行分析，各指标成分和内标的峰形良好，且空白样本对各指标成分的测定无干扰，谱图见图14和图15。

1.2.5.2线性关系、定量限和定量限

取对照品混合溶液，用溶剂按照一定比例稀释，配制成系列浓度对照品混合液，测定前加入内标溶液，按照上述色谱条件和质谱条件进行测定。以对照品质量浓度为横坐标(x)，对照品与内标峰面积比值作为纵坐标(y)进行线性回归，得到回归方程、相关系数及线性范围，同时计算各待测物的检测限和定量限，见表6。

表6八宝丹胶囊待测化合物线性关系考察结果

1.2.6.3精密度

取对照品混合溶液，同一天内连续进样6次测定，按上述检测条件进行分析，记录待测物与内标峰面积，计算待测成分与内标化合物峰面积的比值及其RSD，见表7。

表7分析物的精密度、稳定性和重复性结果(n＝6)

1.2.6.4溶液稳定性

取八宝丹胶囊的样品溶液，分别于0，2，4，8，12h按上述检测条件进行分析，记录待测物与内标峰面积，待测物峰面积与内标峰面积的比值及其RSD。结果见表8。

表8样品及对照品溶液稳定性结果

1.2.6.5重复性

取同一批次八宝丹胶囊粉末，平行制备6份样品，按照上述检测条件进行分析，记录待测物与内标溶液的峰面积，根据回归方程计算含量及RSD。八宝丹胶囊中各待测成分含量的RSD在1.5％～5.4％范围内，结果见表9。表明本方法重复性良好。

表9重复性结果

1.2.6.6提取回收率

称取本品约0.025g，置于具塞锥形瓶中，平行称取6份，分别加入等量的对照品，按上述检测条件进行分析，记录待测物与内标峰面积，根据回归方程计算浓度及RSD。计算绝对回收率。结果见表10。

表10八宝丹胶囊中14中待测成分加样回收率(n＝6)

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1.2.7八宝丹胶囊指标成分含量测定及一致性评价结果

本研究共测定了10批八宝丹样品中指标成分的含量，其中5批次由厦门中药厂有限公司提供，结果见表11，另5批次为本实验室从药店自行采集，结果见表12。厂家提供样本和自行收集样本一致性结果对比见表13。

表11药厂提供的八宝丹胶囊中14种化学成分含量测定结果(n＝2)

表12自行收集的八宝丹胶囊中14种化学成分含量测定结果(n＝2)

表13厂家提供样本和自行收集样本一致性结果对比

对比例

本对比例提供一种检测八宝丹胶囊(源自批号200203)中有效成分的方法，其与实施例1中的检测方法差异仅在于，将提取溶剂分别更改为其他提取试剂(其为研发阶段尝试过的部分提取试剂)，具体的提取试剂及检测结果如表14所示。

表14不同提取溶剂下各成分的峰面积

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种检测八宝丹胶囊中有效成分的方法，其特征在于，所述方法包括：

所述提取溶剂为体积比为（0.9-1.1）：（0.9-1.1）：（1.9-2.1）的二甲基亚砜、氯仿和甲醇的混合液；

通过HPLC-QQQ/MS法对所述有效成分进行检测；

所述有效成分包括胆红素和皂苷类成分；所述皂苷类成分选自人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1和三七皂苷R1中的一种或几种；

其中，在HPLC-QQQ/MS法中，采用C18色谱柱，填料粒径为1.7-2.5μm；色谱柱的柱温为45±2℃，流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为0.1±0.02%甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100%计，

在第0-2.5min，所述流动相B的体积由5%递增为35%；

在第2.5-3min，所述流动相B的体积由35%递增为50%；

在第3-10min，所述流动相B的体积由50%递增为80%；

在第10-20min，所述流动相B的体积由80%递增为95%；

质谱条件中，采用正离子扫描模式；

各有效成分的质谱参数如下：

。

2.根据权利要求1所述的检测八宝丹胶囊中有效成分的方法，其特征在于，所述提取的方式为超声提取，所述超声提取在40±5 KHZ，600±50W下进行；

超声提取时间为40-50min；

提取时的料液比为1 g：1800-2200 mL。

3.根据权利要求1所述的检测八宝丹胶囊中有效成分的方法，其特征在于，所述有效成分还包括胆酸、甘氨脱氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、甘氨胆酸、牛黄胆酸和麝香酮中的一种或几种。

4.根据权利要求3所述的检测八宝丹胶囊中有效成分的方法，其特征在于，各有效成分的质谱参数如下：

。

5.根据权利要求1所述的检测八宝丹胶囊中有效成分的方法，其特征在于，采用内标法进行检测，内标物质为黄柏酮。

6.根据权利要求5所述的检测八宝丹胶囊中有效成分的方法，其特征在于，黄柏酮的质谱参数如下：

。

7.根据权利要求3所述的检测八宝丹胶囊中有效成分的方法，其特征在于，供试品溶液的配置方法包括：

将所述供试品溶液1稀释9-11倍，以获得供试品溶液2；所述供试品溶液2被用于其他有效成分的检测。

8.根据权利要求1所述的检测八宝丹胶囊中有效成分的方法，其特征在于，对照品溶液的配置方法包括：用所述提取溶剂稀释对照品，以得到对照品溶液；

所述对照品包括胆红素和皂苷类成分；所述皂苷类成分选自人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1和三七皂苷R1中的一种或几种。

9.根据权利要求8所述的检测八宝丹胶囊中有效成分的方法，其特征在于，所述对照品还包括胆酸、甘氨脱氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、甘氨胆酸、牛黄胆酸和麝香酮中的一种或几种。

10.权利要求1-9中任一项所述的检测八宝丹胶囊中有效成分的方法在以下任一方面的应用，包括：

（1）在八宝丹胶囊的质量检测中的应用；

（2）在八宝丹胶囊的品质评价中的应用。