CN111983120B - 化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法 - Google Patents

化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111983120B
CN111983120B CN202010325919.3A CN202010325919A CN111983120B CN 111983120 B CN111983120 B CN 111983120B CN 202010325919 A CN202010325919 A CN 202010325919A CN 111983120 B CN111983120 B CN 111983120B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mother
wind
sample
fermentation
nucleoside
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010325919.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111983120A (zh
Inventor
曹国琼
张永萍
徐剑
刘耀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guizhou University of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Guizhou University of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guizhou University of Traditional Chinese Medicine filed Critical Guizhou University of Traditional Chinese Medicine
Priority to CN202010325919.3A priority Critical patent/CN111983120B/zh
Publication of CN111983120A publication Critical patent/CN111983120A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111983120B publication Critical patent/CN111983120B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法。本发明具有建立的化风丹药母核苷类指纹图谱特征性强、方法简便，结合7种核苷类成分含量测定可更好控制其质量；化风丹药母发酵对核苷类成分影响显著，对化风丹药母的质量控制具有参考价值，且本发明建立的方法简单，稳定性好，重复性好，准确度高的特点。

Description

化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法
技术领域
本发明涉及一种化风丹药母图谱建立及核苷类成分含量测定，特别是一种化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法。
背景技术
化风丹是由天麻、僵蚕、全蝎、雄黄、药母、麝香、朱砂、硼砂等十多味中药经加工制作而成的中成药。用于风痰闭阻(头痛、耳鸣、脑动脉硬化、肢体麻木无力及脑萎缩)，中风偏瘫，癫痫，面神经麻痹，口眼歪斜等症的治疗，1951年被列入国务院保护的四大名药之一。药母含生川乌、生半夏、生天南星和白附子等中药粉，其制作方法为:将处方中药物粉碎加入牛胆汁混匀后密闭经发酵而成。
发酵是经净制或处理后的药物，在一定的温度和湿度条件下，通过霉菌和酶的作用，使药物发泡、生衣的方法。发酵法一直是中药炮制方法之一，它借助微生物的作用，改变中药原有药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症。毒剧中药在临床上对某些疑难病症具有较好的疗效，如不经过炮制或炮制不当，不但不能达到治疗疾病的目的，反而还能引起中毒，甚至有生命危险。目前化风丹药母发酵暂无药效成分的检测指标。
为了更好控制化风丹药母的质量，确保临床药效，本发明提供一种化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法，建立不同发酵批次发酵1周化风丹药母的HPLC特征图谱及7种核苷类成分含量测定方法，并比较发酵0、1、2、3、4周后化风丹药母中核苷类成分的含量差异。
发明内容
本发明的目的在于，提供化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法。本发明具有建立的化风丹药母核苷类指纹图谱特征性强、方法简便，结合7种核苷类成分含量测定可更好控制其质量；化风丹药母发酵对核苷类成分影响显著，对化风丹药母的质量控制具有参考价值，且本发明建立的方法简单，稳定性好，重复性好，准确度高的特点。
本发明的技术方案：化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法，包括有以下步骤：
(1)发酵样品的制备：药材打粉、过筛后按化风丹处方药物比例：称取白附子28.2g、生川乌28.2g、生半夏28.2g、生天南星28.2g、郁金14.1g、神曲0.14g，加入牛胆汁126.7g搅拌均匀，置于密闭容器内，并放入恒温恒湿箱中发酵，发酵1周后取样；
(2)供试品溶液的配制：取发酵1周后的化风丹药母样品2-4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入15-25mL纯净水，精密称定质量，超声处理25-30min，放冷，用水补足减失质量，离心5-15min，吸取上清液适量用0.4-0.5μm尼龙微孔滤膜过滤即可；
(3)混合对照品溶液的配制：混合对照品溶液的配制：精密称定尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷对照品适量，加水配置为每1mL含尿嘧啶0.174mg、次黄嘌呤0.151mg、黄嘌呤0.152mg、尿苷0.152mg、肌苷0.182mg、鸟苷0.148mg、胸苷0.163mg的单一对照品母液，精密吸取上述单一对照品母液尿嘧啶0.5mL、次黄嘌呤1mL、黄嘌呤4mL、尿苷1mL、肌苷1mL、鸟苷1mL、胸苷1mL置于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，即得每1mL含0.0087mg尿嘧啶、0.0151mg次黄嘌呤、0.0608mg黄嘌呤、0.0152mg尿苷、0.0182mg肌苷、0.0148mg鸟苷、0.0163mg胸苷的混合对照品溶液；
(4)色谱条件：采用Pntulips BP-C18色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱：0～24min 100％B；24～48min 100～80％B；48～55min，80～100％B；流速：0.8mL/min；检测波长：260nm；柱温：35℃；进样量：10μL对照品，20μL样品。
前述的化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法中，所述步骤(1)中，是放入温度为35℃，湿度为60％的恒温箱中发酵，发酵1周后取样。
前述的化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法中，所述步骤(2)中，取发酵1周后的化风丹药母样品3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入20mL纯净水，精密称定质量，超声处理-功率100W、频率53kHz-30min，放冷，用水补足减失质量，离心-转速20000r/min-10min，吸取上清液适量用0.45μm尼龙微孔滤膜过滤即可。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、建立不同发酵批次化风丹药母的HPLC特征图谱及7种核苷类成分含量测定方法，并比较发酵前后核苷类成分的含量差异。
2、方法：以C18色谱柱、甲醇-水梯度洗脱为流动相、流速0.8mL/min、检测波长260nm对12批化风丹药母进行测定，运用指纹图谱相似度评价软件进行评价；并建立化风丹药母中尿嘧啶、次黄嘌呤等7种核苷类成分含量测定，比较发酵0、1、2、3、4周成分含量差异。结果：特征图谱研究中，以黄嘌呤(4号峰)为参照峰，共标定了8个共有峰，不同发酵批次化风丹药母指纹图谱的相似度较低；尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷7种核苷类成分离度好，且方法学考察达到标准；发酵前后化风丹药母7种核苷类成分含量差异较大，通过发酵药母中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤显著增加；尿苷、肌苷和鸟苷显著减少；但7种核苷的总含量显著增加。
3、结论：所建立的化风丹药母核苷类指纹图谱特征性强、方法简便，结合7种核苷类成分含量测定可更好控制其质量；化风丹药母发酵对核苷类成分影响显著；本研究对化风丹药母的质量控制具有参考价值。
发明人进行了大量的实验，以下是部分实验研究
实验例：
1.仪器与材料
1.1仪器
高效液相色谱仪岛津LC-20AT(岛津企业管理(中国)有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵(邦西仪器科技(上海)有限公司)；盐城凯特TD5B自动脱帽离心机(上海重逢科学仪器有限公司)；ATY224万分之一天平和AUW120D十万分之一天平(日本岛津公司)。
1.2材料
尿嘧啶(批号：100469-201302，含量99.6％)、次黄嘌呤(批号：140661-201704，含量100％)、黄嘌呤(批号：140662-201606)、尿苷(批号：887-200202)、肌苷(批号：140669-201606)、鸟苷(批号：111977-201501)、胸苷(批号101215-201401)对照品均购自中国食品药品检定研究院；白附子、生川乌、生半夏、生天南星、郁金购自药材市场；色谱甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)，其他试剂为分析纯；12批化风丹药母是按发酵工艺在实验室发酵，编号S1-S12；不同发酵时间化风丹药母编号分别为发酵0周、发酵1周、发酵2周、发酵3周、发酵4周。
2.方法与结果
2.1发酵样品的制备
药材打粉、过筛后按化风丹处方药物比例，称取白附子，生川乌，生半夏，生天南星，郁金，神曲，加入牛胆汁搅拌均匀，置于密闭容器内，并放入温度为35℃，湿度为60％的恒温箱中发酵。用于建立指纹图谱的药母共制备12批次分别编号S1-S12；同一批次不同发酵时间化风丹药母编号分别为0周、1周、2周、3周、4周，于不同时间取样取出置于-80℃的冰箱中保存。
2.2色谱条件的选择
2.2.1流动相系统的选择
选择甲醇(A)-水溶液(B)为流动相，梯度洗脱系统如下(0～6min 95％B；6～30min95～80％B；30～40min 80％B)；流速为1.0mL/min；检测波长为260nm；柱温为35℃；进样量为10μL。采用上述色谱条件，进样，结果见图1。
依据上述结果，我们将流速改为0.8mL/min；分别用不同的梯度洗脱程序：(0～6min，100％B；6～60min，100～80％B)，(0～15min，100％B；15～40min，100～80％B)，(0～20min，100％B；20～40min，100～80％B)，(0～24min，100％B；24～48min，100～80％B；48～55min80～100％B)四种不同的梯度洗脱程序，其他条件不变，分别进样。最终选择梯度洗脱程序为(0～24min 100％B；24～48min，100～80％B；48～55min 80～100％B)，此梯度条件对核苷类成分的分离效果较好，峰型也好，能够满足我们的要求。结果见图2、3、4和5。
2.2.2色谱条件
采用Pntulips BP-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱(0～24min100％B；24～48min100～80％B；48～55min，80～100％B)；流速：0.8mL/min；检测波长：260nm；柱温：35℃；进样量：10μL(对照品)，20μL(样品)。在此条件下，各色谱峰分离度好，混合对照品及样品色谱图见图6。
2.3混合对照品溶液的配制
精密称定尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷对照品适量，加水配置为每1mL含尿嘧啶0.174mg、次黄嘌呤0.151mg、黄嘌呤0.152mg、尿苷0.152mg、肌苷0.182mg、鸟苷0.148mg、胸苷0.163mg的单一对照品母液。精密吸取上述单一对照品母液尿嘧啶0.5mL、次黄嘌呤1mL、黄嘌呤4mL、尿苷1mL、肌苷1mL、鸟苷1mL、胸苷1mL置于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，即得每1mL含0.0087mg尿嘧啶、0.0151mg次黄嘌呤、0.0608mg黄嘌呤、0.0152mg尿苷、0.0182mg肌苷、0.0148mg鸟苷、0.0163mg胸苷的混合对照品溶液。
2.4供试品溶液的配制
取各发酵阶段的化风丹样品约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入20mL纯净水，精密称定质量，超声处理(功率100W，频率53kHz)30min，放冷，用水补足减失质量，离心(转速20000r/min)10min，吸取上清液适量用0.45μm尼龙微孔滤膜过滤即可。
2.5特征图谱的建立
2.5.1精密度试验
取发酵1周的化风丹药母供试品(S3)，按“2.4”方法制备供试品溶液，按“2.2.2”色谱条件连续进样6次，记录共有峰保留时间、相对峰面积等，以4号黄嘌呤色谱峰为参照峰(S)，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD值均小于1.73％，相对峰面积的RSD值均小于2.24％，表明仪器精密度良好。结果见表1～2。
表1精密度试验的相对保留时间
Figure BDA0002463209190000061
Figure BDA0002463209190000071
表2精密度试验的相对峰面积
Figure BDA0002463209190000072
2.5.2稳定性试验
取发酵1周的化风丹药母供试品(S3)，按“2.4”方法制备供试品溶液，按“2.2.2”色谱条件，分别于0、1、2、4、6、8、12h进样测定，记录共有峰保留时间、相对峰面积等，以4号黄嘌呤色谱峰为参照峰(S)，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD值均小于1.67％，相对峰面积的RSD值均小于2.85％，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。结果见表3～4。
表3稳定性试验相对保留时间
Figure BDA0002463209190000081
表4稳定性试验相对峰面积
Figure BDA0002463209190000082
取发酵1周的化风丹药母供试品(S3)，按“2.4”方法重复制备6份供试品溶液，按“2.2.2”色谱条件进样，记录共有峰保留时间、相对峰面积等，以4号黄嘌呤色谱峰为参照峰(S)，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD值均小于1.64％，相对峰面积的RSD值均小于2.65％，表明该方法重复性良好。结果见表5～6。
表5重复性试验相对保留时间
Figure BDA0002463209190000091
表6重复性试验相对峰面积
Figure BDA0002463209190000092
2.5.3特征图谱的建立及相似度评价
取12批发酵1周的化风丹药母，按“2.4”方法制备供试品溶液，按“2.2.2”项下条件进样测定，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”进行分析，经多点校正，全谱峰匹配，生成对照图谱，共确定8个共有峰，12批化风丹药母样品HPLC叠加图谱见图7。其中4号黄嘌呤色谱峰保留时间适中。
与其他峰分离良好，故以其为参照峰(S)。供试品图谱S1～S12与对照图谱的相似度分别为0.821、0.712、0.809、0.738、0.882、0.910、0.929、0.954、0.939、0.852、0.867、0.924。
表7特征图谱共有峰相对保留时间
Figure BDA0002463209190000101
表8特征图谱共有峰相对峰面积
Figure BDA0002463209190000102
Figure BDA0002463209190000111
表9 12批化风丹药母指纹图谱与对照指纹图谱的相似度评价结果
Figure BDA0002463209190000112
2.5.4主要色谱峰的指认
分别取混合对照品溶液II及化风丹药母供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，通过与色谱峰比对，指认7个主要色谱峰分别是尿嘧啶(1号峰)、次黄嘌呤(3号峰)、黄嘌呤(4号峰)、尿苷(5号峰)、肌苷(6号峰)、鸟苷(7号峰)、胸苷(8号峰)。
2.6 7种核苷类成分的含量测定
2.6.1线性关系考察
精密吸取“2.3”项下混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL量瓶中，加水定容至刻度，即得6个浓度系列的混合对照品溶液；精密吸取6个浓度系列的混合对照品溶液，按照“2.2.2”项下色谱条件进样测定，以各对照品峰面积(Y)为纵坐标，对照品质量浓(μg/mL,X)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷7种核苷类成分在以上浓度范围内具良好的线性关系。见表10。
表10 7个成分线性关系考察结果
Figure BDA0002463209190000121
2.6.2精密度考察
取混合对照品溶液II，按照“2.2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算各成分峰面积的RSD。结果尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷分别为1.57％、0.92％、2.20％、1.16％、1.15％、1.39％和1.42％。表明仪器精密度良好。结果见表11。
表11精密度试验结果
Figure BDA0002463209190000122
Figure BDA0002463209190000131
2.6.3重复性考察
取发酵1周样品(S3)6份，分别按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.2”项下色谱条件进样测定，记录相对峰面积，计算含量。结果尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷平均含量为0.1688mg/g、0.0814mg/g、0.3241mg/g、0.1609mg/g、0.0365mg/g、0.0086mg/g、0.0981mg/g，RSD分别为1.25％、1.97％、1.18％、2.03％、2.94％、2.77％、2.02％。结果表明本法重复性良好。见表12。
表12 7种核苷类成分重复性试验
Figure BDA0002463209190000132
2.6.4稳定性考察
取发酵1周样品(S3)，按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、1、2、4、6、8、12h按“2.2.2”项下色谱条件进样，记录相对峰面积。结果见表13。结果尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷RSD分别为2.00％、2.13％、2.46％、1.58％、2.43％、1.27％、2.78％。表13样品中7种核苷类成分提取后12h内稳定性良好。
表13样品中7种核苷类成分提取后12h内稳定性
Figure BDA0002463209190000141
2.6.5加样回收率考察
称取己知含量的3号样品6份，每份约1.5g，精密称定，按各成分在原样品中的含有量分别精密加入等量的各对照品溶液，按“2.4”项下方法制备供试溶液，进样测定，计算加样回收率。结果见表14。表中14种成分的平均加样回收率(n＝6)在95.13％～101.39％，RSD在1.88％～2.94％之间，表明本法准确度良好。
表14加油回收率
Figure BDA0002463209190000142
Figure BDA0002463209190000151
Figure BDA0002463209190000161
2.6.6不同发酵时间化风丹药母中7种核苷类成分含量
取不同发酵时间化风丹药母编号分别为发酵0周、发酵1周、发酵3周、发酵4周，每周3份样品，按“2.4”项下方法制备供试溶液，按照“2.2.2”项下色谱条件进样测定。不同发酵时间化风丹药母中7种核苷类成分的含量见表15。由表可知，尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤和胸苷发酵后含量增加，与未发酵相比含量显著增加；尿苷、肌苷和鸟苷发酵后含量减少，与未发酵相比含量显著减少；7种核苷总含量随发酵时间的增加总含量显著增加。
表15不同发酵时间药母中7种核苷类成分的含量(
Figure BDA0002463209190000162
n＝3)
Figure BDA0002463209190000163
Figure BDA0002463209190000171
注：不同字母a-d，表示有显著差异
综上所述，本发明具有建立的化风丹药母核苷类指纹图谱特征性强、方法简便，结合7种核苷类成分含量测定可更好控制其质量；化风丹药母发酵对核苷类成分影响显著，对化风丹药母的质量控制具有参考价值，且本发明建立的方法简单，稳定性好，重复性好，准确度高的有益效果。
附图说明
图1是本发明流动相系统的选择中梯度为(0～6min 95％B；6～30min 95～80％B；30～40min 80％B)的供试品色谱图(流速为1.0mL/min)；
图2本发明流动相系统的选择中梯度为(0～6min，100％B；6～60min，100～80％B)的供试品色谱图(流速为0.8mL/min)；
图3本发明流动相系统的选择中洗脱梯度为(0～15min，100％B；15～40min，100～80％B)的供试品色谱图(流速为0.8mL/min)；
图4本发明流动相系统的选择中洗脱梯度为(0～20min 100％B；20～40min，100～80％)的供试品色谱图(流速为0.8mL/min)；
图5本发明流动相系统的选择中洗脱梯度为(0～24min 100％B；24～48min，100～80％B；48～55min 80～100％B)的供试品色谱图(流速为0.8mL/min)；
图6本发明色谱条件中(A混合对照品图谱，B化风丹药母样品图谱)的HPLC色谱图，其中：尿嘧啶(1号峰)、次黄嘌呤(3号峰)、黄嘌呤(4号峰)、尿苷(5号峰)、肌苷(6号峰)、鸟苷(7号峰)、胸苷(8号峰)；
图7本发明特征图谱的建立及相似度评价中12批化风丹药母样品HPLC叠加图谱(S1-S12)以及对照图谱(R)，其中尿嘧啶(1号峰)、次黄嘌呤(3号峰)、黄嘌呤(4号峰)、尿苷(5号峰)、肌苷(6号峰)、鸟苷(7号峰)、胸苷(8号峰)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例。化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法，包括有以下步骤：
(1)发酵样品的制备：药材打粉、过筛后按化风丹处方药物比例：称取白附子28.2g、生川乌28.2g、生半夏28.2g、生天南星28.2g、郁金14.1g、神曲0.14g，加入牛胆汁126.7g搅拌均匀，置于密闭容器内，并放入温度为35℃，湿度为60％的恒温箱中发酵，发酵1周后取样；
(2)供试品溶液的配制：取发酵1周后的化风丹药母样品3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入20mL纯净水，精密称定质量，超声处理-功率100W、频率53kHz-30min，放冷，用水补足减失质量，离心-转速20000r/min-10min，吸取上清液适量用0.45μm尼龙微孔滤膜过滤即可；
(3)混合对照品溶液的配制：混合对照品溶液的配制：精密称定尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷对照品适量，加水配置为每1mL含尿嘧啶0.174mg、次黄嘌呤0.151mg、黄嘌呤0.152mg、尿苷0.152mg、肌苷0.182mg、鸟苷0.148mg、胸苷0.163mg的单一对照品母液，精密吸取上述单一对照品母液尿嘧啶0.5mL、次黄嘌呤1mL、黄嘌呤4mL、尿苷1mL、肌苷1mL、鸟苷1mL、胸苷1mL置于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，即得每1mL含0.0087mg尿嘧啶、0.0151mg次黄嘌呤、0.0608mg黄嘌呤、0.0152mg尿苷、0.0182mg肌苷、0.0148mg鸟苷、0.0163mg胸苷的混合对照品溶液；
(4)色谱条件：采用Pntulips BP-C18色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱：0～24min100％B；24～48min100～80％B；48～55min，80～100％B；流速：0.8mL/min；检测波长：260nm；柱温：35℃；进样量：10μL对照品，20μL样品。

Claims (3)

1.化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法，其特征在于：包括有以下步骤：
(1)发酵样品的制备：药材打粉、过筛后按化风丹处方药物比例：称取白附子28.2g、生川乌28.2g、生半夏28.2g、生天南星28.2g、郁金14.1g、神曲0.14g，加入牛胆汁126.7g搅拌均匀，置于密闭容器内，并放入恒温恒湿培养箱中发酵，发酵后取样；
(2)供试品溶液的配制：取发酵后的化风丹药母样品2-4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入15-25mL纯净水，精密称定质量，超声处理25-30min，放冷，用水补足减失质量，离心5-15min，吸取上清液适量用0.4-0.5μm尼龙微孔滤膜过滤即可；
(3)混合对照品溶液的配制：混合对照品溶液的配制：精密称定尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷对照品适量，加水配置为每1mL含尿嘧啶0.174mg、次黄嘌呤0.151mg、黄嘌呤0.152mg、尿苷0.152mg、肌苷0.182mg、鸟苷0.148mg、胸苷0.163mg的单一对照品母液，精密吸取上述单一对照品母液尿嘧啶0.5mL、次黄嘌呤1mL、黄嘌呤4mL、尿苷1mL、肌苷1mL、鸟苷1mL、胸苷1mL置于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，即得每1mL含0.0087mg尿嘧啶、0.0151mg次黄嘌呤、0.0608mg黄嘌呤、0.0152mg尿苷、0.0182mg肌苷、0.0148mg鸟苷、0.0163mg胸苷的混合对照品溶液；
(4)色谱条件：采用Pntulips BP-C18色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相：甲醇A-水B，梯度洗脱：0～24min 100％B；24～48min 100～80％B；48～55min，80～100％B；流速：0.8mL/min；检测波长：260nm；柱温：35℃；进样量：10μL对照品，20μL样品。
2.根据权利要求1所述的化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法，其特征在于：所述步骤(1)中，是放入温度为35℃，湿度为60％的恒温箱中发酵，发酵后取样。
3.根据权利要求1所述的化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法，其特征在于：所述步骤(2)中，取发酵后的化风丹药母样品3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入20mL纯净水，精密称定质量，超声处理-功率100W、频率53kHz-30min，放冷，用水补足减失质量，离心-转速20000r/min-10min，吸取上清液适量用0.45μm尼龙微孔滤膜过滤即可。
CN202010325919.3A 2020-04-23 2020-04-23 化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法 Active CN111983120B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010325919.3A CN111983120B (zh) 2020-04-23 2020-04-23 化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010325919.3A CN111983120B (zh) 2020-04-23 2020-04-23 化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111983120A CN111983120A (zh) 2020-11-24
CN111983120B true CN111983120B (zh) 2022-08-19

Family

ID=73442164

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010325919.3A Active CN111983120B (zh) 2020-04-23 2020-04-23 化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111983120B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116068096B (zh) * 2023-04-04 2023-06-16 成都中医药大学 僵蚕断面丝腺环相关的特异性标志物、筛选方法及僵蚕的质量检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007028997A (ja) * 2005-07-27 2007-02-08 Kanebo Seiyaku Kk 生薬エキス配合流動食及びその使用
CN103713058A (zh) * 2013-12-25 2014-04-09 遵义廖元和堂药业有限公司 一种化风丹药母中双酯型生物碱的检测方法
CN103948816A (zh) * 2014-05-23 2014-07-30 贵州万胜药业有限责任公司 一种化风丹药母的发酵制备方法
CN105092765A (zh) * 2015-09-15 2015-11-25 上海市农业科学院 一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法
CN109828060A (zh) * 2019-04-04 2019-05-31 陕西中医药大学 益母草中核苷类成分的检测方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180003721A1 (en) * 2015-01-15 2018-01-04 Joslin Diabetes Center Metabolite Biomarkers Predictive Of Renal Disease In Diabetic Patients

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007028997A (ja) * 2005-07-27 2007-02-08 Kanebo Seiyaku Kk 生薬エキス配合流動食及びその使用
CN103713058A (zh) * 2013-12-25 2014-04-09 遵义廖元和堂药业有限公司 一种化风丹药母中双酯型生物碱的检测方法
CN103948816A (zh) * 2014-05-23 2014-07-30 贵州万胜药业有限责任公司 一种化风丹药母的发酵制备方法
CN105092765A (zh) * 2015-09-15 2015-11-25 上海市农业科学院 一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法
CN109828060A (zh) * 2019-04-04 2019-05-31 陕西中医药大学 益母草中核苷类成分的检测方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HPLC法测定化风丹药母在发酵过程中6个酯型生物碱的含量;马奋刚等;《药物分析杂志》;20200331;第40卷(第03期);413-419 *
Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine;S.P.Li 等;《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》;20060228;第41卷(第5期);1571-1584 *
化风丹血清药物化学的初步研究;向文英 等;《中国药房》;20161231;第27卷(第28期);3911-3914 *
化风丹高效液相色谱指纹图谱的鉴别研究;张强 等;《大家健康》;20170930;第11卷(第27期);15-16 *
基于水溶性浸出物及 HPLC指纹图谱评价不同贮存年限半夏的品质;王朋展 等;《化学分析计量》;20160930;第25卷(第5期);19-23 *
灵芝孢子粉中核苷类成分分析;王金艳等;《菌物学报》;20160122;第35卷(第01期);77-85 *
青海玉树不同产地冬虫夏草中15种核苷类成分比较研究;肖远灿等;《中国药学杂志》;20141130;第49卷(第22期);1983-1988 *
高效液相色谱法测定化风丹药母中3种双酯型生物碱含量;曹国琼等;《贵州农业科学》;20141130;第42卷(第11期);58-61 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111983120A (zh) 2020-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108802255B (zh) 测定复方制剂中灵芝三萜类成分含量的方法
CN107356691B (zh) 建曲指纹图谱的检测方法
CN109212083A (zh) 复方鸡内金咀嚼片的质量检测方法
CN101028460B (zh) 一种中药制剂金嗓清音丸的质量检测方法
CN107064322A (zh) 同时测定地榆或地榆类制剂中没食子酸和地榆皂苷i含量的hplc波长切换法
CN114487242B (zh) 鸡内金和/或醋鸡内金及制剂的特征图谱及其构建方法和含量测定方法
CN111983120B (zh) 化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法
CN109632997A (zh) 一种百合药材中王百合苷b的提取及测定方法
CN116879424A (zh) 生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法
CN115372497B (zh) 一种小活络丸中6种生物碱成分的含量测定方法
CN112345655A (zh) 一种胡蜂毒液指纹图谱的建立方法、胡蜂毒液指纹图谱及其应用
CN103344738A (zh) 九味镇心颗粒的检测方法
CN110441445A (zh) 一种鸡冠花hplc特征指纹图谱的构建方法及黄酮类成分含量测定
CN115524424A (zh) 一种荠菜样品质量控制方法
CN104034823B (zh) 一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法
CN107764924B (zh) 哮喘颗粒中有效成分的检测方法
CN108548885A (zh) 二维液相色谱检测复方南星止痛膏的方法
CN110687224B (zh) 雷公藤药材及其制剂雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲的测定方法
CN105486761A (zh) 一种中药颗粒剂中黄芩苷的含量测定方法
CN114403328A (zh) 一种枳椇子和葛根制备的解酒饮料
CN103575823A (zh) 一种糖敏灵制剂中8种化学成分的检测方法
CN113341007A (zh) 一种基于hplc特征图谱的枣仁安神胶囊全药味多成分含量测定方法
CN112051352A (zh) 一种腹可安片质量控制的新方法
CN115015452B (zh) 一种采用一测多评法测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法
CN109061024A (zh) 小儿扶脾颗粒的标准指纹图谱的构建方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant