CN105092765A - 一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法 - Google Patents
一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及药物分析领域，涉及测定灵芝孢子粉原料及其产品中有效成分的方法,涉及麦角硫因、或、和、核苷类成分的高效液相色谱检测,灵敏度高,专属性强。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体是建立测定灵芝孢子粉原料及其产品中有效成分的方法。
背景技术
灵芝(GanodemalingzhiShengH.Wuetal.)是一种药用价值很高的名贵真菌，灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来的卵形生殖细胞，由于灵芝孢子粉具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎等多种生物活性，越来越多地被用于保健和医药产品之中。目前灵芝孢子粉保健食品已有上百个，市场占有率也非常高，主要以灵芝孢子粉散剂和灵芝孢子油胶囊为主。
由于灵芝孢子粉品种繁多、分布广泛、采收时间长，各地的地理环境、气候因素、采收时间、储存条件等都可能会影响灵芝孢子粉的质量，导致市场上灵芝孢子粉产品的质量良莠不齐，比较混乱。现有的关于灵芝孢子粉的质量评价标准比较缺乏，仅有粗多糖和少量核苷类成分的含量测定分析。为了更客观的评价和反映各种因素等对灵芝孢子粉的质量影响、控制其产品质量，规范产品优劣等级，我们从灵芝孢子粉中首次分离纯化得到一个化合物，经鉴定为麦角硫因。麦角硫因是天然稀有的手性氨基酸类强抗氧化剂，具有多种生物活性如抗氧化、抗辐射等多种功能。
核苷类成分是生物细胞维持生命活动的基本组成元素，参与DNA代谢过程，具有抗肿瘤、抗病毒、镇静中枢神经、基因治疗(Kinahanetal.1981)、心肌保护(Elyetal.1985)等多种生物活性，具有广泛的用途，已研究开发了多种产品(吕爱娟和吴皓2006)。《中国药典》2010年版已将腺苷的含量测定作为冬虫夏草的质量控制指标，此类成分作为质量控制的指标越来越受到重视(孔德平等2011；Gaoetal.2007)。
目前分离核苷类物质常采用含磷酸盐缓冲液的流动相和不含磷酸盐缓冲液的流动相(周惠燕等2011)，磷酸盐难溶于有机溶剂，使用不当易析出，使色谱柱保留能力下降，柱效降低，缩短其使用寿命。因此本研究选择甲醇‐水梯度系统用于C18色谱柱的洗脱，参考灵芝及其他中药中核苷类成分的分析测定方法(曹琰等2010；刘玉军等2013；周芬霞等2013；孔德平等2011；Yuanetal.2008)，对流动相比例进行优化，从而对不同破壁时间、不同采样时期及黄山、大别山、奉化、龙泉4个产区的灵芝孢子粉中的胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鸟苷、2’‐脱氧鸟苷、胸苷、腺苷、2’‐脱氧腺苷、虫草素等15种核苷类成分同时进行含量测定，并对不同样品间的差异性进行分析，为评价破壁情况、采收时间和产地因素对灵芝孢子粉质量的影响打下理论基础，为灵芝孢子粉的质量控制提供参考依据。
建立一个活性成分的检测方法对灵芝孢子粉质量控制具有十分重要的意义。
发明内容
本发明涉及一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法，包括以下步骤：
麦角硫因的高效液相色谱检测。
本发明涉及一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法，包括以下步骤：
麦角硫因的高效液相色谱检测，核苷类成分的高效液相色谱检测。
本发明涉及一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法，包括以下步骤：
A灵芝孢子粉的预处理步骤，将灵芝孢子粉加入溶剂浸提，得到浸提液，过滤，得到滤液；
B高效液相色谱检测步骤，对待测样品的滤液进行高效液相色谱分析；
C指标成分是麦角硫因、和、或、核苷类成分。
本发明涉及建立灵芝孢子粉中活性成分麦角硫因的测定方法。
本发明涉及一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法，包括以下步骤：
1)灵芝孢子粉的预处理步骤，将灵芝孢子粉加入溶剂浸提，得到浸提液，过滤，得到滤液；
2)高效液相色谱检测步骤，对待测样品的滤液进行高效液相色谱分析；
3)指标成分是麦角硫因。
更具体地，本发明涉及的灵芝孢子粉的预处理步骤中，
浸提方法可以包括但不限于水浴浸提、磁力搅拌浸提、超声浸提；
浸提可以为一次性浸提或反复浸提；浸提温度为20-100℃，优选60-90℃，最优选60℃；浸提总时间为30-120min，优选60-90min，最优选60min；
浸提液固液分离的方法可以包括但不限于离心、过滤和抽滤；过滤步骤中选择孔径0.1-0.45μm的水相微孔滤膜，优选0.22μm孔径的水相微孔滤膜；浸提过程中超声功率为600W，频率40kHz。
本发明所述的灵芝孢子粉的麦角硫因高效液相色谱检测的条件如下：
色谱柱为复合柱；流动相溶液成分甲醇、乙腈、甲醇-水、乙腈-水、水中的一种或多种，最优选纯水；
流动相的pH范围为2.0-9.0，优选6.0-7.5；
用于调节pH的酸或盐选自乙酸、乙酸钠、硼酸、甲酸、丁酸、乙二酸中的一种或多种，优选乙酸；检测波长为250-260nm，优选257-260nm，最优选257nm；柱温为15-40℃，优选25-30℃，最优选30℃；
流动相的流速为0.2-1.0mL/min，优选0.4-0.6mL/min，最优选0.6mL/min；
色谱图的记录时间为30min以下；麦角硫因的出峰时间为15-20min。
更进一步地，本发明所述的方法，还包括对麦角硫因进行定量的步骤，所述的定量步骤包括：
1)麦角硫因标准品的预处理步骤，包括制备含不同浓度的麦角硫因标准品的溶液；
2)对含不同浓度的麦角硫因标准品的溶液分别进行高效液相色谱检测；
3)根据麦角硫因待测样品的高效液相色谱出峰时间和峰面积，比照标准品的出峰时间和标准曲线，对待测样品中的麦角硫因进行定量。
其中，麦角硫因标准品的预处理步骤包括：精密称取麦角硫因标准品5mg，于25mL具塞试管中，用超纯水配制成浓度为200mg/L的对照品贮备液；再精密吸取贮备液适量，以超纯水制成不同浓度的溶液；经微孔滤膜过滤，即得不同浓度的麦角硫因标准品溶液。上述微孔滤膜过滤步骤中选择孔径0.1-0.45μm的水相微孔滤膜，优选0.22μm孔径的水相微孔滤膜。
更进一步地，对含不同浓度的麦角硫因标准品的溶液进行高效液相色谱检测的条件，与说明书所述的灵芝孢子粉原料中麦角硫因的高效液相色谱检测方法中使用的条件相同。
本发明涉及一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法，包括以下步骤：
A灵芝孢子粉的预处理步骤，将灵芝孢子粉加入溶剂浸提，得到浸提液，过滤，得到滤液；
B高效液相色谱检测步骤，对待测样品的滤液进行高效液相色谱分析；
C指标成分是核苷类成分；
核苷类成分选自胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鸟苷、脱氧鸟苷、胸苷、腺苷、2’-脱氧腺苷、虫草素中的多种；
色谱柱为反相碳十八柱；流动相溶液成分甲醇、乙腈、甲醇-水、乙腈-水、水中的一种或多种，最优选纯甲醇-水；
流动相的pH范围为6.0-8.0，优选6.5-7.5，最优7.0；
检测波长为250-260nm，优选257-260nm，最优选259nm；
柱温为15-40℃，优选25-30℃，最优选30℃；
流动相的流速为0.2-1.0mL/min，优选0.4-0.6mL/min，最优选0.6mL/min。
本发明涉及一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法，包括以下步骤：
甲醇A-水B：
0→10min，0％A；
10→15min，A：0％→5％；
15→30min，A：5％→20％；
30→35min，A：20％→25％；
35→36min，A：25％→0％；
36→45min，0％A。
本发明的灵芝孢子粉中的核苷的方法
材料、试剂和仪器
材料来源：实验用灵芝孢子粉
试剂：胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鸟苷、2’-脱氧鸟苷、胸苷、腺苷、2’-脱氧腺苷、虫草素(3’-脱氧腺苷)等核苷类标准品均购自Sigma公司；甲醇为Dikma公司色谱纯；水为超纯水。
仪器：Waters600型高效液相色谱仪系统：在线脱气，四元泵，Waters717plus自动进样器，柱温箱，Waters2996型二极管阵列检测器，WelchUltimateAQ-C18(4.6×250mm，5μm)，Empower色谱工作站及数据处理系统；KQ-600B型超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；ELGAPURELABUltra超纯水仪，威立雅水处理技术(上海)有限公司；MS105DU电子分析天平，瑞士MetterToledo公司；5415D微型离心机，德国Eppendorf公司；0.22μm针头式过滤器(水系)，月旭科技(上海)股份有限公司；1mL一次性注射器，常州远东医疗器材厂有限公司。
方法
色谱条件的优化：选用月旭公司AQ-C18(4.6×250mm，5μm)为分析柱，以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，检测波长：259nm，柱温：30℃，进样量：10μL，对洗脱条件进行优化，以确定最佳的洗脱程序。
标准品溶液的制备：分别精密称取各标准品适量，置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，制成含胞嘧啶(10μg/mL)、尿嘧啶(10μg/mL)、胞苷(10μg/mL)、次黄嘌呤(10μg/mL)、黄嘌呤(10μg/mL)、尿苷(50μg/mL)、胸腺嘧啶(10μg/mL)、腺嘌呤(10μg/mL)、肌苷(10μg/mL)、鸟苷(50μg/mL)、脱氧鸟苷(10μg/mL)、胸苷(10μg/mL)、腺苷(50μg/mL)、2’-脱氧腺苷(10μg/mL)、虫草素(10μg/mL)的混合标准品溶液，摇匀，并稀释成7个系列浓度混合标准品溶液。
样品溶液的制备：精密称取样品0.5g，置于10mL具塞试管中，精确加入超纯水10mL，密塞，摇匀，超声提取60min，冷却至室温，补足失重，摇匀，移取2mL于2mL离心管中，10000r/min离心3min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，滤液供HPLC分析用。
合适的梯度洗脱条件可以有效缩短分析时间、提高分离度、改善峰形、提高检测灵敏度(谭雯2008)。通过比较不同洗脱条件下的图谱，
选定最佳的梯度洗脱程序：
甲醇(A)-水(B)：
0→10min，0％A；
10→15min，A：0％→5％；
15→30min，A：5％→20％；
30→35min，A：20％→25％；
35→36min，A：25％→0％；
36→45min，0％A。
在该洗脱程序下，15种目标核苷类均达到基线分离，且保留时间适中，与样品其他峰分离效果较好，色谱重现性高。在此色谱条件，将核苷标样单组份及混合标准品溶液进行HPLC分析，根据各单组分的保留时间定性，核苷类混合标准品图谱及样品(黄山未破壁孢子粉)的分析图谱见图1。
方法学的考察
标准曲线的绘制：取“1.2.2”中制备的系列混合标准溶液，按色谱条件分别进行HPLC分析，测定峰面积，以标准品溶液浓度(X，μg/mL)对色谱峰面积(Y)绘制标准曲线，得回归方程、相关系数(表1)。
精密度、重复性和稳定性实验：取同一混合标准溶液，连续进样6次，计算15种核苷类峰面积的R.S.D.，考察仪器精密度；精确称取同一灵芝孢子粉样品6份，按“1.2.3”方法制备样品溶液，分别进样测定，计算15种核苷含量的R.S.D.，考察方法重复性；取同一样品溶液，分别在制备0、3、6、9、12h进样测定，计算15种核苷的峰面积R.S.D.，考察样品稳定性。各计算结果亦见表1。
混合标准品与样品的高效液相色谱图
A：标准品；B：黄山未破壁孢子粉.
1：胞嘧啶；2：尿嘧啶；3：胞苷；4：次黄嘌呤；5：黄嘌呤；6：尿苷；7：胸腺嘧啶；8：腺嘌呤；9：肌苷；10：鸟苷；11：2’-脱氧鸟苷；12：胸苷；13：腺苷；14：2’-脱氧腺苷；15：虫草素.
表1不同核苷类成分的方法学数据
由表1可知，在实验浓度范围内，标样浓度与峰面积呈现良好的线性关系；R.S.D.结果均小于5％，表明所建立的方法精密度和重复性良好，且供试样品溶液在12h内稳定，该方法可以用于灵芝孢子粉中15种核苷类成分的同时测定分析。
本发明高效液相色谱法的仪器与试剂
仪器：Waterse2695型高效液相色谱仪系统，柱温箱，Waters2998型二极管阵列检测器，Empower色谱工作站及数据处理系统均为美国Waters公司；
AsahipakGS-320HQ色谱柱为昭和电工科学仪器(上海)有限公司；
ELGAPURELABUltra超纯水仪为威立雅水处理技术(上海)有限公司；
5415D微型离心机为德国Eppendorf公司。
试剂：超纯水
本发明高效液相色谱法的方法与结果
供试品溶液的制备：精密称取样品0.5g，置于25ml具塞试管中，加入超纯水10mL，密塞，超声提取60min，补足失重，摇匀，取出2mL于2mL离心管中，10000r/min离心3min，过0.22μm微孔水相滤膜，即得供试品溶液。
对照品的制备：取麦角硫因对照品，用超纯水配成每1mL含0.2mg麦角硫因的溶液，并稀释成5个系列浓度的标准品溶液。
色谱条件：选用AsahipakGS-320HQ色谱柱，以超纯水为流动相进行等度洗脱，流速0.6mL/min，柱温30℃，检测波长257nm，进样体积10μL，运行时间30min。
测定：分别吸取对照品和供试液溶液10uL，按上述色谱条件进行HPLC分析测定。
标准曲线的绘制：根据系列标准品溶液的测定结果，以标准品溶液浓度(X，μg/mL)对色谱峰面积(Y)绘制标准曲线，得回归方程、相关系数。
含量计算：外标曲线法计算供试品溶液中麦角硫因的含量，换算出孢子粉样品中麦角硫因的含量。
本发明高效液相色谱法的优选过程
供试品溶液制备的初始条件：精密称取样品0.5g，置于25ml具塞试管中，分别加入提取溶剂10mL，密塞，超声提取60min，补足失重，摇匀，取出2mL于2mL离心管中，10000r/min离心3min，过0.22μm微孔水相滤膜，即得供试品溶液。
提取溶剂的优化：提取溶剂分别选取为无水乙醇、75％的乙醇、50％的乙醇、20％的乙醇和超纯水，其他条件与供试溶液制备的初始条件相同。
分析检测结果：醇的含量越低，麦角硫因的提取率越高；并且在乙醇的浓度较高时会有大量的与麦角硫因分离度不高的杂质峰出现，不利于麦角甾醇的检测分析，因此选用超纯水为提取溶剂。
提取温度的优化：提取温度选取室温、30℃、50℃、60℃、80℃、90℃、100℃，提取溶剂选取超纯水，其他条件与供试溶液制备的初始条件相同。
分析检测结果：提取温度低于50℃时，麦角硫因的提取率较低；当提取温度升高至60℃时，提取率明显增加；继续升温后提取率有所增加，但提升不明显。综合考虑麦角硫因的提取率和能耗，选择60-90℃为提取温度，最优选60℃为最佳的提取温度。
提取时间的优化：选取超纯水为提取溶剂，提取时间分别设定为30、60、90、120min，其他条件与供试溶液制备的初始条件相同。
分析检测结果：提取时间为30min时，麦角硫因的提取率较低；提取时间延长至60min钟时，提取率显著增加；随着提取时间的继续延长，提取率提升不明显。综合考虑麦角硫因提取率及时间、能耗成本，提取时间优选60-90min，最优选60min。
初始色谱检测条件：高效液相色谱AsahipakGS-320HQ，以超纯水为流动相进行等度洗脱，流速0.6mL/min，柱温30℃，检测波长257nm，上样量10μL，运行时间30min。进样物质为供试品溶液。
流动相组成的优选：分别使用相同体积的甲醇、乙腈、甲醇-水(v/v＝5:95、10:90、20:80、30:70、40:60)、乙腈-水(v/v＝5:95、10:90、20:80、30:70、40:60)替代超纯水作为流动相，其他条件与初始色谱条件相同。
检测结果：水在流动相中所占比例越大，麦角硫因与杂质的分离效果越好，但有机相比例过高时，麦角硫因不易被洗脱，致使保留时间过长，不利于麦角硫因的检测分析，故选择超纯水作为流动相。
流动相pH的优化：使用乙酸或者乙酸钠调节流动相的pH至2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，其他条件与初始色谱条件相同。
检测结果：使用乙酸调节流动相的pH至6.0-7.5之间，麦角硫因与杂质的分离度明显优于其他pH条件下的分离度，pH＝7.0时分离效果最佳。pH过高或过低均不利于麦角硫因与杂质的分离。
检测限和定量限的优选实验
使用流动相逐步稀释由实施例1制备的麦角硫因对照品溶液，进行色谱分析，色谱条件同实施例4，在信噪比S/N为3和10时，计算得麦角硫因的最低检测限和定量限分别为3.29mg/L和3.32mg/L。
标准曲线的绘制
将由实施例1制备得到的麦角硫因对照品溶液进行色谱检测，检测条件同实施例4，记录色谱图见附图1，根据对照品的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线，结果见附图2。标准曲线用于定量测定样品中麦角硫因的含量。
精密度试验
由实施例1制备得到的某一麦角硫因对照品溶液进行5次平行的高效液相色谱测定，色谱条件同实施例4，麦角硫因含量检测结果的相对标准偏差RSD为1.25％，表明该方法的精密度良好。
重复性试验
按照实施例1的方法平行制备5份待测样品溶液，测定麦角硫因的含量，计算麦角硫因含量的RSD值为0.93％，表明该方法重复性良好。
样品的时间稳定性的考察
取实施例1处理得到的1份待测样品，在室温下分别放置0、3、6、9、12、18、24h后进行测定，色谱检测条件同实施例4，结果见表，计算麦角硫因含量的RSD值为0.58％，表明待测样品在24h内稳定。
加样回收率试验
取同一已知麦角硫因含量的灵芝孢子粉样品，称取样品9份，每份0.5g，精密称定，分别按样品所含麦角硫因量的80％、100％、120％定量加入麦角硫因标准品，按照实施例1的方法，制成加标供试样品溶液，分别进样测定，色谱检测条件同实施例4，计算每份样品中麦角硫因的检出值，计算其加样回收率。结果表明，麦角硫因回收率在96.71％-99.64％之间，R.S.D.值为1.55％，表明该方法对麦角硫因的检测特异性良好。
回收率＝(检测值－样品溶液中麦角硫因浓度)/麦角硫因对照品加标浓度×100％
含量计算：外标曲线法计算供试品溶液中麦角硫因的含量，换算出孢子粉样品中麦角硫因的含量。
按本发明提供的方法测定灵芝孢子粉，麦角硫因为主要峰，出峰时间为17.99±0.02min。
本发明的创新点在于首次提出以麦角硫因的含量作为灵芝孢子粉及其产品的检测指标。
本发明方法简便、稳定、精密度高、重现性好，可以准确快速进行检测。
附图说明
图1:麦角硫因标品的HPLC图谱
图2:麦角硫因的标准曲线
图3:灵芝孢子粉的麦角硫因HPLC图谱
图4:混合标准品与样品的核苷类成分高效液相色谱图
关于图4的进一步解释:
图4由A和B组成
A：标准品；B：黄山未破壁孢子粉.
在图4中，1－15分别代表：
1：胞嘧啶；2：尿嘧啶；3：胞苷；4：次黄嘌呤；5：黄嘌呤；6：尿苷；7：胸腺嘧啶；8：腺嘌呤；9：肌苷；10：鸟苷；11：2’-脱氧鸟苷；12：胸苷；13：腺苷；14：2’-脱氧腺苷；15：虫草素.
具体实施方式
实施例1灵芝孢子粉的预处理工艺1
供试品溶液的制备：精密称取样品0.5g，置于25ml具塞试管中，加入超纯水10mL，密塞，超声提取60min，补足失重，摇匀，取出2mL于2mL离心管中，10000r/min离心3min，过0.22μm微孔水相滤膜，即得供试品溶液。
对照品的制备：取麦角硫因对照品，用超纯水配成每1mL含0.1mg麦角硫因的溶液，并稀释成5个系列浓度的标准品溶液。
实施例2灵芝孢子粉的预处理工艺2
供试品溶液的制备：精密称取样品0.5g，置于25ml具塞试管中，加入50％的乙醇10mL，密塞，超声提取60min，补足失重，摇匀，取出2mL于2mL离心管中，10000r/min离心3min，过0.22μm微孔水相滤膜，即得供试品溶液。
实施例3灵芝孢子粉的预处理工艺3
供试品溶液的制备：精密称取样品0.5g，置于25ml具塞试管中，加入无水乙醇10mL，密塞，超声提取60min，补足失重，摇匀，取出2mL于2mL离心管中，10000r/min离心3min，过0.22μm微孔水相滤膜，即得供试品溶液。
实施例4流动相组成的优选工艺1
将上述实施例1-3处理得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为AsahipakGS-320HQ，流动相为纯水；
其他色谱条件：检测波长为257nm，柱温为30℃，进样体积为10μL，流速为0.6mL/min，运行时间30min。。
实施例5流动相组成的优选工艺2
将上述实施例1-3处理得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为AsahipakGS-320HQ，流动相为甲醇；
其他色谱条件：检测波长为257nm，柱温为30℃，进样体积为10μL，流速为0.6mL/min。实施例6流动相组成的优选工艺3
将上述实施例1-3处理得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为AsahipakGS-320HQ，流动相为乙腈；
其他色谱条件：检测波长为257nm，柱温为30℃，进样体积为10μL，流速为0.6mL/min。实施例7流动相PH的优选工艺1
将上述实施例1-3处理得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为AsahipakGS-320HQ，流动相为纯水，PH为3.0
其他色谱条件：检测波长为257nm，柱温为30℃，进样体积为10μL，流速为0.6mL/min。实施例5流动相PH的优选工艺2
将上述实施例1-3处理得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为AsahipakGS-320HQ，流动相为纯水，PH为7.0
其他色谱条件：检测波长为257nm，柱温为30℃，进样体积为10μL，流速为0.6mL/min。实施例6流动相PH的优选工艺3
将上述实施例1-3处理得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为AsahipakGS-320HQ，流动相为纯水，PH为9.0
其他色谱条件：检测波长为257nm，柱温为30℃，进样体积为10μL，流速为0.6mL/min。实施例7流速的优选工艺1
将上述实施例1-3处理得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为AsahipakGS-320HQ，流动相为纯水，PH为7.0，流速为0.6mL/min
其他色谱条件：检测波长为257nm，柱温为30℃，进样体积为10μL。
实施例8流速的优选工艺2
将上述实施例1-3处理得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为AsahipakGS-320HQ，流动相为纯水，PH7.0，流速为0.2mL/min
其他色谱条件：检测波长为257nm，柱温为30℃，进样体积为10μL。
实施例9流速的优选工艺3
将上述实施例1-3处理得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为AsahipakGS-320HQ，流动相为纯水，PH7.0，流速为1.0mL/min
其他色谱条件：检测波长为257nm，柱温为30℃，进样体积为10μL。
实施例10柱温的优选工艺1
将上述实施例1-3处理得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为AsahipakGS-320HQ，流动相为纯水，PH7.0，柱温为30℃
其他色谱条件：检测波长为257nm，，流速为0.6mL/min，进样体积为10μL。
实施例11柱温的优选工艺2
将上述实施例1-3处理得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为AsahipakGS-320HQ，流动相为纯水，PH7.0，柱温为20℃
其他色谱条件：检测波长为257nm，，流速为0.6mL/min，进样体积为10μL。
实施例12柱温的优选工艺3
将上述实施例1-3处理得到的供试品溶液溶液注入高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为AsahipakGS-320HQ，流动相为纯水，PH7.0，柱温为40℃
其他色谱条件：检测波长为257nm，，流速为0.6mL/min，进样体积为10μL。
实施例14样品中核苷类成分的含量测定
样品溶液的制备：精密称取样品0.5g，置于10mL具塞试管中，精确加入超纯水10mL，密塞，摇匀，超声提取60min，冷却至室温，补足失重，摇匀，移取2mL于2mL离心管中，10000r/min离心3min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，滤液供HPLC分析用。
取各待测样品溶液各3份，按优化后的色谱条件进行分析测定，通过样品HPLC色谱图洗脱峰的保留时间与标样比较得出待测样品所含核苷的种类，外标曲线法计算各样品中所含核苷的含量，每个样品平行3份。
龙泉不同破壁时间灵芝孢子粉中核苷类成分分析：将龙泉不同破壁时间灵芝孢子粉的测定分析色谱图以AIA格式文件导出，并将图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”中进行相似度计算(表2)。从中可以看出，相似度均大于0.990，表明不同破壁时间的灵芝孢子粉中的核苷类成分的组成和含量基本一致，故实验中可以以未破壁灵芝孢子粉中核苷类成分的分析来表征灵芝孢子粉中相应核苷类成分的组成和含量。
表2龙泉不同破壁时间灵芝孢子粉相似度分析
龙泉、奉化、大别山、黄山四个产地未破壁灵芝孢子粉(-20℃密封冻藏)中核苷类成分分析：表3为不同产地未破壁灵芝孢子粉中核苷类成分的含量。不同产地的灵芝孢子粉中的核苷类成分在组成和含量上存在显著差异。在实验测定的4个不同产地的样品中：胞嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷等5种核苷类成分均有检出，其中尿苷、鸟苷、腺苷的含量均较多，为灵芝孢子粉中的主要核苷类成分(龙泉、奉化、大别山、黄山样品中3种核苷占总量的比例分别为80.0％、79.1％、72.9％、84.2％)，胞苷的含量次之(龙泉样品中未检出)；胸腺嘧啶和虫草素均未检测到；胸苷只在大别山和黄山样品中含有少量(<10μg/g)；2’-脱氧腺苷只在黄山未破壁样品中有少量检出(6.869μg/g)；其他核苷类成分在能检测出的样品中含量也较低(<20μg/g)。
龙泉不同采样时间未破壁灵芝孢子粉(室温密封存放)中核苷类成分分析：表4为龙泉不同采样时期未破壁灵芝孢子粉中核苷类成分的含量。其中，胞苷、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、
腺嘌呤、2’-脱氧鸟苷、胸苷、2’-脱氧腺苷、虫草素等在两个采收时期的样品中均未检出，故表中未单独列出。由表4可知，随着产粉时间的延长，灵芝孢子粉中含有的相应核苷类成分的含量除胞嘧啶和尿嘧啶有一定程度的减少外，其他检出的核苷类成分均有所增加。
表3不同产地未破壁灵芝孢子粉中核苷类成分的组成(n＝3,μg/g)
表4龙泉不同采样时间未破壁灵芝孢子粉中核苷类成分的组成(n＝3,μg/g)
本发明选用甲醇-水梯度洗脱程序检测核苷，与采用含磷酸盐缓冲液流动相的方法(俞晓玲等2009)相比，本发明可以有效的延长色谱柱的使用寿命。
本发明与目前关于灵芝孢子粉和常见中药中核苷类成分测定的HPLC方法相比(王均理2013；周芬霞等2013；曹琰等2010；米莉莉等2003)，本发明分析的核苷类成分种类多、分离度高、覆盖面广，更具有代表性和说服力，具有较强的实用价值。进行的方法学考察表明，该方法简便、快捷、准确，灵敏度高，重复性好，稳定可靠，可用于灵芝孢子粉中核苷类成分含量的测定，本发明为评价灵芝孢子粉的质量提供了参考依据。
有文献记载灵芝孢子的细胞壁富含纤维素、几丁质，其细胞壁致密、坚硬，结构复杂且耐酸碱，阻碍了人体对其有效成分的消化吸收，破壁处理有利于灵芝孢子粉中三萜、粗多糖及粗脂肪等有效成分的溶出(赵晓燕等2011)。而关于破壁处理对灵芝孢子粉中核苷类等小分子成分的影响的文献还未见报道。从本发明结果可以看出，破壁处理并没有有效的促进灵芝孢子粉中核苷类成分的溶出，破壁时间长短对灵芝孢子粉中核苷类成分提取率的影响不大。
室温和冻藏两种不同的存放条件下样品中核苷类成分的组成和含量存在很大的差别，室温存放样品中相应核苷类成分的总量远低于冻藏样品。这一现象初步推测可能是室温条件下酶和微生物的生命活动所致，具体原因还有待于进一步的研究考证。
Claims (9)
1.一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法，包括以下步骤：
麦角硫因的高效液相色谱检测。
2.一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法，包括以下步骤：
麦角硫因的高效液相色谱检测、和、核苷类成分的高效液相色谱检测。
3.根据权利要求1-2的一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法，包括以下步骤：
A灵芝孢子粉的预处理步骤，将灵芝孢子粉加入溶剂浸提，得到浸提液，过滤，得到滤液；
B高效液相色谱检测步骤，对待测样品的滤液进行高效液相色谱分析；
C指标成分是麦角硫因、和、或、核苷类成分。
4.根据权利要求1-2的一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法，包括以下步骤：
A灵芝孢子粉的预处理步骤，将灵芝孢子粉加入溶剂浸提，得到浸提液，过滤，得到滤液；
B高效液相色谱检测步骤，对待测样品的滤液进行高效液相色谱分析；
C指标成分是麦角硫因；
色谱柱为复合柱；流动相溶液成分甲醇、乙腈、甲醇-水、乙腈-水、水中的一种或多种，最优选纯水；
流动相的pH范围为2.0-9.0，优选6.0-7.5；
用于调节pH的酸或盐选自乙酸、乙酸钠、硼酸、甲酸、丁酸、乙二酸中的一种或多种，优选乙酸；
检测波长为250-260nm，优选257-260nm，最优选257nm；
柱温为15-40℃，优选25-30℃，最优选30℃；
流动相的流速为0.2-1.0mL/min，优选0.4-0.6mL/min，最优选0.6mL/min；
色谱图的记录时间为30min以下；麦角硫因的出峰时间为15-20min。
5.根据权利要求1-2的一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法，包括以下步骤：
A灵芝孢子粉的预处理步骤，将灵芝孢子粉加入溶剂浸提，得到浸提液，过滤，得到滤液；
B高效液相色谱检测步骤，对待测样品的滤液进行高效液相色谱分析；
C指标成分是核苷类成分；
核苷类成分选自胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鸟苷、脱氧鸟苷、胸苷、腺苷、2’-脱氧腺苷、虫草素中的多种；
色谱柱为反相碳十八柱；流动相溶液成分甲醇、乙腈、甲醇-水、乙腈-水、水中的一种或多种，最优选纯甲醇-水；
流动相的pH范围为6.0-8.0，优选6.5-7.5，最优7.0；
检测波长为250-260nm，优选257-260nm，最优选259nm；
柱温为15-40℃，优选25-30℃，最优选30℃；
流动相的流速为0.2-1.0mL/min，优选0.4-0.6mL/min，最优选0.6mL/min。
6.根据权利要求4的一种灵芝孢子粉原料有效成分的检测方法，包括以下步骤：
甲醇A-水B：
0→10min，0％A；
10→15min，A：0％→5％；
15→30min，A：5％→20％；
30→35min，A：20％→25％；
35→36min，A：25％→0％；
36→45min，0％A。
7.如权利要求1-2所述的检测方法，其特征在于：
在所述的灵芝孢子粉的预处理步骤中，浸提方法包括水浴浸提、磁力搅拌浸提、超声浸提。
8.如权利要求1-2所述的方法，其特征在于：
在所述的灵芝孢子粉的预处理步骤中，浸提方法包括一次性浸提或反复浸提，浸提温度为20-100℃，浸提总时间为30-120min；
过滤步骤中选择孔径0.1-0.45μm的水相微孔滤膜，优选0.22μm孔径的水相微孔滤膜。
9.如权利要求1所述的检测方法，在所述的灵芝孢子粉的预处理步骤中，超声浸提过程中超声功率600w，频率40kHz。
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