CN109932441A - 一种舒肝宁注射液hplc指纹图谱的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法，本发明针对灵芝提取物中成分极性较大的特点，建立了针对灵芝提取物的注射液成品指纹图谱，对流动相、检测波长等高效液相色谱条件进行优化，并进行了全面的方法学考察，通过系统研究可以看出从灵芝药材、灵芝提取物到成品制剂的特征成分峰具有较好的相关性，灵芝的特有化学成分能够转移到成品制剂中，该指纹图谱能较好地体现灵芝的特有成分，用该方法还能较为全面地反映舒肝宁注射液中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价，且用该方法检测到的舒肝宁注射液指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。
Description
技术领域
本发明涉及一种药品HPLC指纹图谱的建立方法，特别是一种舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法。
技术背景
舒肝宁注射液是护肝药物，主要由茵陈提取物、栀子提取物、黄芩苷、板蓝根提取物及灵芝提取物制成。具有清热解毒，利湿退黄，益气扶正，保肝护肝的功效。用于湿热黄疸，症见面目俱黄，胸肋胀满，恶心呕吐，小便黄赤，乏力，纳差，便溏；急、慢性病毒性肝炎见前述症状者。
舒肝宁注射液由传统中药古方发展而来，受当时科研水平限制，其质量标准起点较低，对药理药效等基础研究较为有限。为进一步探索其作用机理与药用基础，确保产品安全有效、质量可控，迫切需要运用现代医药科研手段对本产品进行质量标准的提升与药理药效实验研究。
中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。在此基础上，如果进一步开展谱效学研究，可使中药质量与其药效真正结合起来，有助于阐明中药作用机理。目前，对于舒肝宁注射液指纹图谱条件中未能对处方中灵芝提取物的特征成分进行全面体现，限制了舒肝宁注射液的技术提升与深度开发。
发明内容：
本发明的目的在于，提供一种舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法。本发明针对灵芝提取物中成分极性较大的特点，建立了针对灵芝提取物的注射液成品指纹图谱，对流动相、检测波长等高效液相色谱条件进行优化，并进行了全面的方法学考察，通过系统研究可以看出从灵芝药材、灵芝提取物到成品制剂的特征成分峰具有较好的相关性，灵芝的特有化学成分能够转移到成品制剂中，该指纹图谱能较好地体现灵芝的特有成分。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案实现：一种舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法，所述舒肝宁注射液按重量份计算，主要由茵陈提取物3-5份、栀子提取物2-4份、黄芩苷20-24份、板蓝根提取物4-6份和灵芝提取物3-4份按下述方法制备而成：以上五味，取黄芩苷加8-12倍量注射用水混悬，加10％氢氧化钠溶液使溶解；其余茵陈提取物等四味，分别加8-12倍量注射用水溶解，混匀，加0.2％活性炭，搅匀，煮沸15分钟，滤过，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至7.5～8.0，加注射用水至1000体积份，滤过，灌封，灭菌，即得；
所述HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)参照物溶液的制备：取腺苷对照品、胸苷对照品、灵芝酸A对照品、灵芝酸B对照品、赤芝酸A对照品、胞苷对照品、尿苷对照品、鸟苷对照品、虫草素对照品、2-脱氧核苷对照品，精密称定，分别加水制成每1ml含腺苷0.8-1.2mg/ml、胸苷0.8-1.2mg/ml、灵芝酸A 0.8-1.2mg/ml、灵芝酸B 0.8-1.2mg/ml、赤芝酸A 0.8-1.2mg/ml、胞苷0.8-1.2mg/ml、尿苷0.8-1.2mg/ml、鸟苷0.8-1.2mg/ml、虫草素0.8-1.2mg/ml、2-脱氧核苷0.8-1.2mg/ml的溶液；
(2)腺苷对照品溶液的制备：精密称取腺苷对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(3)胸苷对照品溶液的制备：精密称取胸苷对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(4)灵芝酸A对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸A对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得；
(5)灵芝酸B对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸B对照品8-10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得；
(6)赤芝酸A对照品溶液的制备：精密称取赤芝酸A对照品8-10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得；
(7)胞苷对照品溶液的制备：精密称取胞苷对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(8)尿苷对照品溶液的制备：精密称取尿苷对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(9)鸟苷对照品溶液的制备：精密称取鸟苷对照品8-10mg，加水5ml混匀后加入0.1ml氨水溶解，并用水定容至刻度，既得；
(10)虫草素对照品溶液的制备：精密称取虫草素对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(11)2-脱氧核苷对照品溶液的制备：精密称取2-脱氧核苷对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(12)混合参照物溶液①的制备：精密吸取腺苷对照品溶液、胸苷对照品溶液、灵芝酸A对照品溶液、灵芝酸B对照品溶液、赤芝酸A对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml；
(13)混合参照物溶液②的制备：精密吸取胞苷对照品溶液、尿苷对照品溶液、鸟苷对照品溶液、虫草素对照品溶液、2-脱氧核苷对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml；
(14)供试品溶液的制备：精密吸取舒肝宁注射液5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；
(15)指纹图谱的制作：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱ECOSIL HPLC COLUMN-C18，5μm，4.6×250mm；以乙腈为流动相A，0.1％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；梯度洗脱程序为：0～10min，100％B；10～15min，100％→97％(B)；15～30min，97％→80％(B)；30～90min，80％→50％(B)；90～105min，50％(B)；流速为每分钟1ml；检测波长为254nm；柱温为35℃；理论板数按腺苷峰计算应不低于3000；分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录105分钟的色谱图，即可得到舒肝宁注射液的HPLC指纹图谱；
(16)标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次舒肝宁注射液建立了HPLC指纹图谱，通过分析比较确定了5个共有峰，这些共有峰构成了舒肝宁注射液的指纹特征，作为舒肝宁注射液的标准指纹图谱。
前舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法中，所述舒肝宁注射液按重量份计算，主要由茵陈提取物4份、栀子提取物3份、黄芩苷22份、板蓝根提取物5份和灵芝提取物3.5份按下述方法制备而成：以上五味，取黄芩苷加适量注射用水混悬，加10％氢氧化钠溶液使溶解；其余茵陈提取物等四味，分别加注射用水溶解，混匀，加0.2％活性炭，搅匀，煮沸15分钟，滤过，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至7.5～8.0，加注射用水至1000体积份，滤过，灌封，灭菌，即得；
所述HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)参照物溶液的制备：取腺苷对照品、胸苷对照品、灵芝酸A对照品、灵芝酸B对照品、赤芝酸A对照品、胞苷对照品、尿苷对照品、鸟苷对照品、虫草素对照品、2-脱氧核苷对照品，精密称定，分别加水制成每1ml含腺苷1mg/ml、胸苷1mg/ml、灵芝酸A 1mg/ml、灵芝酸B1mg/ml、赤芝酸A 1mg/ml、胞苷1mg/ml、尿苷1mg/ml、鸟苷1mg/ml、虫草素1mg/ml、2-脱氧核苷1mg/ml的溶液；
(2)腺苷对照品溶液的制备：精密称取腺苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(3)胸苷对照品溶液的制备：精密称取胸苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(4)灵芝酸A对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸A对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得；
(5)灵芝酸B对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸B对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得；
(6)赤芝酸A对照品溶液的制备：精密称取赤芝酸A对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得；
(7)胞苷对照品溶液的制备：精密称取胞苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(8)尿苷对照品溶液的制备：精密称取尿苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(9)鸟苷对照品溶液的制备：精密称取鸟苷对照品10mg，加水5ml混匀后加入0.1ml氨水溶解，并用水定容至刻度，既得；
(10)虫草素对照品溶液的制备：精密称取虫草素对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(11)2-脱氧核苷对照品溶液的制备：精密称取2-脱氧核苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(12)混合参照物溶液①的制备：精密吸取腺苷对照品溶液、胸苷对照品溶液、灵芝酸A对照品溶液、灵芝酸B对照品溶液、赤芝酸A对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml；
(13)混合参照物溶液②的制备：精密吸取胞苷对照品溶液、尿苷对照品溶液、鸟苷对照品溶液、虫草素对照品溶液、2-脱氧核苷对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml；
(14)供试品溶液的制备：精密吸取舒肝宁注射液5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；
(15)指纹图谱的制作：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱ECOSIL HPLC COLUMN-C18，5μm，4.6×250mm；以乙腈为流动相A，0.1％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；梯度洗脱程序为：0～10min，100％B；10～15min，100％→97％(B)；15～30min，97％→80％(B)；30～90min，80％→50％(B)；90～105min，50％(B)；流速为每分钟1ml；检测波长为254nm；柱温为35℃；理论板数按腺苷峰计算应不低于3000；分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录105分钟的色谱图，即可得到舒肝宁注射液的HPLC指纹图谱；
(16)标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次舒肝宁注射液建立了HPLC指纹图谱，通过分析比较确定了5个共有峰，这些共有峰构成了舒肝宁注射液的指纹特征，作为舒肝宁注射液的标准指纹图谱。
前述的舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法中，所述5个共有峰，以5号峰腺苷为参照峰，其相对保留时间分别为0.4377-0.4448、0.5251-0.5343、0.6247-0.6358、0.9429-0.9519、1.0000。
发明人进行了大量的实验，以下是本发明所述检测方法的研究
实验例1：舒肝宁注射液成品指纹图谱研究
(一)【指纹图谱】照高效液相色谱法(通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％醋酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1ml；检测波长为254nm；柱温为35℃。理论板数按腺苷峰计算应不低于3000。
表1梯度洗脱程序
参照物溶液的制备：取腺苷对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含腺苷1mg的参照物溶液。
供试品溶液的制备：精密吸取舒肝宁注射液5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录105分钟的色谱图，即得。见图1。
按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的指纹峰相似度不得低于0.90。
(二)实验条件与方法
【指纹图谱】照高效液相色谱法(通则0512)测定。
色谱条件及系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈－0.1％醋酸溶液为流动相，梯度洗脱(见表1)；检测波长：254nm。流速：1ml/min；柱温：35℃，理论板数按腺苷峰计算应不低于3000。
表1流动相梯度洗脱表
参照物溶液的制备：取腺苷对照品、胸苷对照品、灵芝酸A对照品、灵芝酸B对照品、赤芝酸A对照品、胞苷对照品、尿苷对照品、鸟苷对照品、虫草素对照品、2-脱氧核苷对照品适量，精密称定，分别加适当溶剂制成每1ml含腺苷1mg/ml、胸苷1mg/ml、灵芝酸A 1mg/ml、灵芝酸B 1mg/ml、赤芝酸A 1mg/ml、胞苷1mg/ml、尿苷1mg/ml、鸟苷1mg/ml、虫草素1mg/ml、2-脱氧核苷1mg/ml的溶液。
腺苷对照品溶液的制备：精密称取腺苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得。
胸苷对照品溶液的制备：精密称取胸苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得。
灵芝酸A对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸A对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得。
灵芝酸B对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸B对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得。
赤芝酸A对照品溶液的制备：精密称取赤芝酸A对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得。
胞苷对照品溶液的制备：精密称取胞苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得。
尿苷对照品溶液的制备：精密称取尿苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得。
鸟苷对照品溶液的制备：精密称取鸟苷对照品10mg，加水5ml混匀后加入0.1ml氨水溶解，并用水定容至刻度，既得。
虫草素对照品溶液的制备：精密称取虫草素对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得。
2-脱氧核苷对照品溶液的制备：精密称取2-脱氧核苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得。
混合参照物溶液①的制备：精密吸取腺苷对照品溶液、胸苷对照品溶液、灵芝酸A对照品溶液、灵芝酸B对照品溶液、赤芝酸A对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml。
混合参照物溶液②的制备：精密吸取胞苷对照品溶液、尿苷对照品溶液、鸟苷对照品溶液、虫草素对照品溶液、2-脱氧核苷对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml。
舒肝宁注射液供试品溶液的制备：精密吸取舒肝宁注射液5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录105分钟的色谱图，即得。
供试品指纹图谱应与对照指纹图谱基本一致，有相对应的5个特征峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算。对照指纹图谱见图2。
(三)实验结果舒肝宁注射液、灵芝提取物的指纹图谱见图3～6。
按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，舒肝宁注射液指纹图谱与对照指纹图谱的相似度的测定结果见表2。
表2舒肝宁注射液相似度计算结果
由图3～6可发现,对照品腺苷、鸟苷、胞苷、灵芝酸A、灵芝酸B的色谱峰保留时间与灵芝提取物中相关指纹色谱峰基本吻合，并采用质谱确认的方式确认成品中含有以上化学成分，但由于成品中灵芝酸A、灵芝酸B的含量较低故未作为特征峰进行指认。
(四)灵芝提取物与舒肝宁注射液指纹图谱的相关性比较
将灵芝药材、灵芝提取物指纹图谱与成品指纹图谱进行了比较分析。由图7可见，灵芝药材和提取物中1号、2号、3号、4号和5号共有峰均转移至成品中，通过缺灵芝提取物的成品阴性样品对比，可见1号、2号共有峰为灵芝提取物特有专属成分，灵芝提取物的指纹图谱与舒肝宁注射液成品的指纹图谱有较高的相关性，可在注射液图谱中对灵芝提取物的特征峰进行追溯。
实验例2：舒肝宁注射液指纹图谱方法学验证
(一)仪器与试药
1.仪器岛津LC-20ADXR高效液相色谱仪，LabSolutions version 6.43SP2。
2.试药甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。
3.对照品：腺苷(CDAA-280021-20mg)供HPLC含量测定用，由上海安谱科学仪器有限公司提供。
4.样品：10批舒肝宁注射液(贵州瑞和制药有限公司提供)，见表3。
表3舒肝宁注射液样品
(二)色谱条件的选择
1.柱温的选择
1.1色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；按下表进行梯度洗脱,乙腈－0.1％醋酸溶液为流动相；流速为每分钟1ml；检测波长为245nm。
表4流动相梯度洗脱表
1.2供试品溶液的制备精密吸取舒肝宁5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
1.3测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录105分钟的色谱图，即得。
1.4测试范围与效果
1.4.1柱温：30℃，相应条件下的灵芝提取物指纹图谱见图8和图9。(柱温1-1和柱温1-2表示该温度(30℃)下进样的2针平行样结果。
1.4.2柱温：35℃，相应条件下的灵芝提取物指纹图谱见图10和图11。(柱温2-1和柱温2-2表示该温度(35℃)下进样的2针平行样结果。
1.4.3柱温：40℃，相应条件下的灵芝提取物指纹图谱见图12和图13。表示该温度(40℃)下进样的2针平行样结果。
1.5分析与结论：经过较系统的研究，分别实验了以上3种柱温，并得出相应条件下的灵芝提取物指纹图谱。分析上述指纹图谱可发现，3种柱温条件下出峰数目相似，但35℃下的色谱图的分离度更好，故选择35℃作为柱温。
2.色谱柱比对
2.1色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％醋酸溶液为流动相B，按表5中的条件进行梯度洗脱；流速为每分钟1ml；检测波长为245nm；柱温为35℃。
表5流动相梯度洗脱表
2.2供试品溶液的制备精密吸取舒肝宁5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录105分钟的色谱图，即得。
2.4色谱柱类型与效果
2.4.1ECOSIL HPLC COLUMN-C18(5μm，4.6×150mm)，相应条件下的灵芝提取物指纹图谱见图14和图15。色谱柱1-1和色谱柱1-2表示色谱柱(ECOSIL HPLC COLUMN-C18(5μm，4.6×150mm))下进样的2针平行结果。
2.4.2Sino Chrom ODS-BP(5μm，4.6×150mm)，相应条件下的灵芝提取物指纹图谱见图16和图17。色谱柱2-1和色谱柱2-2表示色谱柱(Sino Chrom ODS-BP(5μm，4.6×150mm))下进样的2针平行结果。
2.4.3CNW Athena C18120A(5μm，4.6×25cm)，相应条件下的灵芝提取物指纹图谱见图18和图19。色谱柱3-1和色谱柱3-2表示色谱柱(CNW Athena C18120A(5μm，4.6×25cm))下进样的2针平行结果。
2.4.4Platisil 5μm ODS分析柱(250×4.6mm)，相应条件下的灵芝提取物指纹图谱见图20和图21。色谱柱4-1和色谱柱4-2表示色谱柱(Platisil 5μm ODS分析柱(250×4.6mm))下进样的2针平行结果。
2.5分析与结论：经过较系统的研究，分别实验了以上4根色谱柱，并得出相应条件下的灵芝提取物指纹图谱。由上述可知共分为2种柱长，其中150mm柱长的指纹图谱较250mm柱长的指纹图谱分离度较差，故选用250mm柱长的色谱柱。
3.色谱条件的确认
色谱柱：Platisil 5μm ODS分析柱(250×4.6mm)。流动相：乙腈—0.1％醋酸溶液为流动相，梯度洗脱(见表6)，流速：1ml/min；检测波长为254nm，柱温35℃。理论板数按腺苷峰计算应不低于3000。
表6流动相梯度洗脱表
(三)检测波长的选择
常用来对灵芝进行分析的检测波长有234nm、238nm、239nm、243nm、254nm、280nm、300nm、360nm，故比对同一针舒肝宁注射液在以上波长下的指纹图谱。各检测波长下得到的指纹图见图22至图37。
分析与结论：经过较系统的研究，对比了同一针舒肝宁注射液不同波长下的指纹图谱，可发现234nm、238nm、239nm处出峰数目较多，但比较密集；280nm、300nm、360nm处色谱峰分离效果良好，但出峰数目较少；254nm处出峰数目较多，分离度良好，故选用254nm。
(四)参照物溶液及供试品溶液的制备
1.参照物溶液的制备：精密称取腺苷对照品适量，加水溶解制成每1ml含1mg的溶液，即得。
2.供试品溶液的制备：精密吸取本品5ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
3.测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，测定。
(五)方法学研究
1.精密度试验
精密吸取舒肝宁注射液(20160317)5ml，按供试品溶液制备方法处理，重复进样6次。结果见表7～11，图38。
表7精密度试验共有峰保留时间
表8精密度试验共有峰相对保留时间
表9精密度试验共有峰峰面积
表10精密度试验共有峰相对峰面积
表11精密度试验相似度结果
结论：经统计分析，各共有峰相对保留时间的相对标准偏差为0.00％～0.40％；经相似度软件计算，各色谱间的相似度均为1，说明精密度试验基本符合要求。
2.重复性试验
精密吸取舒肝宁注射液(20160317)5ml，共6份，按供试品溶液制备方法处理，测定。结果见表12～表16，图39。
表12重复性试验共有峰保留时间
表13重复性试验共有峰相对保留时间
表14重复性试验共有峰峰面积
表15重复性试验共有峰相对峰面积
表16相似度计算结果
结论：经统计分析，各共有峰相对保留时间的相对标准偏差为0.00％～0.14％；经相似度软件计算，各色谱间的相似度均为1，说明重复性试验基本符合要求。
3.样品溶液稳定性试验
精密吸取舒肝宁注射液(20160317)5ml，按供试品溶液制备方法处理，于0min、200min、600min、800min、1000min进行测定，结果见表17～21，图40。
表17稳定性试验共有峰保留时间
表18稳定性试验共有峰相对保留时间
表19稳定性试验共有峰峰面积
表20稳定性试验共有峰相对峰面积
表21相似度计算结果
结论：经统计分析，各共有峰相对保留时间的相对标准偏差为0.00％～1.00％；经相似度软件计算，各色谱间的相似度均为1，说明供试品溶液在1000分钟内基本稳定。
(六)样品指纹图谱测定
按照拟订标准正文所述方法，测定是10批舒肝宁注射液的指纹图谱，结果见表22，图41～图53：
采用药典会相似度计算软件，对10批舒肝宁注射液指纹图谱进行匹配，下图表示出10批样品指纹图谱的叠加图：
表22 10批舒肝宁注射液指纹图谱相似度计算结果
结论：10批舒肝宁注射液的指纹谱相似度最低位0.975，因此我们暂定舒肝宁注射液的相似度不得低于0.90。
(七)共有峰的确定及对照指纹图谱的生成
经药典委员会推荐的相似度软件模拟生成舒肝宁注射液的对照指纹图谱，见图52和53。
与现有技术相比，本发明针对灵芝提取物中成分极性较大的特点，建立了针对灵芝提取物的注射液成品指纹图谱，对流动相、检测波长等高效液相色谱条件进行优化，并进行了全面的方法学考察，通过系统研究可以看出从灵芝药材、灵芝提取物到成品制剂的特征成分峰具有较好的相关性，灵芝的特有化学成分能够转移到成品制剂中，该指纹图谱能较好地体现灵芝的特有成分。本发明方法还具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；用该方法还能较为全面地反映舒肝宁注射液中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价，可将舒肝宁注射液质量与其药效真正结合起来，有助于阐明其作用机理为舒肝宁注射液的技术提升与深度开发提供了依据。且用该方法检测到的舒肝宁注射液指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。
附图说明
图1是舒肝宁注射液对照指纹图谱(峰5：腺苷)；
图2是舒肝宁注射液对照指纹图谱；
图3是舒肝宁注射液指纹图谱；
图4是10批舒肝宁注射液指纹图谱；
图5是混合参照物①(依次为腺苷、胸苷、灵芝酸B、灵芝酸A、赤芝酸A)；
图6是混合参照物②(依次为胞苷、尿苷、鸟苷、虫草素、2-脱氧核苷)；
图7是灵芝药材、灵芝提取物、舒肝宁注射液及缺灵芝提取物舒肝宁阴性样品比对图；
图8是柱温1-1时，灵芝提取物指纹图谱；
图9是柱温1-2时，灵芝提取物指纹图谱；
图10是柱温2-1，时，灵芝提取物指纹图谱；
图11是柱温2-2时，灵芝提取物指纹图谱；
图12是柱温3-1时，灵芝提取物指纹图谱；
图13是柱温3-2时，灵芝提取物指纹图谱；
图14是色谱柱1-1，灵芝提取物指纹图谱；
图15是色谱柱1-2，灵芝提取物指纹图谱；
图16是色谱柱2-1，灵芝提取物指纹图谱；
图17是色谱柱2-2，灵芝提取物指纹图谱；
图18是色谱柱3-1，灵芝提取物指纹图谱；
图19是色谱柱3-2，灵芝提取物指纹图谱；
图20是色谱柱4-1，灵芝提取物指纹图谱；
图21是色谱柱4-2，灵芝提取物指纹图谱；
图22是234nm-1，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图23是234nm-2，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图24是238nm-1，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图25是238nm-2，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图26是239nm-1，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图27是239nm-2，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图28是243nm-1，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图29是243nm-2，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图30是254nm-1，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图31是254nm-2，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图32是280nm-1，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图33是280nm-2，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图34是300nm-1，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图35是300nm-2，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图36是360nm-1，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图37是360nm-2，舒肝宁注射液在该波长下的指纹图谱；
图38是舒肝宁注射液精密度匹配图谱；
图39是重复性匹配图谱；
图40是稳定性匹配图谱；
图41是舒肝宁注射液1的指纹图谱；
图42是舒肝宁注射液2的指纹图谱；
图43是舒肝宁注射液3的指纹图谱；
图44是舒肝宁注射液4的指纹图谱；
图45是舒肝宁注射液5的指纹图谱；
图46是舒肝宁注射液6的指纹图谱；
图47是舒肝宁注射液7的指纹图谱；
图48是舒肝宁注射液8的指纹图谱；
图49是舒肝宁注射液9的指纹图谱；
图50是舒肝宁注射液10的指纹图谱；
图51是10批舒肝宁注射液指纹图谱叠加图；
图52是生成对照指纹图谱的10批舒肝宁注射液指纹图谱；
图53是生成的舒肝宁注射液对照指纹图谱。
下面结合实施例对发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
具体实施方式：
实施例1.
一种舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述舒肝宁注射液主要由茵陈提取物4g、栀子提取物3g、黄芩苷22g、板蓝根提取物5g和灵芝提取物3.5g按下述方法制备而成：以上五味，取黄芩苷加10倍量注射用水混悬，加1200ml 10％氢氧化钠溶液使溶解；其余茵陈提取物等四味，分别1200ml加注射用水溶解，混匀，加0.2％活性炭，搅匀，煮沸15分钟，滤过，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至7.5～8.0，加注射用水至1000mL，滤过，灌封，灭菌，即得；
所述HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)参照物溶液的制备：取腺苷对照品、胸苷对照品、灵芝酸A对照品、灵芝酸B对照品、赤芝酸A对照品、胞苷对照品、尿苷对照品、鸟苷对照品、虫草素对照品、2-脱氧核苷对照品，精密称定，分别加水制成每1ml含腺苷1mg/ml、胸苷1mg/ml、灵芝酸A 1mg/ml、灵芝酸B1mg/ml、赤芝酸A 1mg/ml、胞苷1mg/ml、尿苷1mg/ml、鸟苷1mg/ml、虫草素1mg/ml、2-脱氧核苷1mg/ml的溶液；
(2)腺苷对照品溶液的制备：精密称取腺苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(3)胸苷对照品溶液的制备：精密称取胸苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(4)灵芝酸A对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸A对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得；
(5)灵芝酸B对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸B对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得；
(6)赤芝酸A对照品溶液的制备：精密称取赤芝酸A对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得；
(7)胞苷对照品溶液的制备：精密称取胞苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(8)尿苷对照品溶液的制备：精密称取尿苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(9)鸟苷对照品溶液的制备：精密称取鸟苷对照品10mg，加水5ml混匀后加入0.1ml氨水溶解，并用水定容至刻度，既得；
(10)虫草素对照品溶液的制备：精密称取虫草素对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(11)2-脱氧核苷对照品溶液的制备：精密称取2-脱氧核苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(12)混合参照物溶液①的制备：精密吸取腺苷对照品溶液、胸苷对照品溶液、灵芝酸A对照品溶液、灵芝酸B对照品溶液、赤芝酸A对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml；
(13)混合参照物溶液②的制备：精密吸取胞苷对照品溶液、尿苷对照品溶液、鸟苷对照品溶液、虫草素对照品溶液、2-脱氧核苷对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml；
(14)供试品溶液的制备：精密吸取舒肝宁注射液5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；
(15)指纹图谱的制作：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱ECOSIL HPLC COLUMN-C18，5μm，4.6×250mm；以乙腈为流动相A，0.1％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；梯度洗脱程序为：0～10min，100％B；10～15min，100％→97％(B)；15～30min，97％→80％(B)；30～90min，80％→50％(B)；90～105min，50％(B)；流速为每分钟1ml；检测波长为254nm；柱温为35℃；理论板数按腺苷峰计算应不低于3000；分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录105分钟的色谱图，即可得到舒肝宁注射液的HPLC指纹图谱；
(16)标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次舒肝宁注射液建立了HPLC指纹图谱，通过分析比较确定了5个共有峰，这些共有峰构成了舒肝宁注射液的指纹特征，作为舒肝宁注射液的标准指纹图谱。
所述5个共有峰，以5号峰腺苷为参照峰，其相对保留时间分别为0.4377-0.4448、0.5251-0.5343、0.6247-0.6358、0.9429-0.9519、1.0000。
Claims (3)
1.一种舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述舒肝宁注射液按重量份计算，主要由茵陈提取物3-5份、栀子提取物2-4份、黄芩苷20-24份、板蓝根提取物4-6份和灵芝提取物3-4份按下述方法制备而成：以上五味，取黄芩苷加8-12倍量注射用水混悬，加10％氢氧化钠溶液使溶解；其余茵陈提取物等四味，分别加8-12倍量注射用水溶解，混匀，加0.2％活性炭，搅匀，煮沸15分钟，滤过，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至7.5～8.0，加注射用水至1000体积份，滤过，灌封，灭菌，即得；
所述HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)参照物溶液的制备：取腺苷对照品、胸苷对照品、灵芝酸A对照品、灵芝酸B对照品、赤芝酸A对照品、胞苷对照品、尿苷对照品、鸟苷对照品、虫草素对照品、2-脱氧核苷对照品，精密称定，分别加水制成每1ml含腺苷0.8-1.2mg/ml、胸苷0.8-1.2mg/ml、灵芝酸A 0.8-1.2mg/ml、灵芝酸B 0.8-1.2mg/ml、赤芝酸A 0.8-1.2mg/ml、胞苷0.8-1.2mg/ml、尿苷0.8-1.2mg/ml、鸟苷0.8-1.2mg/ml、虫草素0.8-1.2mg/ml、2-脱氧核苷0.8-1.2mg/ml的溶液；
(2)腺苷对照品溶液的制备：精密称取腺苷对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(3)胸苷对照品溶液的制备：精密称取胸苷对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(4)灵芝酸A对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸A对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得；
(5)灵芝酸B对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸B对照品8-10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得；
(6)赤芝酸A对照品溶液的制备：精密称取赤芝酸A对照品8-10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得；
(7)胞苷对照品溶液的制备：精密称取胞苷对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(8)尿苷对照品溶液的制备：精密称取尿苷对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(9)鸟苷对照品溶液的制备：精密称取鸟苷对照品8-10mg，加水5ml混匀后加入0.1ml氨水溶解，并用水定容至刻度，既得；
(10)虫草素对照品溶液的制备：精密称取虫草素对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(11)2-脱氧核苷对照品溶液的制备：精密称取2-脱氧核苷对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(12)混合参照物溶液①的制备：精密吸取腺苷对照品溶液、胸苷对照品溶液、灵芝酸A对照品溶液、灵芝酸B对照品溶液、赤芝酸A对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml；
(13)混合参照物溶液②的制备：精密吸取胞苷对照品溶液、尿苷对照品溶液、鸟苷对照品溶液、虫草素对照品溶液、2-脱氧核苷对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml；
(14)供试品溶液的制备：精密吸取舒肝宁注射液5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；
(15)指纹图谱的制作：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱ECOSIL HPLC COLUMN-C18，5μm，4.6×250mm；以乙腈为流动相A，0.1％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；梯度洗脱程序为：0～10min，100％B；10～15min，100％→97％(B)；15～30min，97％→80％(B)；30～90min，80％→50％(B)；90～105min，50％(B)；流速为每分钟1ml；检测波长为254nm；柱温为35℃；理论板数按腺苷峰计算应不低于3000；分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录105分钟的色谱图，即可得到舒肝宁注射液的HPLC指纹图谱；
(16)标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次舒肝宁注射液建立了HPLC指纹图谱，通过分析比较确定了5个共有峰，这些共有峰构成了舒肝宁注射液的指纹特征，作为舒肝宁注射液的标准指纹图谱。
2.如权利要求1所述的舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述舒肝宁注射液按重量份计算，主要由茵陈提取物4份、栀子提取物3份、黄芩苷22份、板蓝根提取物5份和灵芝提取物3.5份按下述方法制备而成：以上五味，取黄芩苷加10倍量注射用水混悬，加10％氢氧化钠溶液使溶解；其余茵陈提取物等四味，分别加10倍量注射用水溶解，混匀，加0.2％活性炭，搅匀，煮沸15分钟，滤过，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至7.5～8.0，加注射用水至1000体积份，滤过，灌封，灭菌，即得；
所述HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)参照物溶液的制备：取腺苷对照品、胸苷对照品、灵芝酸A对照品、灵芝酸B对照品、赤芝酸A对照品、胞苷对照品、尿苷对照品、鸟苷对照品、虫草素对照品、2-脱氧核苷对照品，精密称定，分别加水制成每1ml含腺苷1mg/ml、胸苷1mg/ml、灵芝酸A 1mg/ml、灵芝酸B 1mg/ml、赤芝酸A 1mg/ml、胞苷1mg/ml、尿苷1mg/ml、鸟苷1mg/ml、虫草素1mg/ml、2-脱氧核苷1mg/ml的溶液；
(2)腺苷对照品溶液的制备：精密称取腺苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(3)胸苷对照品溶液的制备：精密称取胸苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(4)灵芝酸A对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸A对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得；
(5)灵芝酸B对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸B对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得；
(6)赤芝酸A对照品溶液的制备：精密称取赤芝酸A对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得；
(7)胞苷对照品溶液的制备：精密称取胞苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(8)尿苷对照品溶液的制备：精密称取尿苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(9)鸟苷对照品溶液的制备：精密称取鸟苷对照品10mg，加水5ml混匀后加入0.1ml氨水溶解，并用水定容至刻度，既得；
(10)虫草素对照品溶液的制备：精密称取虫草素对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(11)2-脱氧核苷对照品溶液的制备：精密称取2-脱氧核苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得；
(12)混合参照物溶液①的制备：精密吸取腺苷对照品溶液、胸苷对照品溶液、灵芝酸A对照品溶液、灵芝酸B对照品溶液、赤芝酸A对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml；
(13)混合参照物溶液②的制备：精密吸取胞苷对照品溶液、尿苷对照品溶液、鸟苷对照品溶液、虫草素对照品溶液、2-脱氧核苷对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml；
(14)供试品溶液的制备：精密吸取舒肝宁注射液5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；
(15)指纹图谱的制作：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱ECOSIL HPLC COLUMN-C18，5μm，4.6×250mm；以乙腈为流动相A，0.1％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；梯度洗脱程序为：0～10min，100％B；10～15min，100％→97％(B)；15～30min，97％→80％(B)；30～90min，80％→50％(B)；90～105min，50％(B)；流速为每分钟1ml；检测波长为254nm；柱温为35℃；理论板数按腺苷峰计算应不低于3000；分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录105分钟的色谱图，即可得到舒肝宁注射液的HPLC指纹图谱；
(16)标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次舒肝宁注射液建立了HPLC指纹图谱，通过分析比较确定了5个共有峰，这些共有峰构成了舒肝宁注射液的指纹特征，作为舒肝宁注射液的标准指纹图谱。
3.如权利要求1或2所述的舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述5个共有峰，以5号峰腺苷为参照峰，其相对保留时间分别为0.4377-0.4448、0.5251-0.5343、0.6247-0.6358、0.9429-0.9519、1.0000。
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