CN109212085A - 一种灵芝孢子油的指纹图谱及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种灵芝孢子油的指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液制备：取灵芝孢子油，加入石油醚溶解，用萃取柱洗脱，浓缩后加入溶剂溶解；(2)对照品溶液制备：取对照品灵芝酸A、灵芝酸B，分别加入溶剂溶解后得对照品储备液，将两种对照品储备液以一定的体积混合均匀，得到对照品混合溶液；取麦角甾醇，加入溶剂溶解；(3)参照物溶液制备：取灵芝对照药材的75％乙醇提取液，加入溶剂稀释；取灵芝孢子油，进行皂化，提取不皂化物，所得残渣加入溶剂溶解；(4)高效液相色谱检测，制定灵芝孢子油的指纹图谱。本发明首次构建了灵芝孢子油中灵芝三萜及甾醇类成分的HPLC指纹图谱，可有效鉴别灵芝孢子油的真伪，为评价其质量的优劣提供了快速标准检测方法。

Description

一种灵芝孢子油的指纹图谱及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种灵芝孢子油的指纹图谱及其构建方法和应用，属于中药检测技术领域。
背景技术
灵芝孢子油系以多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.的孢子为原料，经破壁、超临界二氧化碳萃取分离制成的油脂提取物。灵芝孢子是在灵芝生长成熟时期菌盖弹射出来的极为细小的颗粒，是灵芝的生殖细胞。目前，灵芝孢子油的提取公认采用超临界二氧化碳流体技术，以孢子为原料制成的油脂类物质，其提取过程在常温下进行，可防止热敏性物质被破坏，完整保留萃取物的生物活性，萃取物无溶剂残留，是一种安全环保的萃取技术，市场上的产品多数采用该制造工艺生产。
灵芝孢子油主要成分为甘油三酯类、脂肪酸、烃以及醛类，还含少量三萜类、麦角甾醇、麦角甾-7,22-二烯-3β-醇、甾体类等。近年随着研究逐渐增多，发现灵芝孢子油具有抗肿瘤、增加免疫调节、抗病毒、降血糖、降血脂、保肝护肝、抗氧化、抗衰老以及治疗神经疾病等作用，故灵芝孢子油产品大量进入市场，列入高端保健品行列，具有重要的社会价值和经济价值，颇受保健品开发公司和消费者的青睐，引起中药新药开发领域关注。
目前，很多学者对灵芝孢子油所含成分指纹图谱的鉴别研究，只涉及甘油三油酸脂、1,2-二油酸-3-棕榈酸-甘油三酯等脂溶性甘油三酯类成分，未见公开发表过关于灵芝孢子油中灵芝三萜及甾醇类成分指纹图谱鉴别的方法。而专业文献已公开的，大多是灵芝子实体中三萜类成分指纹图谱鉴别的方法，文献(金瑜.灵芝孢子油三萜类化合物的高效液相指纹图谱研究[J].实验研究，2012年10月第10卷第29期，77-78.)与公开专利CN101435801A中所述的液相色谱条件是一致的，未采用标准物或对照品进行比对定性，所得结果严谨性不够；两者与已公开的灵芝子实体中三萜类成分指纹图谱鉴别方法中的色谱条件相类似，均不适用于灵芝孢子油中脂质组分之外的其他成分的检测鉴别；并且灵芝孢子油中含有的脂质成分，大大增加了对此类成分之外其他成分(如灵芝三萜及甾醇)研究的难度。故一种灵芝孢子油的指纹图谱及其构建方法和应用，对保证保健食品原料、制剂中间产品的质量，以及灵芝系列中药新药的开发具重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种灵芝孢子油的指纹图谱及其构建方法和应用，本发明的液相色谱条件，能有效地将灵芝孢子油中的灵芝三萜及甾醇类成分分离检测，分离效果佳，是首次创立的灵芝孢子油中灵芝三萜及甾醇类成分的HPLC指纹图谱检测鉴别方法；该方法为灵芝系列产品的质量控制、质量标准的制定提供有利的数据支持，对灵芝系列产品的工艺开发起到重要的指导作用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种灵芝孢子油的指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取灵芝孢子油，加入石油醚溶解，用萃取柱洗脱，分离出灵芝孢子油中的灵芝三萜及甾醇类成分，接收并合并洗脱液，浓缩后加入乙腈-异丙醇混合溶剂溶解，得到供试品溶液；
(2)对照品溶液制备：取对照品灵芝酸A、灵芝酸B，分别加入乙腈-异丙醇混合溶剂溶解后得对照品储备液，将两种对照品储备液以一定的体积混合均匀，得到对照品混合溶液；取麦角甾醇，加入乙腈-异丙醇混合溶剂溶解，得到对照品溶液；
(3)参照物溶液制备：取灵芝对照药材的75％乙醇提取液(1g：15ml)，加入乙腈-异丙醇混合溶剂稀释，得到参照物溶液I；取灵芝孢子油，进行皂化，提取不皂化物，所得残渣加入乙腈-异丙醇混合溶剂溶解，得到参照物溶液II；
(4)高效液相色谱检测，制定灵芝孢子油的指纹图谱。
优选地，所述步骤(1)中，灵芝孢子油与石油醚的质量体积比为1.8g：2mL，萃取柱为C18萃取小柱，萃取小柱预先用10mL石油醚活化，洗脱过程依次用石油醚(I)、体积比为3:4的石油醚-三氯甲烷混合溶剂(II)、三氯甲烷(III)、体积比为5:5的三氯甲烷-甲醇混合溶剂(IV)、甲醇(V)洗脱，洗脱液I、II、III、IV、V的体积比为10:7:10:10:10，接收洗脱液II～V，乙腈-异丙醇混合溶剂的体积比为6:4，灵芝孢子油与乙腈-异丙醇混合溶剂的质量体积比为1.8g：1.5mL。
本发明采用C18萃取小柱，成功分离并富集灵芝孢子油中的灵芝三萜及甾醇类成分，相对于采用GB/T5535.1中第1部分乙醚提取法进行皂化，制备不皂化物，再用大量的溶剂萃取并提纯该部位中含有的灵芝三萜及甾醇类成分，节省了溶剂的使用量，节省了样品前处理的时间，前处理手段简便，经济实效。
优选地，所述步骤(1)中，C18萃取小柱优选为品牌Waters，规格6cc/1g，Part No.：WAT036795。
优选地，所述步骤(2)中，乙腈-异丙醇混合溶剂的体积比为6:4，对照品储备液中灵芝酸A、灵芝酸B与乙腈-异丙醇混合溶剂的质量体积比均为2mg：1mL，对照品储备液混合的体积比为1:1，麦角甾醇与乙腈-异丙醇混合溶剂的质量体积比为0.2mg：1mL。
优选地，所述步骤(3)中，乙腈-异丙醇混合溶剂的体积比为6:4，灵芝对照药材75％乙醇提取液与乙腈-异丙醇混合溶剂的体积比为1:1；灵芝孢子油与乙腈-异丙醇混合溶剂的质量体积比为4g：5mL。
优选地，所述步骤(4)中色谱条件为：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：以体积比为2：8的乙腈-0.1％甲酸混合溶剂为流动相A，以体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相B进行梯度洗脱，所述流动相梯度洗脱条件为：0～20min，流动相中A(88％～95％→70％)，流动相中B(5％～12％→30％)；20～35min，流动相中A(70％)，流动相中B(30％)；35～60min，流动相中A(70％→10％)，流动相中B(30％→90％)；60～90min，流动相中A(10％→0％)，流动相中B(90％→100％)；90～120min，流动相中A(0％)，流动相中B(100％)；
检测波长：257nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
分别精密吸取对照品混合溶液2μL、对照品溶液5μL、参照物溶液和供试品溶液各25μL，注入高效液相色谱仪，测定。
优选地，所述步骤(4)中，色谱柱优选为Kromasil C18，规格：250mm×4.6mm，5μm。
优选地，所述步骤(4)中色谱条件为：流动相：以体积比为2：8的乙腈-0.1％甲酸混合溶剂为流动相A，以体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相B进行梯度洗脱，所述流动相梯度洗脱条件为：0～20min，流动相中A(90％→70％)，流动相中B(10％→30％)；20～35min，流动相中A(70％)，流动相中B(30％)；35～60min，流动相中A(70％→10％)，流动相中B(30％→90％)；60～90min，流动相中A(10％→0％)，流动相中B(90％→100％)；90～120min，流动相中A(0％)，流动相中B(100％)。
优选地，所述步骤(4)中制定灵芝孢子油的指纹图谱的方法为：通过对照品溶液、参照物溶液和供试品溶液色谱图中的色谱峰出峰时间和色谱峰是否存在进行比较，得出供试品溶液图谱中的共有特征峰。
优选地，所述灵芝孢子油的指纹图谱包括13个共有特征峰，其中，12号峰为麦角甾醇，其他为未知成分峰；
以麦角甾醇12号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰：0.657±0.033；2号峰：0.797±0.040；3号峰：0.801±0.040；4号峰：0.812±0.041；5号峰：0.824±0.041；6号峰：0.832±0.041；7号峰：0.858±0.043；8号峰：0.876±0.044；9号峰：0.958±0.048；10号峰：0.970±0.049；11号峰：0.981±0.049；12号峰：1.000±0.050；13号峰：1.194±0.060。
本发明还提供了根据上述构建方法构建的灵芝孢子油的指纹图谱在灵芝孢子油检测中的应用。
根据本发明构建方法构建的灵芝孢子油的指纹图谱可用于检测灵芝孢子油的质量和/或真伪。
本发明还提供了一种灵芝孢子油检测方法，包括将待测灵芝孢子油样品的特征图谱与上述构建方法构建的灵芝孢子油的指纹图谱进行比较。
优选地，所述的检测方法包括以下步骤：
(1)取待测灵芝孢子油样品，加入石油醚溶解，用萃取柱洗脱，分离出灵芝孢子油中的灵芝三萜及甾醇类成分，接收并合并洗脱液，浓缩后加乙腈-异丙醇混合溶剂溶解，得到供试品溶液；利用高效液相色谱法检测得到待测灵子孢子油样品特征图谱，所述色谱条件为：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：以体积比为2：8的乙腈-0.1％甲酸混合溶剂为流动相A，以体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相B进行梯度洗脱，所述流动相梯度洗脱条件为：0～20min，流动相中A(88％～95％→70％)，流动相中B(5％～12％→30％)；20～35min，流动相中A(70％)，流动相中B(30％)；35～60min，流动相中A(70％→10％)，流动相中B(30％→90％)；60～90min，流动相中A(10％→0％)，流动相中B(90％→100％)；90～120min，流动相中A(0％)，流动相中B(100％)；
检测波长：257nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
分别精密吸取对照品混合溶液2μL、对照品溶液5μL、参照物溶液和供试品溶液各25μL，注入高效液相色谱仪，测定；
(2)将步骤(1)所得的待测灵芝孢子油样品特征图谱与灵芝孢子油的指纹图谱进行比对；
所述灵芝孢子油的指纹图谱包括13个共有特征峰，其中，12号峰为麦角甾醇，其他为未知成分峰；
以麦角甾醇12号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰：0.657±0.033；2号峰：0.797±0.040；3号峰：0.801±0.040；4号峰：0.812±0.041；5号峰：0.824±0.041；6号峰：0.832±0.041；7号峰：0.858±0.043；8号峰：0.876±0.044；9号峰：0.958±0.048；10号峰：0.970±0.049；11号峰：0.981±0.049；12号峰：1.000±0.050；13号峰：1.194±0.060；
(3)根据步骤(2)的比对结果判定待测灵芝孢子油样品的质量和/或真伪。
优选地，所述步骤(1)中色谱条件为：流动相：以体积比为2：8的乙腈-0.1％甲酸混合溶剂为流动相A，以体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相B进行梯度洗脱，所述流动相梯度洗脱条件为：0～20min，流动相中A(90％→70％)，流动相中B(10％→30％)；20～35min，流动相中A(70％)，流动相中B(30％)；35～60min，流动相中A(70％→10％)，流动相中B(30％→90％)；60～90min，流动相中A(10％→0％)，流动相中B(90％→100％)；90～120min，流动相中A(0％)，流动相中B(100％)。
优选地，所述步骤(3)中判定标准为：如待测灵芝孢子油样品的供试品溶液特征图谱符合灵芝孢子油的指纹图谱，则可判定待测灵芝孢子油样品为合格样品；反之，则可判定待测灵芝孢子油样品为不合格样品。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明的液相色谱条件，能有效地将灵芝孢子油中的灵芝三萜及甾醇类成分分离检测，分离效果佳，分析检测成本相对较低，是首次创立的灵芝孢子油中灵芝三萜及甾醇类成分的HPLC指纹图谱检测鉴别方法；
(2)本发明分别采用灵芝三萜类成分代表性对照品灵芝酸A和灵芝酸B，以及灵芝甾醇成分代表性对照品麦角甾醇，共三种对照品作为参比对照物；还采用了灵芝对照药材提取物为药材参比对照物，分别进行定性对照，方法可靠有效；
(3)本发明的液相色谱条件，也适用于灵芝子实体中灵芝三萜及甾醇类成分的分离检测；
(4)本发明能为灵芝系列产品的质量控制、质量标准的制定提供有利的数据支持，对灵芝系列产品的工艺开发起到重要的指导作用；
(5)本发明具有方便、快捷、稳定、精密度高、重现性好等优点，可准确可靠的检测和控制灵芝孢子油的质量。
附图说明
图1为液相色谱条件的选择的测定结果HPLC图谱。
图2为十批灵芝孢子油中灵芝三萜及甾醇指纹图谱的鉴别研究中，测定结果257nm下保留时间50min～97min的HPLC图谱。
图3为十批灵芝孢子油中灵芝三萜及甾醇指纹图谱的鉴别研究中，测定结果257nm下的完整HPLC图谱。
图4为本发明实施例12稳定性试验中13个组分峰相对保留时间的散点图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1液相色谱条件的选择及系统适应性
文献(金瑜.灵芝孢子油三萜类化合物的高效液相指纹图谱研究[J].实验研究，2012年10月第10卷第29期，77-78.)与公开专利CN101435801A中所述的液相色谱流动相为乙腈-磷酸(40:60，v/v)，已公开灵芝(子实体)三萜类成分检测鉴别方法中的流动相条件，总结下来分别有乙腈-(0.05％～0.1％)甲酸、乙腈-(0.01％～0.1％)醋酸溶液、乙腈-水(45：55，v/v)、甲醇-(0.01％～1.0％)醋酸溶液、乙腈-0.03％磷酸、乙腈-0.05moL/L磷酸二氢氨水溶液、甲醇-0.5％高氯酸(50:50，v/v)；洗脱步骤有一定比例等度和梯度。
发明人经过实验证明均不适用于灵芝孢子油中灵芝三萜及甾醇类成分的检测测定。最终，通过大量实验研究，采用了两种参比对照物进行比对研究，一是灵芝三萜类成分代表性对照品灵芝酸A和灵芝酸B，以及甾醇成分代表性对照品麦角甾醇，共三种对照品作为参比对照物，制备成对照品溶液，进行对照品的定性比对；二是采用灵芝对照药材75％乙醇提取液，作为药材提取物参照物，代表了药材中灵芝三萜及甾醇类专属性的组分，制备成参照物溶液I，进行药材提取物参照物的定性比对，故可充分全面说明本发明的实效性、准确可靠性。
采用本发明灵芝孢子油的指纹图谱的构建方法进行检测，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取灵芝孢子油1.8g，加入2mL石油醚溶解，用C18萃取小柱洗脱，萃取小柱预先用10mL石油醚活化，洗脱过程依次用石油醚10mL(I)、体积比为3:4的石油醚-三氯甲烷混合溶剂7mL(II)、三氯甲烷10mL(III)、体积比为5:5的三氯甲烷-甲醇混合溶剂10mL(IV)、甲醇10mL(V)洗脱，分离出灵芝孢子油中的灵芝三萜及甾醇类成分，接收洗脱液II～V，接收并合并洗脱液，浓缩后加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂1.5mL溶解，得到供试品溶液；
(2)对照品溶液制备：取对照品2mg灵芝酸A、2mg灵芝酸B，分别加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂1mL溶解后得对照品储备液，将对照品储备液按体积比为1:1混合均匀，得到对照品混合溶液；取0.2mg麦角甾醇，加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂1mL溶解，得到对照品溶液；
(3)参照物溶液制备：取灵芝对照药材75％乙醇提取液5mL，加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂5mL稀释，得到参照物溶液I；取4g灵芝孢子油，按照GB/T5535.1中第1部分乙醚提取法进行皂化，提取不皂化物，所得残渣加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂5mL溶解，得到参照物溶液II；
(4)高效液相色谱检测，制定灵芝孢子油的指纹图谱：
色谱条件：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：以体积比为2：8的乙腈-0.1％甲酸混合溶剂为流动相A，以体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相B进行梯度洗脱，所述流动相梯度洗脱条件为：0～20min，流动相中A(90％→70％)，流动相中B(10％→30％)；20～35min，流动相中A(70％)，流动相中B(30％)；35～60min，流动相中A(70％→10％)，流动相中B(30％→90％)；60～90min，流动相中A(10％→0％)，流动相中B(90％→100％)；90～120min，流动相中A(0％)，流动相中B(100％)；
检测波长：257nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
分别精密吸取对照品混合溶液2μL(灵芝酸A和灵芝酸B)、对照品溶液5μL(麦角甾醇)、参照物溶液和供试品溶液各25μL，注入高效液相色谱仪，测定。
测定结果如图1所示，由图1可知，灵芝孢子油中灵芝三萜及甾醇在本发明的色谱条件上，能被完全分离检测，分离效果好，同时，也能满足灵芝药材中灵芝三萜及甾醇的检测。
分别取对照品灵芝酸A、灵芝酸B及麦角甾醇，加乙腈-异丙醇(6:4，v/v)稀释，制成每1ml含2.7μg的灵芝酸A检测限测试液，制成每1ml含2.5μg的灵芝酸B检测限测试液，制成每1ml含1.9μg的麦角甾醇检测限测试液；分别取灵芝酸A检测限测试液1μl、灵芝酸B检测限测试液1μl、麦角甾醇检测限测试液5μl，以及对照品混合溶液2μl(灵芝酸A和灵芝酸B)，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，测定各组分的保留时间、检测限、理论塔板数和分离度，结果如表1所示。从表1可知，灵芝酸A和灵芝酸B的理论塔板数均大于4万，麦角甾醇的理论塔板数大于10万，灵芝酸B、灵芝酸A、麦角甾醇三种成分的检测限分别为2.7ng、2.5ng、9.5ng，均为纳克级，说明检测方法灵敏度高；灵芝酸A和灵芝酸B的分离度为10.2，说明检测方法分离效果佳。
表1系统适应性试验结果
实施例2样品前处理方法的开发研究
参照物溶液II的制备参考GBT 5535.1-2008《动植物油脂不皂化物测定》中的提取步骤，取灵芝孢子油，回流1小时→乙醚100ml提取，分别提3次→多次用水洗涤有机溶液→蒸干溶剂→不皂化物(三萜和甾醇部位)。该方法前处理耗时长，溶剂消耗量大。
发明人经多次实验，优化样品的前处理方法，得到本发明供试品溶液的制备方法，省时、节约了溶剂使用量，同时得到样品中所需的部位，达到了目的，前处理方法简便，经济实效。参照物溶液Ⅱ，是为了说明本发明中灵芝孢子油样品前处理方法优化后，两种制备方法所得到的有效部位是否一致。取两种前处理方法所制备的样品溶液，按本发明的色谱条件测定，结果表明，在257nm下，样品的色谱信息基本一致，结果如图1所示。本发明前处理方法所得的灵芝孢子油组分(见图1中的3)表现的是原生型态，而参考GBT 5535.1-2008中的提取步骤所得参照物溶液Ⅱ(见图1中的1)，是经水浴加热条件下碱水解后萃取而得，组分可能发生构型转化，不利于组分结构的定性分析。
实施例3十批灵芝孢子油指纹图谱的鉴别研究
取不同产地的灵芝孢子油共10批，按照本发明实施例1的操作制备供试品溶液并检测，记录色谱图。截取257nm下的图谱，保留时间50min至97min，得标示1至13号峰的灵芝孢子油的指纹图谱，如图2所示；257nm下的完整图谱如图3所示(未标峰号)。由图2可知，供试品在257nm下共检测到13个共有色谱峰，第12号峰的保留时间与麦角甾醇对照品保留时间(80.57min)一致，在灵芝酸A(19.11min)和灵芝酸B(22.75min)对照品出峰位置，观察到弱小信号。计算十批样品中各组分峰保留时间相对于12号峰保留时间的比值(相对保留时间)，以及按相对保留时间平均值的±5％，计算各组分峰的定性鉴定限度，结果如表2所示。由表2可知，批间各峰的相对保留时间的RSD不超过0.3％，差异不大。
表2十批灵芝孢子油样品中各组分峰的相对保留时间及定性鉴定限度范围
实施例4
本发明灵芝孢子油指纹图谱的构建方法的一种实施例，取不同产地的灵芝孢子油共10批进行灵芝孢子油指纹图谱的构建，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取灵芝孢子油1.8g，加入2mL石油醚溶解，用C18萃取小柱洗脱，萃取小柱预先用10mL石油醚活化，洗脱过程依次用石油醚10mL(I)、体积比为3:4的石油醚-三氯甲烷混合溶剂7mL(II)、三氯甲烷10mL(III)、体积比为5:5的三氯甲烷-甲醇混合溶剂10mL(IV)、甲醇10mL(V)洗脱，分离出灵芝孢子油中的灵芝三萜及甾醇类成分，接收洗脱液II～V，接收并合并洗脱液，浓缩后加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂1.5mL溶解，得到供试品溶液；
(2)对照品溶液制备：取对照品2mg灵芝酸A、2mg灵芝酸B，分别加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂1mL溶解后得对照品储备液，将对照品储备液按体积比为1:1混合均匀，得到对照品混合溶液；取0.2mg麦角甾醇，加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂1mL溶解，得到对照品溶液；
(3)参照物溶液制备：取灵芝对照药材75％乙醇提取液5mL，加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂5mL稀释，得到参照物溶液I；取4g灵芝孢子油，按照GB/T5535.1中第1部分乙醚提取法进行皂化，提取不皂化物，所得残渣加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂5mL溶解，得到参照物溶液II；
(4)高效液相色谱检测，制定灵芝孢子油的指纹图谱：
色谱条件：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：以体积比为2：8的乙腈-0.1％甲酸混合溶剂为流动相A，以体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相B进行梯度洗脱，所述流动相梯度洗脱条件为：0～20min，流动相中A(90％→70％)，流动相中B(10％→30％)；20～35min，流动相中A(70％)，流动相中B(30％)；35～60min，流动相中A(70％→10％)，流动相中B(30％→90％)；60～90min，流动相中A(10％→0％)，流动相中B(90％→100％)；90～120min，流动相中A(0％)，流动相中B(100％)；
检测波长：257nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
分别精密吸取对照品混合溶液2μL(灵芝酸A和灵芝酸B)、对照品溶液5μL(麦角甾醇)、参照物溶液和供试品溶液各25μL，注入高效液相色谱仪，测定。
制定灵芝孢子油指纹图谱的方法：通过对照品溶液、参照物溶液和供试品溶液色谱图中的色谱峰出峰时间和色谱峰是否存在进行比较，得出供试品溶液图谱中的共有特征峰。
特征峰的确定：本实施例构建的灵芝孢子油指纹图谱包括13个共有特征峰，其中，12号峰为麦角甾醇，其他为未知成分峰。
特征峰的描述：以麦角甾醇12号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰：0.660±0.033；2号峰：0.802±0.040；3号峰：0.807±0.040；4号峰：0.813±0.041；5号峰：0.822±0.041；6号峰：0.827±0.041；7号峰：0.858±0.043；8号峰：0.871±0.044；9号峰：0.958±0.048；10号峰：0.971±0.049；11号峰：0.980±0.049；12号峰：1.000±0.050；13号峰：1.192±0.060。
实施例5
本发明灵芝孢子油指纹图谱的构建方法的一种实施例，取不同产地的灵芝孢子油共10批进行灵芝孢子油指纹图谱的构建，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取灵芝孢子油1.8g，加入2mL石油醚溶解，用C18萃取小柱洗脱，萃取小柱预先用10mL石油醚活化，洗脱过程依次用石油醚10mL(I)、体积比为3：4的石油醚-三氯甲烷混合溶剂7mL(II)、三氯甲烷10mL(III)、体积比为5:5的三氯甲烷-甲醇混合溶剂10mL(IV)、甲醇10mL(V)洗脱，分离出灵芝孢子油中的灵芝三萜及甾醇类成分，接收洗脱液II～V，接收并合并洗脱液，浓缩后加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂1.5mL溶解，得到供试品溶液；
(2)对照品溶液制备：取对照品2mg灵芝酸A、2mg灵芝酸B，分别加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂1mL溶解后得对照品储备液，将对照品储备液按体积比为1:1混合均匀，得到对照品混合溶液；取0.2mg麦角甾醇，加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂1mL溶解，得到对照品溶液；
(3)参照物溶液制备：取灵芝对照药材75％乙醇提取液5mL，加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂5mL稀释，得到参照物溶液I；取4g灵芝孢子油，按照GB/T5535.1中第1部分乙醚提取法进行皂化，提取不皂化物，所得残渣加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂5mL溶解，得到参照物溶液II；
(4)高效液相色谱检测，制定灵芝孢子油的指纹图谱：
色谱条件：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：以体积比为2：8的乙腈-0.1％甲酸混合溶剂为流动相A，以体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相B进行梯度洗脱，所述流动相梯度洗脱条件为：0～20min，流动相中A(88％→70％)，流动相中B(12％→30％)；20～35min，流动相中A(70％)，流动相中B(30％)；35～60min，流动相中A(70％→10％)，流动相中B(30％→90％)；60～90min，流动相中A(10％→0％)，流动相中B(90％→100％)；90～120min，流动相中A(0％)，流动相中B(100％)；
检测波长：257nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
分别精密吸取对照品混合溶液2μL(灵芝酸A和灵芝酸B)、对照品溶液5μL(麦角甾醇)、参照物溶液和供试品溶液各25μL，注入高效液相色谱仪，测定。
制定灵芝孢子油指纹图谱的方法：通过对照品溶液、参照物溶液和供试品溶液色谱图中的色谱峰出峰时间和色谱峰是否存在进行比较，得出供试品溶液图谱中的共有特征峰。
特征峰的确定：本实施例构建的灵芝孢子油指纹图谱包括13个共有特征峰，其中，12号峰为麦角甾醇，其他为未知成分峰。
特征峰的描述：以麦角甾醇12号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰：0.662±0.033；2号峰：0.799±0.040；3号峰：0.805±0.040；4号峰：0.818±0.041；5号峰：0.823±0.041；6号峰：0.830±0.042；7号峰：0.862±0.043；8号峰：0.883±0.044；9号峰：0.959±0.048；10号峰：0.970±0.049；11号峰：0.981±0.049；12号峰：1.000±0.050；13号峰：1.195±0.060。
实施例6
本发明灵芝孢子油指纹图谱的构建方法的一种实施例，取不同产地的灵芝孢子油共10批进行灵芝孢子油指纹图谱的构建，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取灵芝孢子油1.8g，加入2mL石油醚溶解，用C18萃取小柱洗脱，萃取小柱预先用10mL石油醚活化，洗脱过程依次用石油醚10mL(I)、体积比为3:4的石油醚-三氯甲烷混合溶剂7mL(II)、三氯甲烷10mL(III)、体积比为5:5的三氯甲烷-甲醇混合溶剂10mL(IV)、甲醇10mL(V)洗脱，分离出灵芝孢子油中的灵芝三萜及甾醇类成分，接收洗脱液II～V，接收并合并洗脱液，浓缩后加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂1.5mL溶解，得到供试品溶液；
(2)对照品溶液制备：取对照品2mg灵芝酸A、2mg灵芝酸B，分别加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂1mL溶解后得对照品储备液，将对照品储备液按体积比为1:1混合均匀，得到对照品混合溶液；取0.2mg麦角甾醇，加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂1mL溶解，得到对照品溶液；
(3)参照物溶液制备：取灵芝对照药材75％乙醇提取液5mL，加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂5mL稀释，得到参照物溶液I；取4g灵芝孢子油，按照GB/T5535.1中第1部分乙醚提取法进行皂化，提取不皂化物，所得残渣加入体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂5mL溶解，得到参照物溶液II；
(4)高效液相色谱检测，制定灵芝孢子油的指纹图谱：
色谱条件：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：以体积比为2：8的乙腈-0.1％甲酸混合溶剂为流动相A，以体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相B进行梯度洗脱，所述流动相梯度洗脱条件为：0～20min，流动相中A(95％→70％)，流动相中B(5％→30％)；20～35min，流动相中A(70％)，流动相中B(30％)；35～60min，流动相中A(70％→10％)，流动相中B(30％→90％)；60～90min，流动相中A(10％→0％)，流动相中B(90％→100％)；90～120min，流动相中A(0％)，流动相中B(100％)；
检测波长：257nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
分别精密吸取对照品混合溶液2μL(灵芝酸A和灵芝酸B)、对照品溶液5μL(麦角甾醇)、参照物溶液和供试品溶液各25μL，注入高效液相色谱仪，测定。
制定灵芝孢子油指纹图谱的方法：通过对照品溶液、参照物溶液和供试品溶液色谱图中的色谱峰出峰时间和色谱峰是否存在进行比较，得出供试品溶液图谱中的共有特征峰。
特征峰的确定：本实施例构建的灵芝孢子油指纹图谱包括13个共有特征峰，其中，12号峰为麦角甾醇，其他为未知成分峰。
特征峰的描述：以麦角甾醇12号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰：0.650±0.033；2号峰：0.791±0.040；3号峰：0.798±0.040；4号峰：0.812±0.041；5号峰：0.825±0.041；6号峰：0.834±0.042；7号峰：0.858±0.043；8号峰：0.879±0.044；9号峰：0.958±0.048；10号峰：0.970±0.049；11号峰：0.980±0.049；12号峰：1.000±0.050；13号峰：1.194±0.060。
实施例7
灵芝孢子油指纹图谱的标准范围的确定：
对在不同色谱条件下，实施例4～6的各10批灵芝孢子油指纹图谱的特征峰的相对保留时间进行处理，统计得到灵芝孢子油指纹图谱的标准范围为：以麦角甾醇12号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰：0.657±0.033；2号峰：0.797±0.040；3号峰：0.801±0.040；4号峰：0.812±0.041；5号峰：0.824±0.041；6号峰：0.832±0.041；7号峰：0.858±0.043；8号峰：0.876±0.044；9号峰：0.958±0.048；10号峰：0.970±0.049；11号峰：0.981±0.049；12号峰：1.000±0.050；13号峰：1.194±0.060。
实施例8
本发明灵芝孢子油检测方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)取三批样品，由广州白云山汉方现代药业有限公司提供，批号分别为：1004171001(A)、170701(B)、170901(C)，按实施例4的步骤(1)制备供试品溶液，按实施例4的步骤(4)相同的高效液相色谱检测方法检测，得到待测灵芝孢子油样品的特征图谱，特征峰相对保留时间结果如下表3，以12号峰为参照峰；
表3三批灵芝孢子油特征峰相对保留时间检测结果
(2)从表3结果可知，三批样品均可检出13个共有峰，该13个共有峰的相对保留时间均在指纹图谱标准范围及实施例4的指纹图谱规定的范围内，故可判定，三批样品均符合鉴别要求，样品符合规定。
实施例9
本发明灵芝孢子油检测方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)取三批样品，由广州白云山汉方现代药业有限公司提供，批号分别为：1004171001(A)、170701(B)、170901(C)，按实施例5的步骤(1)制备供试品溶液，按实施例5的步骤(4)相同的高效液相色谱检测方法检测，得到待测灵芝孢子油样品的特征图谱，特征峰相对保留时间结果如下表4，以12号峰为参照峰；
表4三批灵芝孢子油特征峰相对保留时间检测结果
(2)从表4结果可知，三批样品均可检出13个共有峰，该13个共有峰的相对保留时间均在指纹图谱标准范围及实施例5的指纹图谱规定的范围内，故可判定，三批样品均符合鉴别要求，样品符合规定。
实施例10
本发明灵芝孢子油检测方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)取三批样品，由广州白云山汉方现代药业有限公司提供，批号分别为：1004171001(A)、170701(B)、170901(C)，按实施例6的步骤(1)制备供试品溶液，按实施例6的步骤(4)相同的高效液相色谱检测方法检测，得到待测灵芝孢子油样品的特征图谱，特征峰相对保留时间结果如下表5，以12号峰为参照峰；
表5三批灵芝孢子油特征峰相对保留时间检测结果
(2)从表5结果可知，三批样品均可检出13个共有峰，该13个共有峰的相对保留时间均在指纹图谱标准范围及实施例6的指纹图谱规定的范围内，故可判定，三批样品均符合鉴别要求，样品符合规定。
实施例11指纹图谱重复性试验
取广州白云山汉方现代药业有限公司，批号为1004171001的样品六份，每份各1.8g，按本发明实施例1的步骤制备供试品溶液并进行检测，记录色谱图。从结果可知，样品在257nm下共检测到13个共有色谱峰，第12号峰的保留时间与麦角甾醇对照品保留时间(80.57min)一致，在灵芝酸A(19.11min)和灵芝酸B(22.75min)对照品出峰位置，观察到弱小信号。六份样品中各组分峰保留时间相对于12号峰保留时间的比值(相对保留时间)如表6所示。由表6可知，样品中的13个组分峰的相对保留时间结果，均在相对保留时间平均值的±5％范围内，重复性试验的各组分峰相对保留时间的RSD不超过0.3％，差异不大，测定结果符合要求，说明本发明灵芝孢子油指纹图谱的构建方法重复性好。
表6灵芝孢子油样品重复性试验检测结果
实施例12指纹图谱稳定性试验
取广州白云山汉方现代药业有限公司，批号为1004171001的供试液，分别于0小时、8小时、24小时、48小时按本发明实施例1所述色谱条件测定，记录色谱图，分别计算不同的时间样品中13个组分峰的相对保留时间，结果如表7所示，各组分峰相对保留时间的RSD不大于0.5％；将不同的四个时间点所测定结果，与上述实施例3中所得的相对保留时间平均值结果，作散点图进行直观分析，如图4所示，13个组分峰的相对保留时间结果均在相对保留时间平均值的±5％范围内，说明本发明灵芝孢子油指纹图谱的构建方法稳定性好。
表7样品溶液稳定试验相对保留时间测定结果
实施例13指纹图谱精密度试验
由不同的检测人员，取广州白云山汉方现代药业有限公司，批号为1004171001的样品六份，每份各1.8g，按本发明实施例1的方法制备样品溶液并进行检测，记录色谱图。从结果可知，样品在257nm下共检测到13个共有色谱峰，第12号峰的保留时间与麦角甾醇对照品保留时间(80.57min)一致，在灵芝酸A(19.11min)和灵芝酸B(22.75min)对照品出峰位置，只观察到弱小信号。六份样品中各组分峰保留时间相对于12号峰保留时间的比值(相对保留时间)如表8所示。从比值结果可知，样品中的13个组分峰的相对保留时间结果，均在相对保留时间平均值的±5％范围内，中间精密度试验的各组分峰相对保留时间的RSD不超过0.4％，差异不大，测定结果符合要求，说明本发明灵芝孢子油指纹图谱的构建方法精密度好。
表8灵芝孢子油样品中间精密度试验检测结果
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种灵芝孢子油的指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取灵芝孢子油，加入石油醚溶解，用萃取柱洗脱，分离出灵芝孢子油中的灵芝三萜及甾醇类成分，接收并合并洗脱液，浓缩后加入乙腈-异丙醇混合溶剂溶解，得到供试品溶液；
(2)对照品溶液制备：取对照品灵芝酸A、灵芝酸B，分别加入乙腈-异丙醇混合溶剂溶解后得对照品储备液，将两种对照品储备液以一定的体积混合均匀，得到对照品混合溶液；取麦角甾醇，加入乙腈-异丙醇混合溶剂溶解，得到对照品溶液；
(3)参照物溶液制备：取灵芝对照药材75％乙醇提取液(1g：15ml)，加入乙腈-异丙醇混合溶剂稀释，得到参照物溶液I；取灵芝孢子油，进行皂化，提取不皂化物，所得残渣加入乙腈-异丙醇混合溶剂溶解，得到参照物溶液II；
(4)高效液相色谱检测，制定灵芝孢子油的指纹图谱。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，灵芝孢子油与石油醚的质量体积比为1.8g：2mL，萃取柱为C18萃取小柱，萃取小柱预先用10mL石油醚活化，洗脱过程依次用石油醚(I)、体积比为3:4的石油醚-三氯甲烷混合溶剂(II)、三氯甲烷(III)、体积比为5:5的三氯甲烷-甲醇混合溶剂(IV)、甲醇(V)洗脱，洗脱液I、II、III、IV、V的体积比为10:7:10:10:10，接收洗脱液II～V，乙腈-异丙醇混合溶剂的体积比为6:4，灵芝孢子油与乙腈-异丙醇混合溶剂的质量体积比为1.8g：1.5mL。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，乙腈-异丙醇混合溶剂的体积比为6:4，对照品储备液中灵芝酸A、灵芝酸B与乙腈-异丙醇混合溶剂的质量体积比均为2mg：1mL，对照品储备液混合的体积比为1:1，麦角甾醇与乙腈-异丙醇混合溶剂的质量体积比为0.2mg：1mL。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，乙腈-异丙醇混合溶剂的体积比为6:4，灵芝对照药材75％乙醇提取液与乙腈-异丙醇混合溶剂的体积比为1:1；灵芝孢子油与乙腈-异丙醇混合溶剂的质量体积比为4g：5mL。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中色谱条件为：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：以体积比为2：8的乙腈-0.1％甲酸混合溶剂为流动相A，以体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相B进行梯度洗脱，所述流动相梯度洗脱条件为：0～20min，流动相中A(88％～95％→70％)，流动相中B(5％～12％→30％)；20～35min，流动相中A(70％)，流动相中B(30％)；35～60min，流动相中A(70％→10％)，流动相中B(30％→90％)；60～90min，流动相中A(10％→0％)，流动相中B(90％→100％)；90～120min，流动相中A(0％)，流动相中B(100％)；
检测波长：257nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
分别精密吸取对照品混合溶液2μL、对照品溶液5μL、参照物溶液和供试品溶液各25μL，注入高效液相色谱仪，测定。
6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中制定灵芝孢子油的指纹图谱的方法为：通过对照品溶液、参照物溶液和供试品溶液色谱图中的色谱峰出峰时间和色谱峰是否存在进行比较，得出供试品溶液图谱中的共有特征峰。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述灵芝孢子油的指纹图谱包括13个共有特征峰，其中，12号峰为麦角甾醇，其他为未知成分峰；
以麦角甾醇12号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰：0.657±0.033；2号峰：0.797±0.040；3号峰：0.801±0.040；4号峰：0.812±0.041；5号峰：0.824±0.041；6号峰：0.832±0.041；7号峰：0.858±0.043；8号峰：0.876±0.044；9号峰：0.958±0.048；10号峰：0.970±0.049；11号峰：0.981±0.049；12号峰：1.000±0.050；13号峰：1.194±0.060。
8.如权利要求1～7任一项所述的构建方法构建的灵芝孢子油的指纹图谱在灵芝孢子油检测中的应用。
9.一种灵芝孢子油检测方法，其特征在于，包括将待测灵芝孢子油样品的特征图谱与如权利要求1～7任一项所述的构建方法构建的灵芝孢子油的指纹图谱进行比较。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取待测灵芝孢子油样品，加入石油醚溶解，用萃取柱洗脱，分离出灵芝孢子油中的灵芝三萜及甾醇类成分，接收并合并洗脱液，浓缩后加乙腈-异丙醇混合溶剂溶解，得到供试品溶液；利用高效液相色谱法检测得到待测灵子孢子油样品特征图谱，所述色谱条件为：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：以体积比为2：8的乙腈-0.1％甲酸混合溶剂为流动相A，以体积比为6:4的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相B进行梯度洗脱，所述流动相梯度洗脱条件为：0～20min，流动相中A(88％～95％→70％)，流动相中B(5％～12％→30％)；20～35min，流动相中A(70％)，流动相中B(30％)；35～60min，流动相中A(70％→10％)，流动相中B(30％→90％)；60～90min，流动相中A(10％→0％)，流动相中B(90％→100％)；90～120min，流动相中A(0％)，流动相中B(100％)；
检测波长：257nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
分别精密吸取对照品混合溶液2μL、对照品溶液5μL、参照物溶液和供试品溶液各25μL，注入高效液相色谱仪，测定；
(2)将步骤(1)所得的待测灵芝孢子油样品特征图谱与灵芝孢子油的指纹图谱进行比对；
所述灵芝孢子油的指纹图谱包括13个共有特征峰，其中，12号峰为麦角甾醇，其他为未知成分峰；
以麦角甾醇12号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰：0.657±0.033；2号峰：0.797±0.040；3号峰：0.801±0.040；4号峰：0.812±0.041；5号峰：0.824±0.041；6号峰：0.832±0.041；7号峰：0.858±0.043；8号峰：0.876±0.044；9号峰：0.958±0.048；10号峰：0.970±0.049；11号峰：0.981±0.049；12号峰：1.000±0.050；13号峰：1.194±0.060；
(3)根据步骤(2)的比对结果判定待测灵芝孢子油样品的质量和/或真伪。
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