CN1853673B - 双参注射剂的指纹图谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种双参注射剂的质量控制方法，该方法包括双参注射剂的指纹图谱测试；红参或人参药材、丹参药材、丹参素或其钠盐、原儿茶醛、丹酚酸B或其镁盐、丹参酮IIA、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf中全部或部分成分的鉴别；丹参素或其钠盐、原儿茶醛、丹酚酸B或其镁盐、丹参酮IIA、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、总酚、总皂苷中全部或部分成分的含量测试；与现有技术相比，本发明质量控制方法对以红参或人参、丹参制成的中药注射剂产品的质量控制更为有效，方法精密度、稳定性均较高。

Description

双参注射剂的指纹图谱检测方法
技术领域
本发明是一种双参注射剂的质量控制方法，属于中药的技术领域。
背景技术
心脑血管疾病如冠心病、脑血栓、高血压、脑梗塞等均是当今世界上最常见和危害最大的疾病之一，也是危害我国人民健康的常见病、多发病，已成为人口死亡的主要原因之一；据报告，近年来的发病率有逐年增高趋势，而且中、青年患者不断增加。为了治疗这些疾病，北京奇源益德药物研究所曾递交了一份专利申请号为“200410022501.6”，名称为“治疗心脑血管疾病的中药及其制备方法”的申请，该药物由红参(或人参)和丹参作为原料制备而成；药物制剂必须要在保证产品质量稳定可控安全的基础之上，才能不断的更新发展，为了更好的控制该制剂的质量，保证用药的安全性，更好的指导生产，使工艺控制更加严格合理，使消费者能全面认识产品质地，需要研究、控制该注射剂质量的方法。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种双参注射剂的质量控制方法，这种方法针对的是如下产品向相关的生产、检测机构提供检测的指标、检测的手段、技术方法等，以便更好的控制该制剂的质量，保证用药的安全性，能够更好的指导生产，使生产工艺控制更加严格合理，使消费者能全面认识产品质地，所针对的产品为：
1)由红参(或人参)药材∶丹参药材＝1∶1-10组方，分别或合并采用水或乙醇溶液提取，然后用沉淀法、柱层析法、溶剂萃取法和超临界萃取法中的一种或几种进行适当精制、混匀，然后制成注射剂，包括直接用于注射给药的注射液、需稀释后用于静脉滴注的注射用浓溶液、直接供静脉滴注的葡萄糖静脉输液和氯化钠静脉输液以及用冷冻干燥法或喷雾干燥法制得的注射用无菌粉末和无菌块状物；
2)由红参(或人参)提取物∶丹参提取物＝1∶1-10组方制成的注射剂，包括直接用于注射给药的注射液、需稀释后用于静脉滴注的注射用浓溶液、直接供静脉滴注的葡萄糖静脉输液和氯化钠静脉输液以及用冷冻干燥法或喷雾干燥法制得的注射用无菌粉末和无菌块状物，所述的提取物可以来源于市售，也可以采用水或乙醇溶液提取，然后用沉淀法、柱层析法、溶剂萃取法和超临界萃取法中的一种或几种进行适当精制之后得到。
或者是使用专利申请号：200410022501.6，名称为：“治疗心脑血管疾病的中药及其制 备方法”提供的制备方法制备的注射制剂。
本发明是这样构成的：
双参注射剂的质量控制方法，该方法包括以下全部或部分内容：
(1)双参注射剂的指纹图谱测试，包括以丹参成分特征为主的指纹图谱和以红参或人参成分特征为主的指纹图谱中的一种或两种；
(2)红参或人参药材、丹参药材、丹参素或其钠盐、原儿茶醛、丹酚酸B或其镁盐、丹参酮IIA、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf中全部或部分成分的鉴别测试方法；
(3)丹参素或其钠盐、原儿茶醛、丹酚酸B或其镁盐、丹参酮IIA、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、总酚、总皂苷中全部或部分成分的含量测试方法。
所述的双参注射剂的质量控制方法，该方法包括如下指纹图谱中的一种或两种：
a、采用液相色谱法测试以丹参成分特征为主的指纹图谱：
(1)供试品溶液的制备：取待测双参注射制剂适量，加水或甲醇或乙醇溶解或稀释，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备：取适量丹参药材中的主要活性成分对照品，包括丹参素或其钠盐、原儿茶醛、丹酚酸B或其镁盐中的一种，用水或甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；
(3)色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料：流动相为乙腈或甲醇-0.01mol/L～2mol/L磷酸二氢钠水溶液或0.01mol/L～2mol/L磷酸二氢钾水溶液或0.01mol/L～2mol/L磷酸氢二钠水溶液或水或0.1％～5％冰醋酸溶液或0.1％～5％甲酸溶液或0.02％～5％磷酸溶液，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min、检测波长为190～410nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内；
(4)标准指纹图谱的制定：以上述方法作为制定以丹参成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～40个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测注射剂中以丹参成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部：
I.计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00；
II.待测注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％；
III.待测注射剂指纹图谱中有10％～50％的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±50％；
b、采用液相色谱法测试以红参或人参成分特征为主的指纹图谱：
(1)供试品溶液的制备：取待测双参注射制剂适量，加水溶解后上于已处理好的大孔吸附树脂柱，依次用水、梯度乙醇溶液除杂后，再用50％～无水乙醇溶液洗脱，收集50％～无水乙醇洗脱部分，挥干，残渣用水或甲醇或乙醇或流动相溶解并定至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备：取适量红参或人参药材中的主要活性成分对照品，包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf中的一种，用水或甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；
(3)色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料：流动相为乙腈或甲醇-水或0.1％～5％冰醋酸或0.1％～5％甲酸或0.005％～5％磷酸溶液，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min、检测波长为190～410nm范围内的一个或几个或蒸发光散射检测器检测，柱温在20～60℃范围内；
(4)标准指纹图谱的制定：以上述方法作为制定以红参或人参成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～20个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测药物组合物中以红参或人参成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部：
I.计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00；
II.待测注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％；
III.待测注射剂指纹图谱中有50％～100％的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±50％。
(共有峰面积的比值是指：以参照物峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值)
优选为：
所述的双参注射剂的质量控制方法，该方法包括如下指纹图谱中的一种或两种：
a、采用液相色谱法测试以丹参成分特征为主的指纹图谱：
(1)供试品溶液的制备：精密称取待测双参注射制剂适量，加水制成每1ml含10mg的溶液，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备：精密称取丹参素钠适量，加水制成每1ml含80μg的溶液，作为参照物溶液；
(3)色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为甲醇，流动相B为1％冰醋酸水溶液，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至80分钟，流动相A的比例由5％升至61％；流速为1.0ml/min，检测波长为280±2nm，柱温为25℃；
(4)标准指纹图谱的制定：以上述方法作为制定以丹参成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有10～20个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测注射剂中以丹参成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测注射剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部：
I.计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；
II.待测注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；
III.待测注射剂指纹图谱中有15％～40％的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±30％；
b、采用液相色谱法测试以红参或人参成分特征为主的指纹图谱：
(1)供试品溶液的制备：取待测双参注射剂适量，加水制成每1ml含50mg的溶液，量取适量，上于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、10％乙醇溶液、20％乙醇溶液、25％乙醇溶液洗脱除杂后，用80％乙醇溶液洗脱，收集80％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用水适量使溶解并定至合适浓度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备：取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为参照物溶液；
(3)色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料：流动相A为乙腈，流动相B 为0.1％磷酸溶液，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至25分钟，流动相A的比例由19升至20％，从25分钟至60分钟，流动相A的比例由20％升至40％，从60分钟至70分钟，流动相A的比例由40％升至45％，流速为1.2ml/min、检测波长为203±2nm，柱温40℃；
(4)标准指纹图谱的制定：以上述方法作为制定以红参或人参成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～15个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测药物组合物中以红参或人参成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部：
I.计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；
II.待测注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；
III.待测注射剂指纹图谱中有80％～100％的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±30％。
所述的双参注射剂的质量控制方法：所述注射剂的鉴别方法包括以下全部或部分内容：
a、注射剂中丹参、丹参酮IIA中一种或两种的薄层色谱鉴别方法：
取待测双参注射制剂适量，用乙醚或石油醚(30～60℃)或石油醚(60～90℃)或二氯甲烷或三氯甲烷或醋酸乙酯提取，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯或三氯甲烷或二氯甲烷溶解，作为供试品溶液；另取丹参对照药材，丹参酮IIA对照品中的一种或两种，制备对照溶液；丹参对照药材溶液的制备：取丹参对照药材，同法制成对照药材溶液；对照品溶液的制备：取丹参酮IIA对照品，加醋酸乙酯或甲醇或乙醇溶解并稀释至合适浓度，作为对照品溶液；采用薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板上，以苯或甲苯或二甲苯-醋酸乙酯或三氯甲烷或二氯甲烷2～40∶0.2～5为展开剂，展开，取出，晾干，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点；
b、注射剂中丹参酮IIA的液相色谱鉴别方法：
取待测双参注射制剂适量，置量瓶中，加水或甲醇或乙醇或流动相至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参酮IIA对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅 胶为填充剂，甲醇或乙腈-水或0.05％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～0.5％磷酸水溶液或0.05％～5％甲酸水溶液20～90∶80～10为流动相，流速为0.5～2ml/min，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内；供试品色谱中，应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰；
c、注射剂中丹酚酸B或其镁盐的薄层色谱鉴别方法：
取待测双参注射制剂适量，加甲醇或乙醇或三氯甲烷或二氯甲烷提取，滤过，滤液浓缩，作为供试品溶液；以丹酚酸B或其镁盐对照品的醋酸乙酯或10％～无水甲醇或10％～无水乙醇溶液为对照；采用薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板上，以苯或甲苯或二甲苯-三氯甲烷或二氯甲烷-醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲醇或乙醇或丙酮-甲酸或乙酸0.2～6∶0.5～8∶0.5～10∶0.1～3∶0.5～5为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯365nm或254nm或日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点；
d、注射剂中丹酚酸B或其镁盐的液相色谱鉴别方法：
取待测双参注射制剂适量，置量瓶中，加水或甲醇或乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹酚酸B或其镁盐对照品的水或10％～无水甲醇或10％～无水乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-水或0.2％～5％冰醋酸水溶液或0.005％～5％磷酸水溶液或0.2％～5％甲酸水溶液10～50∶2～30∶93～20为流动相，流速为0.5～2.0ml/min，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内；供试品色谱中，应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰；
e、注射剂中丹参素或其钠盐、原儿茶醛中一种或两种的薄层色色谱鉴别方法：
取待测双参注射制剂适量，置量瓶中，加水或甲醇或乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以丹参素钠、原儿茶醛对照品中一种或两种的甲醇或乙醇溶液为对照；采用薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷或二氯甲烷或醋酸乙酯或甲酸乙酯-丙酮或甲醇或乙醇-甲酸或冰醋酸1～25∶0.2～5∶0.2～5或苯或甲苯或二甲苯-醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲酸或冰醋酸2～25∶1～22∶0.2～10为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯365nm或254nm或日光下检视或喷以三氯化铁与铁氰化钾的混合溶液后日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点；
f、注射剂中丹参素或其钠盐、原儿茶醛中一种或两种的液相色谱鉴别方法：
取待测双参注射制剂适量，置量瓶中，加水或甲醇或乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参素钠、原儿茶醛中一种或两种对照品的水或甲醇或乙醇溶液为对照；采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇或乙腈-水或0.05％～5％冰醋酸水溶液或0.005％～5％磷酸水溶液或0.05％～5％甲酸水溶液5～40∶95～60为流动相，流速为0.5～2.0ml/min，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内；供试品色谱中，应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰；
g、注射剂中红参或人参、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf中一种或几种的薄层色谱鉴别方法：
取待测双参注射制剂适量，用水溶解后用氨饱和的正丁醇或醋酸乙酯或三氯甲烷或二氯甲烷提取，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇或乙醇溶解，作为供试品溶液；另取红参或人参对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf中的一种或几种，制备对照溶液；红参或人参对照药材溶液的制备：取红参或人参对照药材适量，加三氯甲烷或二氯甲烷回流提取，弃去三氯甲烷或二氯甲烷液，残渣加水饱和正丁醇或醋酸乙酯提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇或乙醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备：以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf中一种或几种对照品的甲醇或乙醇溶液为对照品溶液；采用薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷或二氯甲烷或正己烷或环己烷-醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲醇或乙醇或丙酮-水5～40∶10～100∶5～50∶0.2～3010℃以下放置的下层溶液或正丁醇-醋酸乙酯或甲酸乙酯-水1～10∶0.2～2∶1～15的上层溶液或三氯甲烷或二氯甲烷-甲醇或乙醇-水1～20∶0.2～10∶0.05～5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％～50％硫酸乙醇试剂，在80℃～160℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点；
h、注射剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re中一种或几种的液相色谱鉴别方法：
取待测双参注射制剂适量，加水溶解后上于已处理好的大孔吸附树脂柱，依次用水、梯度乙醇溶液除杂后，再用50％～无水乙醇溶液洗脱，收集50％～无水乙醇洗脱部分，挥干，残渣用水或甲醇或乙醇或流动相溶解并定至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re中一种或几种对照品的甲醇或乙醇溶液为对 照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇或乙腈-水或0.05％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.05％～5％甲酸溶液5～40∶95～60为流动相或甲醇或乙腈-水或0.05％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.05％～5％甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个或蒸发光检测器检测，柱温在20～60℃范围内；供试品色谱中，应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
优选为：
a、注射剂中丹参、丹参酮IIA的薄层色谱鉴别方法：
取待测双参注射制剂适量，加乙醚提取，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯溶解，作为供试品溶液；另取丹参对照药材，丹参酮IIA对照品中的一种或两种，制备对照溶液；丹参对照药材溶液的制备：取丹参对照药材，加乙醚提取，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备：取丹参酮IIA对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯19∶1为展开剂，展开，取出，晾干，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
b、注射剂中丹参酮IIA的液相色谱鉴别方法：
取待测双参注射制剂适量，置量瓶中，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照；采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-1％冰醋酸水溶液75∶25为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为270nm，柱温为30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰；
c、注射剂中丹酚酸B的薄层色谱鉴别方法：
取待测双参注射制剂适量，加75％甲醇溶液溶解，作为供试品溶液；以丹酚酸B对照品的75％甲醇溶液为对照；采用薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸2∶3∶4∶0.5∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯254nm检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
d、注射剂中丹酚酸B的液相色谱鉴别方法：
取待测双参注射制剂适量，置量瓶中，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；取丹酚酸B对照品的75％甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-1.7％甲酸水溶液30∶10∶60为流动相，流速为 1.0ml/min，检测波长为286nm，柱温25℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰；
e、注射剂中丹参素、原儿茶醛中一种或两种的薄层色谱鉴别方法：
取待测双参注射制剂适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取丹参素钠和原儿茶醛对照品中的一种或两种，分别加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液；采用薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸8∶7∶2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以新鲜配制的2％三氯化铁与1％铁氰化钾等体积的混合液，在日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
f、注射剂中丹参素、原儿茶醛中一种或两种的液相色谱鉴别方法：
取待测双参注射制剂适量，置量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参素钠、原儿茶醛对照品的水溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-1％冰醋酸水溶液13∶87为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm，柱温30℃，供试品色谱中，与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰；
g、注射剂中红参或人参、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf中一种或几种的薄层色谱鉴别方法：
取待测双参注射制剂适量，用水溶解后用氨饱和的正丁醇提取，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇溶解，作为供试品溶液；另取红参或人参对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf中的一种或几种，制备对照药材溶液；红参或人参对照药材溶液的制备：取红参或人参对照药材适量，加三氯甲烷回流提取，弃去三氯甲烷液，残渣加水饱和正丁醇提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf中一种或几种对照品，分别加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水7.5∶2∶0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试剂，105℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
h、注射剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re中一种或几种的液相色谱鉴别方法：
取待测双参注射剂适量，加水制成每1ml含50mg的溶液，量取适量，上于已处理好的 D101大孔吸附树脂柱，依次用水、10％乙醇溶液、20％乙醇溶液、25％乙醇溶液洗脱除杂后，用80％乙醇溶液洗脱，收集80％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用水适量使溶解并定至合适浓度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re中一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至35分钟，乙腈的比例为19％，从35分钟至55分钟，乙腈的比例由19％上升至29％，从55分钟至70分钟，乙腈的比例为29％，从70分钟至100分钟，乙腈的比例由29％升至40％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
所述的双参注射剂的质量控制方法：所述注射剂含量的测试方法应包括以下全部或部分内容：
a、注射剂中丹参素、原儿茶醛中一种或两种的含量测定：
取待测双参注射制剂适量，置量瓶中，加水或甲醇或乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参素钠、原儿茶醛对照品中一种或两种的水或甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇或乙腈-水或0.05％～5％冰醋酸水溶液或0.005％～5％磷酸水溶液或0.05％～5％甲酸溶液5～40∶95～60为流动相，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内；以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项：
(1)每单位量含丹参素的限度不得少于2.25mg；
(2)每单位量含原儿茶醛的限度不得少于1.0mg；
(3)每单位量含丹参素和原儿茶醛的总和的限度不得少于3.25mg；
b.注射剂中总酚的含量测定：
取待测双参注射制剂适量，加水溶解并稀释至合适浓度，摇匀，精密量取适量，置量瓶中，加50％甲醇或水1～25ml，加5％亚硝酸钠溶液0.3ml～5ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液0.3ml～5ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液4～25ml，再加50％甲醇或水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以芦丁或原儿茶醛或丹参素钠或丹酚酸B或其镁盐作为对照品，同法制得对照品溶液；以随行溶剂为空白，采用分光光度法，在500±100nm处测定吸收度，以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总酚的限度以芦丁或原儿茶醛或丹参素钠或丹酚酸B或其镁盐计，不得少于7.5mg；
c.注射剂中丹酚酸B或其镁盐含量测定：
取待测双参注射制剂适量，置量瓶中，加水或甲醇或乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹酚酸B或其镁盐对照品的水或10％～无水甲醇或10％～无水乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-水或0.5％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～0.5％磷酸水溶液或0.5％～5％甲酸水溶液10～50∶2～30∶93～20为流动相，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内；以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含丹酚酸B或其镁盐的限度不得少于1.2mg；
d、注射剂中丹参酮IIA的含量测定：
取待测双参注射制剂适量，置量瓶中，加水或甲醇或乙醇或流动相至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参酮IIA对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇或乙腈-水或0.05％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～0.5％磷酸水溶液或0.05％～5％甲酸水溶液20～90∶80～10为流动相，流速为0.5～2ml/min，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内；以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含丹参酮IIA的限度不得少于0.1mg；
e、注射剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re中一种或几种的含量测定：
取待测双参注射制剂适量，加水溶解后上于已处理好的大孔吸附树脂柱，依次用水、梯度乙醇溶液除杂后，再用50％～无水乙醇溶液洗脱，收集50％～无水乙醇洗脱部分，挥干，残渣用水或甲醇或乙醇或流动相溶解并定至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re中一种或几种对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇或乙腈-水或0.05％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.05％～5％甲酸溶液5～40∶95～60或甲醇或乙腈-水或0.05％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.05％～5％甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个或蒸发光检测器检测，柱温在20～60℃范围内；以外标法或标准曲线法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项：
(1)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于0.35mg；
(2)每单位量含人参皂苷Re的限度不得少于0.17mg；
(3)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于0.2mg；
(4)每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1中两种或三种成分总和的限度不得少于0.52mg；
f、注射剂中总皂苷的含量测定：
取待测双参注射制剂适量，置量瓶中，加蒸馏水或甲醇或乙醇适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取适量，置量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加1％～50％香草醛-冰醋酸溶液0.1ml～10ml，高氯酸0.1ml～15ml，摇匀，30℃～80℃水浴上加热3～50分钟，取出，立即以冰水浴或流水冷却，精密加冰醋酸至刻度，摇匀，作为供试品溶液，以人参皂苷Rg1或人参皂苷Rb1或人参皂苷Re或人参皂苷Rf为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用分光光度法，在547±100nm的波长处测定吸收度，以外标法或标准曲线法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以人参皂苷Rg1或人参皂苷Rb1或人参皂苷Re或人参皂苷Rf计，不得少于4.0mg。
优选为：
a.注射剂中丹参素、原儿茶醛中一种或两种的含量测定：
取待测双参注射制剂适量，置量瓶中，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。以丹参素钠、原儿茶醛中一种或两种对照品的水溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-1％冰醋酸水溶液13∶87为流动相，检测波长为280nm，柱温30℃，以外标一点法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项：
(1)每单位量含丹参素的限度不得少于4.5mg；
(2)每单位量含原儿茶醛的限度不得少于2mg；
(3)每单位量含丹参素和原儿茶醛的总和的限度不得少于6.5mg；
b.注射剂中总酚含量测定：
取待测双参注射制剂适量，加水制成每1ml含2.5mg的溶液，摇匀，精密量取1ml，置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以原儿茶醛作为对照品，同法制得对照品溶液；以随行溶剂为空白，照分光光度法，在518nm处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量 ，每单位量含总酚的限度以原儿茶醛计，不得少于15.0mg；
c、注射剂中丹酚酸B含量测定：
取待测双参注射制剂适量，置量瓶中，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹酚酸B对照品的75％甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-1.7％甲酸水溶液30∶10∶60为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为286nm，柱温25℃；以外标一点法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含丹酚酸B的限度不得少于2.4mg；
d、注射剂中丹参酮IIA的含量测定：
取待测双参注射制剂适量，置量瓶中，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照；采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-1％冰醋酸水溶液75∶25为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为270nm，柱温为30℃；以外标一点法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含丹参酮IIA的限度不得少于0.2mg；
e、注射剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re中一种或几种的含量测定：
取待测双参注射剂适量，加水制成每1ml含50mg的溶液，量取适量，上于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、10％乙醇溶液、20％乙醇溶液、25％乙醇溶液洗脱除杂后，用80％乙醇溶液洗脱，收集80％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用水适量使溶解并定至合适浓度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re中一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至35分钟，乙腈的比例为19％，从35分钟至55分钟，乙腈的比例由19％上升至29％，从55分钟至70分钟，乙腈的比例为29％，从70分钟至100分钟，乙腈的比例由29％升至40％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；以外标一点法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项：
(1)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于0.7mg；
(2)每单位量含人参皂苷Re的限度不得少于0.34mg；
(3)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于0.4mg；
(4)每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re中两种或三种成分总和的限度不得少于1.04mg；
f、注射剂中总皂苷的含量测定：
取待测双参注射制剂适量，置10ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取0.6ml，至25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液0.5ml，高氯酸2.0ml，摇匀，60℃水浴上加热15分钟，取出，立即以冰水浴冷却2分钟，用冰醋酸定至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用分光光度法，在547nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以人参皂苷Rg1计，不得少于8.0mg。
双参所述注射剂中的酚类、皂苷类及其它所有可测成分的总含量占制剂中扣除辅料量和水分量的总固体量的25％以上。
(总固体量是指：内容物的重量减去辅料量和水分量后的重量)
与现有技术相比，本发明能更加完善的控制以红参或人参、丹参制成的双参注射剂产品质量。该产品成分复杂，如果只用其中一、两种成分来说明其内在质量，具有一定的片面性，更无法判断其药效的指标成分。因此本申请人制定了以红参或人参成分特征为主的指纹图谱和以丹参成分特征为主的指纹图谱来全面控制注射剂的质量；但是双参注射剂中化学成分复杂性及两种药材所含成分相互之间的干扰影响，导致双参制剂中红参或人参部分、丹参部分的指纹图谱特征峰发生改变，增加了制定指纹图谱的难度，使得各部分指纹图谱特征不稳定，采用常规的检测红参或者丹参的液相色谱条件，各成分特征峰的分离效果很难满足要求必须通过系统考查、控制流动相等色谱条件，采用本发明的条件，选用适宜的参数进行梯度洗脱，才能得到专属、准确、稳定、可操作性强的理想的指纹图谱。
通过实验证明，本发明质量控制方法对以红参或人参、丹参制成的中药注射剂产品的质量控制更为有效，方法精密度、稳定性均较高。
实验例1以红参或人参成分特征为主的指纹图谱的制备
a、实验仪器、试剂及样品：
对照品：人参皂苷Rg1：中国药品生物制品检定所
b、色谱条件与系统适应性实验：
1.色谱柱的选择：
研究过程中，选用了常规的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，分别试用了Zorbax、Inertsil ODS-3、Diamonsil ODS(均为C18，4.6mm×200mm，5μm)三种牌号的色谱柱，结果显示三种牌号的色谱柱均可达到较好的分离效果，其中Inertsil ODS-3色谱柱分离效果最好，柱效最高。故最终选用Inertsil ODS-3色谱柱(4.6mm×200mm，5μm)为实验研究柱。
2.流动相的选择：
研究过程中分别考察了(1)甲醇-水(20∶80)，(2)乙腈-水(10∶90)，(3)乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钠(梯度洗脱)(4)乙腈-0.1％磷酸溶液(梯度洗脱)，溶剂比例为从0分钟至25分钟，流动相A的比例由19升至20％，从25分钟至60分钟，流动相A的比例由20％升至40％，从60分钟至70分钟，流动相A的比例由40％升至45％四种流动相系统。结果显示流动相(1)条件下，峰形较差，1小时内出峰较少，仍有不少组分滞留在后出峰；流动相(2)流动相条件下，峰形较差，分离不好；(3)条件下，峰拖尾严重，出峰不完全；流动相(4)条件下，峰形较好，出峰完全且分布均匀，故而最终被选用。
3.检测波长的确定：
研究中在乙腈-0.1％磷酸溶液(梯度洗脱)流动相条件下，分别考察了在不同波段典型波长203、210、230、254下的色谱峰情况，结果显示，在203nm下色谱峰较多，峰形较好，故最终选用203nm作为检测波长。
4.仪器、色谱柱及积分参数：
4.1仪器参数：选用了液相色谱分析领域主流配置和性能良好的Agilent 1100系列高效液相色谱仪，Chemstation色谱工作站。色谱柱为Inertsil ODS-3(4.6mm×200mm，5μm)；柱温40℃，流速1.2ml/min。
4.2积分参数：Slope Sensitivity：1，peak width：0.05，最小峰面积为参照物(S)峰峰面积的5％，最小峰高为S峰峰高的5％。如此设定可以避免一些很小面积的色谱峰(单峰面积占总峰面积小于0.5％)的计算，同时保证与参照物的相关性。
5.供试品溶液的制备：
取待测双参注射剂适量，加水制成每1ml含50mg的溶液，量取适量，上于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、10％乙醇溶液、20％乙醇溶液、25％乙醇溶液洗脱除杂后，用80％乙醇溶液洗脱，收集80％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用水适量使溶解并定至合适浓度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
6.参照物溶液的制备：
人参皂苷Rg1为红参或人参主要活性成分之一，其积分面积在指纹图谱中所占比例较大且较稳定，同时兼顾中间体和药材的研究，因此选定人参皂苷Rg1作为参照物。
7.指纹图谱及技术参数：
根据10批样品制定标准指纹图谱，将供试品指纹图谱与标准指纹图谱比较，相似度均在0.90～1.00之间。
实验例2以丹参成分特征为主的指纹图谱的制备
a、实验仪器、试剂及样品：
对照品：丹参素钠：中国药品生物制品检定所。
b、色谱条件与系统适应性实验：
1.色谱柱的选择：
研究过程中，选用了常规的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，分别试用了Zorbax、Inertsil ODS-3、Kromasil ODS(均为C18，250mm×4.6mm，5μm)三种牌号的色谱柱，结果显示三种牌号的色谱柱均可达到较好的分离效果，其中Kromasil ODS色谱柱分离效果最好，柱效最高，。故最终选用Kromasil ODS色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)为实验研究柱。
2.流动相的选择：
研究过程中分别考察了(1)甲醇-水(20∶80)，(2)乙腈-水(10∶90)，(3)乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钠(梯度洗脱)(4)甲醇-1％冰醋酸水溶液(梯度洗脱)，溶剂比例为从0分钟至80分钟，甲醇的比例由5％升至61％四种流动相系统。结果显示流动相(1)条件下，峰形较差，1小时内出峰较少，仍有不少组分滞留在后出峰；流动相(2)流动相条件下，峰形较差，分离不好；(3)条件下，峰拖尾严重，出峰不完全；流动相(4)条件下，峰形较好，出峰完全且分布均匀，故而最终被选用。
3.检测波长的确定：
研究中在甲醇-1％冰醋酸水溶液(梯度洗脱)流动相条件下，分别考察了在不同波段典型波长203、210、230、280、300nm下的色谱峰情况，结果显示，在280nm下色谱峰较多，峰形较好，故最终选用280nm作为检测波长。
4.仪器、色谱柱及积分参数：
4.1仪器参数：选用了液相色谱分析领域主流配置和性能良好的SHIMADZU LC-2010AHT系列高效液相色谱仪。色谱柱为Kromasil ODS(4.6mm×200mm，5μm)；柱温25℃，流速1.0ml/min。
5.供试品溶液的制备：
精密称取待测双参注射制剂适量，加水制成每1ml含10mg的溶液，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
6.参照物溶液的制备：
丹参素为丹参中主要活性成分之一，其积分面积在指纹图谱中所占比例较大且较稳定， 同时兼顾中间体和药材的研究，因此选定丹参素钠作为参照物。
7.指纹图谱及技术参数：
根据10批样品制定标准指纹图谱，将供试品指纹图谱与标准指纹图谱比较，相似度均在0.90～1.00之间。
实验例3双参注射剂中丹参、丹参酮IIA的薄层色谱鉴别方法：
为了突出丹参的特征，选择了丹参、丹参酮IIA作为其特征斑点，但是由于药材中存在较多与丹参酮IIA结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下薄层板和展开条件对丹参酮IIA进行了展开：
 条件  问题
甲苯-正己烷-甲醇-水(15∶5∶5∶1)硅胶H薄层板  对照品展开至前沿
苯-环己烷-乙醇-甲酸(15∶10∶1∶1)硅胶H薄层板  对照品未分开，阴性有干扰
环己烷-甲酸乙酯-甲醇(10∶5∶6)硅胶G薄层板  对照品展开至前沿
正己烷-醋酸乙酯-甲醇(15∶5∶1)硅胶GF254薄层板  对照品未分开，阴性有干扰
甲苯-甲醇(10-0.8)硅胶H薄层板  对照品未分开，阴性有干扰
苯-甲醇(15-0.8)硅胶G薄层板  对照品未分开，阴性有干扰
苯-醋酸乙酯(19∶1)硅胶G薄层板  分离清晰，Rf值适中阴性无干扰
经过筛选，确定了以硅胶G薄层板为固定相，以苯-醋酸乙酯(19∶1)硅胶G薄层板为展开剂，在此条件下，丹参酮IIA的Rf值适中，和其它斑点分离清晰，阴性无干扰。
实验例4双参注射剂中丹参酮IIA的液相色谱鉴别方法：
为了突出丹参的特征，除了薄层鉴别方法以外，选择了丹参酮IIA作为其特征成分，但是由于药材中存在较多与丹参酮IIA结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下色谱柱和流动相对丹参酮IIA进行了分离：
经过筛选，确定了以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，甲醇-1％冰醋酸水溶液(75∶25)为流动相，在此条件下，丹参酮IIA保留时间适中，峰行尖锐，对称，阴性无干扰。
实验例5双参注射剂中丹酚酸B或其镁盐的薄层色谱鉴别方法：
为了突出丹参的特征，选择了丹酚酸B或其镁盐作为其特征斑点，但是由于药材中存在较多与丹酚酸B或其镁盐结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下薄层板和展开条件对丹酚酸B或其镁盐进行了展开：
 条件   问题
 苯-甲醇-醋酸乙酯(50∶10∶3)硅胶GF254薄层板   对照品未分开，阴性有干扰
 甲苯-甲醇-醋酸甲酯(50∶10∶3)硅胶H薄层板   对照品未分开，阴性有干扰
 氯仿-正己烷-甲酸(50∶20∶5)硅胶G薄层板   对照品展开至前沿
 二氯甲烷-甲醇(5∶2)硅胶G薄层板   对照品展开至前沿
 醋酸乙酯-正己烷-丙酮(5∶3∶5)硅胶H薄层板   对照品未分开，阴性有干扰
 苯-甲酸乙酯-甲酸(60∶10∶2)硅胶G薄层板   对照品未分开，阴性有干扰
 甲苯-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)硅胶 GF254薄层板   分离清晰，Rf值适中阴性无干  扰
经过筛选，确定了以硅胶GF254薄层板为固定相，以甲苯-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)为展开剂，在此条件下，丹酚酸B或其镁盐的Rf值适中，和其它斑点分离清晰，阴性无干扰。
实验例6双参注射剂中丹酚酸B或其镁盐的液相色谱鉴别方法：
为了突出丹参的特征，除了薄层鉴别方法以外，选择了丹酚酸B或其镁盐作为其特征成分，但是由于药材中存在较多与丹酚酸B或其镁盐结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下色谱柱和流动相对丹酚酸B或其镁盐进行了分离：
Figure RE-G20061K0068X20060123D000182
Figure RE-G20061K0068X20060123D000191
经过筛选，确定了以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，甲醇∶5％冰醋酸水溶液(35∶65)为流动相，在此条件下，丹酚酸B或其镁盐保留时间适中，峰行尖锐，对称，阴性无干扰。
实验例7双参注射剂中丹参素、原儿茶醛的薄层色谱鉴别方法：
为了突出丹参的特征，选择了丹参素、原儿茶醛作为其特征斑点，但是由于药材中存在较多与丹参素、原儿茶醛结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下薄层板和展开条件对麦冬进行了展开：
条件   问题
环己烷-氯仿-甲醇(5∶3∶5)硅胶G薄层板   对照品展开至前沿
正己烷-醋酸乙酯-甲醇(5∶3∶4)硅胶H薄层板   对照品展开至前沿
二甲苯-甲酸乙酯(3∶2)硅胶GF254薄层板   阴性有干扰
正己烷-醋酸乙酯-甲酸(2∶1∶1)硅胶G薄层板   阴性有干扰
甲苯-醋酸乙酯-丙酮(6∶4∶1)硅胶H薄层板   阴性有干扰
苯-甲酸乙酯(10∶9)硅胶H薄层板   阴性有干扰
苯-醋酸乙酯-甲酸(8∶7∶2)硅胶GF254薄层板   分离清晰，Rf值适中阴性无干扰
经过筛选，确定了以硅胶GF254薄层板为固定相，以苯-醋酸乙酯-甲酸(8∶7∶2)为展开剂，在此条件下，丹参素、原儿茶醛的Rf值适中，和其它斑点分离清晰，阴性无干扰。
实验例8双参注射剂中丹参素、原儿茶醛的液相色谱鉴别方法
为了突出丹参的特征，除了薄层鉴别方法以外，选择了丹参素、原儿茶醛作为其特征成分，但是由于药材中存在较多与丹参素、原儿茶醛结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下色谱柱和流动相对丹参素、原儿茶醛进行了分离：
Figure RE-G20061K0068X20060123D000192
Figure RE-G20061K0068X20060123D000201
经过筛选，确定了以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，甲醇-1％冰醋酸水溶液(13∶87)为流动相，在此条件下，丹参素、原儿茶醛保留时间适中，峰行尖锐，对称，阴性无干扰。
实验例9双参注射剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf的薄层色谱鉴别方法
为了突出红参或人参的特征，选择了人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf作为其特征斑点，但是由于药材中存在较多与人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下薄层板和展开条件对麦冬进行了展开：
  条件   问题
  氯仿-正己烷-水(20∶60∶10)10℃以下放置的下层溶液  硅胶G薄层板   对照品展开至前沿
  二氯甲烷-甲酸乙酯-环己烷(10∶1∶5)硅胶H薄层板   对照品展开至前沿
  氯仿-丁酮-甲醇(15∶40∶22)硅胶G薄层板   对照品未分开，阴性有干扰
  氯仿-醋酸乙酯-水(10∶40∶15)10℃以下放置的下层溶液  硅胶G薄层板   对照品未分开，阴性有干扰
  正丁醇-甲酸乙酯-水(5∶1∶5)上层溶液硅胶G薄层板   对照品未分开，阴性有干扰
  异丙醇-甲酸乙酯-水(2∶1.5∶0.5)上层溶液硅胶H薄层板   对照品未分开，阴性有干扰
  三氯甲烷-甲醇-水(7.5∶2∶0.2)硅胶G薄层板   分离清晰，Rf值适中阴性无干  扰
经过筛选，确定了以硅胶G薄层板为固定相，以三氯甲烷-甲醇-水(7.5∶2∶0.2)为展开剂，在此条件下，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf的Rf值适中，和其它斑点分离清晰，阴性无干扰。
实验例10双参注射剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re的液相色谱鉴别方法
为了突出红参或人参的特征，除了薄层鉴别方法以外，选择了人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re作为其特征成分，但是由于药材中存在较多与人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下色谱柱和流动相对人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re进行了分离：
  条件   问题
  甲醇-四氢呋喃-水(85∶5∶10)十八烷基硅烷键合硅胶   出峰时间过快
  乙腈-四氢呋喃水(90∶5∶5)十八烷基硅烷键合硅胶   出峰时间过快
  甲醇-0.005mol/L磷酸二氢钠(80∶20)八烷基硅烷键合硅胶   阴性有干扰
  甲醇-0.02mol/L磷酸氢二钠(80∶20)十八烷基硅烷键合硅胶   阴性有干扰
  乙腈-0.005mol/L磷酸二氢钠(90∶10)八烷基硅烷键合硅胶   阴性有干扰
  乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾(85∶15)十八烷基硅烷键合硅胶   阴性有干扰
  乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至35分钟，乙腈的比  例为19％，从35分钟至55分钟，乙腈的比例由19％上升至29％，从55分  钟至70分钟，乙腈的比例为29％，从70分钟至100分钟，乙腈的比例由  29％升至40％十八烷基硅烷键合硅胶   保留时间适中，峰  行尖锐，对称，阴  性无干扰
经过筛选，确定了以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至35分钟，乙腈的比例为19％，从35分钟至55分钟，乙腈的比例由19％上升至29％，从55分钟至70分钟，乙腈的比例为29％，从70分钟至100分钟，乙腈的比例由29％升至40％，在此条件下，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re保留时间适中，峰行尖锐，对称，阴性无干扰。
实验例11双参注射剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re的含量测定方法
1、仪器、试剂
仪器：
SHIMADZU    2010AHT      高效液相色谱仪
普析通      TU-1810SPC   紫外/可见分光光度仪
SARTORIUS   BP211D       电子分析天平
KQ250DB                  超声波清洗机
试剂：
甲醇    分析纯    北京市通广精细化工公司
乙腈    色谱纯    CALEDON
磷酸     优级纯    北京化工厂
纯净水   娃哈哈
2、色谱分析条件
色谱仪：SHIMADZU      2010AHT       HPLC
固定相：Kromasil-C18  250mm×4.6mm  5μm
流动相：乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至35分钟，乙腈的比例为19％，从35分钟至55分钟，乙腈的比例由19％上升至29％，从55分钟至70分钟，乙腈的比例为29％，从70分钟至100分钟，乙腈的比例由29％升至40％。
流速：1ml/min
柱温：30℃
进样量：10μl
检测波长：203nm
3、系统适用性试验 根据上述仪器条件得到的人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、混合对照品、样品色谱图，其理论板数以人参皂苷Re计算大于2500。样品中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1与相近峰分离清晰完全，分离度均大于1.5。
4、阴性干扰试验 为考察其它药材是否干扰人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的测定，取阴性对照品(缺红参)与供试品溶液同法制成阴性对照品溶液并测定。结果表明，阴性样品对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf的含量测定无干扰。
5、测定波长的选择 人参皂苷Rg1 精密称取人参皂苷Rg1 1.10mg，人参皂苷Re1.02mg，人参皂苷Rb1 1.13mg，分置10ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，分别在190nm～400nm的波长范围内进行扫描，结果表明，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1均在203nm处有最大吸收，因此选择203nm作为测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量的检测波长。
6、线性关系的考察 人参皂苷Rg1人参皂苷Rb1人参皂苷Re  精密称取人参皂苷Rg110.38mg，人参皂苷Rb1 6.94mg，人参皂苷Re4.71mg，共置25ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取0.5、1.5、2.5、3.5、4.5ml，分置5ml量瓶中，加甲醇定至刻度，摇匀，分别从中精密吸取10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，分别以对照品的量(μg)为横坐标，峰面积的峰面积为纵坐标作图，绘制标准曲线。人参皂苷Rg1回归方程Y＝368831.8280X+1343.0250
决定系数γ＝0.9999
人参皂苷Rg1在0.4152～3.7368μg范围内线性良好。
人参皂苷Rg1线性关系
  编号   人参皂苷Rg1量(μg)   峰面积
  1   0.4152   150017
  2   1.2456   460750
  3   2.0760   773892.5
  4   2.9064   1077496.5
  5   3.7368   1373033.5
人参皂苷Rb1回归方程Y＝292441.2824X+339.3
决定系数γ＝0.9999
人参皂苷Rb1在0.2776～2.4984μg范围内线性良好。
人参皂苷Rb1线性关系
  编号   人参皂苷Rb1量(μg)   峰面积
  1   0.2776   80514
  2   0.8328   243078
  3   1.388   411215
  4   1.9432   565124
  5   2.4984   731308
人参皂苷Re回归方程Y＝289499.4692X-831.3000
决定系数γ＝0.9999
人参皂苷Rg1在0.1884～1.6956μg范围内线性良好。
人参皂苷Re线性关系
  编号  人参皂苷Re量(μg)   峰面积
  1   0.1884   52039.5
  2   0.5652   163025
  3   0.9420   274224.5
  4   1.3188   382256
  5   1.6956   487841
7、精密度和对照品溶液稳定性试验 精密称取人参皂苷Rg1 13.84mg，人参皂苷 Rb1 10.25mg，人参皂苷Re7.19mg，共置100ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，分别在0、2、6、10、24小时重复测定，考察对照品溶液的精密度和稳定性
人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Re对照品精密度试验
 时间(h)   0   2   6   10   24  平均值  RSD(％)
 人参皂苷Rg1   527893   527683   528273   529849   528557  528451   0.16
 人参皂苷Rb1   307624   311051   309785   310097   308462  3094054   0.44
 人参皂苷Re   209917   208781   208645   211218   211156  209943   0.59
结果表明，对照品溶液精密度良好，在24小时内稳定。
8、供试品溶液的稳定性试验 取装量差异项下本品5瓶，取内容物，混匀，精密称取0.51236g，至10ml量瓶中，加水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取5ml，，上于已处理好的D101大孔吸附树脂柱(柱子300×8mm，装量180mm)，依次用100ml水、100ml10％乙醇溶液、100ml20％乙醇溶液、50ml25％乙醇溶液洗脱除杂后，用50ml80％乙醇溶液洗脱，收集80％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用水适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解并定量转移至5ml量瓶中，放至室温，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，分别在0、2、6、10、24小时重复测定，考察供试品溶液的稳定性。
供试品稳定性试验
  时间(h)   0   2   6   10   24   均值  RSD(％)
  人参皂苷Rg1(mg/瓶)   0.908   0.908   0.944   0.933   0.930   0.925   1.72
  人参皂苷Rb1(mg/瓶)   0.571   0.576   0.569   0.582   0.564   0.572   1.20
  人参皂苷Re(mg/瓶)   0.490   0.479   0.499   0.481   0.496   0.489   1.79
  合计(mg/瓶)   1.969   1.963   2.012   1.996   1.99   1.986
结果表明，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
9、重复性试验 取装量差异项下本品5瓶，取内容物，混匀，从中取约0.5g(共5份)，分至10ml量瓶中，加水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取5ml，，上于已处理好的D101大孔吸附树脂柱(柱子300×8mm，装量180mm)，依次用100ml水、100ml10％乙醇溶液、100ml20％乙醇溶液、50ml25％乙醇溶液洗脱除杂后，用50ml80％乙醇溶液洗脱，收集80％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用水适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解并定量 转移至5ml量瓶中，放至室温，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
供试品重复性试验
  编号   1   2   3   4   5   均值  RSD(％)
  人参皂苷Rg1(mg/瓶)   0.903   0.897   0.914   0.886   0.908   0.902   1.19
  人参皂苷Rb1(mg/瓶)   0.572   0.564   0.559   0.577   0.568   0.568   1.23
  人参皂苷Re(mg/瓶)   0.504   0.493   0.502   0.511   0.502   0.502   1.28
  合计(mg/瓶)   1.979   1.954   1.975   1.974   1.978   1.972
结果表明，供试品重复性良好。
10、加样回收率试验 采用加样回收法，取装量差异项下本品5瓶，取内容物，混匀，从中取约0.25g(共5份)，精密称定；精密称取人参皂苷Rg1对照品5.88mg，人参皂苷Rb1对照品5.03mg，共置10ml量瓶中，加水适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取1.0ml；精密称取人参皂苷Re对照品12.74mg，置5ml量瓶中，加50％甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取0.3ml；共置10ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取5ml，上于已处理好的D101大孔吸附树脂柱(柱子300×8mm，装量180mm)，依次用100ml水、100ml10％乙醇溶液、100ml20％乙醇溶液、50ml25％乙醇溶液洗脱除杂后，用50ml80％乙醇溶液洗脱，收集80％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用水适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解并定量转移至5ml量瓶中，放至室温，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
注射用双参中人参皂苷Rg1含量为0.277％；
注射用双参中人参皂苷Rb1含量为0.175％；
注射用双参中人参皂苷Re含量为0.155％。
人参皂苷Rg1回收率
Figure RE-G20061K0068X20060123D000251
Figure RE-G20061K0068X20060123D000261
人参皂苷Rg1平均回收率＝100.35％ RSD＝0.71％
人参皂苷Rb1回收率
  编号   称量(g)   供试品中  纯品量(mg)   纯品加入量(mg)   测量值(mg)   回收率(％)
  1   0.30015   0.5253   0.503   1.019   98.13
  2   0.29152   0.5102   0.503   1.002   97.74
  3   0.29003   0.5076   0.503   0.995   96.83
  4   0.28033   0.4906   0.503   0.989   99.18
  5   0.27481   0.4809   0.503   0.971   97.49
人参皂苷Rb1平均回收率＝97.87％  RSD＝0.89％
人参皂苷Re回收率
  编号   称量(g)   供试品中纯品量(mg)   纯品加入量(mg)   测量值(mg)   回收率(％)
  1   0.30015   0.465   0.7644   1.2355   100.80
  2   0.29152   0.452   0.7644   1.2148   99.79
  3   0.29003   0.450   0.7644   1.2170   100.34
  4   0.28033   0.435   0.7644   1.1713   96.32
  5   0.27481   0.426   0.7644   1.1847   99.25
人参皂苷Re平均回收率＝99.30％  RSD＝1.77％
11、三批中试样品含量测定
三批中试样品人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re含量测定
  批号   人参皂苷Rg1(mg/瓶)   人参皂苷Re(mg/瓶)   合计(mg/瓶)
  1批   0.900   0.484   1.384
  2批   0.909   0.529   1.438
  3批   0.814   0.476   1.290
根据三批样品含量测定结果暂定，本品每瓶含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re含量合计不得少于0.72mg。
实验例12双参注射剂中人参总皂苷的含量测定方法
1、仪器、试药
(1)仪器
普析通     TU-1810SPC  紫外/可见分光光度仪
SARTORIUS  BP211D      电子分析天平
(2)试药
香草醛    分析纯    天津市化学试剂三厂
冰醋酸    分析纯    天津市化学试剂三厂
高氯酸    分析纯    天津市化学试剂三厂
纯净水    娃哈哈
2、检测波长的选择 精密称取人参皂苷Rg1 8.31mg，置100ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置10ml具塞试管中，水浴蒸干溶剂，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，立即在冰水浴中冷却2分钟，精密加入冰醋酸5ml，摇匀，在700～400nm波长范围内进行扫描，结果表明，人参皂苷Rg1在547nm处有最大吸收，空白无干扰，因此选择547nm为分光光度法测定注射用双参中人参总皂苷的检测波长。
3、线性关系的考察 精密称取人参皂苷Rg1对照品6.85mg，置100ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHZ)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml，分置10ml具塞试管中，水浴蒸干溶剂，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，立即在冰水浴中冷却2分钟，精密加入冰醋酸5ml，摇匀，以随行溶剂为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)，在547nm的波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，人参皂苷Rg1的量(μg)为横坐标，绘制标准曲线。
回归方程Y＝0.0044X-0.0009；
决定系数γ＝0.9999
人参皂苷Rg1在27.40～137.00μg范围线性良好。
人参皂苷Rg1标准曲线测定数据
  编号   人参皂苷Rg1(μg)   吸收度
  1   27.40   0.121
  2   54.80   0.241
  3   82.20   0.364
  4   109.60   0.486
  5   137.00   0.606
4、精密度和对照品溶液稳定性试验 精密称取人参皂苷Rg1对照品6.53mg，置100ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHZ)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取1.2ml，置10ml具塞试管中，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，60℃水浴15分钟，取出，立即以冰水浴冷却2分钟，精密加冰醋酸5ml，摇匀，以随行溶剂为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)，在547nm的波长处测定吸收度，分别在0、5、10、20、30分钟时重复测定一次。
人参皂苷Rg1精密度实验
 时间(min)   0   5   10   20   30   X平均  RSD％
  吸光度   0.385   0.384   0.380   0.381   0.380   0.382   0.61
结果表明，对照品溶液精密度良好，在30分钟内稳定。
5、供试品溶液的稳定性实验 取装量差异项下本品5瓶，取内容物，混匀，从中精密称取0.12203g，置10ml量瓶中，加水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取0.2ml，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，60℃水浴15分钟，取出，立即以冰水浴冷却2分钟，精密加冰醋酸5ml，摇匀，以随行溶剂为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)，在547nm的波长处测定吸收度，计算，即得。分别在0、5、10、20、30分钟时重复测定。
供试品溶液稳定性实验
  时间(min)   0   5   10   20   30   X平均  RSD％
  总皂苷(mg/瓶)   12.20   11.81   12.06   11.87   12.28   12.04  1.68
结果表明，供试品溶液在30分钟内稳定。
6、重复性试验 取装量差异项下本品5瓶，取内容物，混匀，从中取约0.1g，精密称定，分置10ml量瓶中，加水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取0.2ml，，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，60℃水浴15分钟，取出，立即以冰水浴冷却2分钟，精密加冰醋酸5ml，摇匀，以随行溶剂为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)，在547nm的波长处测定吸收度，计算，即得。
人参总皂苷重复性实验
Figure RE-G20061K0068X20060123D000281
人参总皂苷平均含量＝12.25mg/瓶；RSD＝1.83％。
结果表明，重复性良好。
7、回收率试验采用加样回收法，取装量差异项下本品5瓶，取内容物，混匀，从中取约50mg(共5份)，精密称定；取人参皂苷Rg1对照品约1.8mg，精密称定，共置10ml量瓶中，加水适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加水定至刻度，摇匀，精密量取0.2ml，，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，60℃水浴15分钟，取出，立即以冰水浴冷却2分钟，精密加冰醋酸5ml，摇匀，以随行溶剂为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)，在547nm的波长处测定吸收度，计算，即得。
注射用双参中总皂苷的含量：3.68％
人参总皂苷加样回收率实验
  编号   称量(mg)   供试品中  纯品量(mg)   纯品加入量  (mg)   吸收度   测量值(mg)   回收率(％)
  1   55.32   2.0358   1.87   0.389   3.8882   99.06
  2   54.41   2.0023   1.79   0.374   3.7383   96.98
  3   56.01   2.0612   1.76   0.381   3.8082   99.26
  4   52.13   1.9184   1.85   0.379   3.7882   101.07
  5   54.72   2.0137   1.82   0.385   3.8482   101.80
平均回收率＝99.43％  RSD＝1.65％
8、三批中试样品含量测定
三批中试样品人参总皂苷含量测定
  批号   总皂苷(mg/瓶)   测定次数  RSD(％)
  1批   12.13   3   1.41
  2批   11.83   3   1.37
  3批   12.27   3   0.12
根据三批样品含量测定结果暂定，本品每瓶含人参总皂苷以人参皂苷Rg1计不得少于8.0mg。
实验例13双参注射剂中丹参素、原儿茶醛的含量测定方法
1、仪器、试剂
仪器：
SHIMADZU    10A           高效液相色谱仪
普析通      TU-1810SPC    紫外/可见分光光度仪
SARTORIUS   BP211D        电子分析天平
KQ250DB                   超声波清洗机
试剂：
甲醇      分析纯    北京市通广精细化工公司
冰醋酸    分析纯    北京化学试剂公司
纯净水    娃哈哈
2、色谱分析条件
色谱仪：SHIMADZU       10A          HPLC
固定相：Kromasil-C18   250mm×4.6mm 5μm
流动相：甲醇-1％冰醋酸水溶液(13∶87)
流速：1ml/min
柱温：25℃
进样量：10μl
检测波长：280nm
3、系统适用性试验 根据上述仪器条件得到的丹参素钠、原儿茶醛对照品、样品色谱图，其理论板数以丹参素钠计算大于2500。样品中丹参素、原儿茶醛与相近峰分离清晰完全，分离度大于1.5。
4、阴性干扰试验 为考察其它药材是否干扰丹参素、原儿茶醛的测定，取阴性对照品(缺丹参)与供试品溶液同法制成阴性对照品溶液并测定。结果表明，阴性样品对丹参素、原儿茶醛的含量测定无干扰，
5、测定波长的选择 精密称取丹参素钠2.03mg、原儿茶醛1.86mg，分置100ml棕色量瓶中，加水适量使溶解并定至刻度，摇匀，在200nm～400nm的波长范围内进行扫描。结果表明，丹参素钠、原儿茶醛均在280nm处有最大吸收，因此选择280nm作为测定丹参素钠、原儿茶醛含量的检测波长。
6、线性关系的考察 精密称取丹参素钠8.65mg，原儿茶醛4.02mg，共置10ml棕色量瓶中，加水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取0.25、0.75、1.25、1.75、2.25ml，分置 10ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别从中精密吸取10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。分别以的量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标作图，绘制标准曲线。
丹参素钠
回归方程Y＝7910186.8208X-4661.7000
决定系数γ＝0.9999
丹参素钠在0.21625～1.94625μg范围内线性良好。
丹参素钠线性关系
  编号  丹参素钠量(μg)   峰面积
  1   0.21625   166983
  2   0.64875   509520.5
  3   1.08125   844328.5
  4   1.51375   1194569.5
  5   1.94625   1533237.5
原儿茶醛
回归方程Y＝2426365.1741X+2949.9000
决定系数γ＝0.9999
原儿茶醛在0.1005～0.9045μg范围内线性良好。
原儿茶醛线性关系
  编号  原儿茶醛量(μg)  峰面积
  1   0.1005  243789
  2   0.3015  732048
  3   0.5025  1228843
  4   0.7035  1716004
  5   0.9045  2190308
7、精密度和对照品溶液试验 精密称取丹参素钠8.58mg，原儿茶醛4.07mg，共置100ml棕色量瓶中，加水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，分别在0、2、6、10、24小时重复测定一次。
精密度和对照品溶液试验
Figure RE-G20061K0068X20060123D000311
Figure RE-G20061K0068X20060123D000321
结果表明，对照品溶液精密度良好，在24小时内稳定。
8、供试品溶液的稳定性试验 取装量差异项下本品5瓶，取内容物，混匀，从中精密称取42.83mmg，置10ml量瓶中，加水适量使溶解并定至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，分别在0、2、6、10、24小时重复测定。
供试品稳定性试验
  时间(h)   0   2   6   10   24   平均值  RSD(％)
  丹参素(mg/瓶)   5.77   5.78   5.81   5.78   5.80   5.79   0.26
  原儿茶醛(mg/瓶)   2.51   2.62   2.54   2.58   2.57   2.56   1.62
  合剂(mg/瓶)   8.28   8.4   8.35   8.36   8.37   8.35
结果表明，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
9、重复性试验 取装量差异项下本品5瓶，取内容物，混匀，从中取约40mg(5份)，精密称定，置10ml量瓶中，加水适量使溶解并定至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
重复性试验
  编号   1   2   3   4   5   平均值  RSD(％)
  丹参素(mg/瓶)   5.84   5.76   5.70   5.76   5.81   5.77   0.93
  原儿茶醛(mg/瓶)   2.48   2.53   2.57   2.49   2.51   2.52   1.42
  合剂(mg/瓶)   8.32   8.29   8.27   8.25   8.32   8.29
结果表明，供试品重复性良好。
10、加样回收率试验 采用加样回收法，取装量差异项下本品5瓶，取内容物，混匀，从中取约20mg(5份)，精密称定；精密称取丹参素钠对照品3.84mg，原儿茶醛对照品1.86mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，共置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，加水适量使溶解并定至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
注射用双参中丹参素含量为1.74％；
注射用双参中原儿茶醛含量为0.760％。
丹参素回收率
丹参素平均回收率＝98.54％  RSD＝1.28％
原儿茶醛回收率
  编号   称量  (mg)   供试品中  纯品量(mg)   纯品加入量  (mg)   测量值  (mg)   回收率  (％)
  1   24.07   0.1829   0.186   0.367   98.83
  2   23.75   0.1805   0.186   0.362   97.54
  3   24.01   0.1825   0.186   0.362   96.49
  4   22.54   0.1713   0.186   0.355   98.71
  5   22.98   0.1746   0.186   0.359   99.02
原儿茶醛平均回收率＝98.12％  RSD＝1.10％
12、三批中试样品含量测定
  批号   丹参素(mg/瓶)   原儿茶醛(mg/瓶)   合计(mg/瓶)
  1批   5.84   2.61   8.45
  2批   5.76   2.49   8.25
  3批   5.89   2.53   8.42
根据三批样品含量测定结果暂定，本品每瓶含丹参素(以丹参素钠计)不得少于2.5mg，含原儿茶醛不得少于1mg。
实验例14双参注射剂中总酚的含量测定方法
1、仪器、试药
(1)仪器
普析通     TU-1810SPC  紫外/可见分光光度仪
SARTORIUS  BP211D      电子分析天平
(2)试药
亚硝酸钠   分析纯    天津市化学试剂三厂
硝酸铝     分析纯    天津市化学试剂三厂
氢氧化钠   分析纯    天津市化学试剂三厂
纯净水     娃哈哈
2、检测波长的选择 精密称取原儿茶醛对照品9.35mg，置100ml量瓶中，加水适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加水至刻度，摇匀，精密量取3.0ml，置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，在700～400nm波长范围内进行扫描，结果表明，原儿茶醛在518nm处有最大吸收，空白无干扰，因此选择518nm为分光光度法测定注射用双参中总酚的检测波长。
3、线性关系的考察 精密称取原儿茶醛对照品10.85mg，置100ml量瓶中，加水适量超声处理(功率250W，频率33KHZ)使溶解，取出，放至室温，加水至刻度，摇匀，精密量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以随行溶剂为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)，在518nm的波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，浓度(μg/ml)为横坐标，绘制标准曲线。
回归方程Y＝0.0266X+0.0078；
决定系数γ＝0.9999；
原儿茶醛在4.34～21.70μg/ml范围线性良好。
原儿茶醛标准曲线测定数据
  编号   原儿茶醛(μg/ml)   吸收度
  1   4.34   0.121
  2   8.68   0.241
  3   13.02   0.354
  4   17.36   0.471
  5   21.70   0.583
4、精密度和对照品溶液稳定性试验 精密称取原儿茶醛对照品10.04mg，置100ml量瓶中，加水适量超声处理(功率250W，频率33KHZ)使溶解，取出，放至室温，加水至刻度，摇匀，精密量取3.0ml，置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V B)，以随行溶剂为空白， 在518nm的波长处测定吸收度，分别在0、5、10、20、30分钟时重复测定一次。
原儿茶醛精密度和稳定性实验
 时间(min)   0   5   10   20   30   X平均  RSD％
  吸光度   0.335   0.333   0.330   0.331   0.330   0.332  0.65
结果表明，对照品溶液精密度良好，在30分钟内稳定。
5、供试品溶液的稳定性实验 取装量差异项下本品5瓶，取内容物，混匀，从中精密称取52.33mg，置10ml量瓶中，加水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V B)，以随行溶剂为空白，在518nm的波长处测定吸收度，计算，即得，分别在0、5、10、20、30分钟时测定。
供试品溶液稳定性实验
  时间(min)   0   5   10   20   30   X平均  RSD％
  总酚(mg/瓶)   20.96   20.62   20.33   20.79   21.02   20.74  1.35
结果表明，供试品溶液在30分钟内稳定。
6、重复性试验 取装量差异项下本品5瓶，取内容物，混匀，从中取约50mg(5份)，精密称定，置10ml量瓶中，加水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V B)，以随行溶剂为空白，在518nm的波长处测定吸收度，计算，即得。
重复性实验
  编号   称量(mg)   吸收度   含量(mg/瓶)
  1   52.18   0.358   20.50
  2   55.69   0.367   19.69
  3   56.04   0.370   19.73
  4   51.08   0.348   20.36
  5   52.06   0.355   20.38
丹参总酚平均含量＝20.13mg/瓶；RSD＝1.93％
7、回收率试验 采用加样回收法，取装量差异项下本品(031101批)5瓶，取内容物 ，混匀，从中精密称取25mg(5份)，精密称定；取原儿茶醛对照品约1.5mg，精密称定，共置10ml量瓶中，加水适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加水定至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V B)，以随行溶剂为空白，在518nm的波长处测定吸收度，计算，即得。
注射用双参中总酚的含量：6.06％
加样回收率实验
  编号   供试品称量  (mg)   供试品中纯品量  (mg)   纯品加入量  (mg)   测量值  (mg)   回收率  (％)
  1   26.03   1.5774   1.67   3.2144   98.02
  2   24.96   1.5126   1.63   3.1336   99.45
  3   24.86   1.5065   1.52   2.9720   96.41
  4   26.63   1.6138   1.50   3.1246   100.72
  5   26.18   1.5856   1.59   3.1336   97.36
平均回收率＝98.39％  RSD＝1.73％
8、三批中试样品含量测定
  批号   丹参总酚(mg/瓶)   测定次数  RSD(％)
  1批   19.34   3   1.09
  2批   20.42   3   1.19
  3批   20.11   3   0.75
根据三批样品含量测定结果暂定，本品每瓶含丹参总酚以原儿茶醛计不得少于7.5mg。
实验例15双参注射剂中丹酚酸B的含量测定方法
1仪器与试药
仪器：Agilent1100高效液相色谱仪，chemstationsys工作站；
TU-1800SPC紫外分光光度计。
试药：丹酚酸B：中国药品生物制品检定所；
试剂均为分析纯；
色谱用试剂为色谱纯。
2检测波长的选择 精密称取丹酚酸B对照品适量，加75％甲醇溶解，在190-00nm波 长范围扫描。结果表明丹酚酸B在286nm处有最大吸收，因此选择286nm作为含量测定的检测波长。
3色谱条件
色谱柱：Dikma ODS(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：甲醇-乙腈-1.7％甲酸水溶液30∶10∶60；
检测波长：286nm；
柱温：30℃；
流速：1.0ml/min。
4系统适用性试验
4.1对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品适量，加75％甲醇制成每1ml含0.14mg的溶液，即得。
4.2供试品溶液的制备 取装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中取约0.4g，精密称定，置25ml量瓶中，加75％甲醇超声处理使溶解，取出，放至室温，加75％甲醇定至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45um)滤过，取续滤液作为供试品溶液。
4.3阴性供试品溶液的制备 称取不含丹参的阴性样品，照供试品溶液的制备方法制备，作为阴性供试品溶液。
4.4测定法 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。
根据上述条件得到丹酚酸B对照品色谱图、供试品色谱图，其理论板数n均大于2000。供试品中丹酚酸B色谱峰与相近峰分离清晰完全，分离度均大于1.5，阴性无干扰。
5线性关系 精密称取丹酚酸B对照品适量，加75％甲醇制成每1ml中含2.688mg的对照品溶液，精密量取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分置10ml量瓶中，加75％甲醇至刻度，摇匀，配制成0.053760mg/ml、0.10752mg/ml、0.16128mg/ml、0.21504mg/ml、0.26880mg/ml的对照品溶液。分别从中精密吸取10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定，记录峰面积。以丹酚酸B的量(μg)为纵坐标，峰面积为横坐标，绘制标准曲线。
丹酚酸B线性关系
Figure RE-G20061K0068X20060123D000381
回归方程：Y＝0.0008X+0.0046
相关系数：γ＝0.9999
结果表明，丹酚酸B在0.5376μg～2.6880μg之间线性关系良好。
经过计算，丹酚酸B标准曲线为一过原点的直线，因此选择外标一点法测定双参注射液中丹酚酸B的含量。
6精密度和对照品溶液稳定性试验 精密吸取丹酚酸B对照品溶液(0.1385mg/ml)10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，分别在0、2、4、6、10小时进样测定。
精密度和对照品溶液稳定性试验
 时间(h)   0   2   4   6   10   平均值  RSD(％)
  峰面积   1641.89   1648.19   1659.09   1672.85   1684.48   1661.30  1.05
结果表明，对照品溶液精密度良好，在10小时内稳定。
7供试品溶液稳定性试验取 装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中精密称取0.38557g，按供试品溶液的制备和测定法项下操作，分别在0、2、4、6、10小时进样测定。
供试品溶液稳定性试验结果
  时间(h)   0   2   4   6   10   平均值  RSD(％)
  含量(mg/瓶)   2.951   2.987   2.942   2.939   2.955   2.955  0.65
结果表明，供试品溶液在10小时内稳定性良好。
8重复性试验取 装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中取约0.4g，精密称定，按供试品溶液的制备和测定法项下操作，测定，即得。
重现性试验
  编号   1   2   3   4   5   平均值  RSD(％)
  含量(mg/瓶)   2.934   2.884   3.012   2.956   2.973   2.952  1.61
结果表明，重复性良好。
9加样回收率试验 精密量取本品5ml(共6份)，分置10ml量瓶中；精密吸取丹酚酸B对照品溶液(1.185mg/ml)1.5ml(共6份)，分置上述10ml量瓶中，加75％甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，测定，即得。
注射用双参中丹酚酸B含量0.8887％。
加样回收率试验
  编号  供试品称量(g)   供试品中  纯品量(mg)   纯品加入量(mg)   测得量  (mg)   回收率  (％)
  1   0.20498   1.8217   1.7775   3.575   98.64
  2   0.20093   1.7857   1.7775   3.516   97.35
  3   0.21704   1.9288   1.7775   3.690   99.07
  4   0.20556   1.8268   1.7775   3.573   98.26
  5   0.21029   1.8688   1.7775   3.586   96.59
  6   0.22033   1.9581   1.7775   3.690   97.43
平均回收率＝97.89％；RSD＝0.95％
10样品含量测定
  批号   丹酚酸B(mg/瓶)
  1批   3.015
  2批   2.948
  3批   2.991
根据三批样品含量测定结果暂定，本品每瓶含丹酚酸B不得少于1.2mg。
实验例16双参注射剂中丹参酮IIA的含量测定方法
1仪器与试药
仪器：SHIMADZU LC-2010AHT；
TU-1800SPC紫外分光光度计。
试药：丹参酮IIA：中国药品生物制品检定所；
试剂均为分析纯；
色谱用试剂为色谱纯。
2检测波长的选择 精密称取丹参酮IIA对照品适量，加甲醇溶解，在190-400nm波长范围扫描。结果表明丹参酮IIA在270nm处有最大吸收，因此选择270nm作为含量测定的检测波长。
3色谱条件
色谱柱：Dikma ODS(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：甲醇-1％冰醋酸水溶液75∶25；
检测波长：270nm；
柱温：30℃；
流速：1.0ml/min。
4系统适用性试验
4.1对照品溶液的制备 精密称取丹参酮IIA对照品适量，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。
4.2供试品溶液的制备 取双参注射液作为供试品溶液。
4.3阴性供试品溶液的制备 称取不含丹参的阴性样品，照供试品溶液的制备方法制备，作为阴性供试品溶液。
4.4测定法 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。
根据上述条件得到丹参酮IIA对照品色谱图、供试品色谱图，其理论板数n均大于2000。供试品中丹参酮IIA色谱峰与相近峰分离清晰完全，分离度均大于1.5，阴性无干扰。
5线性关系 精密称取丹参酮IIA对照品适量，加甲醇制成每1ml中含0.4112mg的对照品溶液，精密量取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配制成0.008224mg/ml、0.016448mg/ml、0.024672mg/ml、0.032896mg/ml、0.04112mg/ml的对照品溶液。分别从中精密吸取5μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定，记录峰面积。以丹参酮IIA的量(μg)为纵坐标，峰面积为横坐标，绘制标准曲线。
丹参酮IIA线性关系
  编号  峰面积  进样量(μg)
  1  292315   0.04112
  2  589654   0.08225
  3  874823   0.12336
  4  1170013   0.16448
  5  1465977   0.20560
回归方程：Y＝0.000000-0.000025
相关系数：γ＝0.9999
结果表明，丹参酮IIA在0.0411μg～0.2056μg之间线性关系良好。
6精密度和对照品溶液稳定性试验 精密吸取丹参酮IIA对照品溶液(0.02056mg/ml)5μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，分别在0、2、4、10、24小时进样测定。
精密度和对照品溶液稳定性试验
 时间(h)   0   2   4   10   24   平均值  RSD(％)
  峰面积   792038   794412   790868   787546   784935   789959  0.47
结果表明，对照品溶液精密度良好，在10小时内稳定。
7供试品溶液稳定性试验 精密吸取双参注射液5μl，注入液相色谱仪，记录峰面积。
供试品溶液稳定性试验结果
 时间(h)  0  1  2  3  4   平均值  RSD(％)
  峰面积  1780359  1740113  1767463  1770882  1759436   14763651  0.86
结果表明，供试品溶液在4小时内稳定性良好。
8重复性试验 精密吸取双参注射液5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
重现性试验
  编号   1   2   3   4   5   平均值  RSD(％)
  含量(mg/支)   0.2471   0.2502   0.2487   0.2513   0.2495   0.2494  0.64
结果表明，重复性良好。
9加样回收率试验 精密量取本品5ml(共6份)，分置10ml量瓶中；精密吸取丹参酮IIA对照品溶液(0.1256mg/ml)1ml(共6份)，分置上述10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，测定，即得。
双参注射液中丹参酮IIA含量0.2494mg/支。
加样回收率试验
  编号   供试品中纯品量(mg)   纯品加入量(mg)   测得量(mg)   回收率(％)
  1   0.1247   0.1256   0.247   97.31
  2   0.1247   0.1256   0.248   98.05
  3   0.1247   0.1256   0.247   97.24
  4   0.1247   0.1256   0.249   99.13
  5   0.1247   0.1256   0.248   98.56
  6   0.1247   0.1256   0.247   97.43
平均回收率＝97.95％；RSD＝0.79％
10样品含量测定
Figure RE-G20061K0068X20060123D000421
根据三批样品含量测定结果暂定，本品每瓶含丹参酮IIA不得少于0.1mg。
具体实施方式
实施例1：采用液相色谱法测定以丹参成分特征为主的指纹图谱：
(1)供试品溶液的制备：精密称取待测双参注射制剂适量，加水制成每1ml含10mg的溶液，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备：精密称取丹参素钠适量，加水制成每1ml含80μg的溶液，作为参照物溶液；
(3)色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为甲醇，流动相B为1％冰醋酸水溶液，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至80分钟，流动相A的比例由5％升至61％；流速为1.0ml/min，检测波长为280±2nm，柱温为25℃；
(4)标准指纹图谱的制定：以上述方法作为制定以丹参成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有14个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测注射剂中以丹参成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测注射剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，符合下列要求：
计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，为0.90～1.00；
实施例2：采用液相色谱法测定以红参成分特征为主的指纹图谱：
(1)供试品溶液的制备：取待测双参注射剂适量，加水制成每1ml含50mg的溶液，量取适量，上于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、10％乙醇溶液、20％乙醇溶液、25％乙醇溶液洗脱除杂后，用80％乙醇溶液洗脱，收集80％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用水适量使溶解并定至合适浓度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备：取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为参照物溶液；
(3)色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至25分钟，流动相A的比例由19升至20％ ，从25分钟至60分钟，流动相A的比例由20％升至40％，从60分钟至70分钟，流动相A的比例由40％升至45％，流速为1.2ml/min、检测波长为203±2nm，柱温40℃；
(4)标准指纹图谱的制定：以上述方法作为制定以红参成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有5个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测药物组合物中以红参或人参成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，符合下列要求：
计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，为0.90～1.00；
实施例3：采用液相色谱法测定以丹参成分特征为主的指纹图谱：
(1)供试品溶液的制备：精密称取待测双参注射制剂适量，加甲醇制成每1ml含10mg的溶液，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备：精密称取原儿茶醛适量，加水制成每1ml含40μg的溶液，作为参照物溶液；
(3)色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为1％冰醋酸水溶液，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至80分钟，流动相A的比例由4％升至40％；流速为1.0ml/min，检测波长为280±2nm，柱温为25℃；
(4)标准指纹图谱的制定：以上述方法作为制定以丹参成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有15个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测注射剂中以丹参成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测注射剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，符合下列要求：
I.计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，为0.90～1.00；
II.待测注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不超过总峰面积的5％；
III.待测注射剂指纹图谱中有15％～40％的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，其差值不大于±30％。
实施例4：采用液相色谱法测定以人参成分特征为主的指纹图谱：
(1)供试品溶液的制备：取待测双参注射剂适量，加水制成每1ml含50mg的溶液，量取适量，上于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、20％乙醇溶液、25％乙醇溶液洗脱除杂后，用85％乙醇溶液洗脱，收集85％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用甲醇适量使溶解并定至合适浓度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备：取人参皂苷Rb1对照品，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，作为参照物溶液；
(3)色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料：流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸溶液，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至25分钟，流动相A的比例由22升至25％，从25分钟至60分钟，流动相A的比例由25％升至45％，从60分钟至70分钟，流动相A的比例由45％升至48％，流速为1.1ml/min、检测波长为203±2nm，柱温40℃；
(4)标准指纹图谱的制定：以上述方法作为制定以红参或人参成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有7个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测药物组合物中以红参或人参成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，符合下列要求中的全部：
I.计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，为0.90～1.00；
II.待测注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不超过总峰面积的5％；
III.待测注射剂指纹图谱中有80％～100％的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，其差值不大于±30％。
实施例7：冻干粉针中丹参、丹参酮IIA的薄层色谱鉴别：
取待测冻干粉针适量，加乙醚提取，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯溶解，作为供试品溶液；丹参对照药材溶液的制备：取丹参对照药材，加乙醚提取，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备：取丹参酮IIA对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯19∶1为展开剂，展开，取出，晾干，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例8：冻干粉针中丹参酮IIA的液相色谱鉴别：
取待测冻干粉针适量，置量瓶中，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照；采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-1％冰醋酸水溶液75∶25为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为270nm，柱温为30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例9：冻干粉针中丹酚酸B的薄层色谱鉴别：
取待测冻干粉针适量，加75％甲醇溶液溶解，作为供试品溶液；以丹酚酸B或其镁盐对照品的75％甲醇溶液为对照；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸2∶3∶4∶0.5∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯254nm检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
实施例10：葡萄糖输液剂中丹酚酸B的液相色谱鉴别：
取待测冻干粉针适量，置量瓶中，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；取丹酚酸B或其镁盐对照品的75％甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-1.7％甲酸水溶液30∶10∶60为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为286nm，柱温25℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例11：冻干粉针中丹参素、原儿茶醛的薄层色色谱鉴别：
取待测冻干粉针适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取丹参素钠和原儿茶醛对照品中，分别加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸8∶7∶2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以新鲜配制的2％三氯化铁与1％铁氰化钾等体积的混合液，在日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例12：冻干粉针中丹参素、原儿茶醛的液相色谱鉴别：
取待测冻干粉针适量，置量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参素钠、原儿茶醛对照品的水溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-1％冰醋酸水溶液13∶87为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm，柱温30℃，供试品色谱中，与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例13：冻干粉针中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re的薄层色谱鉴别：
取待测冻干粉针适量，用水溶解后用氨饱和的正丁醇提取，滤过，滤液挥干，残渣用甲 醇溶解，作为供试品溶液；对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水7.5∶2∶0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试剂，105℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例14：氯化钠输液剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re的液相色谱鉴别：
取待测双参注射剂适量，加水制成每1ml含50mg的溶液，量取适量，上于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、10％乙醇溶液、20％乙醇溶液、25％乙醇溶液洗脱除杂后，用80％乙醇溶液洗脱，收集80％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用水适量使溶解并定至合适浓度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.05％磷酸溶液21∶79为流动相；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例15：冻干粉针中丹参、丹参酮IIA的薄层色谱鉴别：
取待测冻干粉针适量，加三氯甲烷提取，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯溶解，作为供试品溶液；丹参对照药材溶液的制备：取丹参对照药材，加三氯甲烷提取，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备：取丹参酮IIA对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯19∶1为展开剂，展开，取出，晾干，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例16：冻干粉针中丹参酮IIA的液相色谱鉴别：
取待测冻干粉针适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照；采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸水溶液70∶30为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为270nm，柱温为30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例17：冻干粉针中丹酚酸B的薄层色谱鉴别：
取待测冻干粉针适量，加80％甲醇溶液溶解，作为供试品溶液；以丹酚酸B对照品的80％甲醇溶液为对照；采用薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄 层板上，以苯-二氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸2∶3∶4∶0.5∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯254nm检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
实施例18：冻干粉针中丹酚酸B镁盐的液相色谱鉴别：
取待测冻干粉针适量，置量瓶中，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；取丹酚酸B镁盐对照品的80％甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-1.5％甲酸水溶液25∶15∶60为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为286nm，柱温25℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例19：冻干粉针中丹参素、原儿茶醛的薄层色色谱鉴别：
取待测冻干粉针适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取丹参素钠和原儿茶醛对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸9∶6∶2.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以新鲜配制的2％三氯化铁与1％铁氰化钾等体积的混合液，在日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例20：冻干粉针中丹参素、原儿茶醛的液相色谱鉴别：
取待测冻干粉针适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参素钠、原儿茶醛对照品的水溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸水溶液10∶90为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm，柱温30℃，供试品色谱中，与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例21：冻干粉针中红参或人参、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf的薄层色谱鉴别：
取待测冻干粉针适量，用水溶解后用氨饱和的醋酸乙酯提取，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇溶解，作为供试品溶液；红参或人参对照药材溶液的制备：取红参或人参对照药材适量，加二氯甲烷回流提取，弃去二氯甲烷液，残渣加水饱和正丁醇提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf对照品，分别加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-水7.5∶2∶0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试剂，105℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试 品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例22：冻干粉针中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re的液相色谱鉴别：
取待测双参注射剂适量，加水制成每1ml含50mg的溶液，量取适量，上于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、5％乙醇溶液、15％乙醇溶液、20％乙醇溶液、25％乙醇溶液洗脱除杂后，用85％乙醇溶液洗脱，收集85％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用水适量使溶解并定至合适浓度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至35分钟，乙腈的比例为19％，从35分钟至55分钟，乙腈的比例由19％上升至29％，从55分钟至70分钟，乙腈的比例为29％，从70分钟至100分钟，乙腈的比例由29％升至40％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例23：注射液中丹参、丹参酮IIA的薄层色谱鉴别：
取待测注射液适量，加醋酸乙酯提取，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯溶解，作为供试品溶液；丹参对照药材溶液的制备：取丹参对照药材，加醋酸乙酯提取，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备：取丹参酮IIA对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以二甲苯-三氯甲烷19∶2为展开剂，展开，取出，晾干，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例24：注射液中丹参酮IIA的液相色谱鉴别：
取待测注射液作为供试品溶液；以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照；采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-0.1％磷酸水溶液75∶25为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为270nm，柱温为30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例25：注射液中丹酚酸B镁盐的薄层色谱鉴别：
取待测注射液适量，挥干，残渣加甲醇溶液溶解，作为供试品溶液；以丹酚酸B镁盐对照品的甲醇溶液为对照；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以二甲苯-三氯甲烷-甲酸乙酯-丙酮-乙酸3∶3∶5∶4∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯254nm检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位 置上，显相同颜色的斑点；
实施例26：注射液中丹酚酸B的液相色谱鉴别：
取待测注射液适量，置量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；取丹酚酸B对照品的乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-1.8％冰醋酸水溶液30∶10∶60为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为286nm，柱温25℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例27：注射液中丹参素、原儿茶醛的薄层色色谱鉴别：
取待测注射液适量，挥干，残渣用乙醇溶解并定至合适浓度，摇匀，作为供试品溶液；另取丹参素钠和原儿茶醛对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸9∶6∶2.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以新鲜配制的2％三氯化铁与1％铁氰化钾等体积的混合液，在日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例28：注射液中丹参素、原儿茶醛的液相色谱鉴别：
取待测注射液适量，置量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参素钠、原儿茶醛对照品的乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-0.5％冰醋酸水溶液13∶87为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm，柱温30℃，供试品色谱中，与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例29：注射液中人参、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf的薄层色谱鉴别：
取待测注射液适量，用氨饱和的正丁醇提取，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇溶解，作为供试品溶液；人参对照药材溶液的制备：取人参对照药材适量，加二氯甲烷回流提取，弃去二氯甲烷液，残渣加水饱和正丁醇提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf对照品，分别加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水10∶3∶0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试剂，105℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例30：注射液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re的液相色谱鉴别：
量取待测双参注射剂适量，上于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、15％乙醇溶液、27％乙醇溶液洗脱除杂后，用95％乙醇溶液洗脱，收集95％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用水适量使溶解并定至合适浓度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.2％磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至35分钟，乙腈的比例为19％，从35分钟至55分钟，乙腈的比例由19％上升至29％，从55分钟至70分钟，乙腈的比例为29％，从70分钟至100分钟，乙腈的比例由29％升至40％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例31：冻干粉针中丹参素、原儿茶醛的含量测定：
取待测冻干粉针适量，置量瓶中，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。以丹参素钠、原儿茶醛对照品的水溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-1％冰醋酸水溶液13∶87为流动相，检测波长为280nm，柱温30℃，以外标一点法进行计算，待测冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下几项：
(1)每单位量含丹参素的限度不得少于4.5mg；
(2)每单位量含原儿茶醛的限度不得少于2mg；
(3)每单位量含丹参素和原儿茶醛的总和的限度不得少于6.5mg。
实施例32：冻干粉针中总酚含量测定：
取待测冻干粉针适量，加水制成每1ml含2.5mg的溶液，摇匀，精密量取1ml，置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以原儿茶醛作为对照品，同法制得对照品溶液；以随行溶剂为空白，照分光光度法，在518nm处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总酚的限度以原儿茶醛计，不得少于15.0mg。
实施例33：冻干粉针中丹酚酸B含量测定：
取待测冻干粉针适量，置量瓶中，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹酚酸B或其镁盐对照品的75％甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-1.7％甲酸水溶液30∶10∶60为流动相，流 速为1.0ml/min，检测波长为286nm，柱温25℃；以外标一点法进行计算，待测冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含丹酚酸B的限度不得少于2.4mg。
实施例34：冻干粉针中丹参酮IIA的含量测定：
取待测冻干粉针适量，置量瓶中，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照；采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-1％冰醋酸水溶液75∶25为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为270nm，柱温为30℃；以外标一点法进行计算，待测冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含丹参酮IIA的限度不得少于0.2mg。
实施例35：冻干粉针中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re的含量测定：
取待测双参注射剂适量，加水制成每1ml含50mg的溶液，量取适量，上于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、10％乙醇溶液、20％乙醇溶液、25％乙醇溶液洗脱除杂后，用80％乙醇溶液洗脱，收集80％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用水适量使溶解并定至合适浓度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.05％磷酸溶液21∶79为流动相；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；以外标一点法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为：
每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Re的总和的限度不得少于1.15mg。
实施例36：冻干粉针中注射剂中总皂苷的含量测定：
取待测冻干粉针适量，置10ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取0.6ml，至25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液0.5ml，高氯酸2.0ml，摇匀，60℃水浴上加热15分钟，取出，立即以冰水浴冷却2分钟，用冰醋酸定至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用分光光度法，在547nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以人参皂苷Rg1计，不得少于8.0mg。
实施例37：冻干粉针中丹参素、原儿茶醛的含量测定：
取待测冻干粉针适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参素钠、原儿茶醛对照品的水溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸水溶液10∶90为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm，柱温30℃，以外标一点法进行计算，待测冻干粉针以相当于每日用成品量为单位 量，含量限度应为：
每单位量含丹参素和原儿茶醛的总和的限度不得少于3.25mg。
实施例38：冻干粉针中总酚含量测定：
取待测冻干粉针适量，加水制成每1ml含2.5mg的溶液，摇匀，精密量取1ml，置25ml量瓶中，加水至10ml，加10％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液2ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以芦丁作为对照品，同法制得对照品溶液；以随行溶剂为空白，照分光光度法，在518nm处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总酚的限度以芦丁计，不得少于7.5mg。
实施例39：冻干粉针中丹酚酸B含量测定：
取待测冻干粉针适量，置量瓶中，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；取丹酚酸B对照品的80％甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-1.5％甲酸水溶液25∶15∶60为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为286nm，柱温25℃；以外标一点法进行计算，待测冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含丹酚酸B或其镁盐的限度不得少于1.2mg。
实施例40：冻干粉针中丹参酮IIA的含量测定：
取待测冻干粉针适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照；采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸水溶液70∶30为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为270nm，柱温为30℃；以外标一点法进行计算，待测冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含丹参酮IIA的限度不得少于0.1mg。
实施例41：冻干粉针中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re的含量测定：
取待测双参注射剂适量，加水制成每1ml含50mg的溶液，量取适量，上于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、5％乙醇溶液、15％乙醇溶液、20％乙醇溶液、25％乙醇溶液洗脱除杂后，用85％乙醇溶液洗脱，收集85％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用水适量使溶解并定至合适浓度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至35分钟，乙腈的比例为19％，从35分钟至55分钟，乙腈的比例由19％上升至29％，从55分钟至70分钟，乙腈的比例为29％，从70分钟至100分钟，乙腈的比例由29％升至40％；流速为 1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；以外标一点法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下几项：
(1)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于0.35mg；
(2)每单位量含人参皂苷Re的限度不得少于0.17mg；
(3)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于0.2mg；
(4)每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Re的总和的限度不得少于0.52mg。
实施例42：冻干粉针中注射剂中总皂苷的含量测定：
取待测冻干粉针适量，置10ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取0.6ml，至25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液1ml，高氯酸2.0ml，摇匀，65℃水浴上加热10分钟，取出，立即以冰水浴冷却5分钟，用冰醋酸定至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以人参皂苷Rb1为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在547nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测双参注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以人参皂苷Rb1计，不得少于4.0mg。
实施例43：注射液中丹参素的含量测定：
取待测注射液适量，置量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以丹参素钠对照品的乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-0.5％冰醋酸水溶液13∶87为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm，柱温30℃，以外标一点法进行计算，待测注射液以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为：每单位量含丹参素的限度不得少于4.5mg。
实施例44：注射液中总酚含量测定：
取待测注射液1ml，置20ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1ml，置25ml量瓶中，加水至5ml，加5％亚硝酸钠溶液2ml，摇匀，放置6分钟，加5％硝酸铝溶液5ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以丹参素钠作为对照品，同法制得对照品溶液；以随行溶剂为空白，照分光光度法，在518nm处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测注射液以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总酚的限度以丹参素钠计，不得少于15.0mg。
实施例45：注射液中丹酚酸B镁盐含量测定：
取待测注射液适量，置量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；取丹酚酸B镁盐对照品的乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷 基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-1.8％冰醋酸水溶液30∶10∶60为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为286nm，柱温25℃；以外标一点法进行计算，待测注射液以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含丹酚酸B镁盐的限度不得少于2.4mg。
实施例46：注射液中丹参酮IIA的含量测定：
取待测注射液作为供试品溶液；以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照；采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-0.1％磷酸水溶液75∶25为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为270nm，柱温为30℃；以外标一点法进行计算，待测注射液以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含丹参酮IIA的限度不得少于0.2mg。
实施例47：注射液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re的含量测定：
量取待测双参注射剂适量，上于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、15％乙醇溶液、27％乙醇溶液洗脱除杂后，用95％乙醇溶液洗脱，收集95％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用水适量使溶解并定至合适浓度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.2％磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至35分钟，乙腈的比例为19％，从35分钟至55分钟，乙腈的比例由19％上升至29％，从55分钟至70分钟，乙腈的比例为29％，从70分钟至100分钟，乙腈的比例由29％升至40％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；以外标一点法进行计算，待测注射液以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为：
每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re的总和的限度不得少于1.44mg。
实施例48：注射液中注射剂中总皂苷的含量测定：
取待测注射液适量，置10ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取0.6ml，至25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加10％香草醛-冰醋酸溶液1ml，高氯酸3.0ml，摇匀，50℃水浴上加热20分钟，取出，立即以冰水浴冷却5分钟，用冰醋酸定至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以人参皂苷Re为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在550nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测注射液以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以人参皂苷Rb1计，不得少于8.0mg。
实施例49：冻干粉针中总酚含量测定：
取待测冻干粉针适量，加水制成每1ml含2.5mg的溶液，摇匀，精密量取1ml，置25ml量瓶中，加水至10ml，加10％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液2ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以丹酚 酸B作为对照品，同法制得对照品溶液；以随行溶剂为空白，照分光光度法，在518nm处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总酚的限度以丹酚酸B计，不得少于7.5mg。

Claims (2)

1.一种双参注射剂的指纹图谱检测方法，其特征在于：该方法包括如下内容：
a、采用液相色谱法测试以丹参成分特征为主的指纹图谱：
(1)供试品溶液的制备：取待测双参注射制剂适量，加水或甲醇或乙醇溶解或稀释，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备：取适量丹参药材中的主要活性成分对照品，包括丹参素或其钠盐、原儿茶醛、丹酚酸B或其镁盐中的一种，用水或甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；
(3)色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料：流动相为乙腈或甲醇-0.01mol/L～2mol/L磷酸二氢钠水溶液或0.01mol/L～2mol/L磷酸二氢钾水溶液或0.01mol/L～2mol/L磷酸氢二钠水溶液或水或0.1％～5％冰醋酸溶液或0.1％～5％甲酸溶液或0.02％～5％磷酸溶液，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min、检测波长为190～410nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内；
(4)标准指纹图谱的制定：以上述方法作为制定以丹参成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～40个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测注射剂中以丹参成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部：
I.计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00；
II.待测注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％；
III.待测注射剂指纹图谱中有10％～50％的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±50％；
b、采用液相色谱法测试以红参或人参成分特征为主的指纹图谱：
(1)供试品溶液的制备：取待测双参注射制剂适量，加水溶解后上于已处理好的大孔吸附树脂柱，依次用水、梯度乙醇溶液除杂后，再用50％～无水乙醇溶液洗脱，收集50％～无水乙醇洗脱部分，挥干，残渣用水或甲醇或乙醇或流动相溶解并定至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备：取适量红参或人参药材中的主要活性成分对照品，包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf中的一种，用水或甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；
(3)色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料：流动相为乙腈或甲醇-水或0.1％～5％冰醋酸或0.1％～5％甲酸或0.005％～5％磷酸溶液，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min、检测波长为190～410nm范围内的一个或几个或蒸发光散射检测器检测，柱温在20～60℃范围内；
(4)标准指纹图谱的制定：以上述方法作为制定以红参或人参成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～20个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测药物组合物中以红参或人参成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部：
I.计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00；
II.待测注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％；
III.待测注射剂指纹图谱中有50％～100％的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±50％。
2.按照权利要求1所述的双参注射剂的指纹图谱检测方法，其特征在于该方法包括如下内容：
a、采用液相色谱法测试以丹参成分特征为主的指纹图谱：
(1)供试品溶液的制备：精密称取待测双参注射制剂适量，加水制成每1ml含10mg的溶液，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备：精密称取丹参素钠适量，加水制成每1ml含80μg的溶液，作为参照物溶液；
(3)色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为甲醇，流动相B为1％冰醋酸水溶液，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至80分钟，流动相A的比例由5％升至61％；流速为1.0ml/min，检测波长为280±2nm，柱温为25℃；
(4)标准指纹图谱的制定：以上述方法作为制定以丹参成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有10～20个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测注射剂中以丹参成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测注射剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部：
I.计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；
II.待测注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；
III.待测注射剂指纹图谱中有15％～40％的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±30％；
b、采用液相色谱法测试以红参或人参成分特征为主的指纹图谱：
(1)供试品溶液的制备：取待测双参注射剂适量，加水制成每1ml含50mg的溶液，量取适量，上于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、10％乙醇溶液、20％乙醇溶液、25％乙醇溶液洗脱除杂后，用80％乙醇溶液洗脱，收集80％乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣用水适量使溶解并定至合适浓度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备：取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为参照物溶液；
(3)色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至25分钟，流动相A的比例由19升至20％，从25分钟至60分钟，流动相A的比例由20％升至40％，从60分钟至70分钟，流动相A的比例由40％升至45％，流速为1.2ml/min、检测波长为203±2nm，柱温40℃；
(4)标准指纹图谱的制定：以上述方法作为制定以红参或人参成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～15个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测药物组合物中以红参或人参成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
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I.计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；
II.待测注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；
III.待测注射剂指纹图谱中有80％～100％的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±30％。
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