CN104198637A

CN104198637A - 一种基于山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷含量鉴别蜂花粉的方法

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Publication number: CN104198637A
Application number: CN201410403985.2A
Authority: CN
Inventors: 周金慧; 李熠; 孙丽萍; 吴黎明; 徐响
Original assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-08-15
Filing date: 2014-08-15
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2034-08-15
Also published as: CN104198637B

Abstract

本发明涉及一种基于山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷含量鉴别蜂花粉的方法，包括以下步骤：标准工作液的配制、蜂花粉的前处理方法和液相色谱-串联质谱法检测。本发明提供了一种高效、稳定、重复性好，准确的鉴别五种蜂花粉的方法，对于加强蜂花粉种类鉴别的研究，探索蜂花粉溯源信息，以及开发我国传统中医药物，提高我国蜂花粉质量，保证消费者的健康等具有重要的意义。

Description

一种基于山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷含量鉴别蜂花粉的方法

技术领域

本发明涉及蜂花粉的鉴别方法，具体涉及一种基于山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷含量鉴别蜂花粉的方法。

背景技术

蜂花粉是蜜蜂从蜜源植物的雄蕊中采集的花粉，加上蜜蜂自身的腺上分泌物、唾液和花蜜形成的不规则扁圆形的团状物。

蜂花粉含有多种氨基酸、维生素、矿物元素、不饱和脂肪酸、有机酸、蛋白质、脂类、碳水化合物，多酚类和黄酮类物质、多糖、酶类、核酸、激素等活性物质，具有丰富的营养价值。蜂花粉因其成分多样而富有多种活性功能，不仅对治疗贫血有特殊的疗效，对于治疗前列腺疾病也有较好的疗效；还具有抗癌、抗辐射、降血脂、防治心脑血管疾病的作用；此外，蜂花粉对于治疗习惯性便秘、胃肠病、肝病、神经衰弱均有功效；同时，蜂花粉对保护皮肤和美容有明显的作用，可除去多余的脂肪达到减肥美体的目的，其提取物还具有保湿、抗氧化、调理皮肤和头发的功效(孙丽萍，田文礼，朱晓丽等.蜂花粉功能食品的研究思路.中国养蜂，2006，57(10):39-40)。

蜂花粉中各成分的含量如下：蛋白质20-25％、碳水化合物40-50％、脂肪5-10％、矿物质2-30％、木质素10-15％、未知物质10-15％，黄酮类物质是蜂花粉中重要的功效组分，也是保健食品中的有效成分。

目前一些不法商家将价格较低的蜂花粉掺入价格较高的蜂花粉中赚取高额利润，但是由于大多数的蜂花粉颜色，味道非常相近，所以很难对市场的蜂花粉进行鉴别。通常根据植物来源对蜂花粉进行分类，所以不同蜂花粉之间的营养成分和生物学功能均存在一定差异。

已有的研究报道中鉴别花粉品种的方法为：感官检验，显微镜镜检，比色法、紫外分光光度法、高效液相色谱-大气压电离质谱法(LC-TSP-MS)、胶束毛细管电泳法(MECC)和高效液相色谱法(HPLC)。其中：

感官检验主要通过眼看蜂花粉的颜色和品尝味道来鉴别种类，但是很多蜂花粉颜色差异比较小乃至肉眼很难分辨，不同的人观察后也会认为是不同的颜色；一些种类的蜂花粉均具有微甜的味道，很难通过品尝分辨其种类，所以该方法最大的缺点是鉴别能力的准确度低，容易受人为因素的影响；

在电子显微镜下来源于不同植物的花粉大小和形状存在一定的差异，因此，可以通过显微镜下的轮廓图鉴定植物的种类。但是在显微镜下很多蜂花粉的形态非常接近，这容易造成鉴别方法主观性强，准确性低；

比色法是在碱性溶液中加Al³⁺与3-羟基黄酮、5-羟基黄酮进行络合反应，利用颜色和含量关系进行比色测定的方法，该法用于组成单一的标准对照物时，结果准确，但当应用于组分复杂的植物试样时，比如花粉黄酮提取液，由于受到花色素、鞣酸及其它酚性成分等多种物质的干扰，而且底液常常出现浑浊现象，因此测定结果明显偏高，而且测定结果重现性不好。

紫外分光光度法：是利用黄酮类化合物在紫外区有较强吸收，利用适当的对照品进行黄酮的测定。为了消除一些水溶性的强极性物质的干扰，将样品用聚酰胺进行了分离提纯，再采用紫外分光光度法测定，此为聚酰胺-紫外分光光度法。

高效液相色谱法：一种方法是采用样品直接进样，梯度洗脱，高效液相色谱分析，测定样品所含黄酮苷类成分，但是由于黄酮苷类种类多，不可能一次分离，而且很多都没有标准对照物可对照，很难定量；另一种方法是通过测定水解苷元含量来计算黄酮苷的量，其测定原理是：蜂花粉黄酮主要成分是以黄酮苷形式存在，经酸水解后生成黄酮醇类化合物，其主要是槲皮素、异鼠李素和山奈酚三种成分，，用HPLC分离测定这三种苷元的含量，再用计算方式转换成相应蜂花粉黄酮苷的含量。

利用薄层色谱法可分离分析蜂花粉中的维生素，由斑点的数目、形状、颜色、荧光及Rf值比较，从而鉴别蜂花粉种类(杨梦兰，李忠奇，王伟等.TLC法鉴别花粉种类，广东公安科技，2000，3：16-19)，但是该方法中使用了大量的具有挥发性的有毒有害试剂，如氯仿，冰醋酸，二氯甲烷和氨水等，而且根据Rf值和颜色鉴别也具有主观性强，准确性低等缺点。

此外，采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)结合二阶导数谱和热扰动下的二维相关红外光谱技术对6种不同花粉，即杏花花粉、油菜花粉、茶花花粉、西瓜花粉、荷花花粉和虞美人花粉，进行了快速无损的鉴别(吴杰，周群，吴黎明等.六种蜂花粉的红外光谱三级鉴别研究，光谱学与光谱分析，2010，30(2)：353-357)，但是该方法需要实验人员具有丰富的结构解析的经验，所以红外光谱法不适合普通检测人员对蜂花粉种类进行鉴别，而且该方法只能用于定性分析，不能定量分析。

山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷，如式Ⅰ所示

至今，尚未见到将山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷用作蜂花粉鉴别的报道。

发明内容

本发明的目的是利用无毒或毒性较小的试剂从不同种类的蜂花粉中提取特征活性组分，然后对其进行定性和定量分析，根据蜂花粉中特征性组分的含量差异来准确鉴别蜂花粉的种类。

本发明提供的一种基于山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷含量鉴别蜂花粉的方法，包括以下步骤：标准工作液的配制、蜂花粉的前处理方法和液相色谱-串联质谱法检测。

所述蜂花粉的前处理方法为加速溶剂萃取法(accelerated solventextraction,ASE)，具体包括以下步骤：蜂花粉用65-70％的甲醇溶液萃取，循环提取2次；

优选地，所述蜂花粉的前处理方法包括以下步骤：蜂花粉用65-70％的甲醇溶液萃取，萃取压力为8.0-9.5MPa，萃取温度为130-135℃，萃取时间为15-20min，循环提取2次。

进一步优选，所述蜂花粉的前处理方法包括以下步骤：称取粉碎均匀的蜂花粉，用其重量2-6倍体积的65-70％甲醇萃取，萃取压力为8.0-9.5MPa，萃取温度为130-135℃，萃取时间为15-20min，循环提取2次。

所述蜂花粉的粒径为100-150μm；

所述甲醇的用量为蜂花粉重量的2.3-5.7倍量体积。

所述液相色谱-串联质谱条件的条件为：流动相为0.1％的甲酸和乙腈溶液；C18色谱柱，柱温为30℃；流速为0.2mL/min；进样量为5.0μL；洗脱条件见表1；雾化器温度：350℃，雾化器流速：6L/min，雾化器压力35psi，毛细管电压:3500V，鞘流气温度:350℃，鞘流气流速:9L/min，锥孔电压:1000V。

所述液相色谱-串联质谱条件的条件中的洗脱梯度表为：

时间(分钟)	A相(0.1％甲酸溶液)	B相(乙腈)
			0	90	10
1.0	90	10
			6.0	78	22
9.0	78	22
			9.10	90	10
15.0	90	10

具体的，该方法包括以下步骤：

1)标准贮备液(2.0mg/mL)的配制：准确称取标准物质山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷50.0mg，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，充分摇匀，配制成2.0mg/mL的标准贮备液，备用；

2)标准工作液的配制：取适量标准贮备液于10mL容量瓶中，用甲醇依次稀释定容，配制成以下系列标准工作液：1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL，100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL，备用；

3)蜂花粉样品前处理方法：称取粉碎均匀的蜂花粉样品12份，每份1.5±0.1g置于萃取池中，分别加入7.0-8.5mL65-70％的甲醇溶液，萃取压力为8.0-9.5MPa，萃取温度为130-135℃，萃取时间为15-20min，循环提取2次，将提取液用甲醇定容至50mL，吸取100μL蜂花粉试样溶液用纯水稀释10倍后过0.22μm滤膜，取1.0mL待分析；

4)液相色谱-串联质谱条件：流动相为0.1％的甲酸和乙腈溶液；洗脱条件见表1；C18色谱柱，柱温为30℃；流速为0.2mL/min；进样量为5.0μL；洗脱条件见表1；雾化器温度：350℃，雾化器流速：6L/min，雾化器压力35psi，毛细管电压:3500V，鞘流气温度:350℃，鞘流气流速:9L/min，锥孔电压:1000V.标准物质山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的母离子为611.2，定量离子为449.1(碰撞能量为8V)，定性离子为287.1(碰撞能量为20V)，驻留时间为100ms，传输电压为100v；

表1：液相梯度洗脱表

时间(分钟)	A相(0.1％甲酸溶液)	B相(乙腈)
			0	90	10
1.0	90	10

6.0	78	22
			9.0	78	22
9.10	90	10
			15.0	90	10

5)测定方法，包括定性测定和定量测定。

其中：

所述定性测定具体为：根据蜂花粉试样溶液中待测物质的含量，选择峰面积相近的标准工作液和样品溶液等体积参插进样，通过色谱保留时间与质谱选择离子共同定性，样品中待测物质与标准物质的保留时间相对偏差不大于1％，而且其选择离子的相对丰度的差异不大于10％；

所述定量测定为：分别取适量蜂花粉试样溶液和相应浓度的标准工作液，作单点校准或多点校准，以色谱峰面积积分值定量，标准工作液及试样液中药物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，试样液进样过程中应参插标准工作液，以便准确定量。

本发明提供的方法具有以下优点：

1、蜂花粉中的成分复杂，不同的成分具有不同的活性

山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷是从具有保肝活性的混合组分中分离出的单一组分，该组分是很偶然的从具有保肝活性的组分中通过继续分离得到的，纯度也很高，然后对蜂花粉进行前处理，然后利用仪器分析方法对其进行定性和定量分析，发现很多蜂花粉中都含有该组分，而且同种蜂花粉中含量差异较小，不同种蜂花粉的含量差异很大，且含量范围无任何交集，所以觉得可以作为一个指标来鉴别这几种蜂花粉。

2、本发明利用少量的提取溶剂，在一定的压力，温度条件下，从不同种类的蜂花粉中提取特征活性组分，其中含有的山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷是从具有保肝活性的混合组分中分离出的单一组分，然后对其进行定性和定量分析，根据蜂花粉中特征性组分的含量差异来准确鉴别蜂花粉的种类，其技术关键点在于：

1)采用65-70％的甲醇溶液作为提取溶剂，可获得最大的提取效率；当甲醇浓度超过70％后，提取效率没有明显的增加。

2)萃取压力范围为8.0-9.5MPa。高压主要用于维持溶剂在高温下始终处于液体状态,同时,升高压力还可以增加溶剂对样品的穿透能力，在8.0-9.5MPa条件下甲醇即处于液体状态而且不显著差异。

3)萃取温度为130-150℃。随着萃取温度的升高总黄酮提取率依次升高，在升至150℃之后，提取率的影响变化不显著。

4)萃取时间为15-20min。在低于20min的时间范围内,随着提取时间的延长,提取效率有一定的提高，超过20min后，提取效率变化不显著。

5)循环提取2次可获得最高的提取效率。增加提取的循环次数可以增加提取效率，然而循环2次以上对提取率的影响差异不大，且循环次数越多耗费时间越长，使萃取效率大大降低，故循环次数以2次为宜。

6)蜂花粉试样溶液在利用液相色谱-串联质谱仪分析前需使用纯水稀释，否则产生色谱图不对称导致定量不准确。

7)流动相中需要加入0.1％甲酸，为待测物提供酸性环境，提供质子，提高离子化效率。

8)在分析蜂花粉试样溶液过程中，只有含有两个子离子，且相对丰度的差异不大于10％，保留时间相对偏差不大于1％情况下才认定含有待测物山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷。

3、本发明利用ASE技术提取蜂花粉中的山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷，然后利用液相色谱-串联质谱联用仪对其进行定性和定量分析，该方法简单，快速，准确，稳定。根据山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷可以准确的鉴别籽瓜花粉、油菜花粉、玫瑰花粉、虞美人花粉、荞麦花粉、玉米花粉和茶花花粉，该方法完全消除了以往方法中主观性强，易受人为因素影响的缺点。

4、本发明提供的方法克服了已有的方法中过度的受人为因素影响，主观性强，准确性低等缺点，而且能够对不同种类蜂花粉中特征活性组分进行定性和定量分析，普通的检测人员也可利用本方法鉴别蜂花粉种类。

5、本发明提供的方法检测的结果显示：标准曲线相关系数大于0.9985，添加回收率范围为85.9-96.7％，相对标准偏差小于8.2％，检测限为0.1μg/g，定量限为0.3μg/g。结果表明建立的提取方法和仪器分析方法是准确，稳定的，适合蜂花粉中山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的定性和定量分析。

6、经过本发明检测，发现五种蜂花粉中山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的含量如下：蚕豆花粉65.2-73.9μg/g、油菜花粉876.4-895μg/g、芝麻花粉2.5-2.84μg/g、益母草花粉1.89-1.99μg/g、玉米花粉8.1-11.8μg/g。由于这五种蜂花粉中山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的含量差异明显，所以可以用该待测物质鉴别这五种蜂花粉。

综上所述，本发明提供了一种高效、稳定、重复性好，准确的鉴别五种蜂花粉的方法，对于加强蜂花粉种类鉴别的研究，探索蜂花粉溯源信息，以及开发我国传统中医药物，提高我国蜂花粉质量，保证消费者的健康等具有重要的意义。

附图说明

图1：山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的多反应离子监测(MRM)图谱。

图2：山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷定量离子和定性离子的总离子流(TIC)色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1)标准贮备液(2.0mg/mL)的配制：准确称取标准物质山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷50.0mg，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，充分摇匀，配制成2.0mg/mL的标准贮备液，备用(所述贮备液在密封，-20℃条件下保存，可稳定保存6个月)

2)标准工作液的配制：取适量标准贮备液于10mL容量瓶中，用甲醇依次稀释定容，配制成以下系列标准工作液：1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL，100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL，备用；(所述工作液密封，置4℃冰箱中保存备用，可稳定保存1个月)。

3)蜂花粉样品前处理方法：称取粉碎均匀(过150目筛)的蜂花粉样品12份，每份1.5g置于萃取池中，萃取池底部预先垫入玻璃纤维素滤纸片，然后分别加入8.5mL70％的甲醇溶液(相当于蜂花粉重量的5.7倍体积)，萃取压力为8.0MPa，萃取温度为130℃，萃取时间为20min，循环提取2次。取提取液至50mL的容量瓶内并用甲醇定容，从容量瓶内吸取100μL蜂花粉试样溶液用纯水稀释10倍后过0.22μm滤膜，取1.0mL待分析。

4)液相色谱-串联质谱条件：流动相为0.1％的甲酸和乙腈溶液；洗脱条件见表1；XDB-C18色谱柱，柱温为30℃；流速为0.2mL/min；进样量为5.0μL；雾化器温度：350℃,雾化器流速：6L/min,雾化器压力35psi,毛细管电压:3500V,鞘流气温度:350℃,鞘流气流速:9L/min,锥孔电压:1000V。标准物质山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的母离子为611.2，定量离子为449.1，定性离子为287.1，定量离子为449.1(碰撞能量为8V)，定性离子为287.1(碰撞能量为20V)，驻留时间为100ms，传输电压为100v。

表1：液相梯度洗脱表

5)测定方法

定性测定：根据蜂花粉试样溶液中待测物质的含量，选择峰面积相近的标准工作液和样品溶液等体积参插进样。通过色谱保留时间与质谱选择离子共同定性。样品中待测物质与标准物质的保留时间相对偏差不大于1％，而且其选择离子的相对丰度的差异不大于10％。

定量测定：分别取适量蜂花粉试样溶液和相应浓度的标准工作液，作单点校准或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中药物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，试样液进样过程中应参插标准工作液，以便准确定量。

6)结果：标准曲线相关系数为0.9988，添加回收率范围为86.7-96.1％，相对标准偏差小于8.2％，检测限为0.1μg/g，定量限为0.3μg/g。

7)鉴别方法：

五种蜂花粉中山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的含量如下：蚕豆花粉65.2-73.9μg/g、油菜花粉893.1-893.4μg/g、芝麻花粉2.72-2.81μg/g、益母草花粉1.92-1.98μg/g、玉米花粉8.45-10.7μg/g。由于这五种蜂花粉中山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的含量差异明显，所以可以用该待测物质鉴别这五种蜂花粉。

实施例2

1)标准贮备液(2.0mg/mL)的配制：同实施例1。

2)标准工作液的配制：同实施例1。

3)蜂花粉样品前处理方法：称取粉碎均匀(过120目筛)的蜂花粉样品12份，每份2.0g置于萃取池中，萃取池底部预先垫入玻璃纤维素滤纸片，然后加入8.0mL68％的甲醇溶液(相当于蜂花粉重量的4倍体积)，萃取压力为8.5MPa，萃取温度为130℃，萃取时间为15min，循环提取2次。取提取液至50mL的容量瓶内并用甲醇定容，从容量瓶内吸取100μL蜂花粉试样溶液用纯水稀释10倍过0.22μm滤膜，取1.0mL待分析。

4)液相色谱-串联质谱条件：同实施例1

5)测定方法

定性测定：同实施例1。

定量测定：同实施例1。

6)结果：标准曲线相关系数为0.9986，添加回收率范围为85.9-96.7％，相对标准偏差小于8.4％，检测限为0.1μg/g，定量限为0.3μg/g。

7)鉴别方法：

五种蜂花粉中山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的含量如下：蚕豆花粉67.9-72.8μg/g、油菜花粉876.4-895μg/g、芝麻花粉2.5-2.84μg/g、益母草花粉1.89-1.99μg/g、玉米花粉8.1-11.8μg/g。由于这五种蜂花粉中山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的含量差异明显，所以可以用该待测物质鉴别这五种蜂花粉。

实施例3

1)标准贮备液(2.0mg/mL)的配制：同实施例1。

2)标准工作液的配制：同实施例1。

3)蜂花粉样品前处理方法：称取粉碎均匀(过140目筛)的蜂花粉样品12份，每份3.0g置于萃取池中，萃取池底部预先垫入玻璃纤维素滤纸片，然后加入7.0mL65％的甲醇溶液(相当于蜂花粉重量的2.3倍体积)，萃取压力为9.5MPa，萃取温度为150℃，萃取时间为20min，循环提取2次。取提取液至50mL的容量瓶内并用甲醇定容，从容量瓶内吸取100μL蜂花粉试样溶液用纯水稀释10倍过0.22μm滤膜，取1.0mL待分析。

4)液相色谱-串联质谱条件：同实施例1。

5)测定方法

定性测定：同实施例1。

定量测定：同实施例1。

6)结果：标准曲线相关系数为0.9990，添加回收率范围为87.4-95.3％，相对标准偏差小于9.1％，检测限为0.1μg/g，定量限为0.3μg/g。

7)鉴别方法：

五种蜂花粉中山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的含量如下：蚕豆花粉68.1-71.6μg/g、油菜花粉879.0-893.5μg/g、芝麻花粉2.57-2.71μg/g、益母草花粉1.90-1.97μg/g、玉米花粉8.34-11.68μg/g。由于这五种蜂花粉中山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的含量差异明显，所以可以用该待测物质鉴别这五种蜂花粉。

对比例1：

参照“ASE-HPLC-ESI-IT/MS法分析淡豆豉中大豆异黄酮类化合物”(作者：陈岑，宋粉云，范国荣，毋福海，发表于广东药学院学报，2014年第2期,164-168)，该文献揭示了加速溶剂萃取-高效液相色谱-电喷雾-离子阱质谱(ASE-HPLC-ESI-IT/MS)联用技术分析淡豆豉中大豆异黄酮类化合物的方法，萃取溶剂：70％(体积分数，下同)乙醇；萃取温度：125℃；静态萃取时间：6min；循环次数：2次；冲洗体积：60％，收集瓶体积；N，冲洗时间：60S；循环次数：2次；萃取池：10mL。

利用该研究中的样品前处理方法和实施例1中的仪器分析条件分析蜂花粉中的山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷。

结果：五种蜂花粉中山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的含量远低于本发明中测得的含量，即得率较低，原因可能是由于蜂花粉和淡豆豉的基质差异较大。

对比例2

参照“加速溶剂萃取技术提取桑叶中芦丁和槲皮素的工艺研究”(作者：程鹏，陈梅兰，朱岩，发表于分析化学，2009年10月,223-223)，该文献揭示了加速溶剂萃取技术提取桑叶中黄酮类化合物的萃取条件，并采用LC梯度淋洗法测定了芦丁和槲皮素的方法，加速溶剂萃取技术提取桑叶中黄酮类化合物的最佳条件为：乙醇浓度60％，提取温度80℃，料液比1：15，提取时间10min。利用该研究中的样品前处理方法和实施例1中的仪器分析条件分析蜂花粉中的山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷。实验结果如下：

结果：五种蜂花粉中山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的含量远低于本发明中测得的含量，即得率较低，原因可能是由于蜂花粉和桑叶的基质差异较大。

对比例3：

参照本专利的样品前处理方法，但是将甲醇溶液换成乙醇溶液，其与步骤均一致。即称取粉碎均匀的蜂花粉样品12份，每份1.5g置于萃取池中，萃取池底部预先垫入玻璃纤维素滤纸片，然后分别加入8.5mL70％的乙醇溶液，萃取压力为8.0MPa，萃取温度为130℃，萃取时间为20min，循环提取2次。取提取液至50mL的容量瓶内并用甲醇定容，从容量瓶内吸取100μL蜂花粉试样溶液并用纯水稀释10倍后过0.22μm滤膜，待分析。实验结果如下：

结果：五种蜂花粉中山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的含量为本发明中测得的含量的70-80％，原因可能是针对蜂花粉这种特殊的基质来说，甲醇比乙醇更容易穿透基质提取其中的待测物质。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种基于山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷含量鉴别蜂花粉的方法，包括以下步骤：标准工作液的配制、蜂花粉的前处理方法和液相色谱-串联质谱法检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蜂花粉的前处理方法为加速溶剂萃取法，具体包括以下步骤：蜂花粉用浓度为65-70％的甲醇溶液萃取，循环提取2次。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蜂花粉的前处理方法包括以下步骤：蜂花粉用65-70％的甲醇溶液萃取，萃取压力为8.0-9.5MPa，萃取温度为130-135℃，萃取时间为15-20min，循环提取2次。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蜂花粉的前处理方法包括以下步骤：称取粉碎后粒径均匀的蜂花粉用其重量2-6倍体积的65-70％甲醇萃取，萃取压力为8.0-9.5MPa，萃取温度为130-135℃，萃取时间为15-20min，循环提取2次。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述蜂花粉的粒径为100-150μm。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述甲醇的用量为蜂花粉重量的2.3-5.7倍量体积。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于,所述液相色谱-串联质谱条件的条件为：流动相为0.1％的甲酸和乙腈溶液；C18色谱柱，柱温为30℃；流速为0.2mL/min；进样量为5.0μL；洗脱条件见表1；雾化器温度：350℃，雾化器流速：6L/min，雾化器压力35psi，毛细管电压:3500V，鞘流气温度:350℃，鞘流气流速:9L/min，锥孔电压:1000V。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱条件的条件中的洗脱梯度表为：

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

3)蜂花粉样品前处理方法：称取粉碎均匀的蜂花粉样品12份，每份1.5±0.1g置于萃取池中，分别加入8.5mL65-70％的甲醇溶液，萃取压力为8.0-9.5MPa，萃取温度为130-135℃，萃取时间为15-20min，循环提取2次，将提取液用甲醇定容至50mL，吸取100μL蜂花粉试样溶液用纯水稀释10倍后过0.22μm滤膜，待分析；

4)液相色谱-串联质谱条件：流动相为0.1％的甲酸和乙腈溶液；洗脱条件见表1；C18色谱柱，柱温为30℃；流速为0.2mL/min；进样量为5.0μL；洗脱条件见表1；雾化器温度：350℃，雾化器流速：6L/min，雾化器压力35psi，毛细管电压:3500V，鞘流气温度:350℃，鞘流气流速:9L/min，锥孔电压:1000V.标准物质山奈酚3，4’-双-O-β-D-葡萄糖苷的母离子为611.2，定量离子为449.1，碰撞能量为8V，定性离子为287.1，碰撞能量为20V，驻留时间为100ms，传输电压为100v；

表1：液相梯度洗脱表

5)测定方法，包括定性测定和定量测定。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述定性测定具体为：根据蜂花粉试样溶液中待测物质的含量，选择峰面积相近的标准工作液和样品溶液等体积参插进样，通过色谱保留时间与质谱选择离子共同定性；所述定量测定为：分别取适量蜂花粉试样溶液和相应浓度的标准工作液，作单点校准或多点校准，以色谱峰面积积分值定量，标准工作液及试样液中药物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，试样液进样过程中应参插标准工作液，以便准确定量。