CN113063869B - 一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法，充分挖掘青刺尖茎叶药用资源，扩展了青刺果的药用范围，通过对青刺尖茎叶进行大孔吸附树脂分离纯化后，得到青刺尖茎叶黄酮提取物，并采用LC‑MS/MS实现了该提取物中部分黄酮成分的定性，同时对其中的夏佛塔苷建立了方法学考察，该化合物为首次在青刺尖茎叶中发现，公开了一种青刺尖茎叶黄酮提取物中夏佛塔苷的定量分析方法，可实现其高效、准确的定量，该方法简便易于推广，可以实现青刺尖茎叶黄酮提取物的质量控制。

Description

一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法及其中夏佛塔苷的定量分析方法。
背景技术
青刺果(Prinsepia utilis Royle)为蔷薇科扁核木属植物青刺尖的果实，又名青那果、鸡蛋果、阿那斯，产于云南、四川、西藏等省区交界地区，生于海拔2300～3200m 的高寒冷凉山区。青刺果用途较广，具有较高的营养和药用价值。其根、叶、果均可入药或食用，具有清热、解毒、活血、消炎、健胃等作用，在云南少数民族有上千年的民间药用及食用历史。
现代药理研究发现青刺果具有抗菌、抗氧化、降血脂、提高免疫力等药理活性，其主要的化学成分为不饱和脂肪酸、三萜类、生物碱类、木质素类、黄酮类等[解仲伯,林华庆,余楚钦,王远苹.青刺果各类提取物的药理作用研究进展,中成药, 2016,38(12):2651-2656；高凡丁,黄士淇,张成庭,蔡圣宝.发酵青刺果种子的酚类物质组成及抗氧化活性分析，云南民族大学学报:自然科学版,2018,27(3):167-175； Zhang Xuan,Jia Yijia,MaYanli,et al.Phenolic Composition,Antioxidant Properties,and Inhibition towardDigestive Enzymes with Molecular Docking Analysis of Different Fractions fromPrinsepia utilis Royle Fruits.2018,23(12):3373]。迄今为止，国内外对青刺果化学成分的研究主要集中在青刺果油，其具有良好的修复皮肤屏障的作用[和丽媛,王玲,吕俊梅.青刺果油研究进展，粮食科技与经济,2019,44(7):145-148；夏海梅,何鹏飞,李艳萍,刘因华,赵远,周志宏.青刺果油生物活性及应用研究概况, 云南中医中药杂志,2018,39(12):86-87]，当前对其茎叶的研究较少，管斌对青刺尖进行了一系列研究[青刺尖化学成分及抗肿瘤活性研究青刺尖茎叶应用,上海交通大学,2013]，采用传统柱色谱分离方法从青刺尖茎叶中分离鉴定了46个化合物，其中三萜及甾体类13个，且证实青刺尖中的三萜类化合物在治疗肿瘤方面具有潜在的药用价值。
夏佛塔苷具有通淋排石、清热利湿、消水肿解血毒的功效[黄新凯,赖海标,钟喨,黄智锋,曾晔,吴松.尿石清合剂对下焦湿热型尿路结石患者上尿路动力学的影响,海南医学,2017,28(14):2288-2291]，目前没有文献报道过在青刺尖嫩叶中鉴定出夏佛塔苷。
已有专利技术对青刺尖嫩叶进行了提取制备，例如中国专利CN105982979B公开了一种青刺尖嫩叶提取物及其制备方法和应用，该专利对青刺尖嫩叶的超声提取方式及皮肤外用剂的应用进行了保护。但是目前尚无文献报道对青刺尖茎叶黄酮提取物进行成分鉴定，也没有文献对青刺尖茎叶黄酮提取物中夏佛塔苷的含量检测方法进行研究。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法，对青刺尖茎叶中黄酮成分进行了分离纯化，紫外比色法确定了黄酮含量，不低于20％；并且采用LC-MS/MS方法对其茎叶黄酮成分进行了初步定性。
本发明的另外一个目的是提供一种青刺尖茎叶黄酮提取物中夏佛塔苷的定量分析方法。
实现上述目的一种技术方案是：一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法，包括以下步骤：
S1,样品前处理：称量青刺尖茎叶黄酮提取物取1g，置于锥形瓶中，用20ml 体积浓度70％乙醇水溶液超声溶解，放冷再称量，用体积浓度70％乙醇水溶液补足减失的重量，取上清液过滤，即得青刺尖茎叶黄酮提取物待测样品；
S2,定性分析色谱条件：色谱柱为Agilent poroshell 120SB-C18；流动相为0.1％甲酸-乙腈梯度洗脱：10％乙腈→10％乙腈0～5min，10％乙腈→30％乙腈5～15 min，30％乙腈→80％乙腈15～25min，80％乙腈→80％乙腈25～35min；流速： 0.4mL·min-1；柱温30℃；进样量：2μl；
S3,定性分析质谱条件：电喷雾负离子扫描ESI-，离子源温度为320℃，毛细管电压150V，锥孔电压65V，脱溶剂气为10L·min-1，脱溶剂气温度为350℃，雾化气为8L·min-1；采用MSE采集方式，扫描范围100～3000amu，MSE高能级碰撞能量为30Ev，碰撞气为氮气；
S4,定性分析结果：将青刺尖茎叶黄酮提取物待测样品，采用步骤S2和S3的定性分析条件进行检测，得到青刺尖茎叶黄酮提取物的总离子流图及254nm下的色谱图，将检测结果与文献及数据库进行比对,对各色谱峰进行初步推测；筛选信噪比较好的二级质谱图以获取色谱峰的二级质谱信息，并获得化合物相应的碎片离子，根据离子的裂解情况及文献数据进一步比对并推测化学成分，最终从青刺尖茎叶黄酮提取物中鉴定出9个黄酮类化合物，分别为槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷、3,6-二葡萄糖基芹菜素、夏佛塔苷、刺槐素、香蒲新苷、芦丁、金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷和异鼠李素-7-O-芸香糖苷。
上述的一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法，所述青刺尖茎叶黄酮提取物的制备工艺如下：
S1,青刺尖茎叶提取步骤：将青刺尖茎叶用体积浓度50～80％的乙醇水溶液，回流提取1～3次，合并提取液，过滤并浓缩后即得粗提液；每次提取时，所述青刺尖茎叶和乙醇水溶液的料液比为1:8-1:15kg/L；
S2,减压浓缩步骤：将步骤S1制得的粗提液在50～70℃进行减压浓缩，除去粗提液中的乙醇得到浓缩液，浓缩液冻干后得到粗提物粉末；
S3,分离纯化步骤：将粗提物粉末加水溶解上样，过大孔吸附树脂，所述大孔吸附树脂的型号为X-5、AB-8、DM-130、D101、HPD-400或HPD-600，依次用水和体积浓度为20％～40％的乙醇水溶液除杂，然后用体积浓度为50％～80％的乙醇水溶液富集，收集50％～80％的乙醇洗脱液，浓缩干燥得到黄色粉末状的青刺尖茎叶黄酮提取物。
上述的一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法，所述青刺尖茎叶提取步骤中，青刺尖茎叶用体积浓度为75％的乙醇水溶液加热回流提取，加热温度为 80～100℃。
上述的一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法，所述分离纯化步骤中，水的洗脱体积为5～10BV，体积浓度为20％～40％的乙醇水溶液除杂时的洗脱体积为 3～8BV，50％～80％的乙醇水溶液富集时的洗脱体积为为6～10BV。
上述的一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法，采用紫外比色法确定所述青刺尖茎叶黄酮提取物中的总黄酮含量＞20％，具体步骤如下：
S1，标准曲线绘制：取芦丁标准品，加体积浓度95％乙醇水溶液制成0.32mg/mL 的芦丁溶液，倍半稀释，得到6个点以上的芦丁梯度浓度标准品，测其500nm的吸光度，作标准曲线，得到标准曲线公式为：
Y＝1.5187X+0.0067
r＝0.9991；
上式中，x为芦丁浓度，y为吸光度，r为数据相关性系数；
S2，总黄酮含量计算：称取青刺尖茎叶黄酮提取物，用体积浓度95％乙醇水溶液制成0.54mg/mL的溶液，作为待测品溶液；测量待测品溶液500nm的吸光度，将待测品溶液500nm的吸光度代入Y＝1.5187X+0.0067，计算得出青刺尖茎叶黄酮提取物中的芦丁浓度，从而得到青刺尖茎叶黄酮提取物中的总黄酮含量。
上述的一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法，所述青刺尖茎叶黄酮提取物对DPPH清除作用IC50＜0.3mg/ml，对羟自由基清除作用IC50＜1.0mg/ml，所述青刺尖茎叶黄酮提取物用于制备抗氧化相关的护肤品、食品及药物。
本发明还提供了一种青刺尖茎叶黄酮提取物中夏佛塔苷的定量分析方法，所述青刺尖茎叶黄酮提取物采用上述的一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法中的青刺尖茎叶黄酮提取物的制备工艺制备；所述夏佛塔苷的定量分析方法包括以下步骤：
S1，选定定量分析色谱条件：色谱柱为Agilent poroshell 120SB-C18；流动相为0.1％甲酸-乙腈梯度洗脱：10％乙腈→10％乙腈0～5min，10％乙腈→20％乙腈5～10min，20％乙腈→35％乙腈10～18min，35％乙腈→80％乙腈18～25min， 80％乙腈→80％乙腈25～30min；流速：0.4L·min-1；柱温35℃；进样量：2μl；
S2，对照品母液的制备：称量夏佛塔苷标准品，加入50％乙醇水溶液制成0.595mg·ml-1对照品母液，混匀，4℃下避光保存备用；
S3，标准曲线绘制：精密吸取对照品母液，通过50％乙醇水溶液将其配成5、 10、20、50、100和200倍稀释的梯度对照品溶液，摇匀，分别按照步骤S1选定的定量分析色谱条件对6个梯度对照品溶液进样测定；在每个对照品溶液的总离子流图中，提取夏佛塔苷母离子信号，对母离子信号分别进行积分，以夏佛塔苷母离子信号积分面积为Y轴，夏佛塔苷浓度为X轴，绘制标准曲线，得到标准曲线公式为：
Y＝6060.2X+1.7359
r＝1；
上式中，X为夏佛塔苷浓度，Y为夏佛塔苷母离子信号积分面积，r为数据相关性系数，夏佛塔苷在2.98μg·mL-1～119μg·ml-1范围内线性关系良好；
S4,样品前处理：称量青刺尖茎叶黄酮提取物取1g，置于锥形瓶中，用20ml 体积浓度70％乙醇水溶液超声溶解，放冷再称量，用体积浓度70％乙醇水溶液补足减失的重量，取上清液过滤，即得供试品溶液；
S5,样品定量分析检测：精密吸取供试品溶液按照步骤S1选定的定量分析色谱条件进样测定，得到样品的总离子流图，在样品的总离子流图中提取夏佛塔苷母离子信号，并对母离子信号进行积分，得到样品的夏佛塔苷母离子信号积分面积；
将样品的夏佛塔苷母离子信号积分面积代入Y＝6060.2X+1.7359中，计算即得样品中夏佛塔苷浓度，该数值与样品配制时的实际浓度的比值即为青刺尖茎叶黄酮提取物中夏佛塔苷的含量。
上述的一种青刺尖茎叶黄酮提取物中夏佛塔苷的定量分析方法，所述青刺尖茎叶黄酮提取物中的夏佛塔苷含量＞3％。
相比其他研究工作者的研究报道，本发明的青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法及其中夏佛塔苷的定量分析方法主要具备以下几个优势：
(1)对青刺尖茎叶中黄酮成分进行了分离纯化，采用紫外比色法确定了黄酮含量，不低于20％；
(2)采用LC-MS/MS方法对其茎叶黄酮成分进行了初步定性，对其中的夏佛塔苷进行定量,夏佛塔苷含量大于3％；
(3)充分利用青刺尖茎叶，努力挖掘其药用价值，对青刺尖茎叶进行分离纯化，简便快速,用黄酮含量及单体夏佛塔苷对该青刺尖茎叶黄酮提取物进行质控，可确保批次间稳定性，实现产业化，从而可以更好的利用青刺果植物资源，实现更大商业价值。
附图说明
图1为青刺尖茎叶黄酮提取物研究流程图；
图2A为青刺尖茎叶黄酮提取物的LC-MS的总离子流图；
图2B为青刺尖茎叶黄酮提取物在254nm的色谱图；
图3A为槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷的质谱裂解图；
图3B为槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷的裂解途径推测图；
图4A为夏佛塔苷的质谱裂解图；
图4B为夏佛塔苷的裂解途径推测图；
图5A为芦丁的质谱裂解图；
图5B为芦丁的裂解途径推测图；
图6A为山奈酚-3-O-芸香糖苷的质谱裂解图；
图6B为山奈酚-3-O-芸香糖苷的裂解途径推测图；
图7为夏佛塔苷高效液相色谱图；
图8A为维生素C对DPPH自由基清除作用；
图8B为青刺尖茎叶黄酮提取物对DPPH自由基清除作用；
图8C为维生素C对羟自由基清除作用；
图8D为青刺尖茎叶黄酮提取物对羟自由基清除作用。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对其具体实施方式进行详细地说明：
请参阅图1，青刺尖茎叶黄酮提取物的制备工艺如下：
S1,青刺尖茎叶提取步骤：取青刺尖茎叶104g，用体积浓度75％的乙醇水溶液，加热回流提取2次，每次2小时，提取温度为80℃，合并提取液，过滤并浓缩后即得粗提液；
S2,减压浓缩步骤：将步骤S1制得的粗提液在60℃进行减压浓缩至无醇味，除去粗提液中的乙醇得到浓缩液，浓缩液冻干后得到粗提物粉末13.37g，得率为 12.86％；
S3,分离纯化步骤：取粗提物粉末3g，将粗提物粉末加水溶解上样，过大孔吸附树脂，大孔吸附树脂的型号为X-5、AB-8、DM-130、D101、HPD-400或HPD-600，本实施例中选用D101；静置吸附4小时，然后分别用180ml水，180ml体积浓度为20％的乙醇水溶液除杂；240ml体积浓度为70％的乙醇水溶液富集，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩干燥得到黄色粉末状的青刺尖茎叶黄酮提取物814.5mg，折合原生药材得率为3.49％。
总黄酮含量测定：
采用紫外比色法确定所述青刺尖茎叶黄酮提取物中的总黄酮含量，具体步骤如下：
S1，标准曲线绘制：取芦丁标准品，加体积浓度95％乙醇水溶液制成0.32mg/mL 的芦丁溶液，倍半稀释，得到6个点以上的芦丁梯度浓度标准品，测其500nm的吸光度，作标准曲线，得到标准曲线公式为：
Y＝1.5187X+0.0067
r＝0.9991；
上式中，X为芦丁浓度，Y为吸光度，r为数据相关性系数；
S2，总黄酮含量计算：称取青刺尖茎叶黄酮提取物，用体积浓度95％乙醇水溶液制成0.54mg/mL的溶液，作为待测品溶液；测量待测品溶液500nm的吸光度，将待测品溶液500nm的吸光度代入Y＝1.5187X+0.0067，计算得出青刺尖茎叶黄酮提取物中的芦丁浓度，从而得到青刺尖茎叶黄酮提取物中的总黄酮含量21.47％。
DPPH自由基和羟自由基清除作用试验：
请参阅图8A、图8B、图8C和图8D，对青刺尖茎叶黄酮提取物进行DPPH自由基和羟自由基清除作用试验，以维生素C作为阳性对照，配置标准溶液，进行相关试验，结果显示，维生素C对DPPH自由基清除作用IC50为0.0146mg/ml(见图8A)，青刺尖茎叶黄酮提取物对DPPH自由基清除作用IC50为0.163mg/ml(见图8B)；维生素C对羟自由基清除作用IC50为0.231mg/ml(见图8C)，青刺尖茎叶黄酮提取物对羟自由基清除作用IC50为0.817mg/ml(见图8D)。
青刺尖茎叶黄酮提取物可以用于制备抗氧化相关的护肤品、食品及药物。
请参阅图2A和图2B,一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法，包括以下步骤：
S1,样品前处理：称量青刺尖茎叶黄酮提取物取1g，置于带塞锥形瓶中，用20ml体积浓度70％乙醇水溶液超声20min溶解，放冷再称量，用体积浓度70％乙醇水溶液补足减失的重量，取上清液过滤，即得青刺尖茎叶黄酮提取物待测样品；
S2,定性分析色谱条件：色谱柱为Agilent poroshell 120SB-C18(2.7μm，3.0mm×100mm)；流动相为0.1％甲酸-乙腈梯度洗脱，流速：0.4mL·min-1；柱温30℃；进样量：2μl；流动相梯度见表1，其中，流动相A为0.1％甲酸，流动相B为乙腈：
表1：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％ 流速
0 90 10 0.4mL·min<sup>-1</sup>
5 90 10 0.4mL·min<sup>-1</sup>
15 70 30 0.4mL·min<sup>-1</sup>
25 20 80 0.4mL·min<sup>-1</sup>
35 20 80 0.4mL·min<sup>-1</sup>
S3,定性分析质谱条件：电喷雾负离子扫描ESI-，离子源温度为320℃，毛细管电压150V，锥孔电压65V，脱溶剂气为10L·min-1，脱溶剂气温度为350℃，雾化气为8L·min-1；采用MSE采集方式(E代表碰撞能量)，扫描范围100～3000amu， MSE高能级碰撞能量为30Ev，碰撞气为氮气；
S4,定性分析结果：将青刺尖茎叶黄酮提取物待测样品，采用步骤S2和S3的定性分析条件进行检测，得到青刺尖茎叶黄酮提取物的254nm下的色谱图(见图 2B)及质谱总离子流图(见图2A)，将检测结果与文献及数据库进行比对,对各色谱峰进行初步推测；筛选信噪比较好的二级质谱图以获取色谱峰的二级质谱信息，并获得化合物相应的碎片离子，根据离子的裂解情况及文献数据进一步比对并推测化学成分，最终鉴定出青刺尖茎叶黄酮提取物中含有9个黄酮类化合物，结果见表 2，分别为槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷、3,6-二葡萄糖基芹菜素、夏佛塔苷、刺槐素、香蒲新苷、芦丁、金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷和异鼠李素-7-O-芸香糖苷。
表2：
Figure GDA0003848517950000091
裂解规律分析：
请参阅图3A至图6B，通过青刺果尖茎叶黄酮二级质谱解析，对化合物进行裂解规律分析，以槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷(化合物1)、夏佛塔苷(化合物3)、芦丁(化合物6)、山奈酚-3-O-芸香糖苷(化合物8)为例，结果如下：
请参阅图3A和图3B，化合物1(t＝5.893min)在负离子模式下m/z 771.1975[M-H]-，母离子脱去一分子葡萄糖m/z 162.0521得到m/z 609.1454[M-H-Glu]-，继续脱去一分子芸香糖基m/z 147.076产生m/z 462.0792的碎片离子，最后再脱去一分子葡萄糖m/z161.0342得到m/z 301.0352的特征离子峰。该化合物的质谱行为与文献报道一致，并通过Scifinder及Reaxys数据库检索，鉴定该化合物为槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷。推测其裂解途径见图3B。
请参阅图4A和图4B，化合物3(t＝10.917min)在负离子模式下m/z 563.1405[M-H]-，母离子存在3种裂解方式，离子峰m/z 503.1183为母离子脱去一分子C2H4O2产生；继续脱去一分子C2H4O2形成m/z 443.0978特征离子峰；m/z 473.1082为母离子脱去一分子C3H6O3产生，该化合物的质谱行为与文献报道一致，并通过Scifinder及Reaxys数据库检索，鉴定该化合物为夏佛塔苷。推测其裂解途径见图4B。
请参阅图5A和图5B，化合物6(t＝12.353min)在负离子模式下m/z 609.1474[M-H]-，母离子脱去一分子芸香糖基C12H21O9得到m/z 301.0358的特征离子峰，该化合物的质谱行为与文献报道一致，并通过Scifinder及Reaxys数据库检索，鉴定该化合物为芦丁。推测其裂解途径见图5B。
请参阅图6A和图6B，化合物8(t＝13.520min)在负离子模式下m/z 593.1522[M-H]-，母离子脱去一分子芸香糖基C12H21O9产生特征碎片离子m/z 285.0408山奈酚分子离子峰，该化合物的质谱行为与文献报道一致，并通过Scifinder 及Reaxys数据库检索，鉴定该化合物为山奈酚-3-O-芸香糖苷。推测其裂解途径见图6B。
一种青刺尖茎叶黄酮提取物中夏佛塔苷的定量分析方法，包括以下步骤：
S1，选定定量分析色谱条件：色谱柱为Agilent poroshell 120SB-C18；流动相为0.1％甲酸-乙腈梯度洗脱流速：0.4L·min-1；柱温35℃；进样量：2μl；流动相梯度见表3，其中，流动相A为0.1％甲酸，流动相B为乙腈：
表3：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％ 流速
0 90 10 0.4mL·min<sup>-1</sup>
5 90 10 0.4mL·min<sup>-1</sup>
10 80 20 0.4mL·min<sup>-1</sup>
18 65 35 0.4mL·min<sup>-1</sup>
25 20 80 0.4mL·min<sup>-1</sup>
30 20 80 0.4mL·min<sup>-1</sup>
S2，对照品母液的制备：称量夏佛塔苷标准品，加入50％乙醇水溶液制成0.595mg·ml-1对照品母液，混匀，4℃下避光保存备用；
S3，标准曲线绘制：精密吸取对照品母液，通过50％乙醇水溶液将其配成5、10、20、50、100和200倍稀释的梯度对照品溶液，摇匀，分别按照步骤S1选定的定量分析色谱条件对6个梯度对照品溶液进样测定；在每个对照品溶液的总离子流图中，提取夏佛塔苷母离子信号，对母离子信号分别进行积分，以夏佛塔苷母离子信号积分面积为Y轴，夏佛塔苷浓度为X轴，绘制标准曲线，得到标准曲线公式为：
Y＝6060.2X+1.7359
r＝1；
上式中，X为夏佛塔苷浓度，Y为夏佛塔苷母离子信号积分面积，r为数据相关性系数，夏佛塔苷在2.98μg·mL-1～119μg·ml-1范围内线性关系良好；
S4,样品前处理：称量青刺尖茎叶黄酮提取物取1g，置于带塞的锥形瓶中，用 20ml体积浓度70％乙醇水溶液超声溶解，放冷再称量，用体积浓度70％乙醇水溶液补足减失的重量，取上清液过滤，即得供试品溶液；
S5,样品定量分析检测：精密吸取供试品溶液按照步骤S1选定的定量分析色谱条件进样测定，得到样品的总离子流图，在样品的总离子流图中提取夏佛塔苷母离子信号，并对母离子信号进行积分，得到样品的夏佛塔苷母离子信号积分面积；
将样品的夏佛塔苷母离子信号积分面积代入Y＝6060.2X+1.7359中，计算即得样品中夏佛塔苷浓度，该数值与样品配制时的实际浓度的比值即为青刺尖茎叶黄酮提取物中夏佛塔苷的含量。三个不同批次青刺尖茎叶黄酮提取物中的夏佛塔苷的平均含量为3.15％。
夏佛塔苷的定量分析方法学考察：
系统适应性及专属性：请参阅图7，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 2μl，按照步骤S1选定的定量分析色谱条件进行分析，以50％乙醇水溶液为空白样品；检测结果见图7。夏佛塔苷3与其它组分达到基线分离，空白样品在相应位置未见色谱峰。
线性范围考察：精密吸取对照品母液，通过50％乙醇将其配成5，10，20，50， 100，200倍稀释的梯度对照品溶液，摇匀，分别按照步骤S1选定的定量分析色谱条件对6个梯度对照品溶液进样测定；在每个对照品溶液的总离子流图中，提取夏佛塔苷母离子信号，对母离子信号分别进行积分，以夏佛塔苷母离子信号积分面积为Y轴，夏佛塔苷浓度为X轴，绘制标准曲线，得到标准曲线公式为：
Y＝6060.2X+1.7359
r＝1；
上式中，X为夏佛塔苷浓度，Y为夏佛塔苷母离子信号积分面积，r为数据相关性系数，夏佛塔苷在2.98μg·mL-1～119μg·ml-1范围内线性关系良好。
精密度试验：取供试品溶液1份，按照步骤S1选定的定量分析色谱条件连续进样6次，测定夏佛塔苷的峰面积，计算相对标准偏差RSD为2.86％，色谱分析仪器精密度良好。
稳定性试验：取供试品溶液1份，分别在室温放置0,2,4,8,12,24h，按照步骤S1选定的定量分析色谱条件测定夏佛塔苷的峰面积，计算相对标准偏差RSD为 1.14％，供试品溶液稳定性良好。
重复性试验：平行制备供试品溶液6份，测定夏佛塔苷的平均含量为3.12％，相对标准偏差RSD为4.96％，表明该定量分析方法重复性良好。
加样回收率试验：精密称取已知含量的供试品溶液6份，每份2.5mg，置于具塞锥形瓶中，按样品中夏佛塔苷含量的50％、100％、150％分别加入对照品溶液并测定，计算回收率；夏佛塔苷的加样回收率(n＝3)分别为102.51％、97.68％、98.38％；相对标准偏差RSD分别为3.35％、3.57％、0.97％；平均回收率为99.52％，表明该定量分析方法准确度良好。
S5,青刺尖茎叶黄酮提取物中夏佛塔苷的含量测定：制备供试品溶液，进样测定夏佛塔苷的含量，三个不同批次夏佛塔苷的平均含量为3.15％。
综上所述，本发明充分挖掘青刺尖茎叶药用资源，扩展了青刺果的药用范围，通过对青刺尖茎叶进行大孔吸附树脂分离纯化后，得到青刺尖茎叶黄酮提取物，并采用LC-MS/MS实现了该提取物中部分黄酮成分的定性，同时对其中的夏佛塔苷建立了方法学考察，该化合物为首次在青刺尖茎叶中发现，可实现其高效、准确的定量，该方法简便易于推广，可以实现青刺尖茎叶黄酮提取物的质量控制。
应当指出的是，对于本技术及相关领域内的技术人员而言，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。

Claims (6)

1.一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1,样品前处理：称量青刺尖茎叶黄酮提取物取 1g，置于锥形瓶中，用20ml体积浓度70％乙醇水溶液超声溶解，放冷再称量，用体积浓度70％乙醇水溶液补足减失的重量，取上清液过滤，即得青刺尖茎叶黄酮提取物待测样品；
S2,定性分析色谱条件：色谱柱为Agilent poroshell 120SB-C18，2.7μm，3.0mm×100mm；流动相为0.1％甲酸-乙腈梯度洗脱：10％乙腈→10％乙腈0～5min，10％乙腈→30％乙腈5～15min，30％乙腈→80％乙腈15～25min，80％乙腈→80％乙腈25～35min；流速：0.4mL·min-1；柱温30℃；进样量：2μl；
S3,定性分析质谱条件：电喷雾负离子扫描ESI-，离子源温度为320℃，毛细管电压150V，锥孔电压65V，脱溶剂气为10L·min-1，脱溶剂气温度为350℃，雾化气为8L·min-1；采用MSE采集方式，扫描范围100～3000amu，MSE高能级碰撞能量为30Ev，碰撞气为氮气；
S4,定性分析结果：将青刺尖茎叶黄酮提取物待测样品，采用步骤S2和S3的定性分析条件进行检测，得到青刺尖茎叶黄酮提取物的总离子流图及254nm下的色谱图，将检测结果与文献及数据库进行比对,对各色谱峰进行初步推测；筛选信噪比较好的二级质谱图以获取色谱峰的二级质谱信息，并获得化合物相应的碎片离子，根据离子的裂解情况及文献数据进一步比对并推测化学成分，最终从青刺尖茎叶黄酮提取物中鉴定出9个黄酮类化合物，分别为槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷、3,6-二葡萄糖基芹菜素、夏佛塔苷、刺槐素、香蒲新苷、芦丁、金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷和异鼠李素-7-O-芸香糖苷。
2.如权利要求1所述的一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法，其特征在于，所述青刺尖茎叶黄酮提取物的制备工艺如下：
S1,青刺尖茎叶提取步骤：将青刺尖茎叶用体积浓度50～80％的乙醇水溶液，回流提取1～3次，合并提取液，过滤并浓缩后即得粗提液；每次提取时，所述青刺尖茎叶和乙醇水溶液的料液比为1:8-1:15kg/L；
S2,减压浓缩步骤：将步骤S1制得的粗提液在50～70℃进行减压浓缩，除去粗提液中的乙醇得到浓缩液，浓缩液冻干后得到粗提物粉末；
S3,分离纯化步骤：将粗提物粉末加水溶解上样，过大孔吸附树脂，所述大孔吸附树脂的型号为D101，依次用水和体积浓度为20％～40％的乙醇水溶液除杂，然后用体积浓度为50％～80％的乙醇水溶液富集，收集50％～80％的乙醇洗脱液，浓缩干燥得到黄色粉末状的青刺尖茎叶黄酮提取物。
3.如权利要求2所述的一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法，其特征在于，所述青刺尖茎叶提取步骤中，青刺尖茎叶用体积浓度为75％的乙醇水溶液加热回流提取，加热温度为80～100℃。
4.如权利要求2所述的一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法，其特征在于，所述分离纯化步骤中，水的洗脱体积为5～10BV，体积浓度为20％～40％的乙醇水溶液除杂时的洗脱体积为3～8BV，50％～80％的乙醇水溶液富集时的洗脱体积为6～10BV。
5.如权利要求1所述的一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法，其特征在于，采用紫外比色法确定所述青刺尖茎叶黄酮提取物中的总黄酮含量＞20％，具体步骤如下：
S1，标准曲线绘制：取芦丁标准品，加体积浓度95％乙醇水溶液制成0.32mg/mL的芦丁溶液，倍半稀释，得到6个点以上的芦丁梯度浓度标准品，测其500nm的吸光度，作标准曲线，得到标准曲线公式为：
Y＝1.5187X+0.0067
r＝0.9991；
上式中，X为芦丁浓度，Y为吸光度，r为数据相关性系数；
S2，总黄酮含量计算：称取青刺尖茎叶黄酮提取物，用体积浓度95％乙醇水溶液制成0.54mg/mL的溶液，作为待测品溶液；测量待测品溶液500nm的吸光度，将待测品溶液500nm的吸光度代入Y＝1.5187X+0.0067，计算得出青刺尖茎叶黄酮提取物中的芦丁浓度，从而得到青刺尖茎叶黄酮提取物中的总黄酮含量。
6.如权利要求1所述的一种青刺尖茎叶黄酮提取物的定性分析方法，其特征在于，所述青刺尖茎叶黄酮提取物对DPPH清除作用IC50＜0.3mg/ml，对羟自由基清除作用IC50＜1.0mg/ml，所述青刺尖茎叶黄酮提取物用于制备抗氧化相关的护肤品、食品及药物。
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