CN103784480A - 黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的制备方法，它包括以下步骤：将黄绿蜜环菌子实体超微粉碎，获得超微粉；将超微粉进行多次水提处理，得到上清液用无水乙醇进行醇沉处理，醇沉上清浓缩得小分子提取物；小分子提取物用分析纯水溶解后过有机滤膜，所得样品溶液在C18或C8制备色谱上进行固相萃取，获得前处理样品；前处理样品在C18制备色谱上进行分离纯化，按照色谱峰进行收集，得各试验组分；对各试验组分进行抗氧化活性实验，选取相对抗氧化活性最好的组分即为本发明目的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分。该方法工艺简单，易于实施，快速高效，重复性好，稳定可控，得到的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分可应用于制备抗氧化药物或保健食品中。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学及生物医药技术领域，尤其涉及一种黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的制备方法，以及该活性组分在制备抗氧化药物或保健食品中的应用。
背景技术
黄绿蜜环菌，俗称黄蘑菇，是青藏高原特有的珍稀食药用真菌。野生黄绿蜜环菌子实体中含丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质、生物碱、挥发油和多糖等营养成分，还含有少量有机酸、黄酮、强心苷、挥发油、甾体三萜类、苷类、香豆素萜类、鞣质、酚类化合物等，特别是硒的含量很高，是癌症的克星。研究表明黄绿蜜环菌具有防治神经炎、脚气病、促进儿童发育、抗氧化、抗流感以及抗肿瘤等生物活性。
公开号为101709322B的中国发明专利“生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法”公开了一种通过黄绿蜜环菌生物转化合成白桦脂酸；公开号为101113413B的中国发明专利“一种黄绿蜜环菌纤溶酶及其生产方法”公开了一种利用黄绿蜜环菌代谢合成纤溶酶的方法；公开号为100999750B的中国发明专利“一种微生物细胞生物转化对羟基苯甲醇合成天麻素的方法”公开了一种利用黄绿蜜环菌生物转化合成天麻素的方法。上述中国专利文件中关于黄绿蜜环菌子实体的研究，主要集中在生物转化上，并未涉及黄绿蜜环菌子实体的化学成分，对其化学成分的研究甚少。
李世峰等发表的“两种野生食用菌抗氧化及抗肿瘤活性研究”（中国食用菌[J].2004,24(3):58-63）中公开了一种黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的提取方法：将子实体粉碎，用80%乙醇加热回流3h，重复提取3次，提取液合并浓缩后，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，剩余部分用三倍体积无水乙醇沉淀，共得到石油醚相、乙酸乙酯相、剩余醇溶相和水溶性粗多糖四相提取物，分别烘干备用。该方法存在以下缺陷：（1）采用传统的溶剂萃取法（液液萃取）进行有效活性组分的提取，批次之间不具有重复性，即无法保证第一批萃取得到的物质组分与第二批萃取得到的物质组分之间的一致性；（2）采用这种液液萃取的方法，物质在不同溶剂中的分配过程需要的时间非常长，而且要多次萃取（一般三次，每次换新的溶剂）、然后合并，这导致整个提取过程的时间周期长，试剂耗费量大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种工艺简单、快速、易于实施、批次稳定可控、重复性好的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的制备方法。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案为：
一种黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的制备方法，包括以下步骤：
（1）以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在40～60℃温度下烘干脱水，然后进行超微粉碎处理，获得超微粉；
（2）将步骤（1）所得的超微粉按1g﹕（6～15）mL的料液比用分析纯水在60～90℃温度下提取1～2h，提取结束后在4000～8000rpm转速下离心收集上清液，重复1～3次，该步使用分析纯水进行粗提不仅使成本低廉，同时也是减少杂质引入、免去了后续去杂等复杂又对活性成分保存不利的步骤；将所得上清液合并，浓缩后加入无水乙醇进行醇沉处理，离心收集上清液，对醇沉上清液减压浓缩至膏状，获得小分子提取物；
（3）在步骤（2）所得的小分子提取物中加入10～20倍体积的分析纯水进行溶解，溶解后过有机滤膜，得到含有小分子提取物的样品溶液，所得样品溶液在填料为反相分离材料C18或C8的制备色谱上进行固相萃取并减压浓缩，获得前处理样品；
（4）将步骤（3）获得的前处理样品在以填料为反相分离材料C18的制备色谱上进行分离纯化，按照色谱峰进行收集，将各收集馏分减压浓缩至粉末，得黄绿蜜环菌子实体各试验组分；
（5）对步骤（4）得到的各试验组分进行抗氧化活性实验，利用建立的体外细胞抗氧化药物筛选模型评估各试验组分的相对抗氧化能力，以已知天然抗氧化剂特丁基对苯二酚（TBHQ）作为参照抗氧化剂，黄绿蜜环菌子实体各试验组分与TBHQ在相同浓度条件下作用于体外细胞抗氧化药物筛选模型的细胞，通过检测试验组与对照组细胞中荧光素酶的活性，计算出相同剂量条件下黄绿蜜环菌子实体各试验组分抗氧化能力与TBHQ的抗氧化能力的倍数关系，选取相对抗氧化活性最好的组分即为本发明目的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分。体外细胞抗氧化药物筛选模型参照公开号为102899351A的中国发明专利“一种抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系及其构建和应用”。
所述步骤（1）中超微粉碎的条件为：使用超微粉碎机在-20～4℃温度下，超微粉碎5～20min。
所述步骤（2）中所得上清液浓缩至固含量为50～200mg/mL，然后加入4～9倍体积的无水乙醇进行醇沉处理。
所述步骤（3）中固相萃取采用的反相分离材料C18或C8的粒径为40μm，采用的分离色谱柱直径为100mm、柱长为300mm，采用A为纯水、B为甲醇的二元流动相 体系进行固相萃取；固相萃取的条件为：3倍柱体积甲醇活化色谱柱，3倍柱体积纯水平衡，含有小分子提取物的样品溶液上样，3倍柱体积纯水淋洗，5倍柱体积50%甲醇-水溶液洗脱，获得前处理样品。
所述步骤（3）中有机滤膜的孔径为0.45μm。
所述步骤（4）中制备液相色谱采用的反向分离材料C18的粒径为8～15μm，采用的分离色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，采用A为0.2％乙酸-水、B为0.2％乙酸-甲醇的二元流动相体系进行分离纯化；分离纯化的条件为：0～10min用95%A、5%B洗脱样品，10～20min用95～78%A、5～22%B梯度洗脱，20～25min用78～5%A、22～95%B梯度洗脱，25～35min用5%A、95%B洗脱样品，检测波长为254nm，进样量为1.2g。
所述步骤（2）（3）（4）中减压浓缩采用旋转蒸发仪进行，工艺条件为真空度0.08Mpa、温度60℃。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述所得的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分在制备抗氧化药物或保健食品中的应用。该抗氧化活性组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，该抗氧化活性组分作为有效成分按常规方法与食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
1、采用超微粉碎机进行低温超微粉碎，以破除黄绿蜜环菌子实体坚硬的细胞壁，有利于内容物的溶出，有效提高了黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的提取率；
2、采用醇沉处理进行预处理，去掉了多糖、多肽等生物大分子物质，留下小分子化合物，减少了后续物质处理量和处理时间，既节约了提取成本和时间成本，也有利于抗氧化活性组分的提取；
3、采用制备色谱对含有活性组分的小分子提取物进行粗提和进一步分离纯化，可从黄绿蜜环菌子实体中分离到抗氧化活性组分，相对于传统的溶剂萃取法，该抗氧化活性组分的制备方法稳定性好，重复性好，得到的物质组分批次之间一致性高，分离纯化过程的时间周期短，试剂耗费量小，制备量大；
4、以已知天然抗氧化剂特丁基对苯二酚（TBHQ）作为参照抗氧化剂，利用建立的体外细胞抗氧化药物筛选模型评估抗氧化活性组分的相对抗氧化能力，检测结果直观、易判断，检测结果显示利用本方法提取得到的活性组分其抗氧化活性高，是相同浓度下TBHQ的五倍多；
5、本发明通过低温超微粉碎、溶剂提取、离心、醇沉处理、制备色谱固相萃取、制备色谱分离纯化进行对黄绿蜜环菌中抗氧化活性组分的提取，通过对各个步骤的工艺 条件和工艺参数的优化，以及各个步骤之间良好的协同作用，使得整个抗氧化活性组分提取的技术方案完整可行，不但成功从黄绿蜜环菌子实体中分离得到了具有抗氧化活性的组分，且经过检测，该方法黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的提取率高达6‰左右；
6、本发明黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的制备方法工艺简单，易于实施，具有快速、高效、重复性好、稳定可控、适用于工业化大规模生产等特点，所得的抗氧化活性组分可用于研发制备抗氧化药物或抗氧化保健食品，而由于该活性组分抗氧化有效成分含量高，使用该活性组分进行制备抗氧化药物或保健食品时有效成分含量高，可以满足不同制剂载体形式对有效成分含量的需求；
7、本发明拓展了抗氧化药物或保健食品的原料来源，扩大了黄绿蜜环菌子实体的应用范围，使黄绿蜜环菌子实体成为抗氧化药物或保健食品的有效组分原料，显著提高了黄绿蜜环菌子实体的附加值。
附图说明
图1为本发明各实施例中黄绿蜜环菌子实体抗氧化活性组分的色谱分离图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
1、原料、材料：
黄绿蜜环菌子实体采摘自青海祁连并经过鉴定；Hek293-ARE细胞由中国医学科学院血液病医院提供。
2、试剂：
分析纯水由密立博纯水仪生产；无水乙醇够自天津市北方天医化学试剂厂；色谱级甲醇、乙酸购自Honeywell公司；TBHQ（叔丁基对苯二酚）购自Sigma公司。
3、仪器设备：
超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司；台式冷冻离心机购自Thermo公司；旋转蒸发仪购自上海亚容生化仪器厂；反相色谱填料购自博纳艾杰尔公司；制备色谱仪购自江苏汉邦科技有限公司。
实施例1：黄绿蜜环菌子实体抗氧化活性组分的提取
本实施例黄绿蜜环菌子实体抗氧化活性组分的制备方法，包括以下步骤：
（1）黄绿蜜环菌子实体室温阴干处理后，在60℃烘干脱水，然后在-20℃超微粉碎5min，即得黄绿蜜环菌子实体超微粉。
（2）取上述黄绿蜜环菌子实体超微粉1Kg，加入6.0L分析纯水在90℃提取3次，每次1h，并在8000rpm下离心收集上清液。该上清液浓缩至固含量为50mg/mL，加入4倍体积的无水乙醇进行醇沉处理并离心收集上清液，对醇沉上清液减压浓缩（采用旋转蒸发仪进行，工艺条件为真空度0.08Mpa、温度60℃，下同）至膏状，即得黄绿蜜环菌子实体小分子提取物。
（3）所述小分子提取物中加入其体积10倍的分析纯水进行溶解，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到黄绿蜜环菌子实体小分子提取物的样品溶液。所述样品溶液使用制备色谱进行固相萃取，填料采用粒径为40μm的反相分离材料C18，分离色谱柱直径为100mm，柱长为300mm。采用A为纯水、B为甲醇的二元流动相体系进行固相萃取；固相萃取的条件为：3倍柱体积甲醇活化色谱柱，3倍柱体积纯水平衡，含有小分子提取物的样品溶液上样，3倍柱体积纯水淋洗，5倍柱体积50%甲醇-水溶液洗脱，获得黄绿蜜环菌子实体前处理样品。
（4）将前处理样品在以填料为反相分离材料C18（粒径8μm）的制备色谱上进行分离纯化，分离色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，采用A为0.2％乙酸-水、B为0.2％乙酸-甲醇的二元流动相体系进行分离纯化，分离纯化的条件为：0～10min用95%A、5%B洗脱样品，10～20min用95～78%A、5～22%B梯度洗脱，20～25min用78～5%A、22～95%B梯度洗脱，25～35min用5%A、95%B洗脱样品，检测波长为254nm，进样量为1.2g；按照色谱峰进行收集，色谱峰如图1（a）所示，将各收集馏分减压浓缩至粉末，得黄绿蜜环菌子实体各试验组分。
（5）对各试验组分进行抗氧化活性实验，利用建立的体外细胞抗氧化药物筛选模型评估各试验组分的相对抗氧化能力，以已知天然抗氧化剂特丁基对苯二酚（TBHQ）作为参照抗氧化剂，黄绿蜜环菌子实体各试验组分与TBHQ在相同浓度条件下作用于体外细胞抗氧化药物筛选模型的细胞，通过检测试验组与对照组细胞中荧光素酶的活性，计算出相同剂量条件下黄绿蜜环菌子实体各试验组分抗氧化能力与TBHQ的抗氧化能力的倍数关系，选取相对抗氧化活性最好的组分即为本发明目的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分，得到的目的抗氧化活性粉末的重量为6.24g，计算其得率为6.24‰。
所得黄绿蜜环菌子实体抗氧化组分经过制备色谱进一步分离纯化及NMR碳谱氢谱分析，判定主要含有尿嘧啶核苷酸及其他未知物。
实施例2：黄绿蜜环菌子实体抗氧化活性组分的提取
本实施例黄绿蜜环菌子实体抗氧化活性组分的制备方法，包括以下步骤：
（1）黄绿蜜环菌子实体室温阴干处理后，在40℃烘干脱水，然后在4℃超微粉碎20min，即得黄绿蜜环菌子实体超微粉。
（2）取上述黄绿蜜环菌子实体超微粉0.3Kg，加入4.5L分析纯水在60℃提取3次，每次2h，并在4000rpm下离心收集上清液。该上清液浓缩至固含量为200mg/mL，加入9倍体积的无水乙醇进行醇沉处理并离心收集上清液，对醇沉上清液减压浓缩至膏状，即得黄绿蜜环菌子实体小分子提取物。
（3）所述小分子提取物中加入其体积10倍的分析纯水进行溶解，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到黄绿蜜环菌子实体小分子提取物的样品溶液。所述样品溶液使用制备色谱进行固相萃取，填料采用粒径为40μm的反相分离材料C8，分离色谱柱直径为100mm，柱长为300mm。采用A为纯水、B为甲醇的二元流动相体系进行固相萃取；固相萃取的条件为：3倍柱体积甲醇活化色谱柱，3倍柱体积纯水平衡，含有小分子提取物的样品溶液上样，3倍柱体积纯水淋洗，5倍柱体积50%甲醇-水溶液洗脱，获得黄绿蜜环菌子实体前处理样品。
（4）将前处理样品在以填料为反相分离材料C18（粒径10μm）的制备色谱上进行分离纯化，分离色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，采用A为0.2％乙酸-水、B为0.2％乙酸-甲醇的二元流动相体系进行分离纯化，分离纯化的条件为：0～10min用95%A、5%B洗脱样品，10～20min用95～78%A、5～22%B梯度洗脱，20～25min用78～5%A、22～95%B梯度洗脱，25～35min用5%A、95%B洗脱样品，检测波长为254nm，进样量为1.2g；按照色谱峰进行收集，色谱峰如图1（b）所示，将各收集馏分减压浓缩至粉末，得黄绿蜜环菌子实体各试验组分。
（5）对各试验组分进行抗氧化活性实验，利用建立的体外细胞抗氧化药物筛选模型评估各试验组分的相对抗氧化能力，以已知天然抗氧化剂特丁基对苯二酚（TBHQ）作为参照抗氧化剂，黄绿蜜环菌子实体各试验组分与TBHQ在相同浓度条件下作用于体外细胞抗氧化药物筛选模型的细胞，通过检测试验组与对照组细胞中荧光素酶的活性，计算出相同剂量条件下黄绿蜜环菌子实体各试验组分抗氧化能力与TBHQ的抗氧化能力的倍数关系，选取相对抗氧化活性最好的组分即为本发明目的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分，得到的目的抗氧化活性粉末的重量为1.78g，计算其得率为5.93‰。
所得黄绿蜜环菌子实体抗氧化组分经过制备色谱进一步分离纯化及NMR碳谱氢谱分析，判定主要含有尿嘧啶核苷酸及其他未知物。
实施例3：黄绿蜜环菌子实体抗氧化活性组分的提取
本实施例黄绿蜜环菌子实体抗氧化活性组分的制备方法，包括以下步骤：
（1）黄绿蜜环菌子实体室温阴干处理后，在50℃烘干脱水，然后在-10℃超微粉碎10min，即得黄绿蜜环菌子实体超微粉。
（2）取上述黄绿蜜环菌子实体超微粉0.5Kg，加入5L分析纯水在75℃提取2次，每次2h，并在5000rpm下离心收集上清液。该上清液浓缩至固含量为100mg/mL，加入6倍体积的无水乙醇进行醇沉处理并离心收集上清液，对醇沉上清液减压浓缩至膏状，即得黄绿蜜环菌子实体小分子提取物。
（3）所述小分子提取物中加入其体积15倍的分析纯水进行溶解，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到黄绿蜜环菌子实体小分子提取物的样品溶液。所述样品溶液使用制备色谱进行固相萃取，填料采用粒径为40μm的反相分离材料C8，分离色谱柱直径为100mm，柱长为300mm。采用A为纯水、B为甲醇的二元流动相体系进行固相萃取；固相萃取的条件为：3倍柱体积甲醇活化色谱柱，3倍柱体积纯水平衡，含有小分子提取物的样品溶液上样，3倍柱体积纯水淋洗，5倍柱体积50%甲醇-水溶液洗脱，获得黄绿蜜环菌子实体前处理样品。
（4）将前处理样品在以填料为反相分离材料C18（粒径15μm）的制备色谱上进行分离纯化，分离色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，采用A为0.2％乙酸-水、B为0.2％乙酸-甲醇的二元流动相体系进行分离纯化，分离纯化的条件为：0～10min用95%A、5%B洗脱样品，10～20min用95～78%A、5～22%B梯度洗脱，20～25min用78～5%A、22～95%B梯度洗脱，25～35min用5%A、95%B洗脱样品，检测波长为254nm，进样量为1.2g；按照色谱峰进行收集，色谱峰如图1（c）所示，将各收集馏分减压浓缩至粉末，得黄绿蜜环菌子实体各试验组分。
（5）对各试验组分进行抗氧化活性实验，利用建立的体外细胞抗氧化药物筛选模型评估各试验组分的相对抗氧化能力，以已知天然抗氧化剂特丁基对苯二酚（TBHQ）作为参照抗氧化剂，黄绿蜜环菌子实体各试验组分与TBHQ在相同浓度条件下作用于体外细胞抗氧化药物筛选模型的细胞，通过检测试验组与对照组细胞中荧光素酶的活性，计算出相同剂量条件下黄绿蜜环菌子实体各试验组分抗氧化能力与TBHQ的抗氧化能力的倍数关系，选取相对抗氧化活性最好的组分即为本发明目的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分，得到的目的抗氧化活性粉末的重量为3.06g，计算其得率为6.12‰。
所得黄绿蜜环菌子实体抗氧化组分经过制备色谱进一步分离纯化及NMR碳谱氢谱分析，判定主要含有尿嘧啶核苷酸及其他未知物。
实施例4：抗氧化活性实验
将经过筛选的对数生长期Hek293-ARE细胞经胰酶消化、计数后接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞数约为2×104个，在37℃，5%的CO2培养箱中培养24小时。为避免边缘效应，周围孔加入PBS；每孔等量补充培养基。然后加入黄绿蜜环菌子实体测活组分（各试验组分），每孔加入相应浓度样品，使得各样品终浓度为20～50mg/mL，每个浓度设3个重复；加阳性对照药物特丁基对苯二酚（TBHQ），阳性对照终浓度同样为20～50mg/mL，同时设空白对照，阳性对照与空白对照都设置5个重复。将加入了测试样品、对照品以及空白对照的细胞培养板放置在37℃，5%CO2培养箱，继续培养24h，使用荧光素酶检测试剂盒（购自上海信然生物科技有限公司）检测各培养孔细胞中荧光素酶的活性。计算黄绿蜜环菌子实体各试验组分相对抗氧化活性（抗氧化活性是特丁基对苯二酚活性的倍数）：相对抗氧化活性(%)=(测试组光强值-空白对照光强值)/(阳性对照光强值-空白对照光强值)×100%。得到相对抗氧化活性最强的即为本发明目的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分，各实施例得到的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的相对抗氧化活性检测数据如表1所示。
上述实施例所用的材料和试剂，除另有说明外，均为适合药物化学及生物医药使用的市售产品。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
表1各实施例黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的相对抗氧化活性
Claims (7)
1.一种黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在40～60℃温度下烘干脱水，然后进行超微粉碎处理，获得超微粉；
（2）将步骤（1）所得的超微粉按1g﹕（6～15）mL的料液比用分析纯水在60～90℃温度下提取1～2h，提取结束后在4000～8000rpm转速下离心收集上清液，重复1～3次，将所得上清液合并，浓缩后加入无水乙醇进行醇沉处理，离心收集上清液，对醇沉上清液减压浓缩至膏状，获得小分子提取物；
（3）在步骤（2）所得的小分子提取物中加入10～20倍体积的分析纯水进行溶解，溶解后过有机滤膜，得到含有小分子提取物的样品溶液，所得样品溶液在填料为反相分离材料C18或C8的制备色谱上进行固相萃取并减压浓缩，获得前处理样品；
（4）将步骤（3）获得的前处理样品在以填料为反相分离材料C18的制备色谱上进行分离纯化，按照色谱峰进行收集，将各收集馏分减压浓缩至粉末，得黄绿蜜环菌子实体各试验组分；
（5）对步骤（4）得到的各试验组分进行抗氧化活性实验，计算出各试验组分相对于特丁基对苯二酚（TBHQ）的抗氧化活性，选取相对抗氧化活性最好的组分即为本发明目的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分。
2.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中超微粉碎的条件为：使用超微粉碎机在-20～4℃温度下，超微粉碎5～20min。
3.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中所得上清液浓缩至固含量为50～200mg/mL，然后加入4～9倍体积的无水乙醇进行醇沉处理。
4.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中固相萃取采用的反相分离材料C18或C8的粒径为40μm，采用的分离色谱柱直径为100mm、柱长为300mm，采用A为纯水、B为甲醇的二元流动相体系进行固相萃取；固相萃取的条件为：3倍柱体积甲醇活化色谱柱，3倍柱体积纯水平衡，含有小分子提取物的样品溶液上样，3倍柱体积纯水淋洗，5倍柱体积50%甲醇-水溶液洗脱，获得前处理样品。
5.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中制备液相色谱采用的反向分离材料C18的粒径为8～15μm，采用的分离色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，采用A为0.2％乙酸-水、B为0.2％乙酸-甲醇的二元流动相体系进行分离纯化；分离纯化的条件为：0～10min用95%A、5%B洗脱样品，10～20min用95～78%A、5～22%B梯度洗脱，20～25min用78～5%A、22～95%B梯度洗脱，25～35min用5%A、95%B洗脱样品，检测波长为254nm，进样量为1.2g。
6.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）（3）（4）中减压浓缩采用旋转蒸发仪进行，工艺条件为真空度0.08Mpa、温度60℃。
7.权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗氧化活性组分在制备抗氧化药物或保健食品中的应用。
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2014
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Patent Citations (2)
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