CN105687253A - 黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法：黄绿蜜环菌子实体超微粉碎后，加入乙醇进行提取，然后过滤取上清减压浓缩，加入正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解后样品在Silica正相分离色谱上分离，采用A正己烷、B乙醇二元流动相，按0～18min93％A、18～28min 60％A、28～45min 5％A洗脱，根据紫外吸收光谱收集20-26min、27.25-28.5min、38.5-41min洗脱液，减压浓缩并烘干，得到本发明抗肝癌活性组分。该分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，适合工业化大生产，得到的目的组分可用于制备抗肝癌药物中。

Description

黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法及其应用

技术领域

本发明涉及中药提取技术领域，具体涉及一种黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法，以及该提取得到的活性组分在制备抗肝癌药物中的应用。

背景技术

黄绿蜜环菌，俗称黄蘑菇，其风味独特，是一种优良的野生食用与药用真菌，也是一种重要的高原生物资源，在青海祁连被称为祁连“八宝”之一。野生黄绿蜜环菌子实体子肥厚，味道鲜美、滑脆爽口，具有特殊的香味，且营养丰富，含丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质、生物碱、挥发油和多糖等营养成分，还含有少量有机酸、黄酮、强心苷、挥发油、甾体三萜类、苷类、香豆素萜类、鞣质、酚类等化合物。特别是硒的含量很高，具有很强的抗肝癌功能。研究表明黄绿蜜环菌还具有防治神经炎、脚气病、促进儿童发育、抗衰老、抗流感以及抗肿瘤等生物活性。

公开号为101709322B的中国发明专利“生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法”公开了一种通过黄绿蜜环菌生物转化合成白桦脂酸；公开号为101113413B的中国发明专利“一种黄绿蜜环菌纤溶酶及其生产方法”公开了一种利用黄绿蜜环菌代谢合成纤溶酶的方法；公开号为100999750B的中国发明专利“一种微生物细胞生物转化对羟基苯甲醇合成天麻素的方法”公开了一种利用黄绿蜜环菌生物转化合成天麻素的方法。上述中国专利文件中关于黄绿蜜环菌子实体的研究，主要集中在生物转化上，并未涉及黄绿蜜环菌子实体的化学成分，对其化学成分的研究甚少。

李世峰等发表的“两种野生食用菌抗氧化及抗肿瘤活性研究”(中国食用菌[J].2004,24(3):58-63)中公开了一种黄绿蜜环菌抗肿瘤活性组分的提取方法：将子实体粉碎，用80％乙醇加热回流3h，重复提取3次，提取液合并浓缩后，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，剩余部分用三倍体积无水乙醇沉淀，共得到石油醚相、乙酸乙酯相、剩余醇溶相和水溶性粗多糖四相提取物，分别烘干备用。该方法存在以下缺陷：(1)采用传统的溶剂萃取法(液液萃取)进行有效活性组分的提取，批次之间不具有重复性，即无法保证第一批萃取得到的物质组分与第二批萃取得到的物质组分之间的一致性；(2)采用这种液液萃取的方法，物质在不同溶剂中的分配过程需要的时间非常长，而且要多次萃取(一般三次，每次换新的溶剂)、然后合并，这导致整个提取过程的时间周期长，试剂耗费量大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法，该方法对样品初步处理后，主要采用高效液相色谱进行分离纯化，分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，适合工业化大生产。

本发明所采用的技术方案为：

一种黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法，该方法包括以下步骤：

(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在40～60℃温度下烘干脱水，然后进行超微粉碎处理，获得超微粉；

(2)将步骤(1)所得的超微粉按1g︰(5～15)mL的料液比加入乙醇，在30～70℃温度下提取1～6h，每0.5h～1h搅拌一次，室温静止1～5h后离心，取沉淀重复1～3次，合并所得上清液减压浓缩至膏状，获得黄绿蜜环菌小分子乙醇提取物；

(3)按质量体积比(g/mL)加入5～10倍的正己烷-乙醇二元混合溶剂，进行超声溶解，溶解后过有机滤膜，得到黄绿蜜环菌小分子乙醇提取物的样品溶液；

(4)将步骤(3)获得的小分子乙醇提取物的样品溶液在以填料为正相分离材料Silica的制备色谱上进行分离纯化，采用A为正己烷、B为乙醇的二元流动相体系，分离纯化的条件为：0～18min93％A-7％B(即按体积百分比93％A、7％B配比而成，下同理)等度洗脱、18～28min60％A-40％B等度洗脱、28～45min5％A-95％B等度洗脱，根据紫外吸收光谱收集20-26min洗脱液(Fr5峰)、27.25-28.5min洗脱液(Fr7峰)、38.5-41min洗脱液(Fr13峰)，减压浓缩并烘干，得到本发明抗肝癌活性组分。

作为优选，所述步骤(1)中超微粉碎在-20～4℃温度下进行，时间为5～20min。

作为优选，所述步骤(2)中乙醇的提取温度为30～70℃，优选为65℃。

作为优选，所述步骤(3)中正己烷-乙醇二元混合溶剂的正己烷与乙醇的体积比为2︰1。

作为优选，所述步骤(3)中有机滤膜的孔径为0.22～0.45μm

作为优选，所述步骤(4)中制备色谱采用的分离色谱柱的直径为50mm、柱长为250mm，正相分离材料Silica的粒径为8～10μm。

作为优选，所述步骤(4)中制备色谱的检测波长为260nm，进样量为1.4g，流速为50mL/min。

作为优选，所述步骤(2)、(4)中减压浓缩采用旋转蒸发仪进行，工艺条件为温度70℃、真空度0.08Mpa。

本发明进一步提供上述提取得到的黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分在制备抗肝癌药物或抗肝癌保健食品中的应用。该黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊、注射剂等。

按照本领域普通技术人员的理解，该黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的给药剂量应根据治疗对象的年龄、体重、疾病严重程度等因素而定，一般可以是Fr5200-300mg/天，Fr7150-250mg/天，Fr13200-350mg/天。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和显著效果：

1、先采用乙醇对黄绿蜜环菌子实体超微粉进行提取，将其中的极性小分子物质提取出，达到初步分离效果，有利于目的组分的提取，并且乙醇可回收再利用，既节约了提取成本，又低毒无污染。

2、再使用高效液相色谱进行目的活性组分的分离：使用乙醇提取得到极性小分子物质，经过试验摸索，正己烷︰乙醇＝2︰1的混合溶剂对其溶解性很好；Silica色谱柱对于非极性和中极性物质有较好的分离效果，且各组分之间分离度也比较理想；而在本发明的洗脱条件下，可以保证进样量和流速在常规范围内变动时均具有良好的重复性，使本发明方法得到的组分批次间一致性高，稳定性好，可操作程度强。

3、采用制备色谱对含有活性组分的小分子提取物进行分离纯化，相对于传统的溶剂萃取法，该制备方法稳定性好，重复性好，制备量大，试剂消耗量小，得到的物质组分批次之间一致性高，分离纯化过程的时间周期短。

4、本方法经过超微粉碎、溶剂提取、过滤杂质、制备色谱分离纯化等一系列步骤后，从黄绿蜜环菌乙醇提取物中分离得到了活性组分，工艺简单，易于实施，具有制备量大、稳定可控、适用于工业化大规模生产等特点，所得活性组分可用于研发制备抗肝癌药物或抗肝癌保健食品。

5、本发明拓展了抗肝癌药物或抗肝癌保健食品的原料来源，扩大了黄绿蜜环菌的应用范围，使黄绿蜜环菌成为抗肝癌药物或抗肝癌保健食品的有效组分原料，显著提高了黄绿蜜环菌的附加值。

附图说明

图1所示的是本发明各实施例黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法中的色谱分离图；

图2所示的是本发明目的抗肝癌活性组分Fr5的抗肝癌活性的实时监测图；

图3所示的是本发明目的抗肝癌活性组分Fr7的抗肝癌活性的实时监测图；

图4所示的是本发明目的抗肝癌活性组分Fr13的抗肝癌活性的实时监测图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

1、原料、材料：

黄绿蜜环菌采摘自青海省祁连山、由中科院西北高原生物研究所王启兰老师鉴定；HepG2细胞由中国医学科学院血液病医院提供。

2、试剂：

分析级乙醇购自天津市康科德科技有限公司；色谱级正己烷购自Honeywell公司；DMSO购自北京索莱宝科技有限公司；F-12K培养基购自Gibco公司。

3、仪器设备：

超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司；台式冷冻离心机购自Thermo公司；恒温鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司；旋转蒸发仪上海亚容生化仪器厂；正相Silica色谱柱购自天津博纳艾杰尔科技有限公司；制备型高效液相色谱仪购自江苏汉邦科技有限公司；细胞实时监测仪购自ACEABiosciencesInc(艾森生物科学公司)；细胞培养箱购自英国RSBiotech公司。

实施例1：

本实施例黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法，包括以下步骤：

(1)黄绿蜜环菌子实体室温阴干处理后，在60℃烘干脱水，然后在-20℃超微粉碎5min，即得黄绿蜜环菌子实体超微粉。

(2)取上述黄绿蜜环菌子实体超微粉1Kg，加入12.0L分析乙醇在70℃提取6h，每0.5h搅拌一次。室温静止5h后离心，取沉淀重复3次，合并所得上清液减压浓缩至膏状并于烘箱70℃干燥处理，即获得黄绿蜜环菌小分子乙醇提取物。

(3)加入10倍体积的色谱级正己烷-色谱级乙醇混合溶剂将步骤(2)所得的小分子提取物进行超声溶解，正己烷与乙醇的比例为2:1。溶解后过0.22μm有机滤膜，即得到黄绿蜜环菌小分子乙醇提取物的样品溶液。

(4)将获得的黄绿蜜环菌小分子乙醇提取物的样品溶液在以填料为正相分离材料Silica(粒径8μm)的制备色谱上进行分离纯化，采用的分离色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，采用A为正己烷、B为乙醇二元流动相体系进行分离纯化；分离纯化的条件为：0～18min，93％A-7％B(A与B体积比93︰7混合而成，下同理)；18～28min，60％A-40％B；28～45min，5％A-95％B，按照梯度对样品进行洗脱；检测波长：260nm；进样量：1.4g；流速：50mL/min，按照色谱峰进行收集，色谱峰如图1(a)所示，收集20-26min洗脱液(Fr5峰)、27.25-28.5min洗脱液(Fr7峰)、38.5-41min洗脱液(Fr13峰)，减压浓缩并烘干，得到本发明抗肝癌活性组分。

将以上得到的黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分经过制备色谱进一步分离纯化及NMR碳谱氢谱分析，初步判定主要含有核苷类化合物。

实施例2：

本实施例黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法，包括以下步骤：

(1)黄绿蜜环菌子实体室温阴干处理后，在40℃烘干脱水，然后在-10℃超微粉碎5min，即得黄绿蜜环菌子实体超微粉。

(2)取上述黄绿蜜环菌子实体超微粉1Kg，加入8.0L分析乙醇在50℃提取4h，每1h搅拌一次，室温静止3h后离心，取沉淀重复3次，合并所得上清液减压浓缩至膏状并于烘箱70℃干燥处理，即获得黄绿蜜环菌小分子乙醇提取物。

(3)加入8倍体积的色谱级正己烷-色谱级乙醇混合溶剂将步骤(2)所得的小分子提取物进行超声溶解，正己烷与乙醇的比例为2:1。溶解后过0.22μm有机滤膜，即得到黄绿蜜环菌小分子乙醇提取物的样品溶液。

(4)将获得的黄绿蜜环菌小分子乙醇提取物的样品溶液在以填料为正相分离材料Silica(粒径8μm)的制备色谱上进行分离纯化，采用的分离色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，采用A为正己烷、B为乙醇二元流动相体系进行分离纯化；分离纯化的条件为：0～18min，93％A-7％B；18～28min，60％A-40％B；28～45min，5％A-95％B，按照梯度对样品进行洗脱；检测波长：260nm；进样量：1.4g；流速：50mL/min，按照色谱峰进行收集，色谱峰如图1(b)所示，收集20-26min洗脱液(Fr5峰)、27.25-28.5min洗脱液(Fr7峰)、38.5-41min洗脱液(Fr13峰)，减压浓缩并烘干，得到本发明抗肝癌活性组分。

将以上得到的黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分经过制备色谱进一步分离纯化及NMR碳谱氢谱分析，初步判定主要含有核苷类化合物。

实施例3：

本实施例黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法，包括以下步骤：

(1)黄绿蜜环菌子实体室温阴干处理后，在50℃烘干脱水，然后在-15℃超微粉碎10min，即得黄绿蜜环菌子实体超微粉。

(2)取上述黄绿蜜环菌子实体超微粉1Kg，加入5L分析乙醇在40℃提取2h，每0.5h搅拌一次，室温静止4h后离心，取沉淀重复3次，合并所得上清液减压浓缩至膏状并于烘箱70℃干燥处理，即获得黄绿蜜环菌小分子乙醇提取物。

(3)加入5倍体积的色谱级正己烷-色谱级乙醇混合溶剂将步骤(2)所得的小分子提取物进行超声溶解，正己烷与乙醇的比例为2:1。溶解后过0.22μm有机滤膜，即得到黄绿蜜环菌小分子乙醇提取物的样品溶液。

(4)将获得的黄绿蜜环菌小分子乙醇提取物的样品溶液在以填料为正相分离材料Silica(粒径8μm)的制备色谱上进行分离纯化，采用的分离色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，采用A为正己烷、B为乙醇二元流动相体系进行分离纯化；分离纯化的条件为：0～18min，93％A-7％B；18～28min，60％A-40％B；28～45min，5％A-95％B，按照梯度对样品进行洗脱；检测波长：260nm；进样量：1.4g；流速：50mL/min，按照色谱峰进行收集，色谱峰如图1(c)所示，收集20-26min洗脱液(Fr5峰)、27.25-28.5min洗脱液(Fr7峰)、38.5-41min洗脱液(Fr13峰)，减压浓缩并烘干，得到本发明抗肝癌活性组分。

将以上得到的黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分经过制备色谱进一步分离纯化及NMR碳谱氢谱分析，初步判定主要含有核苷类化合物。

对比图1中(a)、(b)、(c)，可以得出，本发明黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法重复性好，批次间一致性高，可操作程度强，适合工业化推广生产。

实施例4：抗肝癌活性实验

(1)在5％CO₂，37℃，饱和湿度下，用F-12K(10％FBS+1％PS)培养基培养人肝癌HepG2细胞，选取对数期生长的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。

(2)将细胞实时监测仪放入5％CO₂，37℃饱和湿度培养箱中。取8孔板，每孔加入150μLF-12K培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的HepG2细胞悬液345μL，至每孔细胞数约2万，静置3min,在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μL稀释好的样品，终浓度设置为50μg/ml。用含0.1％DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，得到在黄绿蜜环菌乙醇提取物各试验组分(本发明所得组分Fr5、Fr7、Fr13)作用下的肝癌HepG2细胞的实时增殖图，试验结果如图2-4所示。实验结果说明黄绿蜜环菌乙醇提取物中的组分Fr5、Fr7、Fr13在浓度为50μg/ml时对肝癌HepG2细胞的增殖具有较好的抑制作用。因此，本发明目的活性组分Fr5、Fr7、Fr13具有开发成抗肝癌药物的潜力。

本发明采用RTCA实时无标记细胞分析技术进行抗肝癌活性实验的监测。RTCA实时无标记细胞分析技术是一种基于新型的细胞分析仪而建立的具有实时监测、高信息量、无需标记、全自动化、高灵敏度和高准确性等独特优点的检测技术。该细胞分析仪通过嵌在E-plate板上孔底的微电子感应器阻抗变化去感受细胞的有无以及贴壁、黏附和生长程度的改变。在细胞毒性检测中，可实时、直观的反应细胞增殖、存活、凋亡、形态变化等细胞生物学变化。该技术使得细胞实验变得更加省时高效。

本发明采用RTCA实时无标记细胞分析技术进行体外抗肝癌活性检测，具有实时监测、无需标记、全自动化、高灵敏度和高准确性的优点，可实时、直观得呈现出肝癌细胞增殖、存活、凋亡等细胞生物学变化，使得该细胞实验变得更加省时高效。

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合中药提取的市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (9)

1.一种黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在40～60℃温度下烘干脱水，然后进行超微粉碎处理，获得超微粉；

(2)将步骤(1)所得的超微粉按1g︰(5～15)mL的料液比加入乙醇，在30～70℃温度下提取1～6h，每0.5h～1h搅拌一次，室温静止1～5h后离心，取沉淀重复1～3次，合并所得上清液减压浓缩至膏状，获得黄绿蜜环菌小分子乙醇提取物；

(3)按质量体积比加入5～10倍的正己烷-乙醇二元混合溶剂，进行超声溶解，溶解后过有机滤膜，得到黄绿蜜环菌小分子乙醇提取物的样品溶液；

(4)将步骤(3)获得的小分子乙醇提取物的样品溶液在以填料为正相分离材料Silica的制备色谱上进行分离纯化，采用A为正己烷、B为乙醇的二元流动相体系，分离纯化的条件为：0～18min93％A-7％B等度洗脱、18～28min60％A-40％B等度洗脱、28～45min5％A-95％B等度洗脱，根据紫外吸收光谱收集20-26min洗脱液、27.25-28.5min洗脱液、38.5-41min洗脱液，减压浓缩并烘干，得到本发明抗肝癌活性组分。

2.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中超微粉碎在-20～4℃温度下进行，时间为5～20min。

3.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)中乙醇的提取温度为30～70℃。

4.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤(3)中正己烷-乙醇二元混合溶剂的正己烷与乙醇的体积比为2︰1。

5.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤(3)中有机滤膜的孔径为0.22～0.45μm。

6.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤(4)中制备色谱采用的分离色谱柱的直径为50mm、柱长为250mm，正相分离材料Silica的粒径为8～10μm。

7.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤(4)中制备色谱的检测波长为260nm，进样量为1.4g，流速为50mL/min。

8.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)、(4)中减压浓缩采用旋转蒸发仪进行，工艺条件为温度70℃、真空度0.08Mpa。

9.权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗肝癌活性组分在制备抗肝癌药物或抗肝癌保健食品中的应用。