CN105601603B - 黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法及其应用 - Google Patents
黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法：以黄绿蜜环菌子实体为原料，磨成粉末后乙酸乙酯提取，浓缩至膏状；用正己烷‑乙醇溶剂溶；一维液相色谱分离：采用Silica色谱柱，A相正己烷、B相乙醇二元流动相，B相浓度由0％至75％梯度洗脱，收集26‑29min洗脱液；用乙醇‑正己烷溶剂溶解；二维液相色谱分离：采用Silica色谱柱，A相正己烷、B相乙醇二元流动相，B相浓度2％等度洗脱，收集8‑11min洗脱液，蒸发浓缩，得染料木素。该分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，成本低，染料木素提取率高；目的物对肺癌A549细胞和肝癌Hep‑G2细胞具有抑制作用，具有抗癌药物开发潜力。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学及生物医药技术领域，具体涉及一种黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法，以及该染料木素单体化合物在制备抗肝癌药物和抗肺癌药物中的应用。
背景技术
黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-rivens)，又名黄蘑菇、金蘑菇、黄环菌，隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、蜜环菌属。黄绿蜜环菌子实体中等大，菌盖扁半球形至平展，直径5-12cm，菌盖边缘内卷，表皮开裂形成近环状排列的纤毛状后磷片。菌褶近似菌盖色，稍密，弯生，不等长。菌柄柱形，茎部膨大，长2-10cm，直径2-2.5cm，白色或或带黄色，内实。菌环中位，单层，菌环以上为白色，菌环以下为黄色鳞片。在显微镜下观察，担孢子椭圆形，无色至微黄色，淀粉质，担孢子棒状，无色，具4个孢子，菌丝具明显锁状联合。菌丝分布在土壤5-10cm。该菌夏秋季生于针叶林地或草地上，尤其喜生于高山草地上，菌丝可与主要植被为嵩草和高山杂类草等形成菌根。在牧草生长季节，由黄绿蜜环菌菌丝顶端生长，在草地上形成或大或小的圆圈、半圆或条带状的蘑菇圈。圈的宽度大约为50cm，圈的直径大约6cm左右(周连玉.黄绿蜜环菌的研究概述.安徽农学通报[J].2010,16(3):52-54)。
国内对黄绿蜜环菌营养成分进行了初步分析，富含氨基酸、蛋白质、多糖多肽等营养和药用成分，具有较高的保健和药用价值。但目前的蜜环菌制剂主要以初提混合物为原料，如郭顺星等在“蜜环菌的化学成分及应用研究”(微生物学通报[J].1996,23(4):239-240)中提出：蜜环菌糖浆以蜜环菌培养液(菌丝连同发酵液)为主要原料，煮沸浓缩制成，主治眩晕头痛，神经衰弱，失眠，美尼尔综合症；蜜环菌浸膏以菌丝体为原料，煮沸、过滤，残渣醇析，醇析物与滤液合并浓缩制成，用于治疗血管性头痛、神经衰弱、冠心病、脑动脉血管硬化等病；蜜环菌片以菌丝体烤干后磨成细粉压片而成，对高胆固醇血症、高甘油三酯血症、降低血压有一定效果。由于蜜环菌制剂成分一般为混合物，缺乏必要的药效物质基础和药效研究，所以其缺乏合理的质量控制标准，难以确保临床用药的有效性、安全性、可持续性。可见，对黄绿蜜环菌的化学成分进行进一步提取和研究非常有必要。
袁兴利等在“蜜环菌的化学成分研究”(中国中药杂志[J].2013,38(16):2671-2674)提出以蜜环菌发酵培养物(包含菌丝体和发酵液)为原料进行有效成分提取：采用95％乙醇浸提后，用闪式提取器提取，合并提取液并浓缩；经两次硅胶柱色谱和一次Sephadex LH-20色谱柱，并使用不同的洗脱剂进行分离纯化后，得到染料木素(化学名化学名5,7,4’-三羟基异黄酮；金雀异黄酮)单体化合物。但是使用该方法步骤繁琐，成本高，得到的染料木素含量少，得率比较低，3.5kg干燥的蜜环菌发酵培养物只得到42mg染料木素，这大大限制了染料木素的进一步研究和应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法，该方法采用二维高效液相色谱进行分离纯化，得到具有生物活性的染料木素单体化合物，分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，成本低，染料木素提取率高。
本发明所采用的技术方案为：
一种黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法，该方法包括以下步骤：
(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙酯以液固比(5-10)mL︰1g进行浸泡，然后过滤取上清，得到乙酸乙酯提取液，并浓缩至膏状；
(2)使用乙醇体积分数为10-35％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解步骤(1)得到的膏状乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上样溶液；
(3)对上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为50-150mL/针，流动相流速为550-600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm；采用的洗脱方式为B相浓度由0％至75％(即按体积百分比B相75％、A相25％混合而成的液体，其他同理)进行梯度洗脱45-50min，根据紫外吸收光谱收集26-29min洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；
(4)用乙醇体积分数为2-15％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；
(5)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为500-2000μL/针，流动相流速为10-30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm，采用的洗脱方式为等度洗脱方式，B相浓度2％进行等度洗脱15-20min，根据紫外吸收光谱收集8-11min洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到染料木素单体化合物。
所述步骤(3)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径150mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10～50μm，使用时柱温为室温或25-40℃。
所述步骤(5)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径20mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10～50μm，使用时柱温为室温或25-40℃。
本发明还进一步提供上述提取得到的染料木素单体化合物在制备抗肺癌药物中的应用。该染料木素单体化合物作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊、注射剂等。
本发明进一步提供上述提取得到的染料木素单体化合物在制备抗肝癌药物中的应用。该染料木素单体化合物作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊、注射剂等。
本发明采用二维液相色谱技术进行从黄绿蜜环菌中分离纯化染料木素：
首先：由于染料木素为苷元，极性非常小，所以粗提选用乙酸乙酯进行相似相溶提取，该溶剂可以尽可能多地溶解目的组分，且乙酸乙酯为脂溶性溶剂，与其相似相溶的目的组分也应该具备进入生物活性细胞所必需的脂溶性特性，从而具有更高的进入细胞参与细胞内作用的可能性；
其次，在一维分离的条件选择上：多次试验结果显示，Silica正相硅胶色谱柱对所提物质分离效果较好，而通过考察不同流动相组成和不同洗脱方式、流速及进样量后，结果显示采用本发明乙醇-正己烷0％-75％梯度洗脱分离效果最佳，且进样量在50-150mL/针范围内、流动相在550-600mL/min范围内时重复性良好，得到的一维液相组分中目的峰清晰、无拖尾/吸收等现象，与其他峰之间分离好，有利于分离操作和后续进一步提纯；
再次，在二维分离的条件选择上：由于一维得到的组分中目的化合物含量已相当高，再使用Silica正相硅胶色谱柱，在洗脱条件选择为B相浓度2％等度洗脱时能将极性与染料木素接近的杂质分离开，得到纯度可达95％以上的染料木素单体化合物。
在液相色谱的溶剂选择上，一维色谱分离、二维色谱分离以及中间提取物的溶解，均采用正己烷、乙醇两种溶剂混合液，可以通过改变乙醇的比例来调节有效成分的溶解能力和流动相的洗脱能力，且整个色谱分离仅使用两种溶剂，有利于提取溶剂的回收再利用。
总的来说，本发明黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法工艺简单，成本低，试剂耗费量小，制备量大，稳定可控，重复性好，批次一致性较高，得到的染料木素纯度高，稳定性好，且具备较好的生物活性。通过细胞在线实时监测的方法观测其在体外的抗肿瘤作用，发现该染料木素单体化合物对肺癌A549细胞和肝癌Hep-G2细胞具有抑制作用，具有抗癌药物开发潜力，为抗癌天然药物的开发提供了有力的依据。
附图说明
图1所示的是本发明实施例1黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法的一维高效液相色谱图；
图2所示的是本发明实施例1黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法的二维高效液相色谱图；
图3所示的是本发明实施例1所得到的目的组分的分析型高效液相色谱图；
图4所示的是本发明实施例1所得到的目的组分的MS质谱图；
图5所示的是本发明实施例1所得到的目的组分的C13NMR核磁图；
图6所示的是本发明实施例1所得到的目的组分的DEPT135核磁图；
图7所示的是本发明实施例1所得到的目的组分的H1NMR核磁图；
图8所示的是本发明实施例1所得到的目的组分的HMQC图；
图9所示的是本发明实施例1所得到的目的组分的HMBC图；
图10所示的是本发明实施例3黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法的一维高效液相色谱图；
图11所示的是本发明实施例3黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法的二维高效液相色谱图；
图12所示的是本发明实施例4黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法的一维高效液相色谱图；
图13所示的是本发明实施例4黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法的二维高效液相色谱图；
图14所示的是本发明实施例5中染料木素对肺癌A549细胞的抑制作用；
图15所示的是本发明实施例6中染料木素对肝癌Hep-G2细胞的抑制作用。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
实施例1：黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取
1.原料、材料：
黄绿蜜环菌子实体采摘自青海祁连并经过鉴定。
2.试剂：
无水乙醇购自天津市北方天医化学试剂厂；色谱级乙酸乙酯、正己烷购自Honeywell公司。
3.仪器设备：
超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司；台式冷冻离心机购自Thermo公司；30升中药提取罐购自上海顺仪实验设备有限公司；恒温鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司；旋转蒸发仪上海亚容生化仪器厂；silica正相硅胶色谱柱购自博纳艾吉尔有限公司；制备型高效液相色谱仪购自江苏汉邦科技有限公司。
本实施例黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取，包括以下步骤：
(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在70℃烘干脱水，然后在-20℃超微粉碎1min，即得黄绿蜜环菌超微粉。
(2)取上述黄绿蜜环菌超微粉3kg，经过三次乙酸乙酯浸泡，第一次浸泡：3kg黄绿蜜环菌超微粉加入15L乙酸乙酯，25℃浸泡48h，浸泡结束后，20℃、4,000rpm离心30min，分别收集上清液和残渣，上清液通过旋转蒸发浓缩后转移至60℃恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重。第二次乙酸乙酯浸泡：第一次的残渣加入15L乙酸乙酯，25℃浸泡36h。(浸泡结束，按第一次浸泡方法进行处理，其中水体乙酸乙酯上清可与第一次提取上清混合，烘干至恒重)。第三次浸泡：第二次浸泡残渣加入15L乙酸乙酯，25℃浸泡24h，浸泡结束，按第一次浸泡处理方法进行处理，将三次浸泡上清合并，旋蒸浓缩后烘干至恒重。
(3)将干燥至恒重的乙酸乙酯上清用乙醇体积分数为25％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解配制成125mg/mL的溶液，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到黄绿蜜环菌子实体小分子提取物的一维上样溶液。
(4)对一维上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(150mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为100mL/针，流动相流速为580mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm；乙醇活化色谱柱3～10倍柱体积，正己烷平衡3倍柱体积，一维上样溶液上样，采用B相浓度由0％至75％进行梯度洗脱50min。得到的一维液相色谱图如图1所示，收集27.5-28.5min洗脱液(图中7.5号峰)作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分，称重为3.15克。
(5)用乙醇体积分数为10％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为75mg/mL，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到二维上样溶液。
(6)对二维上样溶液进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(20mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为1000μL/针，流动相流速为20mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm，采用的洗脱方式为等度洗脱方式：B相浓度2％进行等度洗脱15min。得到的二维液相色谱图如图2所示，有一个主峰(HMG-7.5)为目的峰，收集9-10.5min洗脱液(图中HMG-7.5峰)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到浅黄色针晶，称重为0.064克，即为本发明目的组分。
实施例2：染料木素单体化合物的确认
1、HPLC进行纯度分析：
将实施例1得到的目的组分(图2中HMG-7.5峰)进行HPLC进行纯度分析。经高效液相检测纯度达到95％以上，为单一化合物，HPLC谱图见图3。
2、质谱分析：
对目的组分(图2中HMG-7.5峰)进行质谱分析：瀚盟生物技术(天津)有限公司，质谱图见图4。EI-MS m/z:为271(M+H)+，269(M-H)+。
3、核磁共振分析：
对目的组分大豆素进行核磁共振分析：由碳谱、氢谱、COSY相关谱(如图5-9)佐证分析得到以下结果：
1D 1HNMR谱中(DMSO-d6,400MHz)的数据结果如下：δ：8.28(1H,s,H-2)，6.23(1H，d，J＝2.1Hz，H-6)，6.37(1H，d，J＝2.1Hz，H-8)，7.38(2H，d，J＝5.1Hz，H-2’,6’)，6.84(2H，d，J＝5.1Hz,H-3’,5’)，10.85(1H，s，OH-11)，9.6(1H，s，OH-12)12.96(1H，s，OH-13)，
1D 13CNMR谱中(DMSO-d6,400MHz)的数据结果如下：180.66(C-4)，164.71(C-7)，162.48(C-4’)，157.89((C-5)，154.28(C-2)，130.6(C-2’，6’)，122.77(C-1’)，121.73(C-3)，115.54(C-3’，5’)，104.95(C-10)，99.43(C-6)，94.12(C-8)。
根据EI-MS、NMR鉴定结果，经结构解析，确定其为染料木素，染料木素的分子式为C15H10O5，分子量为270，分子结构式如下：
实施例3：黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取
本实施例所用原料、材料、试剂、仪器设备同实施例1。
本实施例黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取，包括以下步骤：
(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在70℃烘干脱水，然后在-20℃超微粉碎1min，即得黄绿蜜环菌超微粉。
(2)取上述黄绿蜜环菌超微粉3kg，经过三次乙酸乙酯浸泡，第一次浸泡：3kg黄绿蜜环菌超微粉加入21L乙酸乙酯，25℃浸泡48h，浸泡结束后，20℃、4,000rpm离心30min，分别收集上清液和残渣，上清液通过旋转蒸发浓缩后转移至60℃恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重。第二次乙酸乙酯浸泡：第一次的残渣加入21L乙酸乙酯，25℃浸泡36h。(浸泡结束，按第一次浸泡方法进行处理，其中水体乙酸乙酯上清可与第一次提取上清混合，烘干至恒重)。第三次浸泡：第二次浸泡残渣加入21L乙酸乙酯，25℃浸泡24h，浸泡结束，按第一次浸泡处理方法进行处理，将三次浸泡上清合并，旋蒸浓缩后烘干至恒重。
(3)将干燥至恒重的乙酸乙酯上清用乙醇体积分数为16％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解配制成102mg/mL的溶液，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到黄绿蜜环菌子实体小分子提取物的一维上样溶液。
(4)对一维上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(150mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为85mL/针，流动相流速为560mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm；乙醇活化色谱柱3～10倍柱体积，正己烷平衡3倍柱体积，一维上样溶液上样，采用B相浓度由0％至75％进行梯度洗脱50min。得到的一维液相色谱图如图10所示，收集27-29min洗脱液(图中7.5号峰)作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分，称重为2.73克。
(5)用乙醇体积分数为12％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为83mg/mL，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到二维上样溶液。
(6)对二维上样溶液进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(20mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为1400μL/针，流动相流速为12mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm，采用的洗脱方式为等度洗脱方式：B相浓度2％进行等度洗脱20min。得到的二维液相色谱图如图11所示，有一个主峰(右边峰)为目的峰，收集8.5-10.5min洗脱液(右边峰)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到浅黄色针晶，称重为0.059克，即为本发明目的组分。
对目的组分进行EI-MS、NMR鉴定，结果同实施例1，即得到目的组分为染料木素。
实施例4：黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取
本实施例所用原料、材料、试剂、仪器设备同实施例1。
本实施例黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取，包括以下步骤：
(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在70℃烘干脱水，然后在-20℃超微粉碎1min，即得黄绿蜜环菌超微粉。
(2)取上述黄绿蜜环菌超微粉3kg，经过三次乙酸乙酯浸泡，第一次浸泡：3kg黄绿蜜环菌超微粉加入28L乙酸乙酯，25℃浸泡48h，浸泡结束后，20℃、4,000rpm离心30min，分别收集上清液和残渣，上清液通过旋转蒸发浓缩后转移至60℃恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重。第二次乙酸乙酯浸泡：第一次的残渣加入28L乙酸乙酯，25℃浸泡36h。(浸泡结束，按第一次浸泡方法进行处理，其中水体乙酸乙酯上清可与第一次提取上清混合，烘干至恒重)。第三次浸泡：第二次浸泡残渣加入28L乙酸乙酯，25℃浸泡24h，浸泡结束，按第一次浸泡处理方法进行处理，将三次浸泡上清合并，旋蒸浓缩后烘干至恒重。
(3)将干燥至恒重的乙酸乙酯上清用乙醇体积分数为30％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解配制成132mg/mL的溶液，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到黄绿蜜环菌子实体小分子提取物的一维上样溶液。
(4)对一维上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(150mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为120mL/针，流动相流速为600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm；乙醇活化色谱柱3～10倍柱体积，正己烷平衡3倍柱体积，一维上样溶液上样，采用B相浓度由0％至75％进行梯度洗脱45min。得到的一维液相色谱图如图12所示，收集26.5-27.5min洗脱液(图中7.5号峰)作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分，称重为3.19克。
(5)用乙醇体积分数为10％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为75mg/mL，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到二维上样溶液。
(6)对二维上样溶液进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(20mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为1000μL/针，流动相流速为20mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm，采用的洗脱方式为等度洗脱方式：B相浓度2％进行等度洗脱15min。得到的二维液相色谱图如图13所示，有一个主峰(右边峰)为目的峰，收集8.5-10.5min洗脱液(右边峰)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到浅黄色针晶，称重为0.067克，即为本发明目的组分。
对目的组分进行EI-MS、NMR鉴定，结果同实施例1，即得到目的组分为染料木素。
实施例5：抑制人肺肿瘤A549细胞生长的试验
主要材料与试剂：
人肺癌A549细胞由中国医学科学院血液病医院提供；F-12K培养基购自LifeTechnologies Corporation；iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪购自艾森生物(杭州)有限公司；DMSO购自天津康科德科技有限公司。
细胞培养：
在5％CO2、37℃饱和湿度下，用F-12K(10％FBS+1％PS)培养基培养人肺肿瘤A549细胞，选取对数期生长的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。
细胞生长情况监测：
将细胞实时监测仪放入37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中。取八孔板，每孔加入150μLF-12K培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的A549细胞悬液345μL，至每孔细胞数约2×104个，静置3min，在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μl稀释好的药物(实施例1得到的染料木素单体化合物)至终浓度为25μg/ml，含1‰DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。
空白对照孔(DMSO)：不加药物，加1‰DMSO；
实验孔(HMG7.5)：加实施例1所得的染料木素单体化合物。
试验结果如图14所示。
结果表明：本发明目的组分染料木素在25μg/ml时对A549细胞生长具有较强的抑制作用。
实施例6：抑制人肝肿瘤Hep-G2细胞生长的试验
主要材料与试剂：
人肝肿瘤Hep-G2细胞由中国医学科学院血液病医院提供；MEM培养基购自LifeTechnologies Corporation；iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪购自艾森生物(杭州)有限公司；DMSO购自天津康科德科技有限公司。
细胞培养：
在5％CO2、37℃饱和湿度下，用MEM(10％FBS、1％PS)培养基培养人肺肿瘤Hep-G2细胞，选取生长状态良好的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。
细胞生长情况监测：
将细胞实时监测仪放入5％CO2、37℃饱和湿度培养箱中。取八孔板，每孔加入150μLMEM培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的Hep-G2细胞悬液345μL，至每孔细胞数约4×104个，静置3min，在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μL稀释好的药物(实施例1得到的染料木素单体化合物)至终浓度为所需药物浓度(25μg/ml)，含1‰DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。
空白对照孔(DMSO)：不加药物，加入1‰DMSO；
实验孔(HMG7.5)：加实施例1所得的染料木素单体化合物。
实验结果如图15所示。
结果表明：本发明目的组分染料木素在25μg/ml时对能Hep-G2细胞具有较好的抑制作用。
以上试验结果显示了本发明制备得到的染料木素具备良好的生物活性，具有进一步开发有效抗肿瘤药物方面的潜力，可以用于制备抗肺癌药物和抗肝癌药物。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合中药提取的市售产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (3)
1.一种黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙酯以液固比(5-10)mL︰1g进行浸泡，然后过滤取上清，得到乙酸乙酯提取液，并浓缩至膏状；
(2)使用乙醇体积分数为10-35％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解步骤(1)得到的膏状乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上样溶液；
(3)对上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为50-150mL/针，流动相流速为550-600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm；采用的洗脱方式为B相浓度由0％至75％进行梯度洗脱45-50min，根据紫外吸收光谱收集26-29min洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；
(4)用乙醇体积分数为2-15％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；
(5)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为500-2000μL/针，流动相流速为10-30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm，采用的洗脱方式为B相浓度2％进行等度洗脱15-20min，根据紫外吸收光谱收集8-11min洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到染料木素单体化合物。
2.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法，其特征在于：所述步骤(3)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径150mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10-50μm，使用时柱温为室温或25-40℃。
3.根据权利要求1所述的黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法，其特征在于：所述步骤(5)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径20mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10-50μm，使用时柱温为室温或25-40℃。
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